مقالة منهجية

من الأنسجة إلى القياس الشكلي: سير عمل جولجي-كوكس خطوة بخطوة لتحليل العمود الفقري العصبي والتغصني في الفئران البالغة

DOI:

10.3791/71384

⸱

يونيو 5, 2026

 ,  , 
1Department of Developmental Neurobiology and Neurophysiology, Institute of Neurobiology - UNAM

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المقالة طريقة خطوة بخطوة لتلوين جولجي-كوكس في الفئران البالغة، تشمل تحضير المحلول، وتغريب الأنسجة، والحماية بالتبريد، والتقسيم، والتطوير، والتركيب. يركز على حفظ الأنسجة والتلوين المتجانس منخفض الخلفية، مما يتيح رؤية واضحة لشكل الخلايا العصبية. تقوم الطريقة بتصنيف الأرواق التغصنية وتدعم التحليل الشكل الكمي لأشواك التغصن.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تحليل مورفولوجيا الخلايا العصبية في الصحة والمرض أساسيا لفهم وظيفة الدماغ ولتقييم تأثيرات التدخلات التجريبية. يظل تلوين جولجي-كوكس تقنية كلاسيكية لكنها ذات صلة عالية لتصوير الأشواك العصبية الكاملة والأشواك الشجرية. ومع ذلك، غالبا ما تختلف البروتوكولات المنشورة في الخطوات الإجرائية الحرجة وغالبا ما تفتقر إلى التفاصيل المنهجية الأساسية، مما يؤدي إلى تباين كبير في جودة التلوين وجعل توحيد المختبر يستغرق وقتا طويلا وتحديا. هنا، يعرض بروتوكول جولجي-كوكس شامل خطوة بخطوة للفئران البالغة، يشمل كامل سير العمل من التعامل داخل الجسم ومعالجة الأنسجة إلى التصوير واستخراج البيانات الشكلية الشكلية. يفصل الاعتبارات العملية والمخاطر الشائعة التي تؤثر على كفاءة التلقب، وسلامة المقاطع، ونسبة الإشارة إلى الضوضاء، ويقدم إرشادات منهجية لتحسين قابلية التكرار. بشكل عام، يتيح هذا البروتوكول التصور البصري الموثوق والتحليل الكمي للخلايا العصبية الكاملة، والأجزاء الشجرية، والأشواك الشجرية. من المتوقع أن يسهل هذا المورد تنفيذ تلوينات جولجي-كوكس بشكل أكبر من الاتساق والشفافية والدقة التقنية، مع توفير إطار واضح لتكييف الطريقة مع بيئات مختبرية متنوعة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الهدف العام من طريقة التلوين جولجي-كوكس هو تمكين التصور عالي الدقة لشكل الخلايا العصبية الكامل، بما في ذلك الأرقام التغصنية والأشواك الشجرية، في أنسجة الدماغ الثابتة 1,2,3,4. تسمح هذه التقنية بتحليل هيكلي مفصل للخلايا العصبية الفردية داخل الدوائر العصبية المعقدة، مما يجعلها ذات قيمة خاصة لدراسات اللدونة المشبكية، والتطور العصبي، والتنكس العصبي، وإعادة تشكيل الهيكل المعتمد على الخبرة 5,6.

يكمن مبرر تطوير واستمرار استخدام طرق جولجي في قدرتها الفريدة على إنتاج تلقيح عصبي متناثر وكامل 1,2. وصفها كميلو جولجي في الأصل عام 1873 وتم تحسينها في عام 1891 بواسطة كوكس 7,8، وتعتمد الطريقة على ترسيب كرومات الفضة ضمن مجموعة محدودة من الخلايا العصبية، مما يتيح إعادة بناء مورفولوجيا كاملة دون تداخل مع العلامات3. تعديل جولجي-كوكس يستبدل نترات الفضة المستخدمة في طريقة جولجي الأصلية بكلوريد الزئبق، مما يحسن اختراق الأنسجة وقوام التلوين2. مقارنة بتقنيات وسم الخلايا العصبية البديلة مثل التعبير عن البروتينات الفلورية، تتبع الفيروسات، أو طرق ملء الصبغة، يقدم تلوين جولجي-كوكس عدة مزايا. لا يتطلب ذلك التلاعب الجيني أو حقن التجسيد أو معدات المجهر المتخصصة، كما يسمح بتصور الأشواك التغصنية ذات التباين العالي تحت مجهر الحقل الساطع 1,2. على الرغم من أن الطرق الحديثة القائمة على الفلورة توفر خصوصية نوع الخلية، إلا أن تلوين جولجي-كوكس لا يزال مفيدا بشكل خاص للعينات الشكلية غير المتحيزة 9,10 وللاستخدام في الأنواع أو الظروف التجريبية التي لا تتوفر فيها أدوات معدلة وراثيا.

ضمن الأدبيات الأوسع، تم استخدام طرق جولجي على نطاق واسع لقياس كثافة وشكل العمود الفقري الشجراني في دراسات التعلم والذاكرة5، والتوتر والاضطرابات النفسية11، وسن12، والأمراض التنكسية العصبية مثل مرض الزهايمر12، 13، 14. الاستخدام المستمر له عبر عقود يبرز موثوقيته في التشريح العصبيالبنيوي 2. هذه الطريقة مناسبة بشكل خاص للباحثين الذين يحللون بنية التغصنات وشكل العمود الفقري في نسيج الدماغ عندما يكون التصور الخلوي الكاملمطلوبا 1. وهو مناسب جدا للدراسات المقارنة في الشكل الشكلي عبر مجموعات تجريبية. ومع ذلك، قد يستفيد الباحثون الذين يحتاجون إلى خصوصية نوع الخلية، أو التصوير الحي، أو التجمع الجزيئي أكثر من طرق الوسم الفلورية أو المشفرة جينيا9،10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام الفئران الإناث البالغة من النوع البري من النوع B6129SF2/J (عدد = 3) في هذه الدراسة. ومع ذلك، يمكن إجراء تلوين مماثل بين الجنسين في مرحلة البلوغ. حصلت جميع الإجراءات التجريبية على موافقة سابقة من لجنة الأخلاقيات الحيوية. (#117.A، معهد علم الأعصاب (INb)، الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك)

1. تحضير الحلول

تحذير: كلوريد الزئبق سام للغاية ومسبب للتآكل. أمسك داخل غطاء بخار كيميائي أثناء ارتداء قفازات ومعطف مختبر وحماية للعين. تخلص من النفايات في حاوية نفايات خطرة معلمة. ثنائي كرومات البوتاسيوم وكرومات البوتاسيوم مؤكسدان سامان ومسرطنتان. أمسك داخل غطاء بخار كيميائي وتجنب ملامسة الجلد أو الاستنشاق.

  1. تحضير حلول تلقيح المخزون
    1. يزن 15 جراما من ثنائي كرومات البوتاسيوم. أذوبها في 300 مل من الماء المقطر مرتين للحصول على محلول بنسبة 5٪ (w/v).
    2. يزن 15 جراما من كلوريد الزئبق. أذوبها في 300 مل من الماء المقطر مرتين للحصول على محلول بنسبة 5٪ (w/v).
    3. يزن 15 جراما من كرومات البوتاسيوم. أذوبها في 300 مل من الماء المقطر مرتين للحصول على محلول بنسبة 5٪ (w/v).
    4. لف جميع الحاويات بورق ألمنيوم وخزنها في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوضاء.
  2. تحضير حل جولجي-كوكس العامل
    1. اخلط محلول ثنائي كرومات البوتاسيوم بسعة 50 مل، ومحلول كلوريد زئبقي بسعة 50 مل، ومحلول كرومات بوتاسيوم بسعة 40 مل.
    2. أضف 100 مل من الماء المقطر وامزجه جيدا.
    3. حضن الخليط لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة، محميا من الضوء.
    4. دع الترسب يستقر. استخدم فقط المادة الفائقة لتلقيب الأنسجة.
      ملاحظة: يمكن تخزين محلول جولجي-كوكس لمدة تصل إلى شهر واحد عند حمايته من الضواء. لتقليل هدر المواد الكيميائية وضمان نضارة المحلول، حضر فقط الحجم المطلوب لكل من المحاليل الأصلية والمحلول النهائي المطلوب للتجربة. جهز على الأقل 23 مل لكل دماغ للحصول على 20 مل من المادة الفائقة القابلة للاستخدام بعد فقدان الترسبات.
  3. تحضير محلول الحماية من التبريد
    1. أذاب 300 جرام من السكروز في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 0.1 مل، pH 7.4، معد بفوسفات الصوديوم الخالي من المياه، وفوسفات الصوديوم أحادي الهيدرال، وكلوريد الصوديوم.
    2. اضبط مستوى الصوت النهائي إلى 1 لتر.
    3. خزن عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع.

2. جمع الأنسجة والتلقيح

  1. إجراء تروية القلب
    1. تخدير الحيوان ببنتوباربيتال الصوديوم (252 ملغ/كجم، المحلول الصناعي). تأكد من عمق التخدير المناسب من خلال عدم وجود انسحاب الدواسة قبل المضي قدما.
    2. إجراء تروية داخل القلب بحوالي 30 مل من 0.1 M PBS (درجة الحموضة 7.4) حتى ينظف السائل الطبيعي، مما يضمن إزالة الدم بالكامل من أنسجة الدماغ. لم يستخدم أي عامل تثبيت؛ يعمل حل جولجي-كوكس نفسه كعامل تثبيت في هذا السير العملي.
    3. استخرج الدماغ بعناية وشطفه بماء مقطر. تأكد من أن الدماغ مثقوب بشكل صحيح وخال من الدم المتبقي (الشكل 1A).
  2. نسيج متلقيب
    1. قسم الدماغ إلى نصفي كرة أو كتل تاجية (~3 مم) باستخدام مصفوفة دماغية لتحسين التلقيح. تسهل كتل الأنسجة الصغيرة تخصيبا أكثر انتظاما وتقلل من التباين، بينما قد تتطلب العينات الأكبر أوقات حضانة أطول وقد تظهر تلوينا أقل تجانسا.
    2. ضع الدماغ في محلول جولجي-كوكس بسعة 10 مل. احمها من الضوئي.
      ملاحظة: حجم 10 مل من محلول جولجي-كوكس يكفي لدماغ فأر بالغ كامل. عند استخدام نصف كرة واحد أو كتل تاجية أصغر (~3 مم سمك)، يمكن تقليل حجم المحلول بشكل متناسب، بشرط أن يبقى النسيج مغمورا بالكامل. إذا تم استخدام الدماغ بالكامل، ينصح بتقسيمها مع الحفاظ على المنطقة المعنية لضمان اختراق أفضل للكاشف والتلقيح المتجانس.
    3. حضن لمدة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    4. استبدلها بمحلول جولجي-كوكس الجديد بسعة 10 مل. حضانه لمدة 10-14 يوما عند 22–25 درجة مئوية في الظلام.
      نقطة توقف: تخزين الأنسجة في محلول جولجي-كوكس لمدة تصل إلى 15 يوما دون فقدان كبير للصلاحية.
      ملاحظة: بعد تلقيح جولجي-كوكس، يطور الدماغ مظهرا ذهبيا داكنا ويصبح هشا للغاية؛ لذا، تعامل معه بحذر (الشكل 1B). يوصى باستخدام ملقط بلاستيكي للتلاعب لتجنب التفاعلات الكيميائية مع مواد الفولاذ.

3. الحماية من التجميد

  1. انقل النسيج إلى محلول واقي للتجميد بسعة 10 مل (30٪ سكروز (مع الوزن) في 0.1 مليون PBS، رقم الحموضة 7.4، معد في الخطوة 1.3).
  2. حضن لمدة 24 ساعة (4 درجات مئوية).
  3. عند نفس درجة الحرارة (4 درجات مئوية)، استبدل بمحلول جديد واقي من التبريد وحضن لمدة لا تقل عن 4–7 أيام.
    نقطة التوقف: قبل القطع، خزن الأنسجة في محلول واقي من التبريد لمدة تصل إلى 3 أسابيع عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.

4. التضمين والتقسيم

  1. النسيج المضمن
    1. حضر 8٪ (بدون ضغط) أغاروز في ماء مقطر ساخن. دعه يبرد حتى يصل إلى حوالي 40 درجة مئوية.
    2. ضع النسيج في قوالب مدمجة وجهها بشكل مناسب.
    3. صب الأغاروز فوق النسيج ودعه ليتصلب لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة أو 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية (الشكل 1C).
    4. قص الزائدة من الأغاروز من الكتلة (الشكل 1D).
  2. نسيج المقطع
    1. ثبت كتلة الأغاروز على مرحلة الاهتزاز باستخدام اللاصق. (الشكل 1E)
    2. املأ غرفة القطع بمحلول واقي من التبريد.
    3. نسيج المقطع بسماكة 100–200 ميكرومتر. يوصى بمقاطع أرق (مثل 100–120 ميكرومتر) لتحليل العمود الفقري التغصني لتحسين دقة التصوير، في حين يمكن استخدام المقاطع السميكة (مثل 150–200 ميكرومتر) لإعادة بناء الخلايا العصبية بالكامل. في هذه الدراسة، تم قطع المقاطع عند 120 ميكرومتر (الشكل 1F).
    4. اجمع الأجزاء باستخدام فرشاة ناعمة.
      ملاحظة: سجل إعدادات الفيبراتوم في جدول المواد. لا تغسل الشرائح تحت أي ظرف من الظروف بعد تركيب الأجزاء. السكروز سيحمي الأنسجة حتى مرحلة النمو.

5. التركيب

  1. تحضير شرائح مغلفة بالجيلاتين
    1. جهز محلول طلاء عن طريق إذابة 0.5 جرام من الجيلاتين في 100 مل (0.5٪ وضح/فولت) من الماء المقطر المسخن حتى الغليان.
    2. حرك حتى يذوب الجيلاتين تماما واترك المحلول يبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
    3. أضف 0.05 جرام من كبريتات الكروم البوتاسيوم (0.05٪ w/v) وامزج حتى يذوب تماما. قم بإزالة الرغوة المتبقية إذا لزم الأمر.
    4. قم بترشيح محلول الجيلاتين عبر ورق الفلتر لإزالة الجزيئات غير المذابة والرغوة المتبقية، لضمان طلاء موحد للشرائح.
    5. اغسل شرائح الزجاج بمنظف محايد وماء، اشطفه جيدا، ثم اشطفه بالماء المقطر.
    6. اغمر في 96٪ إيثانول حتى لا تبقى قطرات مرئية.
    7. يجفف الفرن عند درجة حرارة 50–60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو حتى يجف تماما.
    8. يغمس المحلول في محلول الجيلاتين ويترك المحلول الزائد يصرف.
    9. ضع شرائح الشرائح في الفرن على درجة حرارة 50–60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو حتى تجف تماما.
    10. كرر عملية الطلاء والتجفيف خمس مرات على الأقل لضمان الالتصاق السليم.
    11. بعد الخطوة النهائية للتجفيف، اترك الشرائح تبرد إلى درجة حرارة الغرفة في بيئة خالية من الغبار (مثلا داخل غطاء بخار كيميائي) واحتزنها في حاوية نظيفة ومغلقة حتى الاستخدام.
      ملاحظة: حضر فقط حجم محلول الجيلاتين المطلوب لعدد الشرائح التي سيتم تغطيتها. يمكن تكبير كميات المواد الكيميائية بشكل متناسب مع الحفاظ على التركيزات المحددة (w/v).
  2. ضع الأقسام على شرائح المجهر المطلية بالجيلاتين باستخدام فرشاة ناعمة
    ملاحظة: استخدم شرائح المجهر مغطاة بخمس طبقات على الأقل من الجيلاتين 0.5٪. جهز الشرائح حديثا لضمان سلامة الأنسجة أثناء النمو. لم يتم اختبار الشرائح المشحونة كهربائيا في هذا البروتوكول.
  3. انقع الورق الماص بمحلول واقي من التبريد وضعه فوق الأقسام.
  4. اضغط بلطف مع راحة اليد للقضاء على فقاعات الهواء وضمان التلامس الموحد بين قسم النسيج والشريحة المغطاة بالجيلاتين، مما يعزز الالتصاق مستقر أثناء المعالجة اللاحقة.
    ملاحظة: الضغط اللطيف يحسن الالتصاق من خلال تعظيم التلامس بين المقطع وطبقة الجيلاتين، مما يقلل من خطر الانفصال أثناء التطور المائي.
  5. أزل الورق بحذر واترك الشرائح لتجف في الظلام لمدة 2–3 أيام في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: التجفيف في بيئة منخفضة الرطوبة أمر حاسم للالتصاق المستقر. الحماية من الضوء تقلل من التغيرات الكيميائية الضوئية في الأنسجة المشبعة بجولجي-كوكس، والتي تكون حساسة للضوء بسبب وجود أملاح الكرومات. بالإضافة إلى ذلك، لا يتداخل الأجاروز المتبقي بشكل كبير مع عملية التطور ويمكن ملاحظته حول الأنسجة في القسم المطور (الشكل 2A). وجود الأجاروز يسهل التعامل الآمن مع النسيج أثناء التركيب، حيث أن الأنسجة المحملة بجولجي-كوكس هشة للغاية. إذا رغب في ذلك، يمكن إزالة الأجاروز الزائد يدويا بعناية بعد تركيب الأقسام على الشرائح.
    نقطة التوقف: حافظ على حماية الشرائح من الضوء.

6. التطور

تحذير: الزيلين قابل للاشتعال وسام عند الاستنشاق. أمسك بغطاء بخار كيميائي وتجنب اللهب المفتوح. الأمونيا مادة تآكلية وتنتج أبخرة مهيجة. مقبض في غطاء بخار.

  1. إعادة ترطيب الأقسام
    1. اغمر السلايد في ماء مقطر لمدة 5 دقائق.
    2. انقله إلى ماء مقطر طازج لمدة 5 دقائق.
    3. اغمس في 50٪ إيثانول لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: خطوة الإيثانول بنسبة 50٪ توفر انتقالا تدريجيا من الظروف المائية إلى الجفاف، مما يسهل اختراق المواد الكيميائية ويساعد في الحفاظ على سلامة الأنسجة قبل مرحلة التطوير.
  2. تطوير التلوين
    1. حضن شرائح في محلول أمونيا مائي يتم تحضيره بخلط مجلدين من 25٪ أمونيا مع حجم واحد من الماء المقطر (2:1، v/v) لمدة 8 دقائق
    2. اغسله في ماء مقطر لمدة 5 دقائق.
    3. اغسله مرة أخرى بماء مقطر لمدة 5 دقائق.
    4. حضن في 5٪ (مع ولت) ثيوسلفات الصوديوم في ماء مقطر لمدة 10 دقائق في الظلام.
    5. اغسله بالماء المقطر لمدة دقيقة واحدة.
    6. اغسله مرة أخرى بالماء المقطر لمدة دقيقة واحدة.
      ملاحظة: أكمل عملية التطوير دون انقطاع بمجرد البدء.
  3. جفاف وتنظيف
    1. اغمر الشرائح في 70٪ إيثانول لمدة 5 دقائق.
    2. اغمر الشرائح في 96٪ إيثانول لمدة 5 دقائق.
    3. اغمر شرائح في 100٪ إيثانول لمدة 5 دقائق.
    4. نقل الشرائح إلى الزيلين لمدة لا تقل عن 6 دقائق.

7. التثبيت الدائم

  1. تطبيق وسط تثبيت بيرمونت® (معامل الانكسار ~1.52) على كل قسم.
    ملاحظة: يجب أن يكون معامل الانكسار لوسط التثبيت متوافقا مع أهداف الغمر بالزيت لضمان جودة الصورة المثلى.
  2. ضع غطاء الغطاء بعناية لتجنب فقاعات الهواء.
  3. أغلقي الحواف بطلاء أظافر شفاف.
  4. اترك الزلاجات تجف في الظلام لمدة 48 ساعة في درجة حرارة الغرفة.

8. التصوير

ملاحظة: تختلف طرق التصوير وتكوينات الاستحواذ حسب علامة المجهر؛ يجب تحديد الإعدادات المثلى لكل نظام.

  1. شغل المجهر.
  2. افتح برنامج المجهر
  3. ضع شريحة على منصة المجهر.
  4. التقط صورة ثنائية الأبعاد واسعة الرؤية لقسم الدماغ باستخدام هدف تكبير منخفض مثل 1X/0.04 N.A. أو 4x/0.10 (الشكل 2A، B).

9. تصوير الخلايا العصبية الكاملة

  1. التقط مجموعات صور عالية الدقة للمنطقة التي تحتوي على الخلية العصبية محل الاهتمام، باستخدام هدف 10x/0.25 N.A. أو 20x/0.40N. (الشكل 2C).
    ملاحظة: يجب أن تظهر الخلايا العصبية المختارة للتحليل حدوث تلقيح جولجي-كوكس الكامل والمتجانس، مع أعمدة شجرية محددة بوضوح وتلوين خلفية بسيط. يجب استبعاد الخلايا التي تحتوي على عمليات مقطوعة، أو تغريب غير مكتمل، أو هياكل متداخلة، أو إشارة خلفية عالية لضمان تحليل مورفومتري دقيق.
  2. ركز الصورة وضبط إعدادات الكاميرا، بما في ذلك التعريض وتوازن اللون الأبيض.
  3. حدد الحدود العلوية والسفلية لمكدس الصور.
  4. اضبط مسافة الخطوة إلى 0.5 ميكرومتر داخل نافذة التقاط الصورة.
  5. التقط مكدس الصور باستخدام أمر البرمجيات الخاص بالحصول على المكدس.
  6. كرر الخطوات السابقة لالتقاط كل مجال اهتمام.
  7. احفظ ملف البيانات واحفظ جميع ملفات الصور. تنسيق TIFF للمعالجة الخارجية.

10. تصوير الأشواك التغصنية

  1. التقط مجموعات صور عالية الدقة للمنطقة التي تحتوي على الخلية العصبية محل الاهتمام، باستخدام هدف غمر الزيت 63x/1.4 N.A. في مجهر ساطع مناسب (الشكل 2D).
    ملاحظة: في المخطوطة الحالية، تم الحصول على صور عالية الدقة لأشواك التغصنية المعروضة في الشكل 2D باستخدام وضع المجال الساطع لمجهر كونفوكلي، نموذج زايس LSM 780. ومع ذلك، قد تخدم مجاهر المجال الساطع الأخرى للحصول على صور z-stack عالية الجودة بقيمة 63x، ويجب توحيد معاملاتها من قبل كل مختبر.
  2. ضع قطرة إلى قطرتين من زيت الغمر على الشريحة وضع الهدف فوق الشريحة، مع التأكد من تلامس الهدف مع الزيت.
  3. ركز الصورة وضبط إعدادات الكاميرا، بما في ذلك التعريض وتوازن اللون الأبيض.
  4. حدد الحدود العلوية والسفلية لمكدس الصور.
  5. اضبط مسافة الخطوة إلى 0.3 ميكرومتر داخل نافذة التقاط الصورة.
  6. التقط مكدس الصور باستخدام أمر البرمجيات الخاص بالحصول على المكدس.
  7. كرر الخطوات السابقة لالتقاط كل مجال اهتمام
  8. احفظ ملف البيانات واحفظ جميع ملفات الصور بصيغة TIFF للمعالجة الخارجية.
    ملاحظة: للخطوتين 9 و10. إذا لم يكن المجهر مزودا بمرحلة آلية لجمع المكدس Z، يمكن جمع الصور يدويا عن طريق ضبط التركيز المجهري. ومع ذلك، قد يكون التباعد بين الأقسام البصرية أقل دقة. في هذه الحالة، يمكن إعادة بناء مكدس Z لاحقا في برامج معالجة الصور (مثل ImageJ) من تسلسل الصورة المكتسبة.

11. التحليل المورفومتري

ملاحظة: يمكن استخدام طرق وبرامج متخصصة مختلفة لهذا الغرض. بعض أدوات الوصول المجاني لتحليل العمود الفقري التغصني تشمل ImageJ أو، كما في هذه الدراسة، PyReconstruct15. للحصول على وصف أكثر تفصيلا ل PyReconstruct ووظائفه في إعادة بناء الخلايا العصبية والتحليل الشكلي، راجع المصدر المشار إليه.

  1. إجراء التحليل المورفومتري للعمود الفقري التغصني
    1. بمجرد فتح الملف في ImageJ، قم بتغيير التنسيق إلى RGB باختيار Image > Type > RGB Color.
    2. حول مكدسات Z إلى تسلسل صور في ImageJ: اضغط على ملف > حفظ ك > تسلسل الصورة. احفظ كل تسلسل صورة في مجلد منفصل للتحليل لاحقا. في PyReconstruct، قم بتحميل تسلسل الصورة بالنقر على ملف > > جديد من الصور.
    3. ستظهر نافذة حوار، تطلب تعيين اسم للملف (مثلا WTVR1N1 – فأرة مركبة من النوع البري 1 عصبون 1).
    4. ستظهر بعد ذلك ثلاث نوافذ حوار متتالية. في النافذة الأولى، أدخل قيمة المعايرة (ميكرومتر/بكسل). تتوفر هذه المعلومات في بيانات تعريف مكدس Z ويمكن الوصول إليها في ImageJ.
    5. في النافذة الثانية، أدخل سمك كل قسم بصري متتالي (ميكرومتر). وأخيرا، ستبدأ سلسلة الصور بالتحميل تلقائيا (الشكل الإضافي 1A).
    6. بمجرد تحديد الجزء المهتم، ووفقا لمعايير الإدراج التي يحددها الباحث، يبدأ في التتبع للحصول على بيانات كمية.
    7. خصص اسما ونطاق مميزا لكل نوع من الأثر. حدد المجالات في اللوحة السفلية، حيث يتم تمثيلها بأشكال هندسية ملونة مختلفة (الشكل الإضافي 1B).
    8. ارسم خطا يتوافق مع طول العينة المرغوب باستخدام أداة القلم الرصاص. ثم تولد مسارا ثانيا عبر مكدس Z على طول المقطع التغصني باستخدام أداة Z.
    9. استخدم التتبع الأولي لتحديد طول المقطع المناسب والتحقق منه تحت قوائم > قائمة أثر Z (الشكل التكميلي 1B).
    10. تنقل عبر مجموعة Z وحدد رؤوس العمود الفقري التغصني بتركيز مثالي. باستخدام أداة القلم، رسم أوسع منطقة بعيدة لكل رأس عمود فقري. ثم استخدم أداة Z لتتبع رقبة العمود الفقري عبر مكدس Z (الشكل الإضافي 1C, D). كرر هذا الإجراء حتى يتم تتبع جميع رؤوس العمود الفقري وأعناقها داخل الجزء التغصني المختار.
  2. قياسات رأس العمود الفقري للتصدير
    1. افتح القوائم التي تحتوي على عرض وطول رأس العمود الفقري. يمكنك الوصول إليها تحت قوائم > قائمة التتبع (للعرض) وقوائم > قائمة تتبع Z (للطول) على التوالي.
    2. تصدير البيانات إلى الموقع المطلوب على الكمبيوتر. سيتم إنشاء ملفي إكسل منفصلين، كل منهما يحتوي على بيانات القياس المقابلة.
  3. تصنيف شكل العمود الفقري وحساب الكثافة
    1. استخرج قياسات العرض والطول لرؤوس العمود الفقري وأعناقها من ملفات Excel التي تم إنشاؤها سابقا.
    2. يجب تنظيم البيانات في أعمدة مقابلة معنونة بعرض وطول للتصنيف الشكلية بناء على المعايير التالية:16: الفيلوبوديا (>2 ميكرومتر)، رفيعة (< 2 ميكرومتر)، قصيرة (نسبة عرض الطول إلى الرأس ≤1)، والفطر (عرض الرأس >0.6 ميكرومتر). (الشكل الإضافي 1E). نادرا ما لوحظت الفيلوبوديا في الأجزاء الشجرية التي تم تحليلها، ولذلك لم تدرج في التحليل.
    3. يتم تحديد العدد الكلي للأشواك لكل جزء شجراني تم تحليله في هذه المرحلة، إلى جانب كثافة العمود الفقري (الأشواك لكل ميكرومتر خطي)، بالإضافة إلى نوع وعدد كل نوع فرعي من العمود الفقري. قالب إكسل16 المستخدم لهذا التحليل متوفر في المصدر المشار إليه. باستخدام هذه الطريقة، تم قياس كثافة العمود الفقري التغصني القاعدي في منطقة CA1 من الحصين لدى إناث الفئران البالغة من العمر 12 شهرا.
    4. تصدير بيانات كمية وإنشاء رسوم بيانية باستخدام تطبيقات برمجية علمية متخصصة مصممة لتحليل البيانات والرسوم البيانية والإحصاء. هنا، تم بناء الرسم البياني في الشكل 3 باستخدام برنامج GraphPad Prism.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التخبيس النسجي والتقطيع
أنتج بروتوكول جولجي-كوكس الموصوف هنا تلوينا عصبيا موثوقا ومتجانسا في أنسجة دماغ الفئران البالغة. بعد التلقيب في محلول جولجي-كوكس، اكتسب الدماغ لونا ذهبيا داكنا مميزا، مما يدل على انتشار محلول التلوين الناجح في جميع أنحاء الأنسجة. حافظ تقسيم الاهتزاز على السلامة الهيكلية للسوماتا العصبية والعمليات التغصنية.

التصور العصبي
كشف تصوير الحقول المضيء عن أجسام خلايا عصبية محددة بوضوح وأقواس شجرية مع تلوين...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تظل طريقة التلوين جولجي-كوكس واحدة من أكثر التقنيات استخداما لتصوير شكل الخلايا العصبية والأشواك التغصنية في أنسجة الدماغ الثابتة 3,4. من خلال تخصيب مجموعة صغيرة وعشوائية من الخلايا العصبية، تتيح هذه الطريقة تصور أشجار التغشبية الكاملة مع أقل تلوين خلفي. في البروتوكول الحالي، سمحت التقنية برؤية واضحة لخلايا الهرم الحصينية وأشواكها التغصنية، مما أتاح تحليلا مورفومتري موثوقا باستخدام المجهر الساطع والتصوير المكدس Z. تظهر أمثلة ممثل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل أمانة العلوم، والإنسانية، والتكنولوجيا والابتكار (SECIHTI) (CBF-2025-G-35)، والإدارة العامة للأكاديمية الشخصية (DGAPA)، وبرنامج علم الأعصاب (OPBIOLOGÍA)، المكسيك (PAPIIT-IN-209325). حصل هومبرتو مارتينيز على زمالة ما بعد الدكتوراه من معهد SECIHTI (رقم 2330239). تلقى بيدرو ف. روبيو دعما ماليا من SECIHTI (الجمعية الوطنية للبوسغرادو). شكرا لأ. ر. أغيلار فاسكيز والطاقم الفني في معهد علم الأعصاب (INb)، أ. كاستيا ليون، م. غارسيا سيرفين، وم. أ. كارباخو ماتا على دعمهم للفوفاريوم؛ E. de los Ríos Arellano و E. N. Hernández Ríos للمساعدة في المجهر؛ م. ميندوزا بالتازار وم. إ. روساس ألاتوري لدعم مؤتمرات الفيديو، وب. أ. غارسيا فرياس للتواصل العلمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أغاروزتقنيات الحياة15510-027CAS 9012-56-6
محلول الأمونيا 25٪ميرك208380CAS 1336-21-6. خطير.
فوسفات الصوديوم اللامائي ثنائي القاعديسيغما-ألدرتشS3264CAS 7558-79-4
المجهر ذو المجال الساطعنيكونإكليبس سي
كبريتات الكروم البوتاسيموسسيغما-ألدرتش243361
المجهر الكونفوكليزايسLSM 780
التوازن الرقميأكويريس إنسترومنتسW3200-1200
قوالب التضمينميركE6032الأبعاد: 22x22 مم
الإيثانولماير394
الحيوانات التجريبيةمختبر جاكسون2124-01سلالة الفأر B6129SF2/J
مسحوق الجيلاتينسيغما-ألدرتشG2500
برنامج جراف باد بريزمشركة جراف باد سوفتوير إنك.الإصدار 8.0.2
برنامج ImageJ Fijiالمعهد الوطني للصحة الأمريكيةالإصدار 1.54p، https://imagej.net/software/fiji/downloads
كلوريد الزئبقج. ت. بيكر2594-01CAS 7487-94-7. خطير.
كاميرا المجهرنيكونDS-Vi1
هدف المجهر (10x)نيكون93183خطة 10x/0.25 N.A.
هدف المجهر (1x)نيكون93180خطة UW 1x/0.04 N.A. 
هدف المجهر (20x)نيكون93184خطة 20x/0.40 N.A. 
هدف المجهر (4x)نيكون93182خطة 4x/0.10 N.A. 
هدف المجهر (63x)زايس420782-9900-799خطة APO 63x/1.4 N.A. Oil DIC
شرائح المجهرسيغما-ألدرتشS8902
فوسفات الصوديوم أحادي الهيدرال أحادي الأساسج. ت. بيكر3818-05CAS 10049-21-5
طلاء الأظافرألوان خاطئةلون جريءشفافة
وسائط التثبيت Permountفيشر ساينتيفكSP15-500
كرومات البوتاسيومProductos Quí ميكوس مونتيري2784CAS 7789-00-6. خطير.
ثنائي كرومات البوتاسيومسيغما-ألدرتش207802CAS 7778-50-9. خطير.
برنامج باي ريكونستركتجامعة تكساس، أوستنالإصدار 1.19.0، https://github.com/SynapseWeb/PyReconstruct
كلوريد الصوديومفيرمونت24912CAS 7647-14-5
ثيوسلفات الصوديومProductos Quí ميكوس مونتيري7291CAS 7772-98-7. خطير.
سكروزج. ت. بيكر (أفانتور)4072-0566.55° الدوران النوعي، كاشف ACS
فيبراتوموملايكا بيوسيستمزVT1200Sالسرعة 20 مم/ثانية، AMPL & ndash; 0.60 مم
زيلينCTR ساينتيفكCTR05128CAS 1330-20-7. خطير.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة