مقالة منهجية

تصنيع هيدروجيلات البولي أكريلاميد القابلة للضبط لدراسة تأثيرات صلابة المصفوفة على خلايا الليديغ الجذعية

DOI:

10.3791/71387

⸱

يونيو 5, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Scientific Research Center, The Seventh Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2School of Medicine, Shenzhen Campus of Sun Yat-sen University, 3Department of Urology, The Sixth Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University, 4Center for Stem Cell Biology and Tissue Engineering, Key Laboratory for Stem Cells and Tissue Engineering, Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تصنيع هيدروجيلات البولي أكريلاميد ذات الصلابة القابلة للضبط لدراسة تأثيرات ميكانيكا المصفوفة على سلوك خلايا ليديغ الجذعية في نظام زراعة ثنائي الأبعاد محكم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنظم صلابة المصفوفة خارج الخلية (ECM) سلوك الخلايا الجذعية بشكل حاسم. سابقا، أثبتنا أن الزيادات المرضية في صلابة المصفوفة أثناء التقدم في العمر تعطل توازن خلايا ليديج الجذعية (SLC)، مما يؤدي إلى انخفاض التستوستيرون. استنادا إلى هذا الاكتشاف، نقدم هنا بروتوكولا مفصلا - تم تطويره أصلا في مختبرنا - لتصنيع الهيدروجيلات البولي أكريلاميد (PA) ذات صلابة قابلة للضبط لنمذجة البيئة الدقيقة للخصية في المختبر. تتيح هذه الطريقة إعادة الصب للهلام عبر نطاق صلابة يتراوح بين 1–100 كيلو باسكال، تغطي الظروف الفسيولوجية إلى المرضية. تشمل الخطوات الرئيسية الخلط الدقيق للأكريلاميد/بيس-أكريلاميد الصحيح، وتوازن تورم الهلام، وتنشيط السطح باستخدام سلفو-سانباه، وطلاء الكولاجين لدعم التصاق وزراعة SLC. نقدم تركيبات محسنة للصلابة المستهدفة وإرشادات لحل المشكلات الشائعة مثل عدم اكتمال البلمرة وضعف التصاق الخلايا. يتيح هذا النظام تحقيقا منهجيا لكيفية تعديل صلابة الركيزة لتكاثر SLC، والتمايز، والوظائف المجنونة للستيرويدات تحت ظروف ثنائية الأبعاد محددة. بعيدا عن علم الأحياء التناسلية، يعد أيضا منصة قيمة للدراسات الميكانيكية البيولوجية في أنواع الخلايا الأخرى ولفحص العلاجات التي تستهدف الخلل المرتبط بالتيبس.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب الخصائص الميكانيكية للمصفوفة خارج الخلية (ECM) دورا محوريا في تنظيم مصير الخلايا الجذعية، بما في ذلك التكاثر، والتمايز، والصيانة الوظيفية 1,2,3,4. في الخصية، تم ربط تصلب ECM المرتبط بالعمر بانخفاض إنتاج التستوستيرون. ومع ذلك، لا تزال الآليات الميكانيكية البيولوجية الأساسية غير مفهومة جيدا، ويرجع ذلك جزئيا إلى نقص النماذج الموحدة في المختبر التي تعيد بأمانة نطاق الصلابة الفسيولوجية لمجال الخصية. التيبس الفسيولوجي لنسيج الخصية الفأرية الصغيرة حوالي 1–15 كيلو باسكال، بينما يمكن أن تصل الأنسجة القديمة أو الليفية إلى 20–30 كيلو باسكال أو أكثر.

برزت الهيدروجيلات البولي أكريلاميد (PA) كمنصة متعددة الاستخدامات لدراسة تفاعلات الخلايا والمصفوفات لأن صلابتها يمكن ضبط صلابتها بدقة عن طريق تغيير نسبة الأكريلاميد إلى بيس-أكريلاميد 5,6. مقارنة بالركائز الأخرى مثل الزجاج المطلي بالكولاجين أو الهيدروجيلات التجارية، توفر جل PA تحكما مستقلا في الصلابة وكثافة الروابط الكيميائية الحيوية، مما يتيح التشريح المنهجي للإشارات الميكانيكية. على الرغم من وجود عدة بروتوكولات لتصنيع هلام PA 7,8,9، إلا أنها غالبا ما تفتقر إلى تحسين مفصل لأنواع الخلايا المحددة، خصوصا للخلايا الأولية النادرة مثل SLCs.

هنا، نقدم بروتوكولا قويا وقابلا للتكرار لتحضير هيدروجيلات PA ذات صلابة محددة (1–100 كيلو باسكال) مصممة خصيصا لزراعة SLCs للفئران. تتضمن الطريقة تعليمات خطوة بخطوة لصب الجل، وتوازن التورم، وتشغيل السطح باستخدام سلفو-سانباه، وطلاء الكولاجين لتعزيز التصاق الخلايا. باتباع هذا البروتوكول، يمكن للباحثين توليد ركائز ذات صلابة قابلة للتعديل (تتراوح من 1 إلى 100 كيلو باسكال) تحاكي البيئة الميكانيكية للخصيتين الشابات (اللينة) والقديمة (الصلبة)، مما يمكن من تحقيق كمي لاستجابات SLC المعتمدة على الصلابة. النظام أيضا قابل للتكيف مع أنواع الخلايا الحساسة للميكانيكا الأخرى ويوفر منصة لفحص الأدوية التي تستهدف الأمراض المرتبطة بالتيبس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة صن يات-سين (رقم الموافقة: SYSU-IACUC-2026-B1278) وتم تنفيذها وفقا للإرشادات المؤسسية.

1. عزل وزراعة SLCs الأولية للفئران

  1. قم بتشريح الخصيتين من فئران C57BL/6 وإزالة التونيكا ألبوجينيا بعناية.
  2. اقطع الخصيتين إلى قطع صغيرة.
  3. فصل الخلايا البينية عن الأنابيب المنوية عن طريق حضانة الكولاجيناز من النوع الرابع بقوة 1 ملغ/مل في DMEM/F12 عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. أضف DMEM/F12 الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني لوقف نشاط الكولاجنازي.
  5. الطرد المركزي عند 1500 × جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. أعد تعليق الحبيبة في PBS وقم بالتصفية عبر فلتر 70 ميكرومتر.
  7. إثراء خلايا CD51⁺ عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورية (FACS) باستخدام جهاز فرز خلايا التدفق.
  8. تم زرع الخلايا الغنية في وسط زراعة SLC المكون من DMEM/F12 مع إضافة إلى: 1 نانومال ديكساميثازون، 1 نانوغرام/مل LIF، 5 ميكروغرام/لتر إنسولين-ترانسفيرين-سيلينيت الصوديوم، 5٪ مستخلص جنين الدجاج، 0.1 ملليمو-β ميركابتوإيثانول، 1٪ أحماض أمينية غير ضرورية، 1٪ N2، 2٪ B27، عامل نمو الأرومات الليفية الأساسية 20 نانوغرام/مل، عامل نمو البشرة الجلدية، عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية، وعامل نمو أونكوستاتين M.
  9. زراعة SLCs تحت ظروف قياسية (37 °C، 5٪ CO₂) حتى تصل إلى الكثافة المطلوبة للتلقيح على الهيدروجيلات.

2. تجميع حاوية زجاج الجل الصب

  1. افحص بعناية ونظف الألواح الزجاجية والفواصل المتخصصة المستخدمة في صب هلام الرحلان الكهربائي بالبولي أكريلاميد (PAGE)، مع التأكد من خلوها من الغبار أو التلف أو البقايا.
  2. قم بتجميع الألواح الزجاجية والفواصل والمشابك بشكل صحيح وفقا لتعليمات الشركة المصنعة، لضمان إغلاق التجميع جيدا لمنع التسرب أثناء صب الجل.
  3. ضع الحاوية الزجاجية المجمعة بإحكام على حامل مختبر جاهزة للصب.
    ملاحظة: يستخدم نظام الصب صفائح زجاجية قياسية من ويسترن بلوت (كبريتات الصوديوم دوديسيل [SDS]-PAGE) مع فواصل ثابتة بسماكة 1.0 مم، مما يضمن سماكة هلام قابلة للتكرار وسطح مستو لزراعة الخلايا.

3. تحضير محلول خليط جل PAGE

  1. قم بقياس الكواشف التالية بدقة وفقا للتصميم التجريبي (انظر الجدول 1) في أنبوب طرد مركزي معقم بسعة 15 مل أو 50 مل: محلول مخزون أكريلاميد، محلول مخزون 2٪ من بيس-أكريلاميد، مخزن HEPES بقوة 1M (رقم الهيدروجينات 8.5)، Sterile ddH₂O.
    تحذير: الأكريلاميد وبيس-أكريلاميد هما سموم عصبية. ارتد دائما قفازات وقناع غبار عند وزن البودرة الجافة لتجنب ملامسة الجلد واستنشاق الجزيئات المحمولة في الهواء. يجب إجراء الإجراءات داخل غطاء بخار.

4. إضافة المبادر والمحفز، وصب الجل

  1. أضف التالي إلى المحلول المختلط بالتسلسل: 10٪ بيرسلفات الأمونيوم (APS): يعمل كبادئ لبدء تفاعل البلمرة. ن، ن، ن، ن'- رباعي ميثيل إيثيل إيلين ديامين (TEMED): يعمل كمحفز لتسريع تفاعل البلمرة. للحصول على حجم هلام إجمالي يبلغ 6 مل، أضف 60 ميكرولتر من APS بنسبة 10٪ و6 ميكرولتر من TEMED (انظر الجدول 1 للتحجيم).
    ملاحظة: يبدأ تفاعل البلمرة مباشرة بعد إضافة TEMED؛ لذلك، يجب تنفيذ الخطوات التالية بسرعة.

5. صب المحلول المختلط

  1. قم فورا بصب الماصة أو صب المحلول المخلوط بثبات على أحد أطراف الوعاء الزجاجي لتجنب تكوين فقاعات.

6. السماح للجل بالبلمرة

  1. اترك وعاء الجل المصبوب دون إزعاج في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: عادة ما تستغرق عملية البلمرة 15–30 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية).
  2. انتقل إلى الخطوة التالية بمجرد رؤية واجهة واضحة بين خليط الهلام غير المبلمر والجل المبلمر ويصبح الجل صلبا تماما (الهلام لا يتدفق عند إمالة الحاوية).
  3. مباشرة بعد الصب، ضع طبقة رقيقة من الإيثانول المطلق (أو الإيثانول المشبع بالماء) فوق خليط الهلام لاستبعاد الأكسجين الجوي، الذي يثبط البلمرة الجذرية. يساعد الإيثانول أيضا في تكوين سطح علوي مستو.
  4. بعد البلمرة، أزل الإيثانول قبل تفكيك الألواح.

7. تفكيك الحاوية وجمع الجل

  1. قم بتفكيك المشابك بعناية واستخدم إسفين بلاستيكي أو ملعقة لفصل الألواح الزجاجية بلطف، مما يسمح ببقاء جل PAGE المبلمر سليما على إحدى اللوح.
  2. حضر طبق زراعة يحتوي على كمية كافية من زبدة الفول السوداني المعقم المعقمة.
  3. قم بتقشير الجل بعناية من الطبق الزجاجي باستخدام ملعقة أو يد مرتدية بالقفاز، ودعه ينزلق بسلاسة إلى PBS.
  4. أغلق الطبق الذي يحتوي على الجل في PBS وحضن الطبق عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
    ملاحظة: هذه الخطوة حاسمة. الجل المحضر حديثا يجف ويجب أن يمتص الماء بالكامل وينتفخ إلى أبعاده النهائية في PBS. إذا تم تخطي هذه الخطوة وقطع الجل مباشرة، سيستمر في التمدد في وسط زراعة الخلايا التالي، مما قد يتجاوز مساحة الزراعة بشكل جيد ويجعله غير صالح للاستخدام. سمك الجل بعد التورم هو 1 مم. وهذا أمر حاسم لأنه عندما ينخفض سمك الجل إلى أقل من 100 ميكرومتر، قد تشعر الخلايا بصلابة صفيحة الزراعة الصلبة تحتها، مما قد يتداخل مع القياسات الميكانيكية البيولوجية المقصودة.

8. قطع ونقل الجل إلى صفيحة الزراعة

  1. في اليوم التالي، استرجع الجل من درجة حرارة 4 درجات مئوية. باستخدام ثقب خزعة معقم أو قاطع شفرة (بقطر يطابق حجم بئر لوحة الزراعة، مثل لوحة ذات 6 آبار)، يتم قطع الجل في ظروف معقمة.
  2. داخل خزانة السلامة البيولوجية، استخدم ملقط معقم لالتقاط قرص الجل المقطوع بلطف ووضعه في وسط بئر زراعة فارغة ومعقمة.

9. الغسل الأولي والأشعة فوق البنفسجية

  1. أضف كمية كافية من PBS المعقم إلى البئر الذي يحتوي على الجل، لضمان غمرته بالكامل.
  2. اهز لوحة الزراعة بلطف لغسل سطح الجل.
  3. استنشق PBS باستخدام ماصة.
  4. كرر عملية الغسل مرة أخرى، ليصبح المجموع غسلتين، كل منهما تستغرق 3 دقائق.
  5. بعد الغسيل، أضف كمية كافية من PBS معقم لتغطية الجل مرة أخرى. ضع لوح الزراعة بالكامل مع غطاء مائل قليلا تحت مصباح UV (داخل خزانة أمان حيوي أو رابط UV مخصص) وقم بإشعاعه لمدة ساعة واحدة للتعقيم الأساسي.

10. تفعيل رابط سلفو-سانباه

  1. داخل خزانة السلامة البيولوجية، قم بسحب PBS بعناية من البئر.
  2. قبل الشفط، افصل الجل بلطف عن جدران البئر وقاعها باستخدام رأس ماصة لتجنب تلف الجل بسبب التوتر السطحي السائل.
  3. انقل الجل إلى بئر نظيف آخر في نفس لوح الزراعة باستخدام ملقط معقم.
    ملاحظة: عند نقل الجل، إضافة كمية صغيرة من PBS إلى البئر النظيف يمكن أن يساعد أولا في طرد فقاعات الهواء المحبوسة بين قاع البئر والجل عند وضعه، كما أنه يعمل كغسيل إضافي.
  4. تحضير محلول عمل الربط المتقاطع: حضر محلول عمل سلفو-سانباه بقوة 0.2 ملغ/مل عن طريق تخفيف محلول المخزون (انظر الجدول 1) باستخدام ماء معقم أو المحلول الموصى به (مثل PBS).
    ملاحظة: احم المحلول من الضوء.
  5. أضف محلول عمل كاف من سولفو-سانباه لتغطية الجل (مثلا 250 ميكرولتر لصفيحة ذات 12 بئر، و500 ميكرولتر لصفيحة ذات 6 آبار)، مما يضمن تغطية الجل بالكامل.
  6. ضع اللوح تحت طول موجي 365 نانومتر /120 مللي جول/سم2 ضوء فوق بنفسجي وتعرض للأشعة الشاعية لمدة ساعة واحدة.
    ملاحظة: تقوم هذه الخطوة بتنشيط سلفو-سانباه، مما يمكنه من الارتباط بالمجموعات الوظيفية على سطح الهلام.

11. تفعيل الرابط المتقاطع والغسلات النهائية

  1. بعد الإشعاع، استنشق محلول سولفو-سانباه من البئر داخل خزانة السلامة البيولوجية.
  2. أضف كمية كافية من PBS المعقم إلى البئر، وحجر خفيف لغسل سطح الجل، واسحب PBS.
  3. كرر عملية الغسل مرة أخرى، ليصبح المجموع غسلتين، كل منهما تستغرق 3 دقائق، لإزالة أي سلفو-سانباه غير متفاعل تماما.

12. تحضير محلول الكولاجين من النوع الأول لذيل الجرذان

  1. استخدم محلول حمض الخليك بحجم 0.02 متر كمذيب لتخفيف محلول كولاجين ذيل الجرذ من النوع الأول.
  2. اضبط تركيز محلول العمل النهائي إلى 60–100 ميكروغرام/مل. على سبيل المثال، إذا كان تركيز مخزون الكولاجين 4 ملغ/مل، أضف 15–25 ميكرولتر من المخزون إلى 985–975 ميكرولتر من 0.02 مولار حمض الخليك للحصول على 1 مل من محلول العامل.

13. طلاء الكولاجين والحضانة

  1. أضف الحجم المناسب من محلول الكولاجين العامل إلى كل بئر يحتوي على الهلام المنشط حسب نوع اللوحة: أضف 2 مل لصفيحة ذات 6 آبار، أو 1 مل لصفيحة ب 12 بئر.
  2. حرك طبق الزراعة بلطف لضمان أن محلول الكولاجين يغطي الجل وقاع البئر بشكل متساو.
  3. غط الطبق وحضنه طوال الليل في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية بنسبة 5٪ CO₂ للسماح للكولاجين بالتثبيت على سطح الجل عبر الربط المتقاطع Sulfo-SANPAH.

14. الإشعاع والتثبيت الثانوي للأشعة فوق البنفسجية

  1. في اليوم التالي، أزل اللوحة وأطلق الإشعاع مرة أخرى تحت ضوء UV بقوة حوالي 120 mJ/cmلمدة ساعة واحدة.

15. إزالة الكولاجين غير المرتبط وخلايا البذور

  1. داخل خزانة السلامة البيولوجية، استنشق محلول كولاجين من النوع الأول من ذيل الجرذ بحذر من الآبار.
  2. أضف PBS المعقم إلى الآبار، وقم بحجر خفيف لغسل سطح الجل، ثم استنشق PBS.
  3. كرر الغسيل مرة أخرى، ليصبح المجموع غسلتين، كل منهما لمدة 3 دقائق.
  4. بعد الغسيل، تكون مصفوفة الهلام جاهزة. أعد تعليق خلايا لايديغ الجذعية المحضرة في وسط زراعة SLC الكامل (التركيبة مفصلة في الخطوة 1).
  5. قم بزرع تعليق الخلية مباشرة على سطح الهلام. كثافة البذور الموصى بها هي 2 × 104 خلايا/سم2 (مثلا، حوالي 2 × 105 خلايا لكل بئر لصفيحة قياسية ذات 6 آبار).
  6. حضن ألواح الزراعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة ترطبية بسعة 5٪ CO₂.
  7. للحفاظ على حيوية الخلايا المثلى ووظيفتها المجنونة للستيرويد، غير وسط الزراعة كل 48 ساعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول ينتج هيدروجيلز بولي أكريلاميد ذات صلابة محددة (تتراوح من 1 إلى 100 كيلو باسكال) تبقى ملتصقة بقوة بلوحة الزراعة وتدعم التصاق وانتشار SLC قوي. يوفر الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية على سير العمل بالكامل، من صب الجل إلى بذر الخلايا، مما يمكن المستخدمين من تصور المراحل الرئيسية للبروتوكول.

تم إجراء التحقق الميكانيكي للهيدروجيلز البولي أكريلاميد (الصلابة المستهدفة: 1، 5، 15، 30، 50، و100 كيلو باسكال) باستخدام ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب الخصائص الميكانيكية للمصفوفة خارج الخلية دورا أساسيا في تنظيم سلوك الخلايا الجذعية، ومع ذلك لا تزال الأدوات اللازمة لدراسة هذه التأثيرات بشكل منهجي في الخلايا التناسلية محدودة. أظهرت أعمالنا السابقة أن تصلب المصفوفة المرضية أثناء التقدم في العمر يعطل توازن خلايا ليديج الجذعية (SLC) عبر محور بيزو1/ROS/Gli1، مما يؤدي إلى انخفاض التستوستيرونبمقدار 10. استنادا إلى هذا الاكتشاف، طورنا بروتوكول البولي أكريلاميد الهيدروجيلي لتوفير منصة موحدة وقابلة للتكرار للتحقيق ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا المشروع من قبل البرنامج الوطني الرئيسي للبحث والتطوير في أبحاث الخلايا الجذعية والترجمة في الصين (2021YFA1100601)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82371608)، ومؤسسة قوانغدونغ للبحوث الأساسية والتطبيقية (2023B1515020016)، وبرنامج البحث الأساسي في شنزن (JCYJ20240813150417024، JCYJ20240813150422030).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الخليكسيغما-ألدرتشCat#A6283مخفف كولاجين ذيل الجرذ (0.02 م)
Acryiamide      سانغون بيوتيكالقط#A100341-0500المونومر لتحضير جل البولي أكريلاميد
برسلفات الأمونيوم (APS) سانغون بيوتيكCat#A100486-0100المبادر لبلمرة الجل
مكمل فيتامين B27إنفيتروجينقط#A1486701مكمل محدد غني بمضادات الأكسدة والهرمونات؛ يدعم بقاء الخلايا العصبية والخلايا الجذعية (2٪ في الحمض الجزئي/الحيوي)
عامل النمو الأساسي للأروى الليفية (bFGF)إنفيتروجينقط#13256029عامل النمو المتاتوجيني؛ يعزز تكاثر ونمو سلنتلوك (20 نانوغرام/مل)
بيس-أكريلاميد  شنغهاي يواني يواني بيوتكنولوجيCat#S14002رابط متقاطع لجل البولي أكريلاميد
مستخلص جنين الدجاجيو إس بيولوجيزCat#C3999مصدر غني لعوامل النمو والمغذيات؛ يدعم نمو وقابلية SLC (5٪ v/v)
الكولاجين، النوع الأول، من ذيل الجرذيسينCat#40125ES50يغطي سطح الهيدروجيل البولي أكريلاميد المنشط بسولفو-سانباه لتعزيز التصاق وزراعة ال SLC.
الكولاجيناز من النوع الرابعجيبكوالتصنيف#17104-0191 ملغ/مل في DMEM/F12 لهضم أنسجة الخصية
CYP11A1 الأجسام المضادةجين تكسقط#GTX56293للطقم الغربي
ديكساميثازونسيغما-ألدرتشCat#D1756منشط مستقبلات الجلوكوكورتيكويد؛ يدعم انتشار SLC وصيانة الجذع (1 نانومتر)
DMEM/F12 متوسطجيبكوقط#11320033وسط قاعدي للهضم والغسل وزراعة SLC
عامل نمو البشرة (EGF)بيبروتكCat#AF-100-15يحفز تكاثر SLC ويحافظ على حالة غير متمايزة (20 نانوغرام/مل)
مصل الأبقار الجنيني (FBS)فيستكCat#SE100-011يستخدم بنسبة 10٪ لإيقاف نشاط الكولاجيناز
فيجيلا يوجدhttps://imagej.net/Fijiبرنامج تحليل الصور
الأجسام المضادة GADPHبروتين تكCat#60004-1-Igللطقم الغربي
إنزيمات الهضم الهلامية  التكنولوجيا الحيوية الدقيقةCat#GXDLFAخليط إنزيمات لهضم أنسجة الخصية وعزل SLC
HEPES سيتيفاCat#SH30237.01مخزن مؤقت للحفاظ على pH 7.0 وعدد النقاط الشرطة; 7.4
HSD3 وبيتا؛ الأجسام المضادةسانتا كروزCat#sc-515120للطقم الغربي
فرز خلايا التدفقBDhttps://www.bdbiosciences.com/content/dam/bdb/marketing-documents/BD_Influx_tech_specs.pdf
الإنسولين-ترانسفيرين-الصوديوم سيلينيت (ITS)سيغما-ألدرتشقط#11074547001يعزز بقاء الخلايا، وامتصاص الجلوكوز، والدفاع ضد مضادات الأكسدة (5 & mu; g/L)
بديل مصل نوكاوت (KSR) جيبكوالفئة #10828-028بديل المصل لوسط زراعة SLC
LIF (عامل تثبيط اللوكيميا)ميليبورقط#LIF1010سايتوكين يحافظ على تعدد القدرات في الخلايا الجذعية وتجديدها الذاتي (1 نانوغرام/مل)
خصيتا الفئرانهذه الورقةلا يوجدمعزول من فئران C57BL/6
مجموعة إليسا لتستوستيرون الفأرفاين بيوتكCat#40203ES80لقياس كمية التستوستيرون في النباتات الزائدة
فأرة: C57BL/6 شنتشن توب بيوتيكلا يوجدسلالة الفأر المستخدمة في جمع الخصيتين
فأر: خلايا الليديغ الجذعية للخصية (SLCs) هذه الورقةلا يوجدالخلايا الأولية المعزولة من خصيتي الفئران
ملحق N2إنفيتروجينقط#17502001مكمل خال من المصل المحدد يدعم زراعة الخلايا العصبية وجذعية (1٪ v/v)
الأحماض الأمينية غير الأساسيةهايكلونCat#SH30050.03يوفر مصادر للنيتروجين لتخليق البروتينات واستقلاب الخلايا (1٪ v/v)
أونكوستاتين م (OSM)بيبروتكCat#300-10Tالسيتوكين المشارك في تنظيم تمايز SLC ونضج خلايا Leydig (20 ng/mL)
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)جيبكوقط#10010023مخزن الغسل وإعادة التعليق
عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF)بيبروتكCat#100-14Bيدعم تكاثر الخلايا وهجرتها وبقائها (20 نانوغرام/مل)
بريزم 9.0جراف بادhttps://www.graphpad.com/برامج للتحليل الإحصائي والرسوم البيانية
الأجسام المضادة StARبروتين تكCat#67130-1-Igللطقم الغربي
سولفو-سانباه ماكلينالكات#102568-43-4الرابط المتقاطع غير المتجانس لتنشيط سطح الجل
TEMED فيجينCat#PH0341محفز البلمرة
β-ميركابتوإيثانولإنفيتروجينقط#21985023يقلل الإجهاد التأكسدي ويدعم نمو الخلايا في الزراعة (0.1 ملليمولار)

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
  2. Smith, L. R., Cho, S., Discher, D. E. Stem cell differentiation is regulated by extracellular matrix mechanics. Physiology. 33 (1), 16-25 (2018).
  3. Chaudhuri, O., et al. Hydrogels with tunable stress relaxation regulate stem cell fate and activity. Nature Mater. 15 (3), 326-334 (2016).
  4. Nellinger, S., Kluger, P. J. How mechanical and physicochemical material characteristics influence adipose-derived stem cell fate. Int J Mol Sci. 24 (4), 3551(2023).
  5. Pelham, R. J., Wang, Y. L. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
  6. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Curr Protoc Cell Biol. , (2010).
  7. Sanzari, I., et al. Parylene C topographic micropattern as a template for patterning PDMS and polyacrylamide hydrogel. Sci Rep. 7 (1), 5764(2017).
  8. Kandow, C. E., Georges, P. C., Janmey, P. A., Beningo, K. A. Polyacrylamide hydrogels for cell mechanics: steps toward optimization and alternative uses. Methods Cell Biol. 83, 29-46 (2007).
  9. Aratyn-Schaus, Y., et al. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. J Vis Exp. 46, e2173(2010).
  10. Huang, J., et al. High matrix stiffness triggers testosterone decline in aging males by disrupting stem Leydig cell pool homeostasis. Cell Rep. 44 (9), 116207(2025).
  11. Syed, S., Karadaghy, A., Zustiak, S. Simple polyacrylamide-based multiwell stiffness assay for the study of stiffness-dependent cell responses. J Vis Exp. 97, e52643(2015).
  12. Zheng, Y. C., et al. Islet transplantation ameliorates diabetes-induced testicular interstitial fibrosis and is associated with inhibition of TGF-β1/Smad2 pathway in a rat model of type 1 diabetes. Mol Med Rep. 23 (5), 376(2021).
  13. Trottmann, M., et al. Shear-wave elastography of the testis in the healthy man - determination of standard values. Clin Hemorheol Microcirc. 62 (3), 273-281 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Polyacrylamide HydrogelsMatrix StiffnessStem Leydig CellsExtracellular MatrixHydrogel FabricationCollagen CoatingSubstrate StiffnessCell DifferentiationMechanobiologySteroidogenic Function

مقالات ذات صلة