مقالة بحثية

توصيف جزيئي وجينوم ممثل لجينات الضراوة في المكورات العنقودية الذهبية الناتجة عن عدوى القدم السكري

DOI:

10.3791/71373

⸱

مايو 29, 2026

 ,  , 
1Department of Microbiology, College of Medicine, University of Anbar, 2Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Pharmacy, University of Anbar

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفت هذه الدراسة آليات مقاومة مضادات الميكروبات، ومحددات الضراوة، والخصائص الجينومية لعزلات المكورات العنقودية الذهبية التي تم تعافيها من عدوى القدم السكري باستخدام اختبار الحساسية المضادة للميكروبات، والتحليل القائم على التفاعل البوليمسي عن البوليمير، وتسلسل الجينوم الكامل.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل التهابات القدم السكري (DFIs) مصدر قلق صحي عام، وتعد المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA) من بين أكثر مسببات الأمراض أهمية سريريا. بحثت هذه الدراسة في انتشار جينات الضراوة (CAN و HGL)، وملفات مقاومة مضادات الميكروبات، والخصائص الجينومية الممثلة لعزلات S. aureus المقاومة للأدوية المتعددة التي تم استعادتها من مرضى DFIs. أجريت دراسة رصدية مقطعية على 125 مريضا يعانون من التهابات القدم السكري بين يناير وديسمبر 2024. تم إجراء اختبار قابلية الإصابة بمضادات الميكروبات باستخدام طريقة انتشار قرص كيربي–باور وفحص السيفوكسيتين وفقا لإرشادات معهد المعايير السريرية والمخبرية (CLSI)، حيث استخدم S. aureus ATCC 25923 كسلالة لمراقبة الجودة. تم تأكيد قابلية الفانكومايسين من خلال اختبار التركيز المثبط الأدنى (MIC). تم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للكشف عن جينات الضراوة (CAN و HGL) وجينات مجموعة blaOXA I. تم إجراء تسلسل الجينوم الكامل (WGS) على عزلتين ممثلتين، بما في ذلك عزل مقاوم للأدوية متعددة (MDR) وعزل مقاوم للأدوية بشكل واسع النطاق (XDR)، باستخدام نهج تسلسل جديد لإنشاء تجميعات جينوم مسودة. من بين 125 عينة سريرية، لوحظ نمو بكتيريا في 90 عينة (72٪)، منها 45 عزلة (50٪) تم تحديدها على أنها S. aureus. من بين هذه العزلات، تم تصنيف 35 من 45 (77.78٪) كMRSA، و36 من 45 (80٪) كانوا مقاومين لعدة أدوية. تم اكتشاف جين HRG في جميع العزلات، بينما تم تحديد جين ال can في 13 من أصل 45 (28.89٪) من العزلات. لم يتم اكتشاف جينات من مجموعة blaOXA الأولى. حدد التحليل الجينومي عدة جينات مرتبطة بالمقاومة، بما في ذلك blaZ، tet(38)، norA، وvanT، إلى جانب عناصر CRISPR-Cas ومحددات مقاومة مرتبطة بالبلازميد. تسلط هذه النتائج الضوء على الانتشار العالي لالتهاب المندوبؤوس الذهبي المقاوم للأدوية المتعددة في المؤشرات المقاومة السريعة وتدعم أهمية المراقبة الجينومية المستمرة للسلالات المقاومة ذات الصلة سريريا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تجعل العديد من خصائص الاستعمار والضراوة البكتيريا الموجبة للجرام المكونة المكورات العنقودية الذهبية (S. aureus) ممرضة انتهازية شائعة قادرة على التسبب في مجموعة واسعة من العدوى، بما في ذلك القوباء، والتهابات الجروح، والخراجات الجلدية، وبكتيريميا، والتهاب الشغاف المعدي1. بعض هذه العدوى قد تتطور إلى مرض شديد وتتطلب دخول المستشفى، خاصة لدى مرضى السكري المطلق، أو تثبيط المناعة، أو الأورام الخبيثة، أو القسطرة البولية، أو عدوى فيروس نقص المناعة البشرية1.

ترتبط سلالات S. aureus المقاومة للميثيسيلين (MRSA) بمعدلات مراضة ووفيات كبيرة بسبب قدرتها على اكتساب محددات مقاومة مضادات الميكروبات بسرعة والبقاء في بيئات الرعاية الصحية1. غالبا ما يصاب مرضى السكري بقرحة القدم السكرية بسبب الاعتلال العصبي، وقصور الأوعية الدموية، وضعف الاستجابات المناعية2. عدوى القدم السكري (DFIs) لها فيزيولوجيا مرضية معقدة، وتتأثر النتائج السريرية بعوامل ميكروبية ومرتبطة بالمضيف، بما في ذلك الضراوة البكتيرية3. على الرغم من أن تقرحات القدم السكري قد تحتوي على مجتمعات متعددة الميكروبات تتكون من بكتيريا وفطريات هوائية ولاهوائية، إلا أن S. aureus لا تزال واحدة من مسببات الأمراض السائدة المعزولة من هذه العدوى4. يمتلك الكائن الحي عدة محددات للضراوة تسهل تفادي المناعة، وغزو الأنسجة، والاستعمار المزمن، والعدوى المستمرة. علاوة على ذلك، فإن اكتساب مقاومة الميثيسيلين المبوساة بواسطة mecA/SCCmec وغيرها من محددات مقاومة المضادات الحيوية قد حد بشكل كبير الخيارات العلاجية للعدوى المرتبطة ب DFI 4,5. أفادت دراسات سابقة عن انتشار عال لعزلات S. aureus المقاومة للأدوية المتعددة (MDR) في عدوى القدم السكري، مع ارتبط المقاومة غالبا بجينات β-لاكتاماز، بما في ذلك متغيرات blaTEM، blaOXA، ومتحورات BLACTX-M 6.

تساهم عدة جينات مرتبطة بالضراوة في ممرضية واستمرارية S. aureus في التهابات الجروح المزمنة. من بين هذه العوامل، يرمز جين HGL γ-هيموليزين، وهو عامل سام للخلية مرتبط بتدمير الأنسجة، والالتهاب، والتهرب المناعي، واستمرار سلالات MRSA المكتسبة من المجتمع7،8. يشفر جين العلبة مادة لتصق بالكولاجين تسهل التصاق البكتيريا بأنسجة غنية بالكولاجين ويساهم في الاستعمار المزمن واستمرار العدوى8. أظهرت الدراسات السابقة انتشار مرتفع لجرعة HG بين عزلات MRSA التي تم التعايد من عدوى القدم السكري، مما يؤكد على التزامن بين محددات الضراوة ومقاومة الميكروبات في هذه العدوى. تساهم التعرض غير المناسب للمضادات الحيوية، وطول فترة الاستشفاء، وضعف اختراق الأنسجة للعوامل المضادة للميكروبات، وتطور الجروح المزمن في ظهور وانتشار كائنات MDR لدى مرضى DFIs10. وفقا للتعريفات الدولية، تظهر البكتيريا المقاومة للأدوية المتعددة (MDR) مقاومة لعامل مضاد ميكروبي واحد على الأقل في ثلاث فئات أو أكثر، وتظل البكتيريا المقاومة للأدوية (XDR) معرضة لفئة أو فئتين فقط من المضادات الحيوية، وبكتيريا مقاومة الباندوغ (PDR) مقاومةلجميع الفئات العاشرة التي تم اختبارها. على الرغم من الأهمية السريرية المعترف بها ل S. aureus في عدوى القدم السكري، لا تزال هناك معلومات جزيئية وجينومية متكاملة محدودة تربط محددات الضراوة بملفات مقاومة مضادات الميكروبات في العزلات السريرية من هذه المنطقة.

لذلك، هدفت هذه الدراسة إلى توصيف أنماط مقاومة مضادات الميكروبات، وتحديد انتشار جينات الضراوة المختارة (HGL و CAN)، والتحقيق في وجود جينات مجموعة OXA من المجموعة الأولى من BLA، وإجراء تحليل تسلسل جينوم كامل تمثيلي لعزلات S. aureus المقاومة متعددة الأدوية التي تم استعادتها من مرضى مرضى القدم المصابين بالسكري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. المرضى الذين يدرسون

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الموافقة الأخلاقية في جامعة الأنبار، وزارة التعليم العالي والبحث العلمي، العراق (الموافقة رقم 145)، مدينة الرمادي، محافظة الأنبار، العراق، في 24 ديسمبر 2023. تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل المشاركين البشريين وفقا للإرشادات الأخلاقية المؤسسية لجامعة الأنبار. تم الحصول على موافقة مكتوبة ومستنيرة من جميع المشاركين قبل التسجيل.

أجريت دراسة رصدية مقطعية من يناير إلى ديسمبر 2024 في مستشفيات الرمادي التعليمية والعيادات الخاصة التابعة لها في محافظة الأنبار، العراق. تم تسجيل ما مجموعه 125 مريضا مؤهلا متتاليا مصابين بعدوى القدم السكري (DFIs) خلال فترة الدراسة. تم تحديد حجم العينة بناء على عدد المرضى المؤهلين المتاحين خلال فترة الدراسة وليس بناء على حسابات إحصائية. سريريا، تم تعريف DFI بأنه وجود قرحة قدم من أي درجة لدى مرضى السكري من النوع الأول (T1DM) أو السكري من النوع الثاني (T2DM). تم تضمين المرضى الذكور والإناث الذين لديهم شدة قرحة متفاوتة.

كان المرضى مؤهلين إذا كان لديهم قرحة قدم سكرية تم تشخيصها سريريا، وحضروا المرافق الصحية المشاركة، وقدموا موافقتهم الواعية. شملت معايير الاستبعاد تقرحات القدم غير المرتبطة بداء السكري (مثل القرحات الرضحية)، والإحالة من مرافق صحية أخرى، وعدم القدرة على تقديم الموافقة المستنيرة بسبب مرض خطير، وتلقي علاج مضاد حيوي خلال 48 ساعة قبل جمع العينة، والعدوى متعددة الميكروبات. تم استبعاد المرضى المصابين بعدوى متعددة الميكروبات لضمان التوصيف الدقيق لعزل المكورات العنقودية الذهبية الجزيئية والجينومية. تم جمع البيانات الديموغرافية والسريرية، بما في ذلك العمر والجنس ومضاعفات السكري، ومدة مرض السكري، وتاريخ المضادات الحيوية، والحالات المصاحبة، باستخدام استبيان منظم.

تم نقل العينات السريرية إلى مختبر علم الأحياء الدقيقة خلال ساعتين من الجمع تحت ظروف مبردة (4 درجات مئوية) باستخدام مسحات نقل معقمة تحتوي على وسط آميز وتمت معالجتها فورا للتحليل الميكروبيولوجي. تم إجراء جميع الإجراءات التي تشمل العينات السريرية، والزراعة البكتيرية، واختبار الحساسية المضادة للميكروبات، وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، والتصوير بالأشعة فوق البنفسجية (UV) تحت ظروف مختبرية من مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL-2) وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية. استخدم موظفو المختبر معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، بما في ذلك معاطف المختبر، والقفازات ذات الاستخدام الواحد، والأقنعة الجراحية، وحماية العين عند الحاجة. تم اتباع إجراءات معقمة صارمة في جميع الإجراءات الميكروبيولوجية والجزيئية لتقليل مخاطر التلوث والتعرض. تم استخدام مناطق عمل مخصصة لمعالجة الزراعة البكتيرية وإجراءات تضخيم الحمض النووي لمنع التلوث المتبادل. تم تعقيم المواد الملوثة، بما في ذلك ألواح الزراعة، والممسحات، ورؤوس الماصات، والمواد القابلة للتخلص منها، عند 121 درجة مئوية و15 psi لمدة 15–20 دقيقة قبل التخلص منها. تم التخلص من القطع الحادة في حاويات مخصصة للخطر البيولوجي المقاوم للثقب. تمت إدارة النفايات البيولوجية وفقا لبروتوكولات التخلص من النفايات الطبية الحيوية المؤسسية. ضمنت هذه الإجراءات السلامة البيولوجية التعامل الآمن مع الكائنات المقاومة للأدوية المتعددة، بما في ذلك MRSA والعزلات المقاومة للفانكومايسين (الشكل 1).

figure-protocol-1
الشكل 1: نظرة عامة على سير العمل السريري، والميكروبيولوجي، والجزيئ، وتسلسل الجينوم الكامل، والمعلوماتية الحيوية المستخدم في الدراسة. يلخص الشكل جمع العينات، والزراعة الميكروبيولوجية، واختبار الحساسية المضادة للميكروبات، والكشف الجزيئي المعتمد على PCR، وتسلسل الجينوم الكامل، والتحليلات المعلوماتية الحيوية في مراحل لاحقة. تم إنشاء هذا الرقم بمساعدة منصة التصميم المبنية على الذكاء الاصطناعي Gamma Pro (تطبيق جاما)، وتمت مراجعته ومراجعته والتحقق منه من قبل المؤلفين من قبل المؤلفين من حيث الدقة العلمية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم تحليل البيانات باستخدام برنامج SPSS الإصدار 22.0. تم حساب الإحصائيات الوصفية، بما في ذلك المتوسطات والنسب المئوية. تم تحليل الارتباطات بين المتغيرات الفئوية باستخدام اختبار كاي تربيع. تم اعتبار قيمة p <0.05 ذات دلالة إحصائية.

2. معالجة وجمع العينات

تم جمع عينات من الجزء الأعمق من تقرحات القدم السكري باستخدام تقنية المسحة العميقة. تم تدوير مسحتين قطنيين معقمين مبللا مسبقا بمرق معقم بقوة فوق قاعدة الجرح بعد إزالة الجرح بمشرط معقم وتنظيفهما بمحلول ملحي معقم لتقليل التلوث الناتج عن الكائنات الدقيقة المستعمرة. تم استخدام مسحة واحدة لتلوين الجرام، بينما استخدمت المسحة الثانية للزراعة الميكروبيولوجية. تم فحص المسحات الملونة مباشرة بالجرام بشكل مجهري.

تم الحصول على عينات من أنسجة العظم من مرضى يشتبه سريريا بالتهاب العظم النخاعي في ظروف عقيمة بعد إزالة الجراحة من الجسم. قبل جمع العينات، كانت أسطح القرحة تنظف بمحلول ملحي عادي معقم لتقليل التلوث السطحي. تم جمع عينات أنسجة العظام بشكل معقم باستخدام أدوات جراحية معقمة ونقلها فورا إلى حاويات معقمة للمعالجة الميكروبيولوجية.

تم توحيد العينات أو تفريمها ناعما تحت ظروف معقمة وتلقيحها على أجار الدم، وأجار الملح مانيتول (MSA)، وأجار ماكونكي، وأجار المغذيات. تم حضن الصفائح هوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 18–24 ساعة. دعم الأجار الدموي والأجار المغذي نمو الكائنات الموجبة والسالبة للجرام، بينما استخدم MSA للعزل الانتقائي والتمايز لأنواع المكورات العنقودية ، بما في ذلك S. aureus. استخدم أجار ماكونكي لاستعادة البكتيريا سالبة الجرام. تم فحص صفائح الزراعة بعد الحضانة، وتم الإبلاغ عن العينات التي لم تظهر نموا ظاهرا بعد 48 ساعة على أنها "لا نمو".

استند التحديد الأولي للبكتيريا إلى شكل المستعمرة، وتلوين الجرام، والخصائص الكيميائية الحيوية، تلاه تأكيد جزيئي ل S. aureus باستخدام تضخيم PCR لجين النواة . شملت التعرف الكيميائي الحيوي اختبار الكاتالاز، واختبارات الانزلاق وأنابيب التخثر، وتخمير المانيتول، واختبار DNase. تم تحديد العزلات المؤكدة باستخدام نظام VITEK 2 Compact مع بطاقة تعريف VITEK 2 GP. تم قبول نتائج التعريف فقط عندما كان مستوى الثقة ≥95٪. تم إعادة اختبار النتائج غير المتنافرة أو منخفضة الثقة باستخدام تحليل كيميائي حيوي متكرر واختبار VITEK المتكرر. تم حفظ العزائل النقية في 20٪ جليسرول تم تحضيره في مرق حقن القلب في الدماغ (BHI) للتحليلات الجزيئية والجينومية اللاحقة (الشكل 1).

3. اختبار الحساسية المضادة للميكروبات

تم إجراء اختبار الحساسية المضادة للميكروبات باستخدام طريقة انتشار الأقراص كيربي–باور وفقا لإرشادات معهد المعايير السريرية والمختبرية (CLSI) لعام 2022. تم إجراء اختبارات على أجار مولر-هينتون بعمق أجار موحد يبلغ 4 ملم. تم تعديل الزراعة البكتيرية الطازجة إلى معيار ماكفارلاند 0.5 باستخدام مقياس كثافة قبل التطعيم. تم استخدام مسحات معقمة لتطعيم أسطح الأجار بشكل متساو.

تم استخدام الأقراص المضادة للميكروبات التالية: الأمبيسيلين (10 ميكروغرام)، جنتاميسين (10 ميكروغرام)، أميكاسين (30 ميكروغرام)، سيفوكسيتين (30 ميكروغرام)، سيفوروكسيم (30 ميكروغرام)، بيبراسيلين/تازوباكتام (100/10 ميكروغرام)، ميروبينيم (10 ميكروغرام)، حمض الأموكسيسيلين–كلافولانيك (30 ميكروغرام)، الأوكساسيلين (1 ميكروغرام)، ليفوفلوكساسين (5 ميكروغرام)، كليندامايسين (2 ميكروغرام)، تيجيسيكلين (15 ميكروغرام)، سيبروفلوكساسين (5 ميكروغرام)، إريثروميسين (15 ميكروغرام)، ترايميثوبريم–سلفاميثوكسازول (25 ميكروغرام)، لينزوليد (30 ميكروغرام)، وفانكومايسين (30 ميكروغرام). تم حضن الألواح هوائيا عند 37 درجة مئوية لمدة 16–18 ساعة. تم تفسير أقطار المناطق وفقا لنقاط انقطاع CLSI.

تم تحديد المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA) باستخدام فحص السيفوكسيتين (30 ميكروغرام) وفقا لتوصيات CLSI. تم إجراء اختبار مراقبة الجودة باستخدام S. aureus ATCC 25923. تم إجراء جميع التجارب بشكل مكرر لضمان قابلية التكرار. تم تصنيف عزلات مقاومة الأدوية متعددة (MDR)، ومقاومة الأدوية بشكل واسع النطاق (XDR)، والعزلات المقاومة للعزيلة (PDR) وفقا لتعريفات معيارية دولية استنادا إلى ملفات مقاومة مضادات الميكروبات (الشكل 1).

4. الكشف عن الثورة الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA)

تم استخدام اختبار انتشار قرص سيفوكسيتين (30 ميكروغرام) كطريقة ظاهرية للكشف عن MRSA. تم تصنيف العزلات ذات مناطق التثبيط ≥22 مم على أنها عجينة طبيعية حساسة للميثيسيلين (MSSA)، بينما تم تصنيف العزلات ذات مناطق التثبيط ≤21 مم كMRSA وفقا لمعايير CLSI (الشكل 1).

5 تحديد مقاومة الفانكومايسين من خلال اختبار التركيز المثبط الأدنى (MIC)

تم تحديد تركيزات الفانكومايسين المثبطة (MICs) باستخدام طريقة تخفيف المرق الدقيقة وفقا لإرشادات CLSIرقم 11. تم تحضير تخفيفات ثنائية متسلسلة من فانكومايسين (4–512 ميكروغرام/مل) في مرق مولر-هينتون. تم تعديل المعلقات البكتيرية إلى معيار ماكفارلاند 0.5 وتخفيفها إلى حوالي 1 × 105 CFU/mL.

بعد الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، تم تعريف MIC بأنه أدنى تركيز لم يلاحظ فيه نمو بكتيريا مرئي. تم تفسير قابلية الفانكومايسين وفقا لمعايير CLSI كما يلي: معرضة (≤2 ميكروغرام/مل)، متوسطة (4–8 ميكروغرام/مل)، ومقاومة (≥16 ميكروغرام/مل)11,12 (الشكل 1).

6. الكشف الجزيئي

6.1 استخراج الحمض النووي

تم زراعة عزلات المكورات العنقودية الذهبية في مرق تسريب القلب في الدماغ لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. تم استخراج الحمض النووي الجيني البكتيري باستخدام مجموعة تجارية ونظام استخراج أحماض نووية آلي. كان الحمض النووي المستخرج يخزن عند −20 درجة مئوية حتى الاستخدام. تم قياس تركيز الحمض النووي باستخدام فلورومتر لتقييم مدى ملاءمة تضخيم PCR. كان متوسط تركيز الحمض النووي 85 ± 8.2 نانوغرام/ميكرولتر.

تم الحصول على بادئات تستهدف جينات can، وhlg، وجينات الفئة D β-لاكتاماز (BLAOXA-group I) واستخدمت في تضخيم PCR كما هو موضح في الجداول 113، 14، 15، 16.

الجدول 1: تسلسلات البادئات المستخدمة في تضخيم PCR للجينات المستهدفة التي تم التحقيق فيها في هذه الدراسة. يلخص الجدول الجينات المستهدفة، وتسلسلات البرايمر، وأحجام الأمبليكونات المتوقعة، ودرجات حرارة التلدين، والمراجع المستخدمة في تضخيم PCR لجينات مجموعة OXA من نوع Nuc، meCA، HGL، CAN، وBLAOXA من المجموعة I في عزلات المكورات العنقودية الذهبية التي تم استعادتها من عدوى القدم السكري. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

6.2 الكشف الجزيئي عن الضراوة وجينات β-لاكتاماز من الفئة D (ولاOXA-group I) بواسطة PCR

تم سرد تسلسلات البادئات المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 1. تم إجراء تضخيم PCR لجينات mecA، النواة، الجينات المرتبطة بالضراوة، وجينات β-لاكتاماز من الفئة D (BLAOXA-group I) في 25 ميكرولتر من خليطات تفاعل تحتوي على 12.5 ميكرولتر GoTaq Green Master Mix (2×)، 0.5 ميكرولتر MgCl2، 3 ميكرولتر من قالب DNA جينومي، 1 ميكرولتر لكل من البرايمر الأمامي والخلفي (10 بيومول/ميكرولتر)، و7 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز.

تكونت ظروف الدورة الحرارية من خطوة إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تليها 30–35 دورة تضخيم تشمل إزالة الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة، والتلدين عند 50–62 درجة مئوية لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة حسب مجموعة البرايمر، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية إلى دقيقة واحدة. تم التمديد النهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 7–19 دقيقة.

تم فصل منتجات PCR المضخمة على جل أغاروز بنسبة 1.5٪–2٪ ملون ب Safe Red وعرضها تحت الإضاءة فوق البنفسجية باستخدام نظام توثيق هلامي. تم تضمين ضوابط سلبية في كل عملية PCR لتأكيد صحة التضخيم.

7. تسلسل الجينوم الكامل (WGS)

تم إجراء تسلسل الجينوم الكامل (WGS) على عزلتين سريريتين ممثلتين من المكورات العنقودية الذهبية تم استردادها من عينات من أنسجة عظمية تم الحصول عليها من مرضى مصابين بعدوى القدم السكري. شملت العزلات المختارة عزلة واحدة مقاومة للأدوية المتعددة (MDR) وعزلة واحدة مقاومة للأدوية بشكل واسع النطاق (XDR)، تم تحديدها من خلال اختبار الحساسية المضادة للميكروبات الظاهري وملفات المقاومة المؤكدة من قبل MIC. مكنت هذه الاستراتيجية من توصيف جينوم تمثيلي للعزلات المقاومة ذات الصلة سريريا (الشكل 1).

تم تقييم جودة وتركيز وسلامة الحمض النووي الجينومي قبل التسلسل لضمان ملاءمة التحضير في المكتبة والتحليل المعلوماتي الحيوي لاحقا. تم قياس الحمض النووي باستخدام فلوروميتر، وتم التحقق من سلامة الحمض النووي بواسطة الرحلان الكهربائي الهلام 1٪ بقوة 150 فولت لمدة 40 دقيقة. تم اختيار حجم شظايا الحمض النووي التي يبلغ طولها حوالي 200–400 قطعة شعر من الظهر باستخدام تنقية الخرزات المغناطيسية، تلاها إصلاح النهاية، وأدينيل 3 أقدام وربط المكيف.

تم توليد جزيئات الحمض النووي الدائرية أحادية السلسلة عن طريق التضخيم والتنقية والتدوير لأجزاء مرتبطة بالمكيف باستخدام أوليغونيوكليوتيدات الجبيرة. تم توليد كرات الحمض النووي النانوية (DNBs) لاحقا من خلال تضخيم الدائرة الدوارة. تم إجراء التسلسل على منصة DNBSEQ باستخدام كيمياء تخليق المجس-المرساة التوافقية (cPAS).

خضعت قراءات التسلسل الخام لإجراءات مراقبة الجودة لإزالة القراءات منخفضة الجودة، وتلوث المحولات، والقراءات الغامضة، والتسلسلات المكررة. تم استخدام القراءات النظيفة في التحليلات اللاحقة. تم إجراء تجميع الجينوم لتقدير حجم الجينوم، ومحتوى GC، وعمق تغطية التسلسل. تم إنشاء مسودات الجينوم النهائية بصيغ تقديم FASTA وGenBank وNCBI.

حدد التعليق الجينومي جينات التسلاسل المشفرة (CDS)، والحمض النووي الريبوزومي (tRNA)، والحمض النووي الريبوزومي (rRNA)، والحمض النووي الريبي الصغير (sRNA). تم إجراء التعليقات الوظيفية للجينات المتوقعة باستخدام قواعد بيانات متعددة، بما في ذلك Swiss-Prot وCOG وKEGG وCAZy وVFDB وARDB وCARD، للجينات المرتبطة بالضراوة والمقاومة للمضادات الحيوية.

8. تحليل المعلوماتية الحيوية

تم إجراء تجميع الجينوم والتعليق باستخدام مركز موارد المعلوماتية الحيوية البكتيرية والفيروساتية (BV-BRC). تم إجراء تحليلات تطورية باستخدام أدوات PATRIC. تم إنشاء خرائط تصوير الجينوم الدائري لتوضيح تسلسلات الترميز، ومحتوى GC، وانحراف GC، ومحددات مقاومة مضادات الميكروبات، والجينات المرتبطة بالضراوة، والعناصر الجينية المتحركة.

تم تحديد العلاقات التطورية باستخدام عائلات البروتينات العالمية من PATRIC (PGFams) التي تم تحديدها من أقرب الجينومات المرجعية باستخدام تحليل Mash/MinHash. تم توليد محاذاة البروتينات باستخدام MUSCLE، وتم رسم محاذاة النيوكليوتيدات المقابلة إلى عائلات البروتين. تم بناء أشجار التطور باستخدام RAxML مع تحليل التمهيد السريع (الشكل 1).

تم تحليل مكونات الجينوم أيضا باستخدام Pathogenwatch لتأكيد أنواع الجينات والكشف عن جينات مقاومة مضادات الميكروبات. تم تحليل الجينات المرتبطة بالضراوة باستخدام ABRicate. استخدمت خدمة تعليق جينوم PATRIC نهجا قائما على k-mer لتحديد جينات مقاومة مضادات الميكروبات وتعيين تعليقات وظيفية، وفئات مضادات الميكروبات، وآليات المقاومة. تم توليد تصورات جينومية دائرية لعزلات MDR التمثيلية وعزلات S. aureus المقاومة للميثيسيلين كما هو موضح سابقافي 17. يلخص الجدول التكميلي 1 جميع أدوات المعلوماتية الحيوية، وإصدارات البرمجيات، وقواعد البيانات، والمعلمات التحليلية المستخدمة في التحليلات الجينومية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

معالجة العينات والإيجابية في الزراعة

تم جمع وتحليل ما مجموعه 125 عينة سريرية في هذه الدراسة. لوحظ نمو بكتيريا في 90 من أصل 125 عينة (72٪). تمت معالجة هذه العينات الإيجابية للزراعة لاحقا للتعرف على البكتيريا واختبار قابلية الإصابة بالمضادات الحيوية. تم استخدام الإحصائيات الوصفية، بما في ذلك التكرارات والنسب المئوية، لتلخيص توزيع العزلات البكتيرية بين جميع العينات السريرية والعينات الإيجابية للزراعة. لم تجرى أي تحليلات إحصائية استدلالية في هذه ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تزداد عدوى القدم السكري (DFIs) الناتجة عن الكائنات الدقيقة المقاومة للأدوية المتعددة (MDR) عالميا، مع ضعف التحكم في المؤشر السكري في الدم وسوء نظافة القدم التي تساهم في زيادة المراضة والوفيات 18,19,20,21. على الرغم من أن المكورات العنقودية الذهبية غالبا ما تكون متعددة الميكروبات، إلا أن المكورات العنقودية الذهبية تظل واحدة من مسببات الأمراض الرئيسية ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه لا توجد لديهم مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية قد تكون أثرت على العمل المبلغ عنه في هذه الدراسة.

مساهمة في المؤلف:

ساهم شيما ح. الكوبيسي في التصور، وتطوير المنهجية، والتحقيق، والتحليل الرسمي، وإعداد مسودة المخطوطة الأصلية. ساهم رؤى أ. حسين في التحقق من صحة والبحث وإعداد مسودة المخطوطة الأصلية. ساهم مشتاق ت. س. العكيلي في التصور، والإشراف، وإدارة المشاريع، والتحقيق، ومراجعة وتحرير المخطوطات.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر المؤلفون باستخدام منصة التصميم المبنية على الذكاء الاصطناعي Gamma Pro (تطبيق غاما) لتوليد الشكل 1. تمت مراجعة وتحرير والتحقق من جميع المحتوى المولد بعناية من قبل المؤلفين لضمان الدقة العلمية والاتساق والنزاهة. لم يتلق المؤلفون أي دعم مالي للبحث أو التأليف أو نشر هذا المقال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أبريكيت سوفتويرGitHub (ت. سيمان)مفتوح المصدراكتشاف جينات الضراوة
أغاروزإنفيتروجين، الولايات المتحدة الأمريكية16500-500الرحلان الكهربائي الهلامي
مجموعة Agencourt AMPure XPبيكمان كولترA63881تنقية الحمض النووي واختيار الحجم
أميكاسين (30 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT0107BAST
أقراص المضادات الحيوية (أمبيسيلين 20 وميكرو؛ g)أوكسويد، المملكة المتحدةCT0003Bاختبار الحساسية المضادة للميكروبات
قاعدة بلود آجارأوكسويد، المملكة المتحدةCM0055عزل البكتيريا الموجبة والسالبة للجرام
مرق حقن القلب الدماغي (BHI)أوكسويد، المملكة المتحدةCM1135زراعة وتخزين المعزولات
سيفوكسيتين (30 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT0119Bكشف MRSA
سيفوروكسيم (30 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT0026BAST
سيبروفلوكساسين (5 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT0425BAST
كليندامايسين (2 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT0064BAST
منصة DNBSEQBGI، الصينمختلفتسلسل الجينوم الكامل
إريثروميسين (15 سنة وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT0020BAST
فاست كيو سي<سترونغ>سايمون أندروز في معهد بابراهام (بابراهام للمعلوماتية الحيوية)NAنظام الطوابير
نظام توثيق الجلبيو-راد، الولايات المتحدة الأمريكيةجل دوكتورد آند تريد؛ XR+تصوير هلام الرحلان الكهربائي
جنتاميسين (10 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT0024BAST
الجلسرول (الدرجة الجزيئية)سيغما-ألدرتشG5516يستخدم بنسبة 20٪ للحفاظ على العزل على المدى الطويل
جوتاك جرين ماستر ميكس (2×)بروميغا، الولايات المتحدة الأمريكيةM7122مزيج تضخيم PCR
ليفوفلوكساسين (5 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT1587BAST
لينزوليد (30 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT1716BAST
ماكونكي آجارأوكسويد، المملكة المتحدةCM0007وسط انتقائي للبكتيريا سالبة الجرام
مانيتول سولت آجار (MSA)أوكسويد، المملكة المتحدةCM0085وسط انتقائي/تفريقي لأنواع المكورات العنقودية (Staphylococcus).
ميروبينيم (10 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT0774BAST
حل MgCl2بروميغا، الولايات المتحدة الأمريكيةمختلفمكون تفاعل PCR
مولر-هينتون آجارأوكسويد، المملكة المتحدةCM0337استخدم ل Kirby– اختبار انتشار الأقراص باور
أداة محاذاة العضلاتمفتوح المصدرمختلفمحاذاة تسلسل البروتين
مياه خالية من النوكليازبروميغا، الولايات المتحدة الأمريكيةP1193مكون تفاعل PCR
أجار المغذيأوكسويد، المملكة المتحدةCM0003وسيط النمو الأغراض العامة
أوكساسيلين (1 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT0159BAST
PathogenWatchمعهد ويلكوم سانجرالأداة الإلكترونيةهوية النوع والمادة كشف جينات AMR
باتريك / BV-BRCمركز موارد المعلوماتية الحيوية البكتيريةالمنصة الإلكترونيةتجميع الجينوم والعمل التعليق
بيبراسيلين/تازوباكتام (100/10 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT1628BAST
أداة تصور الجينوم بروكسيجامعة تورونتوالأداة الإلكترونيةتصور خريطة الجينوم
فلوروميتر الكموميبروميغا، الولايات المتحدة الأمريكيةE6150قياس الحمض النووي
فلوروميتر الكيوبتثيرمو فيشر العلميQ33238قياس الحمض النووي لنظام WGS
برنامج RAxMLمفتوح المصدرمختلفالتحليل التطوري
S. aureus ATCC 25923ATCC، الولايات المتحدة الأمريكية25923سلالة مراقبة الجودة لنظام AST
بقعة حمراء آمنةتقنية iNtRON الحيويةمختلفصبغة جل الحمض النووي
مجموعة استخراج الحمض النووي البكتيري SaMagساكاسي بيوتكنولوجيز، إيطاليامختلفاستخراج الحمض النووي الجيني
نظام الاستخراج الآلي SaMag-12ساكاسي بيوتكنولوجيز، إيطالياSMG-12مستخرج الأحماض النووية الآلي
أعواد القطن المعقمةمصنعون مختلفونمختلفيستخدم لجمع عينات تقنية المسحة العميقة
محلول ملحي طبيعي معقممصنعون مختلفونمختلفيستخدم لغسل سطح القرحة قبل أخذ العينة
شفرات المشرط المعقمةمصنعون مختلفونمختلفيستخدم لإزالة القرحة قبل أخذ العينة
تيجسيكلين (15 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT1849BAST
تريميثوبريم-سلفاميثوكسازول (25 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT0052BAST
جهاز الترانسلمنيتور فوق البنفسجيمصنعون مختلفونمختلفتصور منتجات PCR
فانكومايسين (30 وميكرو؛ ز) القرصأوكسويد، المملكة المتحدةCT0588BAST
VITEK 2 CompactBioMé ريو، فرنسامختلفنظام التعريف الآلي
بطاقات تعريف VITEK 2 GNBioMé ريو، فرنسامختلفتحديد البكتيريا سالبة الجرام

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, X., Yuan, C. X., Xu, B., Yu, Z. Diabetic foot ulcers: Classification, risk factors and management. World J Diabetes. 13 (12), 1049-1065 (2022).
  2. Budzynska, A., Kazmierczak-Siedlecka, K., Białowas-Kot, A., et al. Virulence factor genes and antimicrobial susceptibility of Staphylococcus aureus. strains isolated from blood and chronic wounds. Toxins (Basel). 13 (7), 491(2021).
  3. Xia, N., Morteza, A., Yang, F., Cao, H., Wang, A. Review of the role of cigarette smoking in diabetic foot disease. J Diabetes Investig. 10 (2), 202-215 (2019).
  4. Arfaoui, A., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. from diabetic foot infections in a Tunisian hospital with the first detection of MSSA CC398-t571. Antibiotics (Basel). 11 (12), 1755(2022).
  5. Hussein, S. Z., Mohammed Saleh, G. Molecular detection of virulence factor genes for Staphylococcus aureus. in diabetic foot ulcers in Iraq. Ibn Al-Haitham J Pure Appl Sci. 37 (3), 98-105 (2024).
  6. Shahi, S. K., Kumar, A. Isolation and genetic analysis of multidrug-resistant bacteria from diabetic foot ulcers. Front Microbiol. 6, 1464(2015).
  7. Víquez-Molina, G., Aragón-Sánchez, J., et al. Virulence factor genes in Staphylococcus aureus. isolated from diabetic foot soft tissue and bone infections. Int J Low Extrem Wounds. 17 (1), 36-41 (2018).
  8. Ventura, C. L., et al. Identification of a novel Staphylococcus aureus. two-component leukotoxin using cell surface proteomics. PLoS One. 5 (7), e11634(2010).
  9. Hussein, R. A., Al-Kubaisy, S. H., Al-Ouqaili, M. T. S. The influence of efflux pump, outer membrane permeability, and β-lactamase production on the resistance profile of multi-, extensively, and pandrug-resistant Klebsiella pneumoniae. J Infect Public Health. 17 (11), 102544(2024).
  10. Magiorakos, A. P., et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and pandrug-resistant bacteria: An international expert proposal for interim standard definitions for acquired resistance. Clin Microbiol Infect. 18 (3), 268-281 (2012).
  11. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. , 32nd ed, CLSI. Wayne (PA). (2022).
  12. Moses, V. K., Kandi, V., Rao, S. K. D. Minimum inhibitory concentrations of vancomycin and daptomycin against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. isolated from various clinical specimens: A study from South India. Cureus. 12 (1), e6749(2020).
  13. Karimzadeh, R., Ghassab, R. K. Identification of nuc nuclease and sea enterotoxin genes in Staphylococcus aureus. isolates from nasal mucosa of burn hospital staff: A cross-sectional study. New Microbes New Infect. 47, 100992(2022).
  14. Alkhafaji, I. A. Proliferation of tst genes in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. (MRSA). Clin Med Insights. 1 (1), 1-5 (2020).
  15. Kumar, J. D., Negi, Y. K., Gaur, A., Khanna, D. Detection of virulence genes in Staphylococcus aureus. isolated from paper currency. Int J Infect Dis. 13 (6), e450-e455 (2009).
  16. Armin, S., Fallah, F., Navidinia, M., Vosoghian, S. Prevalence of blaOXA-1 and blaDHA-1 AmpC β-lactamase-producing and methicillin-resistant Staphylococcus aureus. in Iran. Iran J Microbiol. 5 (4), 1-8 (2017).
  17. Grant, J. R., et al. Proksee: In-depth characterization and visualization of bacterial genomes. Nucleic Acids Res. 51 (W1), W484-W492 (2023).
  18. Adams, F. G., et al. Staphylococcus aureus. strain 63-2498 isolated from a diabetic patient. Microbiol Resour Announc. 14 (10), 1-4 (2025).
  19. Al-Ouqaili, M. T. S., Hussein, R. A., Kanaan, B. A., Al-Neda, A. T. S. Investigation of carbapenemase-encoding genes in Burkholderia cepacia and Aeromonas sobria. isolates from nosocomial infections in Iraqi patients. PLoS One. 20 (8), e0315490(2025).
  20. Anwar, K., Hussein, D., Salih, J. Antimicrobial susceptibility testing and phenotypic detection of MRSA isolated from diabetic foot infection. Int J Gen Med. 13, 1349-1357 (2020).
  21. Wazqar, A. A., Baatya, M. M., Lodhi, F. S., Khan, A. A. Assessment of knowledge and foot self-care practices among patients with diabetes mellitus in a tertiary care center in Makkah, Saudi Arabia: A cross-sectional analytical study. Pan Afr Med J. 40, 123(2021).
  22. Hinojosa, C. A., et al. Impact of the bacteriology of diabetic foot ulcers on limb loss. Wound Repair Regen. 24 (5), 923-927 (2016).
  23. Inzucchi, S. E., et al. Management of hyperglycemia in type 2 diabetes, 2015: A patient-centered approach. Diabetes Care. 38 (1), 140-149 (2015).
  24. Tentolouris, N., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus.: An increasing problem in a diabetic foot clinic. Diabet Med. 16 (9), 767-771 (1999).
  25. Citron, D. M., Goldstein, E. J., Merriam, C. V., Lipsky, B. A., Abramson, M. A. Bacteriology of moderate-to-severe diabetic foot infections and in vitro. activity of antimicrobial agents. J Clin Microbiol. 45 (9), 2819-2828 (2007).
  26. Anvarinejad, M., et al. Isolation and antibiotic susceptibility of microorganisms isolated from diabetic foot infections in Nemazee Hospital, Southern Iran. J Pathog. 2015, 328796(2015).
  27. Lipsky, B. A., Senneville, É, Abbas, Z. G., et al. Guidelines on the diagnosis and treatment of foot infection in persons with diabetes (IWGDF 2019 update). Diabetes Metab Res Rev. 36 (S1), e3280(2020).
  28. Bai, Z., et al. Identification of methicillin-resistant Staphylococcus aureus from methicillin-sensitive Staphylococcus aureus. and molecular characterization in Quanzhou, China. Front Cell Dev Biol. 9, 629681(2021).
  29. Abebe, T. A., Gebreyes, D. S., Abebe, B. A., Yitayew, B. Antibiotic-resistant bacteria and resistance genes in drinking water sources in North Shoa Zone, Amhara Region, Ethiopia. Front Public Health. 12, 1422137(2024).
  30. Herman-Bausier, P., et al. Mechanical strength and inhibition of Staphylococcus aureus. collagen-binding protein Cna. mBio. 7 (5), e01529-16(2016).
  31. de Almeida, L. M., et al. Comparative analysis of agr groups and virulence genes among subclinical and clinical mastitis Staphylococcus aureus. isolates from sheep herds in Northeast Brazil. Braz J Microbiol. 44 (2), 493-498 (2013).
  32. Elboshra, M. M. E., Hamedelnil, Y. F., Moglad, E. H., Altayb, H. N. Prevalence and characterization of virulence genes among methicillin-resistant Staphylococcus aureus. isolated from Sudanese patients in Khartoum State. New Microbes New Infect. 38, 100784(2020).
  33. Mohsin, S. M., Al-Ghanimi, A. A. K., Alwan, D. H. Molecular detection of virulence and antibiotic resistance genes of Staphylococcus aureus. isolated from diabetic foot infection. Med J Babylon. 22 (4), 1369-1377 (2025).
  34. Wang, M., Zhang, Q. Characteristics of virulence genes of clinically isolated Staphylococci .in Jingzhou area. Contrast Media Mol Imaging. 2022, 8804616(2022).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة