مقالة بحثية

علم الأدوية الشبكي، التعلم الآلي، والتحقق الحية لكبسولة دانتشي جيانغتانغ في اعتلال الكلى السكري

51 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/71328

⸱

يوليو 28, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Anhui University of Chinese Medicine

في هذه المقالة

ملخص

قد تخفف كبسولة دانتشي جيانغتانغ (DJC) من اعتلال الكلى السكري (DN)، كما يتضح من التغيرات في إشارات الكيموكينات وعلامات البروج، المدعومة بالمعلوماتية الحيوية والتحقق الحي .

الملخص

على الرغم من أن كبسولة دانتشي جيانغتانغ (DJC) هي تحضير عشبي صيني تقليدي يستخدم سريريا لعلاج السكري، إلا أن كيفية حمايتها للكلية أثناء اعتلال الكلى السكري (DN) لم يتم توضيحها بالكامل بعد. تم تصميم هذا البحث لاستكشاف الآليات المحتملة التي يؤثر بها DJC على DN، مع التركيز على سلسلة الإشارات المرتبطة بالبيروبتوسيس (PIROPTOSIS) من عائلة NLR التي تحتوي على نطاق البيرين 3 (NLRP3)/Caspase-1/Gasdermin D (GSDMD).

تم استخدام استراتيجية متكاملة تجمع بين علم الأدوية الشبكي وتعلم الآلة. تم استخدام قاعدة بيانات وتحليل أنظمة الطب الصيني التقليدي ومنصة تحليل الدواء (TCMSP) وأداة تحليل المعلوماتية الحيوية للآلية الجزيئية للطب الصيني التقليدي (BATMAN-TCM) لفحص المكونات النشطة الحيوية وأهدافها البروتينية المقابلة ل DJC. تم استرجاع الجينات المرتبطة ب DN من Geo Expression Omnibus (GEO)، وGeneCards، وBorn Mendelian Inheritance on Man (OMIM). تم فرز وتصنيف الأهداف الرئيسية للمرشحين باستخدام خوارزميات تعلم آلي متعددة. تم تقييم الارتباط بين مكونات DJC الفعالة والأهداف الأساسية من خلال الالتحام الجزيئي. وأخيرا، تم تقييم الفعالية العلاجية والآليات المتوقعة لدى الفئران المصابة بالسكري من نوع db/db.

حدد تحليل الأدوية الشبكي 599 هدفا ل DJC و68 جينا متداخلا مشتركا مع DN. باستخدام خوارزميات التعلم الآلي، تم تحديد رابطة الكيموكين 2 (CCL2) وCASP1 كأهداف مرشحة ذات أولوية. تنبأ الالتحام الجزيئي بإمكانية وجود ألفاط قوية بين المكونات الفعالة ل DJC وهذه البروتينات الأساسية. أشارت تحليلات الإثراء الوظيفي (GO/KEGG) إلى أن تعديل DJC مرتبط بالاستجابات الالتهابية ومسار MAPK. أظهر التحقق من صحة الجسم الحي أن علاج DJC خفف من إصابات الكلى وعلامات التليف. تشير هذه النتائج إلى أن DJC قد يخفف من DN جزئيا من خلال تغييرات إشارات بيروبتوزيس مرتبطة بمستقبل الكيموكين 2 (CCR2) المرتبطة ب CCL2/C-C.

المقدمة

يستمر العبء العالمي لمرض السكري (DM) في التصاعد، مما يشكل تحديا كبيرا في الصحة العامة. يقدر أن 5.2 مليون حالة وفاة سنويا تنبع من المرض المزمنة والمضاعفات المرتبطة به1. يعتبر DN مضاعفات دقيقة وعية وعائية خطيرة ومساهما رئيسيا في تطور مرض الكلى في المرحلة النهائية (ESRD)، حيث يؤثر على حوالي 30-40٪ من سكان السكري 2,3. تساهم عوامل متعددة متداخلة في تطور مرضي DN، بما في ذلك خلل الأيض، وإعادة تشكيل الديناميكية الدموية، والاستجابات الالتهابية المستمرة. تؤدي الإصابات المرضية، بما في ذلك ارتفاع الجلوكوز وفرط الدهون في الدم، إلى تنشيط مسار البروبتوسيس النباتي NLRP3/الكاسباز-1/GSDMD، مما يؤدي إلى الموت الالتهابي المبرمج في الخلايا الطهارية المتوسطة والأنبوبية الكلوية، تليها آفات tubulointerstialal تقدمية4. يتميز الالتهاب البريوتسي بتمزق غشاء البلازما، الذي يدفع إطلاق IL-1β وIL-185. تزيد هذه العوامل الالتهابية من نسخ رابطة الكيموكين 2 (CCL2) في نمط C-C، وتعزز تسرب البلاعمية، وتزيد من تنشيط البيروبتوز، مما يزيد من تفاقم إصابة الكلى6. في الممارسة السريرية، تظهر هذه الحالة بظهور تدريجي في البول الألبومي وانخفاض تدريجي في معدل ترشيح الكبيبة، مما قد يؤدي إلى تلف الكلى غير القابل للعلاج وتدهور ملحوظ في جودة حياة الأشخاص المصابين 7,8. على الرغم من التقدم في الرعاية الطبية، إلا أن الاستراتيجيات العلاجية الحالية، التي تركز بشكل رئيسي على التحكم الصارم في السكر الدمي وضغط الدم، غالبا ما تفشل في إيقاف تقدم المرض بالكامل. بينما حظيت العلاجات الدوائية الناشئة، بما في ذلك عوامل الحظر SGLT2، ومنشطات GLP-1، ومثبطات مستقبلات القشرة المعدنية (mineralocorticoid)، بالإضافة إلى علاجات الخلايا الجذعية والتدخلات الغذائية، باهتمام كبير وأصبحت أكثر انتشارا في الممارسةالعملية، إلا أن خطر الظهورية المتبقية للقشرية المعدنية لا يزال مرتفعا. لذا، يظل تطوير المواد العلاجية المبتكرة أولوية بحثية عاجلة، خاصة تلك الناتجة عن الطب التقليدي التي قد تستهدف عدة مسارات مرضية في آن واحد.

كبسولة دانتشي جيانغتانغ (DJC)، تركيبة حصرية داخل المستشفى تم تطويرها في أول مستشفى تابع لجامعة أنهوي للطب الصيني (رقم Z20090006 الموافقة على إعداد مؤسسة الطب الإقليمية في أنهوي؛ براءة اختراع رقم ZL200310112845.1؛ الدفعة رقم 20220427)، مرشحة علاجية واعدة. يجب أن يكون مغلقا، ويخزن في بيئة جافة ومهواة، ويحمي من الضوء. تتكون الصيغة من ستة أعشاب صينية تقليدية: Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae)، ويتمانيا بيغرا (Hirudo)، وأليزما أورينتالي (Alismatis Rhizoma)، وCuscuta chinensis (Cuscutae Semen)، وPaeonia suffruticosa (قشرة موتان)، وRehmannnia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata) (5:4:4:3:2:5)10. في الممارسة السريرية، أظهر DJC فعالية كبيرة في انخفاض سكر الدم والقدرة على تقليل مؤشرات إصابات الكلى لدى مرضى السكري11. تشير أبحاث سابقة إلى أن DJC قد يمارس تأثيرات حماية من الرينوبر من خلال تنظيم مستويات الجلوكوز في الدم واستقلاب الدهون 12,13,14. ركزت الدراسات السابقة على DJC بشكل رئيسي على التحقق من منظور المسار الواحد مع اختيار أهداف غير منهجي. لذلك، قمنا بدمج علم الأدوية الشبكي وتعلم الآلة لفحص المكونات النشطة وتحديد جينات المركز الأساسية، تلاها التحقق الأولي في الجسم الحي، لتعزيز التحليل.

تقدم الصيدلة الشبكية استراتيجية فعالة لتحليل الوصفات العشبية المعقدة. يدمج هذا الإطار الأساليب الحيوية المعلوماتية والنظامية البيولوجية، والكيمياء الحاسوبية، وعلم الأدوية لفك رموز آليات "متعددة المكونات، متعددة الأهداف، ومتعددة المسارات" لتأثيرات الأدوية 15,16,17. يسهل هذا النهج الشامل فحصا منظما للتفاعلات المعقدة بين المركبات العشبية والشبكات الخاصة بالأمراض، كاشفا عن التأثيرات التآزرية الكامنة في الطب الصينيالتقليدي 18. ومع ذلك، يمكن أن تولد الأدوية الشبكية التقليدية أحيانا ضوضاء مفرطة في البيانات. لتجاوز ذلك، يتيح دمج خوارزميات التعلم الآلي فحصا دقيقا للجينات الأساسية المميزة من مجموعات بيانات واسعة النطاق. علاوة على ذلك، يوفر الالتحام الجزيئي منظورا بديهيا وديناميكيا للتنبؤ بمواجهات ارتباط محتملة بين الدواء والجزيء الحيوي19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

فحص المركبات الحيوية النشطة والأهداف المحتملة ل DJC

تم استرجاع المركبات النشطة بيولوجيا من الأعشاب الستة في DJC، Pseudostellaria heterophylla (Radix Pseudostellariae)، Paeonia suffruticosa (قشرة موتان)، Cuscuta chinensis (Cuscutae semen)، Alisma orientale (Alismatis Rhizoma)، Rehmannia glutinosa (Rehmanniae Radix Praeparata)، وWhitmania pigra (Hirudo) من قاعدة بيانات TCMSP. تم إجراء الفحص بناء على معايير الحراكية الدوائية: التوافر الحيوي الفموي (OB) ≥ 30٪ وشبه الدواء (DL) ≥ 0.18. بالنسبة ل Whitmania pigra، التي تفتقر إلى بيانات في TCMSP، تم الحصول على مركباته الفعالة وأهدافها من BATMAN-TCM، باستخدام درجة ≥ 20 وقيمة P < 0.05 كمعايير اختيار. تم تطبيق UniProt لتوحيد جميع الأهداف المجمعة في تسمية جينية موحدة.

اكتساب الجينات المرتبطة ب DN

تم جمع الجينات المرتبطة بالحمض النووي من ثلاثة مصادر. أولا، تم البحث في GeneCards وOMIM باستخدام مصطلح "اعتلال الكلى السكري". تم الاحتفاظ بالجينات من GeneCards بدرجة ملاءمة > 1. ثانيا، تم الحصول على ثلاثة ملفات تعريف ميكروآراي (GSE30529، GSE104948، GSE96804) من مستودع GEO. العينات في GSE30529 اشتقت من أنابيب الكلى، بينما كانت العينات في GSE104948 و GSE96804 نشأت من الكبيبات الكلوية. تم إجراء جميع عمليات البحث في قواعد البيانات في 15 ديسمبر 2024. تم تحديد الجينات المعبر عنها بشكل تفاضلي (DEGs) بين مرضى DN والضوابط الأصحاء في مجموعة البيانات GSE30529 باستخدام حزمة limma في برنامج R. تم تحديد معايير الفرز عند قيمة p معدلة < 0.05 و |log2(تغيير الطية)| > 0.5. عرضت الرسوم البركانية وخرائط الحرارة جينات معبرة بشكل مختلف.

تحديد الأهداف العلاجية المفترضة ل DJC ل DN

حدد تحليل مخطط فين المواقع المشتركة بين مجموعة أهداف DJC والجينات المرتبطة بالحمض النووي من بطاقات الجينات، OMIM، وDEGs GSE30529. وقد خدمت هذه المواقع المشتركة كجينات علاجية مرشحة لجميع إجراءات البحث اللاحقة.

إنشاء وتحليل شبكات تفاعل البروتين (PPI)

تم رفع مواقع علاجية محتملة إلى STRING لبناء شبكة تفاعل بين البروتين والبروتين، مع تحديد حد التفاعل فوق قيمة ثقة 0.4. عالجت سايتوسكيب مجموعات بيانات الشبكة للعرض البصري. تم حساب مؤشرات طوبولوجية مثل Degree عبر إضافة CytoNCA لتحديد العقد الأساسية في جميع أنحاء الشبكة.

تحليل الإثراء

لتحديد الأدوار البيولوجية وتسلسلات الإشارات المرتبطة بالأهداف المرشحة، تم تحليل الإثراء الوظيفي بلغة R باستخدام حزمة clusterProfiler، باستخدام org. Hs.eg.db للتعليق التوضيحي وggplot2 للتصور. تم تقييم مصطلحات علم الجينات (GO) عبر فئات العمليات البيولوجية (BP)، والمكون الخلوي (CC)، والوظيفة الجزيئية (MF). تم الاحتفاظ بمسارات موسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG) عندما كانت قيمة p الإثراء < 0.05.

تطبيق خوارزمية سايتوهوبا

تم استخدام إضافة CytoHubba في Cytoscape لحساب أربعة مؤشرات مركزية طوبولوجية لكل عقدة شبكة. الدرجة، وهي عدد الجيران المتصلين مباشرة، تعكس اتساع تفاعلات كل بروتين. يقيس المكون الحي الأقصى (MNC)، وهو مقياس يحدد حجم أكبر مكون متصل في الرسم البياني الحي للعقدة، التأثير التنظيمي المحلي. يقوم المكون المتسرب من الحافة (EPC) بتقييم الأهمية الهيكلية العالمية من خلال إزالة الحواف العشوائية المحاكاة وقياس حجم المكون المتصل المتوسط. تم تقاطع الجينات التي تحتل المراتب ضمن أفضل 20 لكل مؤشر لإنتاج جينات المحور النهائية.

فحص الجينات الأساسية المعتمد على التعلم الآلي

تم تطبيق ثلاثة أساليب تعلم آلي على ملفات التعبير من مجموعة البيانات GSE30529 لتحديد جينات محور موثوقة بين الأهداف المرشحة.

(1) LASSO (عامل الانكماش والاختيار المطلق الأقل): تم ضبط معامل التنظيم λ عبر التحقق المتقاطع الخماسي الأضعاف، حيث تم تحديد القيمة المثلى بناء على الأداء المتوسط عبر الطيات. خضعت ميزات التعبير الجيني المدخلة لتوحيد تلقائي لدرجة Z لإزالة تأثيرات حجم التعبير. مع α معامل العقوبة ثابتا عند 1 لتنظيم LASSO النقي، تم استخدام لوحة محددة مسبقا مكونة من 100 قيمة λ للفحص. قامت عقوبة اللغة الأولى بتقليص معاملات الميزات منخفضة الصلة إلى الصفر، مما أتاح اختيار الميزات والتحكم في التعقيد في نفس الوقت، بينما خففت قوة التنظيم المتبادلة بالتحقق من خطر الإفراط في التركيب.

(2) SVM-RFE (إزالة الميزات المتكررة لآلة الدعم المتجهة): تم استخدام إطار عمل تحقق متقاطع مكون من طبقتين من 5 أطعاف لضمان فحص ميزات قوي. تم توليد خمس مجموعات فرعية غير متداخلة عن طريق تقسيم مجموعة البيانات بالكامل بشكل ستوشاستي، حيث استخدمت أربع مجموعات للتدريب وواحدة للاختبار عبر خمس تكرارات؛ المتوسط المعتدل للانحياز الناتج عن تقسيم العينة الواحدة. تم تطبيق إزالة الميزات العودية لتقليل أبعاد الميزات وتقييد تعقيد النموذج، مما يقلل من الإفراط في التوافق. كان معدل الخطأ في التصنيف والدقة بمثابة مقاييس أداء لتحديد العدد الأمثل للميزات.

(3) الغابة العشوائية (RF): تم بناء غابة عشوائية أولية مكونة من 500 شجرة، حيث تم تحديد الرقم الأمثل للشجرة بواسطة الحد الأدنى لمعدل خطأ التصنيف خارج الكيس لإعادة تدريب النموذج النهائي. جميع المعلمات الفائقة المتبقية، بما في ذلك حجم مجموعة الميزات العشوائية عند كل تقسيم عقدة، تم الاحتفاظ بها في إعدادات الحزمة الافتراضية. تم ترتيب درجات أهمية الجينات من النموذج النهائي بترتيب تنازلي لتوليد مجموعة جينات توقيع المرض. تم تحديد المجموعة النهائية من الجينات الأساسية من خلال تقاطع نتائج هذه الخوارزميات الثلاث.

التحقق المستقل القائم على مجموعة البيانات لتعبير جينات المحور

تم استخدام مجموعتين خارجيتين مستقلتين، GSE104948 و GSE96804، للتحقق من صحة مستويات النسخ في جينات المركز. خضعت مجموعات بيانات تعبير الجينات لعملية تطبيع الجسم؛ تم رسم اختلافات التعبير بين حالات DN والأشخاص الأصحاء باستخدام مجموعات أدوات ggplot2 وggsignif الخاصة ب R.

الالتحام الجزيئي

التشكيلات ثلاثية الأبعاد لبروتينات هدف المحور (CASP1، معرف PDB: 3E4C؛ CCL2، معرف PDB: 7S00) تم الحصول عليها من بنك بيانات البروتين. تم الحصول على تشكيلات ثلاثية الأبعاد للمركبات الحيوية النشطة عبر PubChem. تم اختيار حمض الأورسوليك، وحمض 3β-hydroxyurs-12-en-28-oic، والكويرسيتين للالتحام لأن علم الأدوية الشبكي توقع تفاعلات بين هذه المركبات النشطة والأهداف الأساسية CCL2 أو CASP1. تمت معالجة البروتينات مسبقا عن طريق إزالة الروابط الأصلية وجزيئات الماء، وإدخال الهيدروجينات القطبية، ثم خضوعها للالتحام الجزيئي باستخدام أوتودوك فينا. تمثل الألفة الربطية، الممثلة بدرجة الالتحام (بالكيلو كالوري/مول)، تخدم لتقييم قوة التفاعلات. تم تعيين عتبة طاقة ارتباط −5.0 كيلو كالوري/مول لتعريف تفاعلات بين جزيئية مستقرة. تم تصور التكوينات المتعثرة باستخدام PyMOL.

الحيوانات وتصميم التجارب

استخدمت الدراسة الحالية 30 فأرا ذكرا يبلغ من العمر 8 أسابيع من نوع DB/db من درجة خالية من مسببات الأمراض (SPF)، إلى جانب 10 فئران ذكور متطابقة الأعمار مع SPF db/m . تم تربية جميع الفئران التجريبية في منشأة بدرجة SPF تحت فترة ضوئية فاتحة وظلامية مدتها 12 ساعة وحافظت عليها في ظروف مستقرة: 22 ± 2 درجة مئوية، رطوبة نسبية 50–70٪، ووصول غير مقيد إلى الطعام ومياه الشرب العادية. تم منح الموافقة الأخلاقية لجميع بروتوكولات التجارب في الجسم الحي من قبل لجنة أخلاقيات الحيوانات بجامعة أنهوي للطب الصيني (رقم الموافقة: AHUCM-mouse-2023059).

خضعت القوارض لمرحلة تكيف لمدة 7 أيام قبل التجميع العشوائي (6 حيوانات لكل منها) و8 أسابيع من التدخل اليومي. تم قياس مستوى السكر في الدم الصائم في جميع الحيوانات التجريبية؛ تم تخصيص الحيوانات باستخدام جدول أرقام عشوائي، وأجريت قياس الأنسجة وIHC وقياس النقطة الغربية تحت تقييم أعمى.

مجموعة التحكم الطبيعية (CTL): فئران دفق/ميليين تتلقى محلول ملحي عن طريق التمقم الفموي.

مجموعة النموذج (M): فئران db/db تتلقى محلول ملحي عن طريق التجويز الفموي.

مجموعة DJC-الجرعة المتوسطة (DJC-M): فئران db/db تتلقى DJC بجرعة 0.78 جم/كجم (ما يعادل الجرعة اليومية السريرية للبالغين).

مجموعة DJC-الجرعة العالية (DJC-H): فئران تتلقى DJC بجرعة 1.56 جرام/كجم (ضعف الجرعة اليومية للبالغين).

تحضير الجرعات

تم اشتقاق مقياس الجرعة من الإنسان إلى الفأر باستخدام نهج تطبيع مساحة سطح الجسم، كما هو موضح في منهجية التجارب الدوائية، بمعامل تحويل 9.1. كانت الجرعة اليومية السريرية من DJC 6 جرام لبالغ يزن 70 كجم (0.0857 جم/كغ)، مما أعطى جرعات مكافئة للفئران بلغت 0.78 جرام/كغ (جرعة سريرية بمقدار ضعف واحد) و1.56 جرام/كغ (جرعة سريرية بمقدار مرتين). جميع الفئران تلقت إعطاء الدواء داخل المعدة بحجم ثابت 10 مل/كجم. تم وزن مسحوق DJC بدقة وتعليق في محلول CMC-Na بنسبة 0.5٪ لتكوين تعليقات منتظمة بجرعة 78 ملغ/مل (جرعة متوسطة) و156 ملغ/مل (جرعة عالية).

بعد 8 أسابيع من الإعطاء اليومي، تم تحفيز التخدير في جميع الفئران التجريبية باستخدام بنتوباربيتال الصوديوم بنسبة 1٪. تم جمع عينات الدم عبر الشريان الأبهر البطني وتم طردها لعزل المواد الفائقة لإجراء اختبارات كيميائية حيوية على أساس كيت. تم استخدام أقفاص أيضية لجمع عينات بول الفئران. تم تثبيت الأنسجة الكلوية الجزئية في بارافورمالديهايد بنسبة 4٪ لصبغ الهيماتوكسيلين-إيوزين (HE) وماسون. تم تجميد القطع في النيتروجين السائل، وتم الحفاظ على أنسجة الكلى المتبقية عند درجة حرارة −80 درجة مئوية للاختبارات التحليلية اللاحقة.

التحليل النسيجي

بعد التثبيت على 4٪ بارافورمالديهايد، خضعت أنسجة الكلى لتجفيف الإيثانول بدرجات متدرجة، وتنظيف الجسم، ودمج البارافين، وتقسيم تسلسلي بطول 4 ميكرومتر لتلوين HE وماسون الثلاثي اللون اللاحق. تم إجراء صبغ HE وفقا للإجراءات القياسية (إزالة البارافين، إعادة الترطيب، تلوين الهيماتوكسيلين النواوي، تمايز الإيثانول المحمض والتلوين، التلوين المضاد بالإيوزين، التجفيف، التنظيف، وتركيب البلسم المحايد) لملاحظة التغيرات النسيجة الكلوية. تم غمر الأقسام في صبغة الهيماتوكسيلين لمدة 3 دقائق، تلتها تلوين مضاد الإيوزين لمدة 15 ثانية. في تلوين ماسون الثلاثي الألوان، خضعت الأقسام لإزالة البارافين، وإعادة الترطيب، والتلوين المتسلسل، والتمايز، وفصل لون حمض الخليك، تلاها الجفاف، والتصفيف، والتركيب لتقييم تراكم الكولاجين الكلوي والتغيرات الليفية. تم استخدام المجهر الساطع لفحص وتصوير جميع أقسام الأنسجة الملونة بتكبير 200×. تم تسجيل المقاطع الملونة بHE باستخدام مؤشر التصلب الكبيبي (GSI). في تلوين ماسون الثلاثي الألوان، تم تطبيق إعداد ماسون ثلاثي الألوان لعزل قناة الكولاجين الزرقاء، وتم حساب نسبة مساحة الكولاجين إلى منطقة الأنسجة المصبوغة باللون الأحمر.

الكيمياء المناعية (IHC)

بعد تثبيت لمدة 24 ساعة مع 4٪ بارافورمالديهيد، تم تجفيف عينات الأنسجة عبر تدرجات الإيثانول المتسلسلة، ثم تم تضمينها بالبارافين وقطعها إلى مقاطع متتالية بحجم 5 ميكرومتر. بعد إزالة البارافينية، خضعت الأقسام لسحب المستضدات وحجب البيروكسيداز الداخلي. بعد الحصر، تم حضن شرائح الأنسجة بأجسام مضادة أولية مخففة عند 4 درجات مئوية خلال الليل في غرفة رطبة. تلقت الشرائح حضانة ثانوية للأجسام المضادة في درجة حرارة الغرفة بعد غسيل PBS، تلتها تفاعل كروموجيني DAB حتى يتم تحقيق شدة التلوين المثلى. ثم خضعت الأقسام لعملية التلوين المضادة للهيماتوكسيلين المتسلسلة، والتمايز، والتلوين، والتجفيف، والتنظيف، وتركيب الغطاء الانزلاقي، والتصوير المجهري بمجال ساطع. تم استرجاع المستضدات عن طريق التداخل الذاتي لمدة 10 دقائق، تليها تبريد طبيعي إلى درجة حرارة الغرفة. بعد الحجب بمصل ماعز بنسبة 5٪ لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تم حضان الأقسام بالجسم المضاد الأولي (تخفيف 1:200) ثم بجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب من نوع IgG مضاد لفيروس نقص الرشد الماعز (تخفيف 1:300) لمدة 60 دقيقة لكل منها في درجة حرارة الغرفة. تم إجراء تفاعل الكروموجين DAB لمدة 3–5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وتمت مراقبته مجهريا، وانتهى بالشطف بالماء المقطر. تم التقاط الصور بتكبير ×200، وتم قياس نسبة مساحة التلوين الإيجابية باستخدام ImageJ.

كشف ELISA

كانت خطوات الفحص تتوافق مع البروتوكولات الرسمية التي يوفرها بائعو المجموعات. تم إعداد معايير العزل والتخفيف التسلسلي مسبقا. كانت الآبار الفارغة والقياسية والعينة تحمل بالكواشف وتحتضنها في الظلام. تم غسل الألواح جيدا بعد الحضانة، ثم حضنتها مع الإنزيم المرافق في الظلام. بعد الغسيل، أضيف ركيزة كروموجينية لتفاعل لوني محمي بالضوء، ينتهي بمخزن التوقف بمجرد ظهور تدرجات زرقاء مميزة في الآبار القياسية. تم قياس امتصاص كل بئر عند الطول الموجي المستهدف باستخدام قارئ ميكرولوح. تم قياس تركيزات IL-1β وIL-18 في المصل باستخدام منحنيات معايرة مولدة من قيم OD للتركيزات القياسية (عينات مصل غير مخففة؛ الامتصاص المقاس عند 450 نانومتر؛ ثمانية آبار تقنية مكررة لكل عينة). تم قياس الكرياتينين البولي وبروتين بولي بسعة 24 ساعة في عينات بول غير مخففة تم جمعها باستخدام أقفاص أيضية مدتها 24 ساعة (قراءة الامتصاص عند 546 نانومتر؛ ثماني نسخ تقنية لكل عينة).

PCR الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)

تم عزل الحمض النووي الريبي الكلي من أنسجة الكلى، وتم تحديد نقاءه وتركيزه بواسطة القياس الطيفي الضوئي. تم نسخ الحمض النووي الريبي المنقى عكسيا لتوليد قوالب cDNA. تم إجراء RT-qPCR على جهاز PCR في الوقت الحقيقي مع برنامج الدورة الحرارية التالي: 5 دقائق قبل الإزالة (95 درجة مئوية)، تليها 40 جولة تضخيم: 15 ثانية عند 95 درجة مئوية، دقيقة واحدة عند 60 درجة مئوية. تم إجراء RT-qPCR في تفاعل بسعة 10 ميكرولتر يحتوي على 5 ميكرولتر من خليط SYBR Green Master، و0.2 ميكرولتر من الأساس الأمامي، و0.2 ميكرولتر من الأساس العكسي. 1 ميكرولتر من قالب cDNA، و3.6 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase. تم إجراء النسخ العكسي لتخليق cDNA بحجم تفاعل إجمالي قدره 20 ميكرولتر. وأجري تحليل منحنى الانصهار لتأكيد خصوصية التضخيم، وتم اختبار كل عينة في ثلاث نسخ تقنية. تم تقييم مستويات النسخ بواسطة تطبيع 2⁻ΔΔCq إلى β-أكتين، مع إدراج جميع تسلسلات البرايمر في الجدول 1.

تحليل البقع الغربية

تم جمع حوالي 40 ملغ من عينات أنسجة الكلى من كل مجموعة فئران، وتم تفريمها على الثلج، وتجانسها بالكامل في محلول تحلل البروتين. بعد دوران لمدة 15 دقيقة عند 12,000 دورة في الدقيقة عند 4 درجات مئوية، تم جمع الفائض الكلي المحتوي على البروتين من التجانسات الأنسجة، وجمعه، وحفظه بالتجميد عند −80 درجة مئوية. تم خلط المادة الفائقة للبروتين مع مخزن التحميل وتم تزييعها عن طريق الغليان في حمام ماء. تم تحميل حوالي 10 ميكرولتر من عينة البروتين الطبيعية في كل مسار وفصلها على جل SDS-بولي أكريلاميد بنسبة 10٪. تم نقل البروتينات المستهدفة إلى مرشحات النيتروسيلولوز عبر الانقسام الكهربائي الرطب. تم إجراء النقل بتيار ثابت قدره 400 مللي أمبير في حمام جليدي لمدة 30–45 دقيقة. بعد النقل، تم حضنة البقع في حليب بارد خالي من الدسم لمدة ساعتين، ثم حضنتها طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية مع 1:1,000 أجسام مضادة أولية. تم تغطية البقع المغسولة بأجسام مضادة ثانوية مطابقة (1:10,000) عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين، وتم تسجيل وقياس إشارات النطاق المضيء من صور البقع باستخدام برنامج ImageJ. بالنسبة ل GSDMD-N، استخدم توبولين كتحكم في التحميل لأن وزنه الجزيئي المتوقع (~35 كيلو دالتون) يتداخل مع وزن GAPDH (~36 كيلو دالتون). أجريت جميع تجارب البلوت الغربية مع ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة.

التحليل الإحصائي

تعرض البيانات الكمية كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم تحليل الفروق بين مجموعتين باستخدام اختبار t للطالب غير المرتبط، بينما تم تقييم المقارنات بين مجموعات متعددة من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) تلاه اختبار ما بعد الوقوع لتوكي. تم اعتبار قيمة p < 0.05 ذات دلالة إحصائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تحديد المكون النشط الحيوي والأهداف في DJC

تم تحديد ما مجموعه 66 مركبا نشطا بيولوجيا استوفى معايير الفحص (OB ≥ 30٪ وDL ≥ 0.18) من بين الأعشاب الستة التي تشكل DJC. شملت هذه 26 مركبا من Pseudostellaria heterophylla، و6 من Paeonia suffruticosa، و8 من Cuscuta chinensis، و6 من Alisma orientale، و10 من Rehmannia glutinosa، و10 من Whitmania pigra. أدى توحيد ملصقات الأهداف وإزالة التكرار إلى 599 هدف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لا يزال DN سببا رئيسيا ل ESRD، ويتميز بوجود ممرض معقد ومتعدد العوامل لم يفهم بالكاملبعد 20,21. على الرغم من أن DJC أظهر فعالية سريرية واعدة في تحسين DN، إلا أن الآليات الجزيئية الأساسية ظلت إلى حد كبير بعيدة المنال22. في هذه الدراسة، استخدمنا مخططا تحليليا متعدد الأوميكس يدمج علم الأدوية الشبكي، وأدوات التعلم الآلي، واختبارات محاكاة الربط، والتحقق في الجسم الحي، لاستكشاف الإجراءات الدوائية ل DJC. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مشاريع البحث الرئيسية لجامعات مقاطعة أنهوي (المنحة رقم 2024AH050968).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Creatinine (CRE) Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC011-2-1
ECLBiosharpBL520B
Eosin Staining KitServicebioG1002
Goat anti-rabbit IgG-HRP ConjugateAbbkineA21020
Hematoxylin Staining KitServicebioG1004
Masson's Trichrome Stain KitServicebioG1006
Mouse IL-1β ELISA KitMeiMianMM-0040M1
Mouse IL-18 ELISA KitMeiMianMM-0169M1
Rabbit anti-mouse Caspase1 AntibodyAffinityAF5418
Rabbit anti-mouse CCL2 AntibodyAbcamab315478
Rabbit anti-mouse cleaved-Caspase-1 AntibodyAffinityAF4005
Rabbit anti-mouse GAPDH AntibodyZenbioR380626
Rabbit anti-mouse GSDMD-N AntibodyAbcamab219800
Rabbit anti-mouse NLRP3 AntibodyAbcamab263899
Rabbit anti-mouse Tubulin AntibodyAffinityAF7011
Reverse Transcription KitBiosharpBL696A
RIPA Lysis BufferBeyotime BiotechnologyP0013
RIPA Lysis BufferLeagenePS0013
RNA isolation reagentServicebioG3013-100ML
SYBR Green Master MixServicebioG3326-05
Urinary Protein Quantification KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteC035-2-1
software nameversion
AutoDock Vina1.2.3
Cytoscape software3.10.0
GraphPad Prism9.0
ImageJjava 1.8.0_345
PyMOL2.5
R software4.2.0

المراجع

  1. Demir S, Nawroth PP, Herzig S, Ekim Üstünel B. Emerging targets in type 2 diabetes and diabetic complications. Adv Sci (Weinh). 2021;8(18):e2100275.
  2. Zimmet PZ, Magliano DJ, Herman WH, Shaw JE. Diabetes: a 21st century challenge. Lancet Diabetes Endocrinol. 2014;2(1):56-64.
  3. Liu M, et al. Loss of glomerular aldolase B in diabetic nephropathy promotes renal fibrosis via activating Akt/GSK-3β/β-catenin axis. J Adv Res. 2025;76:207-18.
  4. Wang L, et al. Puerarin reduces diabetic nephropathy-induced podocyte pyroptosis by modulating the SIRT1/NLRP3/caspase-1 pathway. Mol Cell Endocrinol. 2025;595:112409.
  5. Wang Y, et al. C-reactive protein promotes diabetic kidney disease via Smad3-mediated NLRP3 inflammasome activation. Mol Ther. 2025;33(1):263-78.
  6. Liu Y, et al. Role of MCP-1 as an inflammatory biomarker in nephropathy. Front Immunol. 2024;14:1303076.
  7. Bai Z, Huang X, Nie S. Kidney function-related protection of polysaccharides from red kidney bean and small black soybean via urine metabolomics in type 2 diabetic rats. Carbohydr Polym. 2025;355:123311.
  8. Xuan C, et al. Isoquercitrin alleviates diabetic nephropathy by inhibiting STAT3 phosphorylation and dimerization. Adv Sci (Weinh). 2025;12(25):e2414587.
  9. Hu Q, et al. Diabetic nephropathy: focusing on pathological signals, clinical treatment, and dietary regulation. Biomed Pharmacother. 2023;159:114252.
  10. Wu YJ, et al. Danzhi Jiangtang Capsule mediates NIT-1 insulinoma cell proliferation and apoptosis by GLP-1/Akt signaling pathway. Evid Based Complement Alternat Med. 2019;2019:5356825.
  11. Sun M, et al. Danzhi Jiangtang Capsule ameliorates kidney injury via inhibition of the JAK-STAT signaling pathway and increased antioxidant capacity in STZ-induced diabetic nephropathy rats. Biosci Trends. 2018;12(6):595-604.
  12. Fang Z, et al. Radix pseudostellariae of Danzhi Jiangtang capsule relieves oxidative stress of vascular endothelium in diabetic macroangiopathy. Saudi Pharm J. 2020;28(6):683-91.
  13. Xie J, et al. Danzhi Jiangtang capsule reduces renal injury in rats with diabetes induced by high fat diet and streptozotocin via downregulating toll-like receptor 4-nuclear factor-κB pathway and apoptosis. J Tradit Chin Med. 2023;43(2):312-21.
  14. Fang Z, et al. The effects of Danzhi Jiangtang capsule on clinical indices and vascular endothelial function in patients with impaired glucose tolerance of Qi-Yin deficiency type. Ann Med. 2023;55(2):2291185.
  15. Li X, et al. Network pharmacology prediction and molecular docking-based strategy to explore the potential mechanism of Huanglian Jiedu Decoction against sepsis. Comput Biol Med. 2022;144:105389.
  16. Zhao L, et al. Network pharmacology, a promising approach to reveal the pharmacology mechanism of Chinese medicine formula. J Ethnopharmacol. 2023;309:116306.
  17. Li X, et al. Network pharmacology approaches for research of traditional Chinese medicines. Chin J Nat Med. 2023;21(5):323-32.
  18. Zhao N, et al. Integrated chemical composition, transcriptomics, and network pharmacology to reveal the mechanism of Jia-Wei-Si-Miao-Yong-An Decoction in ACS model rats. Phytomedicine. 2025;145:157027.
  19. Wu J, et al. Use of molecular dynamics simulations to study how plant biomolecules help improve environmental health. Sci Total Environ. 2023;869:161871.
  20. Abhirami BL, Krishna AA, Kumaran A, Chiu CH. Targeting NF-κB in diabetic nephropathy: exploring the therapeutic potential of phytoconstituents. Arch Pharm Res. 2025;48(7-8):577-637.
  21. Joumaa JP, et al. Mechanisms, biomarkers, and treatment approaches for diabetic kidney disease: current insights and future perspectives. J Clin Med. 2025;14(3):727.
  22. Shi H, et al. In vivo and in vitro studies of Danzhi Jiangtang capsules against diabetic cardiomyopathy via TLR4/MyD88/NF-κB signaling pathway. Saudi Pharm J. 2021;29(12):1432-40.
  23. Deng Y, et al. Mechanism exploration of Wenshen Jianpi Decoction on renoprotection in diabetic nephropathy via transcriptomics and metabolomics. Phytomedicine. 2025;139:156446.
  24. Li J, et al. Mechanistic investigation of astragalus root in the management of T2DM-NAFLD comorbidity: an integrated network pharmacology, molecular docking, molecular dynamics simulation, and in vitro study. Pharmaceuticals (Basel). 2026;19(2):289.
  25. Li X, et al. Integrating network pharmacology, bioinformatics, and experimental validation to unveil the molecular targets and mechanisms of galangin for treating hepatocellular carcinoma. BMC Complement Med Ther. 2024;24(1):208.
  26. Zhao L, et al. Inflammation in diabetes complications: molecular mechanisms and therapeutic interventions. MedComm (2020). 2024;5(4):e516.
  27. Shen J, et al. Different types of cell death in diabetic endothelial dysfunction. Biomed Pharmacother. 2023;168:115802.
  28. Li J, et al. Investigating the effects and potential mechanisms of astragalus root against diabetic nephropathy based on bioinformatics analysis and in vitro validation. Int J Mol Sci. 2026;27(10):4641.
  29. Tang L, et al. ATP6AP1 drives pyroptosis-mediated immune evasion in hepatocellular carcinoma: a machine learning-guided therapeutic target. Discov Oncol. 2025;16(1):616.
  30. Wu Y, Ma Y. CCL2-CCR2 signaling axis in obesity and metabolic diseases. J Cell Physiol. 2024;239:e31192.
  31. Song Z, et al. The novel potential therapeutic target PSMP/MSMP promotes acute kidney injury via CCR2. Mol Ther. 2024;32(7):2248-63.
  32. Yang Y, et al. CCL2-CCR2 axis in cardiovascular disease: research advances and challenges. Sci Bull (Beijing). 2025;70(6):820-4.
  33. Pozzi S, Satchi-Fainaro R. The role of CCL2/CCR2 axis in cancer and inflammation: the next frontier in nanomedicine. Adv Drug Deliv Rev. 2024;209:115318.
  34. Torices S, et al. Targeting the CCL2/CCR2 axis in HIV-1 infection and ischemic stroke. Stroke. 2026;57(2):538-48.
  35. Scurt FG, et al. Monocyte chemoattractant protein-1 predicts the development of diabetic nephropathy. Diabetes Metab Res Rev. 2022;38(2):e3497.
  36. Xu J, et al. (5R)-5-hydroxytriptolide ameliorates diabetic kidney damage by inhibiting macrophage infiltration and its cross-talk with renal resident cells. Int Immunopharmacol. 2024;126:111253.
  37. Wang X, et al. Discovery of the pharmacodynamic material basis of Danggui Buxue Decoction in the treatment of diabetic kidney disease based on lipidomics regulation. Phytomedicine. 2025;141:156643.
  38. Fu J, Wu H. Structural mechanisms of NLRP3 inflammasome assembly and activation. Annu Rev Immunol. 2023;41:301-16.
  39. Makoni NJ, Nichols MR. The intricate biophysical puzzle of caspase-1 activation. Arch Biochem Biophys. 2021;699:108753.
  40. Shi Y, et al. Inhibition of caspase-1 suppresses GSDMD-mediated peritoneal mesothelial cell pyroptosis and inflammation in peritoneal fibrosis. Small. 2025;21:e2409362.
  41. Broz P. Pyroptosis: molecular mechanisms and roles in disease. Cell Res. 2025;35(5):334-44.
  42. Zhang G, et al. Emodin influences pyroptosis-related caspase 1-GSDMD axis alleviated cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Sci Rep. 2025;15(1):19397.
  43. Ouyang PW, et al. Procyanidin B2 attenuates microvascular dysfunction in diabetic retinopathy via inhibition of caspase-1/GSDMD-mediated pyroptosis. J Ethnopharmacol. 2025;344:119528.
  44. Chen J, et al. Chlorogenic acid attenuates deoxynivalenol-induced apoptosis and pyroptosis in human keratinocytes via activating Nrf2/HO-1 and inhibiting NLRP3/GSDMD pathway. Food Chem Toxicol. 2024;186:113578.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

233 233 CCL2 CCR2

مقالات ذات صلة