مقالة منهجية

التحليل البصري الوراثي للسلوك في بعوضة Aedes aegypti

255 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71394

⸱

أغسطس 21, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics, Yale University, 2Kavli Institute for Neuroscience, Yale University, 3Howard Hughes Medical Institute, 4Wu Tsai Institute, Yale University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول استخدام علم البصريات الوراثي (optogenetics) لفهم سلوك بعوضة Aedes aegypti. وتُعرض طرق التربية والتحضير والمقايسات والتحليل لتقييم الوظيفة العصبية أثناء الانجذاب إلى الحيوانات المضيفة والتغذية على الدم. ستسمح هذه التقنيات التأسيسية بإجراء دراسات الدوائر العصبية والسلوكية لهذا الناقل المهم للأمراض البشرية.

الملخص

تعد بعوضة Aedes aegypti ناقلاً مهماً للمسببات المرضية الفيروسية وتعمل كنموذج لأنواع أخرى من النواقل. تنتقل المسببات المرضية عندما تلدغ البعوضة حيواناً مضيفاً، ولكن الدوائر العصبية التي تتحكم في سلوك البحث واللدغ لا تزال غير معروفة. تفصل هذه الورقة الطرق المستخدمة في التحكم في النشاط العصبي لدى البعوض باستخدام علم البصريات الوراثي (optogenetics)، وهي تقنية أساسية لتحديد العلاقة السببية بين الدوائر العصبية والسلوك. وتشمل هذه الطرق تربية البعوض لأغراض علم البصريات الوراثي، وثلاثة اختبارات مصممة لقياس خطوات مختلفة في تسلسل الاستثارة، والجذب، وسبر الخرطوم، والامتلاء من دم المضيف. تحدث هذه السلوكيات على مقاييس مكانية مختلفة واستجابةً لمحفزات حسية متنوعة. وقد تم تجهيز كل اختبار سلوكي بمصابيح LED حمراء (~625 nm) للتنشيط البصري الوراثي. وللكشف عن الاستثارة استجابةً للمحفزات الشمية، يتم قياس الطيران والمشي كمياً. أما لاختبار الجذب أو الهبوط، فيتم عرض وجبة دم مسخنة للبعوض في ساحة كبيرة. ويتم اختبار سبر الخرطوم والامتلاء باستخدام فيديو عالي الدقة، مما يسمح بقياس الزوائد وحجم البطن. ويصف البروتوكول نماذج الرؤية الآلية لتمكين القياس الكمي الزمني عالي الدقة للسلوك وقياسات نقطة النهاية للتغذية. ويمكن استخدام هذه الطرق لاختبار دور أي مجموعة من الخلايا العصبية التي يمكن الوصول إليها وراثياً في سلوك اللدغ لدى البعوض، كما يمكن توسيع نطاقها لتشمل سلوكيات إضافية.

المقدمة

تُعد البعوضة واحدة من أخطر الحيوانات في العالم، ليس بسبب شراستها أو قوتها، بل لفعاليتها كناقل للأمراض. فالمطفيات المسببة للملاريا والتي ينقلها بعوض Anopheles مسؤولة عن مئات الآلاف من الوفيات سنوياً، بينما يتسبب كل من Aedes aegypti وAedes albopictus في انتشار الحمى الصفراء، وحمى الضنك، والشيكونغونيا، وحمى زيكا، والعديد من الأمراض الأخرى المهددة للحياة1. ويتواجد البعوض في جميع القارات باستثناء القارة القطبية الجنوبية، مما يشكل مصدر قلق كبير للصحة العامة2. ويؤدي سلوك التغذية على الدم إلى نقل المسببات المرضية بشكل مباشر، ولكنه يمثل أيضاً خطوة أساسية في دورة حياة البعوض ، حيث تتطلب عملية وضع البيض وجبة من دم الفقاريات. لذا، فإن الحد من انتشار الأمراض التي ينقلها البعوض يتطلب فهماً لآليات البحث عن المضيف.

من الثابت أن إناث البعوض تستخدم إشارات بعيدة المدى وقصيرة المدى لتحديد مواقع العوائل3,4. ويعد ثاني أكسيد الكربون (CO2) غازاً شديد التطاير يتواجد في زفير الإنسان، وغالباً ما يكون أول إشارة يستشعرها البعوض. يتم اكتشافه في العصبونات الحسية الشمية لدى Aedes aegypti بواسطة بروتينات Gr1 وGr2 وGr3، والتي تشكل مستقبل CO25. ويؤدي التعرض لـ CO2 إلى سلوك الإقلاع والطيران، والمعروف أيضاً بالتنشيط6,7، والذي يمكن أن يستمر لمدة تصل إلى 10–15 min، حتى في غياب محفزات إضافية8. كما يعمل CO2 بالتآزر مع رائحة الجلد لتعزيز التنشيط والجذب5,9. وبعد اكتشاف CO2 ورائحة الجلد، يصبح البعوض مهيأً لاستشعار إشارات إضافية من العائل تكون أكثر قرباً، مثل الحرارة، والتباين البصري، والرطوبة، والتي توجهه للهبوط على عائل مناسب للحصول على وجبة دم5,10,11,12,13. ويتيح دمج إشارات حسية متعددة للبعوض تتبع عوائله وتحديد مواقعها بفعالية.

عندما تهبط أنثى البعوض على مضيف محتمل، تغرز البعوضة خرطومها في السطح حتى تحدد بقعة من الجلد، وهي عملية تُعرف باسم السبر (probing)14,15. وبعد عملية السبر، يخترق المِرقاق الجلد، ويحدد موقع وعاء دموي، ويقوم في الوقت ذاته بامتصاص الدم مع حقن اللعاب، مما يُمكّن البعوضة من مضاعفة وزن جسمها في غضون دقائق قليلة16. ويتم توجيه الدم إلى المعي المتوسط، حيث تُهضم البروتينات لإنتاج البيض. ومن المثير للاهتمام أن الامتلاء من المضيف ليس ضرورياً لانتشار الممرضات، حيث يمكن لعملية السبر وحدها أن تنقل المرض16,17. لذا، فإن فهم كل خطوة في سلوك اللدغ قد يسمح بتطوير استراتيجيات لتعطيل بحث إناث البعوض عن المضيف وعملية اللدغ، وبالتالي السيطرة على انتشار الأمراض التي ينقلها البعوض.

تم تطوير العديد من الأدوات في الكائنات النموذجية للتحكم في النشاط العصبي. كانت الأدوات المبكرة تعمل بشكل تأسيسي أو عن طريق التنشيط الحراري18,19,20,21. وبالرغم من فائدتها، إلا أن هذه الكواشف الجينية تفرض بعض العيوب؛ حيث يمكن للأدوات التأسيسية أن تؤثر على النمو، مما يؤدي إلى ظهور أنماط ظاهرية لا تعود حصرياً إلى الوظيفة الدائرية للعصبونات. كما تستخدم البعوض حرارة الجسم لتحديد الفقاريات المضيفة، مما يجعل القنوات المنشطة حرارياً غير مناسبة بشكل فريد لدراسة سلوكها22,23. وفي دراسات السلوك، تشير علم البصريات الوراثي (optogenetics) إلى استخدام أدوات جينية تستجيب لأطوال موجية محددة من الضوء للتحكم في تنشيط العصبونات المستهدفة. وقد استُخدمت هذه التقنية بالفعل في أنظمة متعددة، بدءاً من فحص تكافؤ العطش في الفئران، ودراسة سلوك التزاوج في Drosophila، وصولاً إلى استعادة فقدان الرؤية الناتج عن التهاب الشبكية الصباغي في التجارب البشرية24,25,26. وتعمل القنوات البصرية الوراثية عن طريق امتصاص الفوتونات والسماح لأنواع محددة من الأيونات بالمرور عبر الغشاء البلازمي، مما يؤدي إلى تنشيط العصبون أو تثبيطه. ومن خلال إدخال جينات مشفرة لبروتينات حساسة للضوء عبر التحول الجيني في الكائن الحي، يمكن استخدام هذه التقنية لتنشيط أو تثبيط عصبونات محددة كان من المستحيل التحكم فيها لولا ذلك. يوفر علم البصريات الوراثي مزايا في التحكم الزمني والمكاني، ومجموعة من الضوابط التي تمكن من الاستنتاج التجريبي.

وصف المؤلفون مؤخراً أول استخدام لأدوات علم البصريات الوراثي (optogenetics) لدراسة سلوك البعوض8. تعتمد هذه الأدوات على قناة الكاتيون CsChrimson التي يتم تنشيطها بالضوء الأحمر، وهي نوع من channelrhodopsin مزاح نحو اللون الأحمر27. تتطلب الأوبسينات الميكروبية، بما في ذلك CsChrimson، عاملاً كيميائياً مساعداً، وهو all-trans retinal، لكي تتمكن من امتصاص الفوتونات28. يرتبط CsChrimson بالبروتين الفلوري المراسل tdTomato ويخضع لسيطرة نظام التعبير الثنائي QF2/QUAS، مما يسمح بدمجه بمرونة مع خطوط محرك مختلفة29. ولاستهداف العصبونات الحسية لـ CO2 ، تم استخدام خط محرك يعبر عن عامل النسخ QF2 في العصبونات التي تعبر عن الوحدة الفرعية Gr3 لمستقبل CO2 30. أظهر البعوض استجابة سلوكية ضئيلة بعد التعرض للضوء الأحمر وحده8؛ بالإضافة إلى ذلك، يعد الضوء الأحمر الأكثر فعالية في اختراق الأنسجة البيولوجية، مما يجعل الأوبسين الذي ينشط بالضوء الأحمر مثالياً لعلم البصريات الوراثي25.

تصف هذه الورقة بروتوكولات لثلاثة اختبارات تقيس جوانب مختلفة من سلوك البحث عن العائل والتغذية على الدم بالتزامن مع التحفيز البصري الوراثي (Optogenetic stimulation) (الشكل 1A). أولاً، يتم تقديم بروتوكول لتربية خطوط البعوض المعدلة بصرياً وراثياً. يصف القسم الثاني جهاز "opto-thermocycler"، وهو جهاز تدوير حراري (PCR thermocycler) معدل يمكن استخدامه لتتبع الاستثارة والجس عندما يتعرض البعوض لمحفزات حرارية وضوئية. صُمم اختبار "opto-thermocycler" لقياس سلوكيات البحث هذه عبر فترات زمنية ممتدة، باستخدام سلالات محركة للتحكم في النشاط العصبي عن طريق التحفيز البصري الوراثي. ويصف القسم الثالث اختبار "blood blanket"، حيث يتوفر للبعوض وصول مستمر إلى وجبة دم اصطناعية رقيقة في قاعدة جهاز تدوير حراري معدل، مما يسمح بتتبع الطيران والجس والامتلاء تحت ظروف إضاءة ودرجات حرارة متغيرة. يوفر اختبار "blood blanket"، الذي يعتمد على جهاز "opto-thermocycler"، وسيلة لقياس كمية الامتلاء من وجبة دم اصطناعية، مما يتيح دراسة سلوكيات تغذية البعوض  باستخدام محفزات حرارية وبصرية وراثية محددة التوقيت بدقة. ويصف القسم النهائي جهاز "opto-membrane feeder"، حيث يُقدم للبعوض وجبة دم دافئة في علبة، مما يسمح بتتبع كل من الانجذاب إلى مصدر الدم والامتلاء أثناء التعرض لمحفزات ضوئية. يُستخدم اختبار "opto-membrane feeder" لاستقصاء التسلسل السلوكي الكامل للبحث عن العائل والتغذية على الدم في نظام طيران حر. وبالإضافة إلى المخرجات المتوقعة لكل اختبار، تم وصف نماذج رؤية حاسوبية لتتبع أجزاء جسم البعوض وتحديد السلوكيات أثناء الاختبارات. تتيح اختبارات "opto-thermocycler" و"blood blanket" و"opto-membrane feeder" قياس مراحل متميزة من سلوك التغذية على الدم لدى البعوض مع التحكم في النشاط العصبي باستخدام الضوء. وتسمح هذه التقنيات المبتكرة بدراسة كيفية تحكم الدوائر العصبية للبعوض في السلوكيات التي تشكل تهديداً للصحة العامة.

البروتوكول

تحتوي البعوض المستخدم في هذا البروتوكول على جينات منقولة، ووفقاً للوائح وزارة الزراعة في الولايات المتحدة، يجب تربيتها في مرافق المستوى الثاني لاحتواء المفصليات (Arthropod Containment Level II).32يتم احتجاز البعوض لمنع هروبه، ثم التخلص منه في نفايات المخاطر البيولوجية. وقد تمت مراجعة بروتوكولات السلامة البيولوجية واحتجاز مفصليات الأرجل والموافقة عليها من قبل إدارة الصحة البيئية بجامعة Yale. &؛ السلامة. لا يتضمن هذا العمل استخدام أي مشاركين بشريين أو حيوانات تجارب. يمكن تأكيد النمط الجيني للبعوض باستخدام العلامات الفلورية (3xP3-dsRed لـ Gr3-QF2 و 3xP3-CFP لـ QUAS-CsChrimson) أو عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للمجموعة الجينية المُدرجة8جميع المواد المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. التربية باستخدام علم البصريات الوراثي

  1. تتم تربية البعوض وفقاً للبروتوكول القياسي31 مع الاستثناءات التالية لزيادة استجابة السلالات البصرية الوراثية أثناء التجربة.
  2. إجراء عمليات التهجين باستخدام سلالات ليفربول من النوع البري، وسلالات QUAS-CsChrimson، و Gr3-QF2 متماثلة الزيجوت لإنتاج السلالات التجريبية متباينة الزيجوت Gr3-QF2/+، و QUAS-CsChrimson/+، و Gr3>CsChrimson.
  3. تربية البعوض داخل حاضنة محكمة الإغلاق ضد الضوء ومضبوطة عند 28 °C ورطوبة 80%، وفق دورة تتكون من 14 h من الضوء الأزرق (450 nm) و 10 h من الظلام (الشكل 1B).
    ملحوظة: استخدام الضوء الأزرق يقلل من تنشيط القنوات التي يتم تفعيلها بالضوء الأحمر، مثل CsChrimson. يجب إجراء جميع خطوات التربية خارج الحاضنة في ظروف إضاءة منخفضة.
  4. بدء التجارب على البعوض البالغ بعد مرور أسبوع واحد على الأقل من الفقس.
    ملحوظة: بينما يمثل العمر من 2–3 أسابيع السن المثالي للتجارب السلوكية، يمكن استخدام البعوض حتى 4 أسابيع بعد الفقس. يجب أن تكون الأنماط الجينية الضابطة والتجريبية من نفس العمر، ويُسجل ذلك كعدد الأيام بعد الفقس. ولتوحيد أعمار الحيوانات، يجب تفقيس جميع البيض في اليوم نفسه.
  5. قبل يومين من التجربة، يتم سحب إناث البعوض المتزاوجة التي لم تتغذَّ على الدم بلطف من الأقفاص وتخديرها عند 4 °C. باستخدام ريشة أو جهاز شفط، تُنقل الحشرات بعناية إلى الحاويات التجريبية وفقاً للمقايسة المستخدمة.
  6. تحضير حصة مقدارها 0.2 M من all-trans retinal (ATR) في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، وتُخزن عند -20 °C. يتم توفير سكروز بنسبة 10% و 400 µM من ATR عبر فتائل قطنية مبللة على شبكة الحاوية. يمكن للحيوانات التغذي على هذه الوجبة لمدة 1–3 أيام في الظلام.
    ملحوظة: التغذية في الظلام، بدلاً من الضوء الأزرق، تمنع تلاشي لون ATR (الشكل 1B). بالإضافة إلى ذلك، في جميع خطوات البروتوكول، تم تخدير البعوض بتعريضه لدرجة 4 °C لمدة 5–10 min، حتى يتوقف عن الحركة. وفي نهاية كل تجربة، يتم قتل البعوض رحيماً بتعريضه لدرجة -20 °C لمدة 24 h.
    تحذير: يمكن أن يسبب all-trans-retinal تهيجاً شديداً عند ملامسته للجلد والعينين. يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة مثل معطف المختبر والقفازات وواقي العينين عند التعامل معه. ثنائي ميثيل سلفوكسيد هو سائل قابل للاشتعال يمكن امتصاصه عبر الجلد عند الملامسة، ويجب التعامل معه في بيئة جافة مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية وواقي العينين المناسبة. كما يجب تخزين DMSO في حاويات تخزين كيميائية مقاومة للحريق.
  7. قبل يوم واحد (20–24 h) من التجربة، تُستبدل مغذيات السكروز بمغذيات جديدة تحتوي على ماء مقطر و 400 µM من ATR. تظل الحيوانات في الظلام حتى بدء التجربة (الشكل 1B). انتقل إلى القسم 2 أو 3 أو 4.
    ملحوظة: يجب إجراء التجارب خلال الفترة الضوئية النهارية للبعوض لزيادة معدل الاستجابة.

2. جهاز التدوير الحراري الضوئي (Opto-thermocycler)

  1. تجميع مكونات المقايسة
    1. قم بتصنيع الصفائح الأكريليكية لاحتواء البعوض (الشكل 2). يرجى الرجوع إلى الشكل 2أ لمخطط بياني، الشكل 2ب للمكونات الإلكترونية، و الشكل 2ج لصورة من الـ لوح أكريليك. راجع الملفات الموجودة في (https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0) للاطلاع على القوالب.
      1. لإنشاء الجدران، استخدم القطع بالليزر لقص ورقة أكريليك بسمك 3 مم إلى أربعة مستطيلات بأبعاد 10 سم في 1 سم وستة مستطيلات بأبعاد 7 سم في 1 سم. ثبّت المستطيلات باستخدام غراء الأكريليك في مصفوفة مكونة من خمسة في ثلاثة، بحيث تكون كل وحدة عبارة عن حجرة بأبعاد 17 مم في 17 مم في 10 مم. يوجد نموذج هذه القطع في الملف "14_animal_thick_v3.ai”.
        ​تنبيه: الغراء الأكريليكي مادة قابلة للاشتعال ويمكن أن يسبب تهيجاً للجهاز التنفسي وتهيجاً للعينين. يجب استخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع الغراء الأكريليكي، مثل القفازات ومعطف المختبر والنظارات الواقية، كما يجب استخدام هذا المذيب في منطقة جيدة التهوية وبعيداً عن اللهب المكشوف.
      2. لقاعدة الغرفة، قم بقص صفيحة أكريليك بسمك 1.5 ملم وبأبعاد 6.985 سم في 10.16 سم مع إزالة البئر الموجود في الأسفل جهة اليمين. ولقص الغطاء، قم بقص صفيحة أكريليك بسمك 1.5 ملم على شكل مستطيل بأبعاد 6.985 سم في 10.16 سم. القالب الخاص بهذه القطع هو "14_animal_thin_v3.ai”.
    2. قُم بقص ورقة شبكية سوداء مقاومة للأشعة فوق البنفسجية لتكون بنفس حجم قطعة الأكريليك السفلية (الشكل 2ج). ضع الشبكة بين جدران اللوحة والقطعة السفلية، ثم قم بتثبيتها في مكانها باستخدام غراء الأكريليك. أزل الشبكة من البئر الموجود في أسفل اليمين بحيث تكون الفتحة غير مسدودة.
  2. قم ببناء إطار لتثبيت الكاميرا ومصابيح الـ LED (الشكل 2أ).
    1. قم ببناء إطار بأربعة دعامات عند كل ركن من أركان جهاز التدوير الحراري باستخدام قضبان بناء بصرية مربعة بمقاس 25 ملم وطول 60.96 سم. استخدم قضيبين للبناء بمقاس 25 ملم وطول 22.86 سم لربط الدعامة الأمامية اليمنى بالدعامة الخلفية اليمنى، والدعامة الأمامية اليسرى بالدعامة الخلفية اليسرى، على مسافة 30 سم من طاولة المختبر.
    2. قم بتوصيل الركيزتين اليمنى واليسرى من الأمام بسكة بناء مقاس 30.48 سم و25 ملم، مرفوعة بمقدار 24 سم عن المنضدة، ومن الخلف بسكة بناء مقاس 30.48 سم و25 ملم مرفوعة بمقدار 42 سم عن المنضدة.
    3. قم بتثبيت قوائم بصرية بطول 1 قدم في سكة البناء على الجانبين الأيسر والأيمن من الإطار. اربط ستة صمامات ثنائية باعثة للضوء (LEDs) بطول موجي 627 نانومتر (حمراء) متصلة على التوالي، على ارتفاع 24 سم فوق كتلة PCR في جهاز التدوير الحراري، بكل قائم.
      ملاحظة: على الرغم من أن طول موجة الضوء الذي يؤدي إلى ذروة نشاط CsChrimson يبلغ حوالي 590 نانومتر، فإن الأطوال الموجية القريبة من 625 نانومتر توازن بين الحاجة إلى تنشيط CsChrimson وتجنب الاستجابات السلوكية للضوء في المجموعات الضابطة جينياً.27ثبّت باستخدام الشريط اللاصق مبردًا حراريًا وعدسة على كل صمام ثنائي باعث للضوء (LED) لتركيز الضوء باتجاه كتلة جهاز التدوير الحراري.
    4. ثبّت عموداً بصرياً بطول 30.48 سم في الجزء العلوي من ركيزتي سكة البناء الأماميتين. استخدم مشبكاً قائماً في منتصف العمود البصري لتركيب عمود بصري آخر بطول 15.24 سم بحيث يتجه للداخل فوق كتلة جهاز التدوير الحراري. ثبّت كاميرا مزودة بمرشح تمرير طويل للأشعة تحت الحمراء في الطرف، بحيث تكون موجهة للأسفل، وعلى ارتفاع 40 سم فوق الكتلة.
    5. استخدم القوائم البصرية لإنشاء إطار يمتد من سكة البناء على شكل مستطيل حول كتلة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، بحيث يكون مرتفعاً فوق السطح مباشرة. ثبّت شريطاً من صمامات ثنائية باعثة للضوء (LED) تعمل بالأشعة تحت الحمراء، بحيث تكون مواجهة لكتلة تفاعل البوليميراز المتسلسل لإضاءة البعوض بزاوية قائمة بالنسبة للكاميرا.
      ملاحظة: إن الإضاءة بالأشعة تحت الحمراء المستخدمة في التصوير بالفيديو لا تسبب تسخيناً ملموساً للحلبة، حيث يتم الحفاظ على درجة حرارة سطح الجهاز الدوري الحراري عند 24 درجة مئوية. °درجة الحرارة C طوال التجربة.
    6. غطِّ الهيكل بستارة عازلة للضوء لمنع التداخل الناتج عن الضوء المحيط.
    7. غَطِّ السطح وجوانب كتلة جهاز PCR بطبقة واحدة من شريط الحجب الضوئي لإنشاء سطح مستوٍ ومتساوٍ بخلفية داكنة.
    8. ضع مستشعر المزدوجة الحرارية على كتلة PCR في الزاوية اليمنى السفلية وثبته بشريط عازم للضوء. تحقق من توزيع الضوء بالتساوي عبر كتلة PCR باستخدام مقياس القدرة. اضبط جهد أو تيار مزود الطاقة لتوصيل الضوء عند 12 µواط/مم2.
    9. ضع صمامًا ثنائيًا باعثًا للأشعة تحت الحمراء (LED) على حافة كتلة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لمزامنة الفيديو مع مخرج تقديم التحفيز (الشكل 2جقم بتغطية السطح بشريط لاصق أسود للسماح بالكشف عن الضوء دون التسبب في حدوث توهج في الكاميرا.
    10. قم بتوصيل المزدوجة الحرارية، ومصباح LED الخاص بالمزامنة، ومصابيح LED ذات الضوء الأحمر وفقاً للمخطط الموضح في الشكل 2بقم بتنزيل البرمجيات المطلوبة (SpinView (الإصدار 1.27.0.48)، وCoolTerm (الإصدار 2.0.1)، وArduino IDE (الإصدار 1.8.12)). قم بتنزيل كود Arduino وبرنامج المدوّر الحراري من مستودع GitHub.
      ​ملاحظة: تمت برمجة كود Arduino لتقديم ضوء أحمر، وحرارة بدرجة حرارة الجسم، ومزيج من هذين المحفزين. تتوفر سبعة برامج تحفيز كموارد، حيث يكون ترتيب المحفزات فيها عشوائياً، ويمكن تعديل هذه البرامج لتقديم محفزات مختلفة. هناك تسعة محفزات لكل تجربة: ثلاثة للحرارة فقط، وثلاثة للضوء فقط، وثلاثة للحرارة والضوء في وقت واحد. تعمل عملية تقديم المحفزات من خلال رصد Arduino للتغيرات في درجة حرارة سطح كتلة PCR عبر المزدوجة الحرارية، ثم تقديم المحفزات الضوئية في الأوقات المحددة. يمكن العثور على تفاصيل إضافية في التعليقات الواردة ضمن برامج التحفيز.
  3. تجهيز التجربة
    1. تُربى البعوضات وفقاً لبروتوكول التربية باستخدام علم البصريات الوراثي؛ انظر القسم 1 و الشكل 1ب.
    2. قبل يومين من التجربة، انقل 14 بعوضة أنثى باستخدام جهاز شفط إلى حاوية منفصلة. قدم محلول السكروز (ATR) للبعوض وفقًا للخطوة 1.6. في حال مقارنة أنماط جينية متعددة، اجعلها مجهولة الهوية بالنسبة للشخص الذي يجري التجربة.
      ​ملاحظة: بمجرد تلقي البعوض لـ ATR، يجب التعامل معه في ضوء خافت.
    3. قبل يوم واحد من التجربة (20-24 ساعة)، يتم سحب 14 بعوضة أنثى لكل لوح أكريليك وتخديرها عند درجة حرارة 4 °ج. ضع بعناية بعوضة واحدة في كل بئر من الآبار، واحدة تلو الأخرى، باستخدام ريشة أو جهاز شفط الحشرات.
    4. ثبّت جانب اللوح الأكريليكي باستخدام شريط لاصق (Scotch tape) لتثبيت الغطاء في مكانه. لا تقم بطي الشريط فوق الجزء العلوي أو السفلي من اللوح الأكريليكي، لأن ذلك سيعيق رؤية الكاميرا.
    5. ضع اللوح الأكريليكي فوق ثلاث فتائل قطنية مغموسة في 400 µمحلول M ATR في ماء مقطر (انظر الخطوة 1.6)، موضوعة على التوازي. قم بمحاذاة كل من الثلاثة صفوف إلى فتيلة لضمان وصول جميع البعوض إلى محلول الماء-ATR. ضع اللوحة الأكريليكية في حاضنة مظلمة طوال الليل.
  4. إجراء التجربة
    1. قم بتوصيل الكاميرا، ومصابيح LED، وجهاز Arduino بالكمبيوتر. قم بتشغيل مصدر الطاقة. امسح سطح جهاز التدوير الحراري الضوئي (opto-thermocycler) باستخدام إيثانول بتركيز 70% واتركه حتى يجف.
      ​تنبيه: الإيثانول مادة قابلة للاشتعال وقد تسبب تهيجاً شديداً للعين. يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند التعامل مع الإيثانول. بالإضافة إلى ذلك، يجب تجنب أي لهب مكشوف.
    2. باستخدام حاوية معتمة، انقل اللوح الأكريليكي الذي يحتوي على البعوض إلى منتصف كتلة جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ثم غطِّ جهاز التدوير الحراري البصري (opto-thermocycler) بستارة حجب الضوء.
    3. افتح برنامج SpinView على جهاز الكمبيوتر. انقر فوق اسم الكاميرا لفتح عرض الكاميرا. قم بتوصيل أضواء الأشعة تحت الحمراء وتأكد من ظهور كتلة PCR واللوح الأكريليكي في عرض الكاميرا.
    4. إذا لزم الأمر، قم بتعديل اللوح الأكريليكي بحيث يكون محاذياً وفي المركز، مع التأكد من ظهور المزدوجة الحرارية في الزاوية اليمنى السفلية من اللوح الأكريليكي. تأكد من أن ضوء المزامنة يظهر ضمن الإطار (الشكل 2ج).
    5. اضبط الإعدادات في الكاميرا وفي برنامج SpinView لضمان الحصول على فيديو واضح ومقصوص يظهر اللوح الأكريليكي. في الـ تنسيق الصورة قم بضبط لسان التبويب (tab) العرض, الطول, الإزاحة X، و إزاحة Y خيارات لضمان رؤية اللوحة الأكريليكية وضوء المزامنة. في الـ الإعدادات علامة تبويب، مجموعة معدل إطارات الاستحواذ تفعيل إلى صحيح و معدل إطارات الاستحواذ إلى 30 عدد الإطارات في الثانية.
    6. تدوير التعرض التلقائي و كسب تلقائي إيقاف. اضبط الـ زمن التعرض و كسب القيم التي تُحدث تباينًا واضحًا بين الخلفية السوداء والبعوض. انقر فوق زر التسجيل الأحمر في الزاوية العلوية اليمنى لفتح نافذة منفصلة لحفظ ملف الفيديو.
    7. في النافذة المنبثقة، حدد مسار الملف في الأعلى: انقر تصفح، وانتقل إلى المجلد التجريبي، ثم انقر مجلد جديد، وقم بتسميته باسم التجربة. اضبط عدد الإطارات المراد تسجيلها على العدد المناسب للتجربة (على سبيل المثال، 43,500) أو على 0 لإيقاف التسجيل يدويًا.
    8. في علامة تبويب الفيديوهات، قم بضبط الحقول التاليةنوع تسجيل الفيديو: MJPG، حجم تقسيم ملف الفيديو: ١٠٠٠ ميجابايت، جودة ضغط JPEG: 65. افتح الـ ‘optothermo_lightheat_random1البرنامج على جهاز التدوير الحراري ثم ابدأ تشغيله. يجب أن يبدأ جهاز التدوير الحراري بخطوة تثبيت عند 25 درجة مئوية. °ج.
    9. افتح برنامج المطابقة، ‘TC_optothermo_lightheat_random1.ino»، على بيئة Arduino IDE، ثم قم برفعه إلى اللوحة. افتح مراقب التسلسل (serial monitor) وتأكد من أن درجة الحرارة تبلغ 25 تقريباً °ج.
    10. أغلق مراقب التسلسل (serial monitor) في بيئة Arduino IDE. افتح برنامج CoolTerm للبدء فيها تحصيل مخرجات مراقب التسلسل الخاص بـ Arduino. تأكد من تطابق المنفذ التسلسلي والقناة مع تلك المستخدمة في Arduino IDE. ستظهر المخرجات في نافذة CoolTerm.
    11. ابدأ تسجيل مخرجات Arduino في ملف نصي/ثنائي. ابدأ تسجيل الفيديو على Spinview. انقر سيرة ذاتية لإنهاء مرحلة التثبيت في الجهاز الدوري الحراري. راقب مخرجات Arduino في CoolTerm للتحقق مما إذا كانت درجة الحرارة ستنخفض إلى 18 °C ويرتفع عداد المنبه إلى 1، مما يؤدي إلى بدء التجربة. اترك المقايسة تعمل حتى اكتمال التجربة.
  5. تنظيف
    1. أوقف تسجيل الفيديو وعملية الحصول على مخرجات CoolTerm. أغلق كلا البرنامجين. أنهِ برنامج الجهاز المدوّر الحراري (thermocycler). أخرج اللوح الأكريليكي الذي يحتوي على البعوض من الجهاز المدوّر الحراري وضعه في درجة حرارة -20 °توضع في المجمد (freezer) طوال الليل لقتل البعوض رحمةً.
      ​تنبيه: عند قتل البعوض المعدل وراثياً، تأكد من بقائه في درجة حرارة -20 °في بيئة C لمدة 24 ساعة على الأقل قبل التخلص منها في حاوية النفايات البيولوجية الخطرة لضمان موتها.
    2. في حال البدء بتجربة أخرى، كرر القسم 2.3. افصل كابلات الكاميرا وجهاز Arduino، وأوقف تشغيل مصدر الطاقة. افصل صمامات الثنائي الباعثة للضوء (LEDs) ذات الأشعة تحت الحمراء. نظف الألواح الأكريليكية بإزالة الشريط اللاصق والتخلص من البعوض الميت.
    3. رُش الغطاء والصفيحة الأكريليكية بإيثانول بتركيز 70%، وامسح جميع جوانب الآبار والشبكة بعناية باستخدام إصبع ترتديه قفاز. اشطفها جيداً بالماء منزوع الأيونات، ثم رص الصفائح الأكريليكية للتخزين، مع الفصل بين الأغطية بمناديل ورقية لتجنب الخدش.

3. مقايسة الغطاء الدموي

  1. تجميع مكونات المقايسة (الشكل 3)
    1. قم ببناء مقايسة المدوّر الحراري الضوئي كما هو موضح في القسم 2.1. ارجع إلى الأشكال الخاصة بالمقايسة (الشكل 3A)، والمحفز الحراري (الشكل 3B)، واللوح الألمنيومي (الشكل 3C).
    2. قم ببناء لوح تغذية بوجبة دم ألمنيومي كما هو موضح في الشكل 3C.
      1. باستخدام قاطع ليزر أو قاطع بنفاث مائي، قم بتصنيع الجزء العلوي والسفلي من اللوح. اصنع الجزء السفلي من اللوح عن طريق قص ورقة ألمنيوم بسمك 0.8 mm إلى أبعاد 90 mm في 134 mm. واصنع الجزء العلوي عن طريق قص ورقة ألمنيوم بسمك 1.6 mm إلى أبعاد 90 mm في 134 mm. اصنع 15 ثقباً مستطيلاً (17.2 mm في 18.6 mm) في اللوح العلوي. يمكن العثور على ملفات القوالب في مستودع GitHub الخاص بـ blood blanket عبر (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket) تحت عنوان "Aluminum plate templates".
      2. ضع حشية سيليكون رقيقة (بسمك 0.5 mm) بين الأجزاء الألمنيومية لمنع التسرب. يتم قصها باستخدام قاطع ليزر لتناسب شكل الجزء العلوي الألمنيومي.
      3. ثبّت الطبقات معاً باستخدام ثمانية براغي قياسية سداسية الرأس ذات قمة مقببة من مقاس 4-40 وبطول 0.47625 cm. استخدم لقمة تسنين لإنشاء أسنان البراغي في القطع المعدنية. قم بتوصيل هذه البراغي من خلال حلقات معدنية مستديرة وحلقات على شكل "W" في الجزء السفلي من اللوح لزيادة الثبات عند وضعه فوق كتلة المدوّر الحراري.
    3. قم بتنزيل كود Arduino وبرنامج المدوّر الحراري الخاص بمقايسة blood blanket من مستودع GitHub (https://github.com/sorrellslab/bloodblanket).
    4. قم بتحضير حصص من ATP بتركيز 20 mM في NaHCO3 بتركيز 25 mM وخزنها عند -20 ˚C حتى وقت الاستخدام.
      ​ملاحظة: قم بتحضير محلول ATP جديد كل ستة أشهر. تجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة. قم بتحضير NaHCO3 بتركيز 1 M و NaCl بتركيز 5 M (يُخزن كل منهما في درجة حرارة الغرفة). يكون NaHCO3 مستقراً في المحلول لمدة 7 أيام فقط.
  2. التحضير للتجربة
    1. قم بتربية البعوض ونقله إلى ألواح أكريليك كما هو موضح في القسمين 1 و 2.2. في حال إجراء مقارنات بين أنماط جينية مختلفة، اجعلها مجهولة بالنسبة للقائم بالتجربة.
    2. في يوم التجربة، قم بتحضير 10 mL من وجبة دم اصطناعية دنيا (110 mM NaCl، و 20 mM NaHCO3، و 1.5 mM ATP) عن طريق إضافة 750 µL من محلول ATP بتركيز 20 mM، و 220 µL من محلول NaCl بتركيز 5 M، و 200 µL من محلول NaHCO3 بتركيز 1 M إلى 8.83 mL من الماء منزوع الأيونات. اخلط المكونات جيداً عن طريق القلب.
      ملاحظة: يتم تحضير وجبة الدم الاصطناعية طازجة قبل كل تجربة.
    3. قم بإعداد تسجيل SpinView وفقاً للخطوات من 2.3.4 إلى 2.3.8.
    4. افتح ملف Arduino المسمى “Red-light-Only__BB_.ino” (أو ملف المحفز المطلوب) للتجربة.
  3. إجراء التجارب
    1. انقل باستخدام الماصة 650 µL من وجبة الدم الاصطناعية الدنيا إلى كل بئر من آبار اللوح، مع التأكد من أن الوجبة تملأ كل بئر بالكامل دون فيضان.
    2. قم بمد مربع من البارافيلم بمقاس 10.2 cm في 10.2 cm فوق حلقة قطرها 20.3 cm. ضع البارافيلم فوق اللوح، مع الضغط على الحواف حتى يلتصق. باستخدام المشرط، قم بقص حافة بعرض 1.3 cm حول اللوح وادفع البارافيلم الزائد تحت اللوح لإحكام غلق الوجبة.
    3. ضع اللوح مباشرة فوق كتلة PCR للسماح بأقصى انتقال للحرارة (الشكل 3A).
      ملاحظة: يُستخدم شريط التعتيم على سطح كتلة PCR في المدوّر الحراري الضوئي، ولكن ليس في blood blanket.
    4. ضع المزدوجة الحرارية على سطح البارافيلم في الزاوية اليمنى السفلية من اللوح الألمنيومي. قم بتوصيل الكاميرا ومصابيح LED و Arduino بالكمبيوتر. قم بتشغيل مزود الطاقة. ابدأ برنامج “BB_thermocycler_program.x50prog” على المدوّر الحراري.
      ملاحظة: يكون معدل تغيرات درجة الحرارة هو أقصى سرعة تدرج للمدوّر الحراري، وقد تم اختيارها لمحاكاة هبوط البعوضة على المضيف للتغذية بأفضل شكل ممكن.
    5. باستخدام حاوية مظلمة وإضاءة خافتة في الغرفة لتقليل التعرض للضوء، انقل لوح الأكريليك الذي يحتوي على البعوض إلى اللوح الألمنيومي، مع التأكد من محاذاة كل بئر مع البعوض. تأكد من وجود المزدوجة الحرارية في الزاوية اليمنى السفلية من اللوح وملامستها للبارافيلم لقياس درجة حرارة وجبة الدم الاصطناعية.
    6. ابدأ البرنامج عن طريق إعادة رفع برنامج “Red-light-Only__BB_.ino” في بيئة Arduino IDE. أغلق مراقب التسلسل (serial monitor). في CoolTerm، اضغط على Connect لرؤية درجة الحرارة الحالية. وباستخدام درجة الحرارة الابتدائية هذه، اضبط درجة حرارة التشغيل في نص Arduino لتكون أقل منها بحوالي 0.6 °C.
    7. في نافذة CoolTerm، اختر Capture to Text/Binary File وابدأ جمع البيانات. ابدأ تسجيل الفيديو في نافذة التسجيل في SpinView. انقر فوق Resume لإنهاء فترة التوقف في المدوّر الحراري. راقب مخرجات Arduino في CoolTerm للتأكد من اكتشاف انخفاض الحرارة وبدء التجربة.
    8. بعد انتهاء مدة التجربة، انقر فوق Stop Recording. في CoolTerm وفي علامة تبويب Capture to Text/Binary File، اختر Stop لإيقاف كتابة مخرجات التسلسل.
    9. أزل لوح البعوض من لوح blood blanket وانقله إلى الغرفة الباردة لتخديره. قم بعدد البعوض ذوي البطون المنتفخة التي تحتوي على وجبة الدم الاصطناعية كبعوض شبعان، بما في ذلك الذين تغذوا جزئياً.
    10. بين التجارب، نظف سطح كتلة PCR عن طريق المسح بـ Kimwipe مبللة بإيثانول 70%. أزل البارافيلم واشطف اللوح الألمنيومي بالماء منزوع الأيونات. كرر القسم 3.3 لإجراء تجارب إضافية. قم بتدوير ترتيب التجارب بين الأيام لتقليل تأثير دورات النشاط اليوماوي.
  4. التنظيف
    1. أوقف تسجيل جميع البرامج واخرج منها. افصل كابلات USB الخاصة بالكاميرا و Arduino ومصابيح الأشعة تحت الحمراء. أغلق الكمبيوتر. أوقف برنامج “thermocycler_program.x50prog” الذي يعمل على المدوّر الحراري.
    2. ضع ألواح البعوض في مجمد بدرجة حرارة -20 °C طوال الليل لقتل البعوض. اغسل اللوح الألمنيومي بالماء منزوع الأيونات. اغمر لوح الأكريليك بإيثانول 70%، ثم اشطفه بالماء منزوع الأيونات واتركه ليجف طوال الليل قبل تحميل المزيد من البعوض.
      ملاحظة: يجب تجفيف الألواح طوال الليل بعد الغسيل لضمان عدم بقاء أي رطوبة. ففي حالة وجود رطوبة، سيؤدي ذلك إلى تكثف الماء على الغطاء وسيتداخل مع الفيديو.

4. مقايسة التغذية عبر الغشاء البصري

  1. تجميع مكونات المقايسة (الشكل 4)
    1. قم بتجميع إطار باستخدام مكونات ميكانيكية بصرية وبقياس 30.48 سم في منصة أكريليك سوداء، بمقاس 30.48 سم وسُمك 0.635 سم. اصنع ثقباً في مركز الأكريليك بقطر 11.43 سم باستخدام قاطع ليزر. اصنع ثقوباً على بُعد 2.54 سم من كل زاوية للسماح للأكريليك بالاستناد إلى دعامات الإطار، على ارتفاع 23.495 سم تقريباً فوق القاعدة.
    2. ثبت في المركز حلقة من الأكريليك الأسود بقطر داخلي يبلغ 19.05 سم وقطر خارجي يبلغ 20.32 سم (الشكل 4-أتوجد نماذج لجميع المكونات الأكريليكية في مستودع GitHub الخاص بمغذي الغشاء البصري (https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0) جنباً إلى جنب مع برامج Arduino. انظر الشكل لمعرفة الإعداد العام (الشكل 4-أ)، المثير (الشكل 4ب)، ومخطط الدائرة (الشكل 4C)، وصورة ثابتة من الفيديو (الشكل 4د).
      ​ملاحظة: المواد المحددة المستخدمة في تجميع هذه المنصة ليست حاسمة، لذا قد تتوفر خيارات أكثر فعالية من حيث التكلفة.
    3. قم بتثبيت كاميرا مزودة بمرشح تمرير طويل للأشعة تحت الحمراء أسفل الفتحة المركزية، بحيث تكون موجهة للأعلى نحو أسطوانة البعوض. اضبط فتحة العدسة لتكون مفتوحة بالكامل، بما يسمح بالتركيز الانتقائي على الجزء الشبكي العلوي من الأسطوانة (الشكل 4A).
    4. لصنع العلب، يتم قطع أنبوب شفاف من البوليكربونات بقطر 11.43 سم إلى قطع أسطوانية بطول 12.7 سم.
      1. قم بتصنيع قواعد للعلب عن طريق قطع دوائر بقطر 11.43 سم باستخدام الليزر من أكريليك بسُمك 0.3175 سم. يتم نقش حواف الدوائر بالليزر بحيث يتم تركيبها داخل الأنبوب. ثم ثبّتها في الأنابيب باستخدام إيبوكسي بلاستيكي.
      2. اصنع غطاءً داخلياً باستخدام أكريليك أسود بسمك 0.635 سم و0.3175 سم وشبكة سوداء مقاومة للأشعة فوق البنفسجية. يتكون التصميم من حلقة داخلية بقطر 10.795 سم، وحلقة خارجية بقطر 12.065 سم، مع مد الشبكة السوداء فوق الحلقة الأصغر. يجب خياطة الشبكة عبر ثقوب مقصوصة بالليزر باستخدام خيط مشمع.
        ​ملاحظة: يجب وضع العبوات دائمًا على مناشف ورقية لتجنب خدش القواعد الأكريليكية التي يتم من خلالها تسجيل الفيديو.
    5. تصنيع حاويات أكريليك لتقديم وجبات الدم (الشكل 4أ).
      1. قص حلقة بقطر داخلي قدره 5.08 سم وقطر خارجي قدره 6.6 سم من أكريليك شفاف بسمك 0.15875 سم. قم بتثبيت هذه الحلقة بحلقة شفافة أخرى قطرها الداخلي 5.842 سم وقطرها الخارجي 6.604 سم باستخدام غراء الأكريليك.
      2. ضع أسطوانة من الشبكة المعدنية بارتفاع 13.97 سم وقطر 19.05 سم داخل الحلقة الأكريليكية السوداء في مركز المنصة.
      3. داخل الشبكة المعدنية، قم بتثبيت ملف من مصابيح RGB LED على مسافة 3.81 سم من الجدار الخارجي للوعاء، بحيث يتم التحكم فيها بواسطة لوحة Arduino Uno المستقرة على المنصة الأكريليكية السوداء (الشكل 4ج).
      4. باستخدام مقياس القدرة، قم بقياس شدة الضوء في جميع أنحاء الجزء الداخلي من الأسطوانة، واضبط موقع المصابيح بحيث تتراوح إضاءة الساحة بين 3.5-6. µواط/ملم2خارج الشبكة المعدنية، قم بتثبيت حلقة من صمامات ثنائية باعثة للضوء (LEDs) تعمل بالأشعة تحت الحمراء بطول موجي 850 نانومتر على الإطار باستخدام روابط بلاستيكية، بحيث تكون موجهة نحو الداخل.
    6. قم بتوصيل كابل USB بلوحة Arduino Uno ثم صلها بجهاز الكمبيوتر. صِل كابل USB من الكاميرا إلى جهاز الكمبيوتر. أوقف تشغيل اتصال الإنترنت.
    7. ضع بنية الغشاء الضوئي في حضانة مظلمة أو غرفة بيئية عند درجة حرارة 26 °ودرجة حرارة مئوية ورطوبة نسبية بلغت 80% طوال فترة التجارب.
  2. تحضير عبوات البعوض
    1. قبل إجراء التجربة، اغسل عبوات البعوض عن طريق رش إيثانول بتركيز 70% ومسحها برفق باستخدام إسفنجة ناعمة. اشطف العبوات بالماء منزوع الأيونات واتركها لتجف في الهواء طوال الليل.
    2. قبل يومين من التجربة، قم بفرز البعوض الذكور والإناث تحت التخدير بالبرودة، وضع 20 أنثى في كل عبوة. وفر إمكانية الوصول إلى ATR وفقاً للخطوة 1.6.
    3. في هذه المرحلة، يجب أن تظل الأنماط الجينية محجوبة عن الباحث. كما ينبغي تدوير ترتيب التجارب بين الأيام لتقليل الاختلافات في نتائج السلوك الناتجة عن التوقيت التجريبي.
  3. إجراء التجارب
    1. لتحضير وجبة الدم، ضع زجاجات ماء سعة 119 مل في 45 °حمام مائي ساخن، واحد لكل تجربة. يحافظ هذا الحجم ودرجة الحرارة على وجبة الدم قريبة من درجة حرارة الجسم طوال فترة التجربة.
    2. قم بتحضير حصص مقدار كل منها 5 مل من دم أغنام منزوع الفيبرين. تُحفظ في درجة حرارة 4 مئوية. °يُرجى رجّ الأنبوب وقلبه قبل الاستخدام لمنع الانفصال. ويجب تحضير وجبة الدم طازجة قبل كل تجربة.
      تنبيه: يجب التعامل مع دم الأغنام منزوع الفبرين مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة لتقليل التعرض لمسببات الأمراض. كما يجب نقع المواد القابلة لإعادة الاستخدام التي تلامس الدم في محلول مبيض بتركيز 10% ثم شطفها بماء منزوع الأيونات. ونظراً لأن المبيض قد يسبب تهيجاً شديداً للجلد والعينين، يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة طوال فترة التعامل معه.
    3. ضع الجزء الأول من عينة الدم في أنبوب سعة 45 °حمام مائي ساخن لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل التجربة. قم بإذابة ATP على الثلج. قم بمد قطعة بطول 5.08 سم في مربع من البارافيلم (parafilm) بمقاس 5.08 سم فوق الغطاء الأكريليكي من الجانب الذي يحتوي على الدائرة المسطحة الأكبر، وذلك لإنشاء تجويف لوجبة الدم (الشكل 4أ).
    4. امسح جهاز الكمبيوتر بإيثانول بتركيز 70% لإزالة الروائح البشرية. قم بتوصيل جهاز الكمبيوتر بمحرك أقراص صلب خارجي. قم بتوصيل الكاميرا وجهاز Arduino. صِل مصابيح RGB ومصابيح الأشعة تحت الحمراء بمصدر طاقة.
    5. افتح برنامج SpinView وملف Arduino الخاص بالمحفز المناسب. أنشئ مجلدًا على القرص الصلب الخارجي ليحتوي على بيانات التجربة. قم بتحميل "blue_only.ioملف Arduino لتوفير ضوء أزرق خافت بطول موجي 471 نانومتر من مصابيح LED RGB إلى الساحة (تبعاً لـ الشكل 4ب).
    6. دون تعريض البعوض لكميات زائدة من ثاني أكسيد الكربون (CO2)2 من النفخ، افحص العبوة الخاصة بالتجربة وسجّل أي حالات نفوق قبل بدء التجربة. ضع العبوة في المركز واتركها للتأقلم تحت ضوء أزرق خافت لمدة تتراوح بين 10 إلى 20 دقيقة قبل التعرض للمحفز.
      ​ملاحظة: يتم تنفيذ خطوة التأقلم والتجربة تحت ضوء أزرق خافت لأن الظلام التام يثبط طيران البعوض.
    7. تفعيل التقاط الفيديو
      1. في برنامج SpinView، اختر الكاميرا. في الـ الإعدادات قم بتعديل التعريض الضوئي والكسب حسب الحاجة للحفاظ على تباين عالٍ بين الحشرات فاتحة اللون والخلفية الداكنة (الشكل 4د).
      2. انقر على زر التسجيل الأحمر الموجود في الشريط العلوي لضبط إعدادات التقاط الفيديو. حدد مسار الملف من خلال النقر على تصفحثم انتقل إلى القرص الصلب الخارجي. وأنشئ مجلداً جديداً باسم وصفي لكل تجربة، مع مراعاة عدم إدراج مسافات في اسم المجلد.
      3. في الـ خيارات الحفظ علامة تبويب، تحديد التقاط 0 إطار، مما سيسمح للفيديو بالتسجيل حتى يتم إيقافه يدويًا. تحت وضع التسجيلاختر مُنظّم (مُخفّف بمحلول منظم)في علامة تبويب "الفيديوهات" (Videos)، حدد الحقول التالية: نوع تسجيل الفيديو: MJPG، حجم تقسيم ملف الفيديو: ١٠٠٠ ميجابايت، وجودة ضغط JPEG: 65.
    8. مباشرة قبل التعرض للمحفز، اسحب بالماصة 500 µلتر من ATP بتركيز 20 ملي مولار، لتحقيق تركيز نهائي قدره 2 ملي مولار من ATP، في عينة الدم المجهزة بحجم 5 مل. اقلب الأنبوب عدة مرات للمزج.
    9. صُب محلول ATP والدم في وعاء وجبة الدم. وضع فوق وجبة الدم زجاجة مقلوبة سعة 119 مل مملوءة بـ 45 °مياه لدرجة حرارة مئوية معينة للحفاظ على درجة حرارة الدم قريبة من درجة حرارة جسم الإنسان طوال فترة التجربة.
    10. في برنامج SpinView، اختر "بدء التسجيل" (Start Recording). ومن دون تحفيز البعوض بالتنفس، ضع وجبة الدم فوق الغطاء الشبكي للعبوة بحيث يتمكن البعوض من ثقب غشاء البارافيلم (parafilm) عبر الشبكة.
    11. تحميل الـ أردوينو (Arduino) برنامج لـ / لأجل “1sON_10sOFF.io” (الشكل 4ب)، أو المثير المطلوب. سيؤدي ذلك إلى إرسال ضوء أحمر بطول موجي 624 نانومتر لمدة ثانية واحدة كل 10 ثوانٍ، حتى "blue_only.ioيتم رفع الملف يدويًا. ويُعد الطول الموجي 624 نانومتر كافيًا لتنشيط CsChrimson بصريًا جينيًا.
    12. ضَع حصة الدم في الحمام المائي للتجربة التالية. بعد مرور 15 دقيقة على التجربة، اختر إيقاف التسجيلقم بتحميل "blue_only.ioملف لإيقاف تحفيز الضوء الأحمر.
    13. قم بإزالة حامل وجبة الدم وزجاجة الماء. ثم أخرج العلبة وقم بتخدير البعوض عند درجة حرارة 4 °ج. لإجراء تجارب إضافية، عد إلى القسم 4.3. افحص البعوض المخدر بصرياً لتحديد وتسجيل عدد البعوض الذي تغذى على الدم من خلال البحث عن بطن ممتلئة بالدم.
  4. تنظيف
    1. أغلق جميع البرامج. أخرج القرص الصلب الخارجي وافصله عن الكمبيوتر. أوقف تشغيل الكمبيوتر.
    2. نظف حاويات البعوض كما تم وصفه سابقاً في الخطوة 4.2.1. نظف حاملات وجبات الدم الأكريليكية. املأ وعاء بولي كربونات نصف الحجم بثلثي كمية المياه، ثم أضف 100 مل من المبيض.
    3. أضف حاملات وجبة الدم الأكريليكية والزجاجات البلاستيكية إلى الحوض. غطِّ الحوض بالغطاء واتركه منقوعاً لمدة 10 دقائق. اشطف المبيض وأزل ورق البارافيلم. افرك الأدوات بلطف واشطفها لإزالة أي بقايا دم.

5. تحليل السلوك

  1. قم بتجهيز مقاطع الفيديو للتحليل عن طريق ضغطها في ملفات بصيغة .mp4 باستخدام برنامج ffmpeg (الإصدار 8.0.1). وفي حال كانت ملفات الفيديو مجزأة، قم بدمجها في مقطع فيديو واحد باستخدام أي برنامج لتحرير الفيديو. افتح مقاطع فيديو التدريب في برنامج SLEAP (الإصدار 1.4.1) بنظام التدرج الرمادي.
    ​ملاحظة: إذا كانت إعدادات تسجيل الفيديو مناسبة، فيجب أن يكون كل شيء ضمن الإطار، وألا تظهر البعوضيات المتحركة بشكل ضبابي. يمكن استخدام برامج أخرى لتتبع أجزاء الجسم. إصدار SLEAP المستخدم في هذا البحث هو 1.4.1. يرجى الرجوع إلى وثائق SLEAP للاطلاع على البروتوكولات المحدثة.
  2. قم بإنشاء هيكل يحدد الأجزاء ذات الصلة من الحيوانات وفقاً للسلوكيات التي يتم تقييمها (الشكل 2د, الشكل 3Dو، و الشكل 4E).
  3. باستخدام الـإطار عشوائيخيار تحت الـ الإطار المقترح اختر 10 إطارات عشوائيًا وقم بتصنيف كل بعوضة كحالة منفردة. إذا كانت أجزاء معينة من البعوضة محجوبة (على سبيل المثال، عند إدخال طرف الخرطوم في الشبكة أثناء عملية السبر)، فقم بتحديد الموقع التقريبي للجزء من الجسم. قم بتدريب نموذج على الإطارات المصنفة باستخدام هذه الإعدادات.
    1. بالنسبة لنموذج متعدد الحيوانات من الأعلى إلى الأسفل (المستخدم في نموذج المدوّر الحراري البصري وبطانية الدم): في الـ مسار التدريب علامة تبويب، مجموعة أقصى عدد من الحالات إلى 14في علامة تبويب تكوين نموذج المركز (Centroid Model Configuration)، قم بضبط حجم القص إلى تلقائي، وضبط أدنى مستوى للهضبة. دلتا إلى 1e-04مجموعة بلاتوه باشيانس (Plateau Patience) إلى 10مجموعة طول الخطوة إلى 8، و الـ الجزء المُرسي بما أنك لم تقدم نصاً محدداً للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى العلمي من JoVE الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية، وسأقوم بصياغته بدقة أكاديمية ووفقاً للمعايير العلمية المتبعة. الصدر.
    2. لنموذج متعدد الحيوانات من القاعدة إلى الأعلى (المستخدم في جهاز التغذية ذو الغشاء البصري): في الـ مسار التدريب تبويب، مجموعة أقصى عدد من الحالات إلى لا يوجد حد أقصىفي علامة تبويب تكوين النموذج التصاعدي (Bottom-Up Model Configuration)، قم بضبط حجم القطع إلى تلقائي، والضبط أدنى مستوى للهضبة. دلتا إلى 1e-04مجموعة، ضبط صبر الهضبة إلى 10، والضبط طول الخطوة إلى 16.
  4. أجرِ التنبؤ على عدد محدد من الإطارات باستخدام هذه الإعدادات: في علامة تبويب خط أنابيب الاستدلال (Inference Pipeline)، بالنسبة لجهاز الدورة الحرارية البصري (opto-thermocycler) وبطانية الدم (blood blanket)، قم بضبط الحد الأقصى للحالات إلى 14, جهاز التتبع إلى بسيط, الحد الأقصى لعدد المسارات إلى 14، و ربط كسور المسار المنفرد إلى صحيح.
  5. بالنسبة لمغذي الغشاء البصري، قم بضبط لا يوجد حد أقصى لـ الحد الأقصى للحالات و الحد الأقصى لعدد المسارات, جهاز تتبع إلى بسيط، و ربط كسور المسار المنفرد إلى صحيحقم بتصحيح الإطارات المتوقعة وأعد التدريب. كرر دورات التوقع، والتوسيم، والتدريب على مجموعة بيانات التدريب.
    ملاحظة: تم إجراء التحقق من خلال الفحص العشوائي للإطارات المصنفة وتحديد الأخطاء المتكررة (مثل: الكشف الخاطئ عن البعوض، أو التنبؤات المكررة، أو التوجيه غير الصحيح، أو التعيين الخاطئ لأجزاء الجسم)، مع التركيز على الإطارات التي تحتوي على هذه الحالات الحدية. قد يتطلب الأمر فحص ما يصل إلى 150 إطاراً مصنفاً، وذلك بناءً على تكرار الخطأ. كما يوفر برنامج SLEAP مقاييس تقييم قائمة على واجهة المستخدم الرسومية (GUI) لإجراء تحقق إضافي من النموذج. وبمجرد أن يؤكد الفحص البصري تحقيق الدقة والضبط الكافيين، يتم تطبيق النموذج على الفيديوهات التجريبية وتصدير النتائج بصيغة .csv أو .h5 لتحليل السلوك. ويمكن بعد ذلك تدريب مصنفات السلوك باستخدام مخرجات تقدير الوضعية كما تم وصفه سابقاً.8تُعرّف السلوكيات على النحو التالي: المشي، وهو حركة الجسم الانتقالية مع حركة الأرجل؛ الطيران، وهو حركة انتقالية سريعة مع بسط الأجنحة؛ التنظيف، وهو حركات أرجل تكرارية فوق أجزاء الجسم (قرون الاستشعار، أو الخرطوم، أو الأجنحة، أو الأرجل)؛ والجس، وهو إدخال الخرطوم عبر الشبكة الموجودة في قاع الحاوية. ويجب أن تحقق مصنفات السلوك >دقة بنسبة 90% مقارنة بالتوصيفات البشرية.
  6. أجرِ التحليل الإحصائي باختيار الاختبارات غير المعلمية (non-parametric tests) نظراً لأن البيانات لا تتبع عادةً التوزيع الطبيعي. أجرِ اختبارات المقارنة البعدية (post-hoc tests) المناسبة مع تصحيح المقارنات المتعددة. وبالنسبة لبيانات الامتلاء (engorgement data)، فإن المكررات التجريبية هي مجموعات من البعوض، بينما تكون المكررات في بيانات السلوك هي بعوضات منفردة.

النتائج

استُخدمت ثلاثة اختبارات سلوكية لمراقبة سلوكيات البحث عن العائل والتغذية على الدم في البعوض، كما هو موضح في الشكل 1A. رُبيت البعوضات تحت دورة ضوء أزرق-ظلام (14:10 LD؛ الشكل 1B) لمزامنة الإيقاعات اليوماوية، مما يسمح بإجراء التجارب خلال فترات اليقظة. وقبل يومين من التجارب، نُقلت البعوضات إلى ظلام تام وزُوِّدت بالعامل المساعد للأوبسين ATR. إذا كانت البعوضات غير متزامنة أو لم يتم تغذيتها بـ ATR، فسوف تظهر نشاطاً منخفضاً في الاختبارات السلوكية. وكانت الأنماط الجينية المستخدمة في كل اختبار هي Gr3>CsChrimson ومجموعتين ضابطتين جينياً: خط المحرك Gr3-QF2 وخط المؤثر QUAS-CsChrimson.

يسمح مقايسة الدورة الحرارية البصرية (القسم 2) بتقييم استيقاظ البعوض وسلوك السبر لفترات طويلة استجابةً لمحفزات الحرارة والضوء. يحاكي إيصال الحرارة اقتراب البعوضة من مضيف دافئ الدم، بينما يحاكي إيصال الضوء لمدة 5 ثوانٍ زفيراً طويلاً للنفس33. يتيح استخدام جهاز الدورة الحرارية تسخيناً وتبريداً سريعاً للسطح يتزامن مع التنشيط البصري الوراثي عبر مزدوجة حرارية ومتحكم دقيق (الشكل 2A, B). وُضعت الأنماط الجينية الثلاثة للبعوض في ألواح أكريليك ذات آبار معزولة وقيعان شبكية تظهر فيها سلوكيات المشي والطيران والسبر (الشكل 2C). تم اكتشاف موضع أجزاء جسم البعوض باستخدام خوارزميات تتبع الوضعية، مثل SLEAP34 و DeepLabCut35 (الشكل 2D, E). يمكن استخدام خوارزميات تصنيف السلوك بدءاً من تتبع الوضعية (مثل SimBA36 و A-SOiD37) أو مدخلات الفيديو (مثل FERAL38). يوضح الشكل 2E تسميات SLEAP أثناء الطيران والمشي والسبر، وهي سلوكيات أساسية في البحث عن المضيف والتغذية. يمكن تصنيف هذه السلوكيات من خلال سرعة الصدر والمسافة بين قاعدة طرف الخرطوم. وهنا، يتم عرض مخرجات تتبع السلوك باستخدام APT و JAABA39. تعرضت البعوضات إما لزيادة في الحرارة، أو محفز ضوئي، أو لمحفزي الحرارة والضوء معاً في آن واحد، تليها فترة استراحة لمدة 20 min قبل المحفز التالي8 (الشكل 2F). عند التعرض للحرارة، تظهر جميع الأنماط الجينية الثلاثة فترة قصيرة من السبر (الشكل 2G). والأهم من ذلك، عند التعرض لمحفز ضوئي لمدة 5 ثوانٍ، تصبح بعوضات Gr3>CsChrimson مستيقظة أو "منشطة"، حيث تظهر زيادة في سلوك المشي والطيران تستمر لمدة تصل إلى 10–15 min. كما تظهر البعوضات سلوك السبر، والذي يُعرف بأنه الإدخال المتكرر للخرطوم في القاع الشبكي للألواح. تم رسم البيانات كسلوك فردي للبعوض (الشكل 2G) ونسبة جميع البعوضات التي أظهرت كل سلوك بمرور الوقت (الشكل 2H). تتيح الدورة الحرارية البصرية تحفيزاً بصرياً وراثياً وحرارياً دقيقاً ومتكرراً عبر عدة أفراد، مما يجعلها أداة مفيدة لدراسة سلوك الاستيقاظ والسبر.

يعتمد اختبار بطانية الدم (القسم 3) على اختبار المدوّر الحراري البصري، ولكنه يوفر وجبة دم اصطناعية دنيا مستساغة بحيث يمكن قياس مقدار امتلاء البعوض بالدم (الشكل 3A). تم تطبيق نبضة من الضوء الأحمر (~627 nm) لمدة 5 ثوانٍ لتنشيط العصبونات الحسية لـ CO2 بصرياً وراثياً، وتم تسخين الطبقة الرقيقة من وجبة الدم الاصطناعية من 25 °C إلى ~35 °C (كما تم قياسها عند السطح بواسطة مزدوجة حرارية؛ الشكل 3B). تم تقديم وجبة دم اصطناعية لكل من الأنماط الجينية الثلاثة في طبق تغذية من الألمنيوم (الشكل 3C). حيث عُرضت وجبة دم اصطناعية في طبق تغذية من الألمنيوم على كل من بعوض Gr3-QF2 وQUAS-CsChrimson وGr3>CsChrimson (عدد = 10 تجارب لكل مجموعة جينية، 14 بعوضة لكل منها) (الشكل 3C). ولقياس امتلاء البعوض بمرور الوقت طوال التجربة، استُخدم برنامج SLEAP لتتبع نقاط على جسم البعوضة. تم ذلك من خلال إنشاء هيكل يتضمن 5 عقد على بطن البعوضة (الشكل 3D). وفي نهاية كل تجربة، تم عد عدد البعوض الممتلئ يدوياً. وأظهرت خطوط البعوض الضابطة، Gr3-QF2 وQUAS-CsChrimson، متوسط امتلاء متماثلاً (الشكل 3E، p = 0.401). وفي المقابل، أظهر الخط Gr3>CsChrimson معدلات تغذية أعلى بكثير، بمتوسط معدل امتلاء بلغ 53% (الشكل 3E، p = 0.00078 مقارنة بـ Gr3-QF2 وp = 0.00097 مقارنة بـ QUAS-CsChrimson). مُثلت البيانات باستخدام مخططات الكمان والمخططات الصندوقية (الوسيط، والمدى الربيعي، والمدى)، وحُللت باستخدام اختبار Kruskal-Wallis واختبار Dunn مع تصحيح Holm عند عتبة دلالة p < 0.05. تم تحديد امتلاء الحيوان الفردي بمرور الوقت كالتغير في مساحة البطن المحاطة بـ 5 عقد (الشكل 3F). وتظهر هذه النتائج أنه يمكن استخدام اختبار بطانية الدم لتقييم آثار التنشيط البصري الوراثي للمجموعات العصبونية المستجيبة لـ CO2 على سلوك الامتلاء لدى البعوض عند تغذيته على وجبة دم اصطناعية.

يتيح مقايسة التغذية عبر الغشاء البصري (القسم 4)، حيث يتم توفير وجبة دم دافئة للبعوض في ساحة أسطوانية، دراسة انجذاب البعوض إلى مصدر الدم ومدى الامتلاء. ولتحديد ما إذا كان التنشيط البصري الوراثي للعصبونات الحسية لـ CO2 كافياً لإحداث الانجذاب إلى مصدر الدم والتغذية عليه، تم تعريض بعوض Gr3>CsChrimson وبعوض التحكم (n = 10 لكل نمط جيني، حيث تشير n إلى عدد التجارب التي أجريت، مع وجود 20 بعوضة في كل عبوة لكل تجربة) لوجبة دم دافئة في وحدة التغذية عبر الغشاء البصري تحت التعرض لنبضة متكررة من الضوء الأحمر الساطع لمدة 1 ثانية كل 10 s لمدة 15 min (الشكل 4B). ولقياس الانجذاب إلى وحدة التغذية عبر الغشاء، تم استخدام نموذج SLEAP بثلاث نقاط لتتبع الرأس والصدر والبطن للبعوض الذي هبط، مع حساب عدد البعوض الموجود ضمن المنطقة ذات الأهمية (الشكل 4D، الشكل 4E). أظهر بعوض Gr3>CsChrimson زيادة في الانجذاب إلى منطقة وجبة الدم بمرور الوقت مقارنة بمجموعة التحكم Gr3-QF2 (الشكل 4F، p = 0.027). ولم يظهر بعوض Gr3>CsChrimson انجذاباً أعلى من الناحية الإحصائية مقارنة بـ QUAS-CsChrimson (الشكل 4F، p = 0.310). تم تحديد مجموعات الدلالة باستخدام اختبار Kruskal-Wallis، يليه اختبار Dunn مع تصحيح Holm. وقد تم تحديد عتبة الدلالة عند p < 0.05. رُسمت البيانات كمتوسط النسبة المئوية للبعوض المنجذب إلى وجبة الدم، مع إظهار المنطقة المظللة للخطأ المعياري. أظهرت الأنماط الجينية للتحكم Gr3-QF2 و QUAS-CsChrimson معدلات امتلاء مماثلة بلغت 26% و 29% على التوالي، والتي تم تقييمها يدوياً كما هو موضح (الشكل 4G، p = 0.351). في المقابل، أظهر بعوض Gr3>CsChrimson معدل امتلاء أعلى بشكل ملحوظ من أي من مجموعتي التحكم، حيث بلغ في المتوسط 61% (الشكل 4G، p < 0.001 مقابل Gr3-QF2 و p = 0.002 مقابل QUAS-CsChrimson). رُسمت البيانات في شكل مخططات كمان ومخططات صندوقية (الوسيط، والمدى الربيعي، والمدى) وحُللت باستخدام اختبار Kruskal-Wallis واختبار Dunn مع تصحيح Holm عند عتبة دلالة p < 0.05. تشير هذه النتائج إلى أن مقايسة التغذية عبر الغشاء البصري هي وسيلة فعالة لتقييم آثار التنشيط البصري الوراثي لعصبونات CO2 على انجذاب البعوض وامتلاءه من وجبة الدم.

مخطط مقايسة سلوك البعوض؛ الطرق: جهاز التدوير الحراري البصري (opto-thermocycler)، الغطاء الدموي؛ المحفزات: الحرارة، CO2.
الشكل 1: المقايسات والتربية المخصصة لعلم البصريات الوراثي في البعوض. (A) مخطط توضيحي لسلوكيات البحث عن المضيف لدى البعوض مع خصائص مقايسات السلوك المعروضة. وتُشير الأشرطة الرمادية إلى خطوات البحث عن المضيف التي يتم قياسها بواسطة كل مقايسة سلوكية. (B) الجدول الزمني لتربية البعوض من أجل تجارب علم البصريات الوراثي. قام المؤلفون بإنشاء الشكل 1 لهذا المنشور باستخدام برنامج Adobe Illustrator، ولا يتطلب استخدامه أي ترخيص. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

سلوك البعوض، دورة حرارية بالأشعة تحت الحمراء، إعداد إضاءة LED حمراء، تحليل بياني، استجابة للمحفز.
الشكل 2: يقوم جهاز الدورة الحرارية الضوئي (opto-thermocycler) بقياس سلوكيات الاستثارة والبحث أثناء التنشيط الضوئي الوراثي. (A) مخطط تخطيطي لمقايسة الدورة الحرارية الضوئية تتكون من لوحة من البعوض على كتلة جهاز الدورة الحرارية PCR مع مصابيح LED علوية وكاميرا. (B) مخطط الدائرة للمتحكم الدقيق الذي يكتشف درجة حرارة الدورة الحرارية ويتحكم في مصابيح LED. تم إنشاء مخطط الدائرة باستخدام Fritzing بموجب ترخيص CC-BY-SA 3.0 (https://github.com/fritzing/fritzing-app/blob/develop/README.md). ويسمح هذا الترخيص أيضاً بإعادة استخدام الصورة بالكامل، شريطة تقديم الائتمان المناسب. (C) صورة ثابتة من المقايسة تصور اللوحة الأكريليكية التي تتسع لما يصل إلى 14 بعوضة. يوجد المزدوج الحراري في البئر السفلي الأيمن. (D) الهيكل العظمي للبعوض المستخدم في نموذج SLEAP لتقدير الوضعيات. تشمل النقاط المحددة على الجسم: طرف وقاعدة الخرطوم، المستخدمان للكشف عن سلوك السبر (موضح باللون الأحمر)؛ والأرجل الأمامية، حيث تتصل بالصدر، وحيث يتصل الفخذ بالساق، وحيث تتصل الساق بالرسغ (موضح باللون الأزرق)؛ وطرف البطن (موضح باللون الأصفر). تم استخدام نموذج متعدد الحيوانات من الأعلى إلى الأسفل. استُخدمت أدوات تقدير الوضعيات ومصنفات السلوك لقياس استثارة البعوض وسلوك السبر. (E) أمثلة على مشي البعوض وطيرانه وسبره، مع تراكب تنبؤات SLEAP في الأعلى. يُستخدم المشي والطيران كمقاييس سلوكية للاستثارة. (F) مخرجات تقديم المحفز. تشير الخطوط المتموجة الصفراء إلى محفزات حرارة درجة حرارة الجسم، وتشير مصابيح LED الحمراء إلى محفزات الضوء الأحمر. (G) مخططات إيثوجرام لسلوكيات المشي والطيران والسبر لبعوض Gr3-QF2 و QUAS-CsChrimson و Gr3>CsChrimson (العدد = 22–23 بعوضة فردية لكل نمط جيني) بعد تقديم المحفز. (H) سلوك طويل الأمد بعد التنشيط الضوئي الوراثي في بعوض Gr3>CsChrimson (العدد = 68–70 بعوضة فردية). تم إنشاء لوحات الشكل A–E بواسطة المؤلفين لهذا المنشور باستخدام Adobe Illustrator، ولا يلزم ترخيص حقوق طبع ونشر لاستخدامها. البيانات في (F–H) مأخوذة من Sorrells et al, 2022، بموجب ترخيص CC BY 4.08. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

إعداد تجربة تغذية البعوض، ومخططات تحليل البيانات، ومخطط لوجبة دم اصطناعية، ورسم بياني لدرجة الحرارة.
الشكل 3: يقيس مقايسة غطاء الدم كمية الامتلاء استجابة للتنشيط البصري الوراثي. (A) مخطط لمقايسة غطاء الدم. يتم وضع البعوضة في قفص أكريليك حيث يتم تقديم دم اصطناعي متاح أسفل شاشة شبكية. (B) قراءة لدرجة الحرارة ومحفز الضوء الأحمر من المقايسة. (C) مخطط لمجموعة لوحة تغذية غطاء الدم المصنوعة من الألومنيوم. (D) تضمن هيكل SLEAP المستخدم لتقدير الوضعية النقاط الموضحة في الشكل 2D، بالإضافة إلى أربع نقاط على طول جانبي البطن حيث تلتقي بالصدر، وحواف الجزء الأكثر سمكاً من البطن. تم قياس الامتلاء كالمساحة داخل النقاط الخمس على طول محيط البطن باستخدام تنبؤات من نموذج متعدد الحيوانات من الأعلى إلى الأسفل. (E) مخطط كمان يوضح متوسط النسبة المئوية للامتلاء من وجبة الدم الاصطناعية لكل نمط جيني (n = 10 تجارب، بمعدل 14 بعوضة لكل تجربة لكل نمط جيني). تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار Kruskal-Wallis، يليه اختبار Dunn مع تصحيح Holm. تشير الأحرف المختلفة إلى وجود دلالة إحصائية p < 0.05 بين المجموعات، بينما لا تختلف المجموعات التي تحمل نفس الحرف عن بعضها البعض بشكل ملحوظ إحصائياً. (F) الامتلاء بمرور الوقت في حيوان Gr3>CsChrimson، مقاساً بمساحة البطن. يعرض خط الاتجاه الأحمر نافذة منزلقة مدتها 30 ثانية على مدار ثماني دقائق من التجربة، حيث تمثل x = 0 الوقت الذي يبدأ فيه الامتلاء. جميع المخططات في الشكل 3 تم إعدادها من قبل المؤلفين لهذا المنشور باستخدام Adobe Illustrator، ولم تكن هناك حاجة لترخيص حقوق الطبع والنشر لاستخدامها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

إعداد علم البصريات الوراثي للبعوض؛ التحكم في ضوء RGB؛ أردوينو؛ وجبة دم؛ رسم بياني لنسبة الجذب؛ النتائج.
الشكل 4: يقيس اختبار وحدة التغذية ذات الغشاء البصري الجذب والتغذية على الدم. (A) مخطط تخطيطي لوحدة التغذية ذات الغشاء البصري مع المكونات الفردية. (B) الجدول الزمني لتجارب الاختبار. يمثل الخط الأزرق ضوءاً أزرق خافتاً طوال فترة التأقلم والتجربة. يظهر جزء من المحفز التجريبي، وهو يمثل نبضات من الضوء الأحمر مدتها 1 ثانية تفصل بينها 10 s. (C) رسم تخطيطي يوضح توصيلات وحدة التغذية ذات الغشاء البصري. تم إنشاء مخطط الدائرة باستخدام Fritzing بموجب ترخيص CC-BY بواسطة المؤلفين. (D) إطار نموذجي من فيديو وحدة التغذية ذات الغشاء البصري. يتم عد البعوض الموجود داخل الدائرة الحمراء لتحديد نسبة الجذب. (E) أمثلة لبعوضة غير متغذية وبعوضة ممتلئة بالدم، مع تحديد الرأس والصدر والبطن بواسطة نموذج تتبع SLEAP الخاص بوحدة التغذية ذات الغشاء البصري. تم استخدام نموذج SLEAP متعدد الحيوانات من الأسفل إلى الأعلى لقياس الجذب إلى المنطقة المستهدفة حيث توضع وجبة الدم. (F) رسم بياني خطي يوضح متوسط نسبة الإشغال في منطقة وجبة الدم (والتي تُستخدم كمقياس سلوكي للهبوط) بمرور الوقت، حسب النمط الجيني (n = 10 تجارب تضم 20 بعوضة لكل نمط جيني). يتم رسم المتوسط كل 30 s. تمثل المناطق المظللة الخطأ المعياري. تم تحديد الدلالة الإحصائية بواسطة اختبار Kruskal-Wallis، يليه اختبار Dunn مع تصحيح Holm. تمثل الحروف المختلفة مجموعات ذات دلالة إحصائية؛ تم تحديد العتبة عند p < 0.05. (G) مخطط كمان يوضح متوسط نسبة الامتلاء بوجبة الدم حسب النمط الجيني. في (F, G)، تم تحديد الدلالة الإحصائية بواسطة اختبار Kruskal-Wallis، يليه اختبار Dunn مع تصحيح Holm. الأنماط الجينية المدرجة بنفس الحرف لا تختلف عن بعضها البعض بشكل ملحوظ. تم تحديد عتبة الدلالة عند p < 0.05. تم إنشاء الشكل 4 باستخدام Adobe Illustrator، وجُمعت بياناته بواسطة المؤلفين لهذا المنشور، ولم يتطلب الاستخدام أي ترخيص حقوق طبع ونشر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

تصف هذه الورقة بروتوكولات مفصلة لتقييم مدى كفاية أنواع الخلايا العصبونية في تحفيز خطوات جذب المضيف والعض. يتكون سلوك العض من سلسلة من الخطوات السلوكية، بدءاً من الكشف بعيد المدى وصولاً إلى الجذب قصير المدى، ثم ثقب الجلد، وأخيراً الارتواء. من حيث المبدأ، يمكن للأنواع العصبونية أن تتحكم في إجراءات أو خطوات محددة، أو توجه السلوك نحو تسلسلات معينة، أو تزيد من مدة السلوك بأكمله، أو تلعب أدواراً أخرى عديدة. وبالتالي، فإن المقاييس المتعددة المقدمة ضرورية لتحليل الوظيفة العصبونية في هذه العملية.

يمكن أن تؤدي العديد من الأخطاء الشائعة إلى استجابات ضعيفة للبعوض في هذه المقايسات. يمكن تجنب انخفاض النشاط والتغذية من خلال إجراء التجارب خلال ذروة نشاط البعوض، بالقرب من أوقات الانتقال بين دورات الضوء والظلام في غرف تحضينها. قد تعود معدلات التغذية الضعيفة في غطاء الدم ومغذي الغشاء البصري (opto-membrane feeder) إلى رداءة جودة وجبة الدم الاصطناعي أو درجة الحرارة غير الصحيحة. تأكد من أن جميع الكواشف (NaHCO3، وATP، ودم أغنام منزوع الفبرين) غير منتهية الصلاحية ومخزنة بشكل صحيح. ويُنصح بتحضير جميع المحاليل في يوم التجربة لضمان أقصى درجات النضارة. تأكد من أن طبق غطاء الدم يلامس مباشرة سطح كتلة جهاز المدوّر الحراري للـ PCR. قد تتراكم التكثيفات على أطباق المدوّر الحراري البصري (opto-thermocycler) وغطاء الدم في حالة وجود رطوبة متبقية. قبل بدء التجارب، ضع الأطباق على مناشف ورقية لامتصاص أي رطوبة. عند حدوث استجابة بصرية وراثية ضعيفة، تأكد من أن عمر البعوض لا يقل عن أسبوع واحد وأنه يحصل على وقت كافٍ للتغذية على ATR، حيث إنه عامل كيميائي مساعد ضروري لقنوات CsChrimson.

لقد تم تطوير أدوات علم البصريات الوراثي (Optogenetics) التي تكون حساسة لأطوال موجية تتراوح من الأزرق (~450 nm) إلى الأحمر (~650 nm)، وهو ما يشمل الطيف المرئي. ويعد الضوء الأحمر مفيداً بشكل خاص في الحشرات، حيث تظهر عادةً حساسية منخفضة و/أو استجابات سلوكية محدودة لهذه الأطوال الموجية40. ومن المثير للاهتمام أن البعوض يظهر انجذاباً أثناء الطيران إلى بقع من المحفزات البصرية ذات الأطوال الموجية الطويلة الموجودة في درجات ألوان بشرة الإنسان41. وبناءً على ذلك، قد يكون استخدام الضوء الأحمر قيداً يؤدي إلى تداخل في تفسير التنشيط البصري الوراثي في اختبارات انجذاب البعوض للعائل. ومع ذلك، أظهرت بعوض المجموعات الضابطة جينياً  التحكم استجابات طفيفة للضوء الأحمر المطبق على نطاق واسع، حتى عند شدات قوية (Figures 2–4). ويُوصى باستخدام مجموعات ضابطة جينياً تفتقر إما إلى البناءات المحفزة (driver) أو المنفذة (effector)، بالإضافة إلى مجموعات ضابطة بدون ضوء، لضمان تفسير التأثيرات السلوكية بدقة. وغالباً ما تُستخدم مجموعة ضابطة تفتقر إلى العامل المساعد للرودوبسين ATR في تجارب علم البصريات الوراثي في أنواع أخرى؛ ومع ذلك، فإن غذاء الأسماك المستخدم في تغذية يرقات البعوض يحتوي على فيتامين A، وهو السلف لـ ATR، لذا فإن هذا الضابط يكون أقل فعالية في هذا النظام.

تقتصر المحفزات البصرية الوراثية المعروضة هنا على المحفزات المستمرة ذات شدة الضوء القابلة للتعديل. ومن المرجح أن تؤدي المحفزات البصرية الوراثية التي تحاكي أنماط النشاط العصبي الطبيعي بدقة إلى استثارة السلوك المراد دراسته. لذا، إذا كانت التسجيلات العصبية متاحة، يمكن تصميم المحفز ليتطابق مع الشدة والديناميكيات الزمنية الملحوظة. وعندما لا تكون هذه المعطيات معروفة، يمكن فحص وظائف الخلايا العصبية باستخدام محفزات وسياقات سلوكية مختلفة، مع مراعاة أن النتائج قد لا تعكس وظيفة الخلايا العصبية في السلوك الطبيعي. ومع ذلك، يمكن استخدام تحفيز نشاط الخلايا العصبية خارج النطاق الطبيعي لاستكشاف الدوائر أو الخصائص السلوكية بطرق فريدة، تماماً كما يمكن استخدام الفيزيولوجيا الكهربائية لسبر الخصائص الخلوية. حالياً، استُخدمت الأدوات البصرية الوراثية فقط في الخلايا العصبية الحسية لدى البعوض، وهو تطبيق يوفر بعض المزايا مقارنة بتقديم المحفزات الطبيعية. تعتمد الاستراتيجيات التقليدية لقياس بحث البعوض عن العائل على تقديم غاز CO2 الحقيقي. ويتطلب استخدام CO2 الحقيقي تدفق هواء مفلتر ومرطب، وهو ما يستلزم إعدادات تجريبية معقدة للتمكن من تقديمه وإزالته بدقة في فترات زمنية قصيرة9,10,42,43. وبما أن تدفق الهواء والرطوبة يمثلان كلاهما إشارات لجذب البعوض وتوجيهه، فإن التفعيل البصري الوراثي يعد وسيلة جذابة لدراسة تأثيرات المحفزات الشمية بشكل منفصل عن هذه المحفزات الأخرى. كما استُخدمت الأدوات البصرية الوراثية سابقاً لدراسة تأثير الجنس والحالة الفيزيولوجية على السلوك8، مما قدم رؤى حول هذه التساؤلات الهامة في بيولوجيا البعوض.

بعيداً عن علم البصريات الوراثي، تعتمد هذه البروتوكولات على مقاييس قياسية استُخدمت لتقييم سلوك البعوض وتتسم ببعض المحدوديات. ولتسهيل عملية التنظيف، تستخدم "بطانية الدم" وجبة اصطناعية تحتوي فقط على المواد المذاقية اللازمة لكي يتغذى البعوض حتى الامتلاء. ويمكن التغلب على هذا القصور باستخدام الدم (كما هو الحال في مغذي الغشاء البصري الوراثي) أو المواد المحاكية حيوياً التي تعيد إنتاج جوانب من أنسجة العائل. يتم تسليم الحرارة في جهاز التدوير الحراري البصري وبطانية الدم إلى البعوض الذي يمشي أو يقف بدلاً من البعوض الطائر، وتكون هذه العملية محدودة بسرعة تدرج جهاز التدوير الحراري الخاص بتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لذا، فإن هذه المقاييس قادرة على اكتشاف سلوك السبر والامتلاء ولكنها لا ترصد الجذب. وثمة قصور آخر في المقاييس القائمة على المختبر يتمثل في أنه لفهم التأثير السلوكي لإشارات محددة، يتم استبعاد الإشارات الأخرى التي يستخدمها البعوض. ومن الممكن ابتكار مقاييس مختبرية ومقاييس شبه ميدانية تزداد تعقيداً لدراسة جوانب إضافية من البيئات الطبيعية التي يتغذى فيها البعوض على عوائله.

تتمثل إحدى القيود الأخرى لتقنية علم البصريات الوراثي في البعوض في أنه تم إنشاء عدد قليل من خطوط التشغيل بخلاف تلك الخاصة بالخلايا العصبية الحسية. وبالتالي، سيتحقق كامل إمكاناتها عندما يتم دمجها مع محركات يتم التعبير عنها في الخلايا العصبية البينية التي لا يمكن تحفيزها مباشرةً عبر الطرق الأخرى. تفتح الموارد الناشئة حديثاً، مثل أطلس خلايا بعوض Aedes aegypti، الباب أمام التقدم في علم الوراثة العصبية للبعوض44. وسيكون العمل المستقبلي مطلوباً لتطوير مثل هذه المحركات لسبر الدوائر العصبية للبعوض. وبالمثل، هناك حاجة إلى أدوات إضافية من علم البصريات الوراثي للتثبيط لتحديد ما إذا كان نوع معين من الخلايا العصبية ضرورياً لسلوك معين. وعلى الرغم من أن المقاييس المقدمة في هذا البحث مصممة لقياس جذب العائل والتغذية على الدم، إلا أنه يمكن توسيع هذه النهج لدراسة خطوات إضافية من البحث عن العائل وسلوكيات مثل التزاوج، ووضع البيض، والتغذية على الرحيق. ستوفر دراسات علم البصريات الوراثي رؤى جديدة حول كيفية التحكم في سلوك البعوض على مستوى الدوائر العصبية، وقد تؤدي إلى نهج جديدة لمنع انتشار الأمراض التي ينقلها البعوض.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

نتوجه بالشكر إلى كيم ليزون-جيدا، وفرناندا ميديروس كونتيني، وياويو جياو على تعليقاتهم حول المخطوطة. تم تمويل هذا البحث من خلال منحة NIH رقم DP2AI177891. كما نشكر وحدة التقنيات العصبية الممولة من معهد ييل كافلي لعلوم الأعصاب على المشورة الفنية. T.S. باحث ضمن برنامج HHMI Freeman Hrabowski Scholar.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1⁄أكريليك أسود مقاس 8 بوصاتMcMaster-Carr8650K32بنية وحدة التغذية ذات الغشاء الضوئي
1⁄أكريليك شفاف مقاس 8 بوصاتMcMaster-Carr8536K134أسطوانة تغذية الغشاء البصري
¼ أكريليك أسود بمقاس بوصةMcMaster-Carr8560K259بنية مغذي الغشاء البصري
محول التيار المترددJameco ReliaPro2197581هيكل وحدة تغذية ذات غشاء بصري
غراء أكريليكشركة United States Plastic Corp 97562عبوة تغذية ذات غشاء بصري، قفص الغطاء الدموي
أدينوسين 5′ملح ثنائي الصوديوم المميأ لـ -تراي فوسفاتSigma AldrichA6419-1Gوجبة دم اصطناعية
الكل-ترانس-ريتينالSpectrum ChemicalR3041-1GMالتربية باستخدام علم البصريات الوراثي
لوحة تجارب ألومنيوم (Aluminum Breadboard)ThorlabsMB12هيكل وحدة التغذية بالغشاء الضوئي
صفيحة ألومنيوم 0.03125 بوصةMcMaster-Carr89015K11طبق تغذية بغطاء دموي
صفيحة ألومنيوم 0.0625 بوصةMcMaster-Carr89015K37طبق تغذية بغطاء دموي
متتبع أجزاء الحيوان (APT)مختبر برانسون في HHMI Janelia Farmيرجى تزويدي بالنص المصدر باللغة الإنجليزية لكي أتمكن من ترجمته إلى اللغة العربية وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.الإصدار 3.0، بيانات مستنسخة بواسطة جهاز المدوّر الحراري البصري (الشكل 2)، تم التنزيل في 9 يوليو 2020
بيئة تطوير Arduino المتكاملة (Arduino IDE)أردوينو (Arduino)نظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى العلمي المطلوب ترجمته من اللغة الإنجليزية إلى اللغة العربية، وسأقوم بتنفيذه وفقًا للمعايير المهنية والأكاديمية المحددة.الإصدار 1.8.12، المستخدم للتحكم في المنبهات لجهاز المدوّر الحراري البصري، والبطانية الدموية، &مُغذي الغشاء البصري والكهربائي (amp; opto-membrane feeder)
لوحة المتحكم الدقيق Arduino Uno Rev3أردوينو (Arduino)A000066 برمجة مغذي الغشاء البصري
شبكة نافذة من الألياف الزجاجية سوداء اللونمنتجات متميزة رائدة IHLRS3684BLقفص تغطية الدم
شريط لاصق أسودThorlabsT137-2.0جهاز التدوير الحراري الضوئي
أربطة ربط بلاستيكية سوداء أربطة الكابلات وغيرهاct242هيكل تغذية الغشاء البصري
ستارة تعتيممتجر الأدوات6520SFجهاز التدوير الحراري الضوئي وبطانية تدفئة الدم
أضواء LED الزرقاء21LEDUSARB5730BLWPتربية البعوض
زجاجةزجاجة SKS &التعبئة والتغليف0604-07سخان دم بمغذٍ غشائي بصري
حبيبات تغذية الأسماك القاعيةواجهة برمجة التطبيقات5352983تغذية اليرقات
كاميراالذبابة السوداءU3-13S2M-CS, FLIتسجيل الفيديو للمقايسات
عداد النقراتيولاين (ULine)H-7350تقليل كثافة اليرقات
كمبيوترAsus X1407Qإجراء المقاييس التحليلية
مبيض مركز (8.25% هيبوكلوريت الصوديوم)VWR89501-620تنظيف وحدة تغذية الغشاء الضوئي
كول تيرم (CoolTerm)برمجيات روجر ماير المجانيةبما أنه لم يتم تقديم نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته من اللغة الإنجليزية إلى اللغة العربية، وسأقوم بمعالجته وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.الإصدار 2.0.1، المستخدم في تسجيل المنفذ التسلسلي لجهاز المدوّر الحراري البصري، والبطانية الدموية، &مغذّي الغشاء البصري-التضخيمي (opto-membrane feeder)
دم أغنام منزوع الفيبرين مختبرات هيموستات (Hemostat Laboratories) DSB100وجبة دم لجهاز التغذية ذو الغشاء البصري (opto-membrane feeder)
برغي سداسي الرأس ذو قمة مقببة 4-40McMaster-Carr92949A105طبق تغذية بغطاء دموي
إيبوكسيLoctite1363118صفيحة أكريليك لجهاز التدوير الحراري الضوئي، هيكل وحدة تغذية الغشاء الضوئي
إيثانولDecon Labs2716التطهير
محرك أقراص صلب خارجيLaCieLAC9000298تخزين الفيديو
ffmpegFFmpegنظرًا لعدم وجود نص مصدر، يرجى تزويد النص الإنجليزي المراد ترجمته.الإصدار 8.0.1، المعالجة المسبقة للفيديو
فتيل قطني بطول أربع بوصاتريتشموند دينتال (Richmond Dental)201226تغذية البعوض البالغ
GitHubGitHub, Incلم يتم توفير نص للترجمة. يرجى تزويد النص الإنجليزي المطلوب ترجمته.مستودعات الأكواد، وملفات الأجزاء، ونماذج SLEAP الخاصة بجهاز المدوّر الحراري الضوئي (opto-thermocycler) (الإصدار 1.0.0، https://github.com/sorrellslab/opto-thermocycler/releases/tag/v1.0.0)، وبطانية الدم (blood blanket) (الإصدار 1.0.0، https://github.com/sorrellslab/bloodblanket/releases/tag/v1.0.0)، ومغذي الغشاء الضوئي (opto-membrane feeder) (الإصدار 1.0.0، https://github.com/sorrellslab/opto-membranefeeder/releases/tag/v1.0.0)
المجموعة 3>CsChrimsonلا ينطبقنظرًا لعدم وجود نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية وفقًا للمعايير المذكورة.تم إعداده خصيصاً لهذه الدراسة، كما هو موضح في الخطوة 1.2
بعوض Gr3-QF2ليس لديك أي نص لترجمته. يرجى تزويدي بالنص المصدر باللغة الإنجليزية لكي أتمكن من ترجمته إلى اللغة العربية وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.بما أنه لم يتم توفير نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي المراد ترجمته لكي أتمكن من تحويله إلى اللغة العربية وفقاً للمعايير العلمية والمهنية المحددة.كاشف جيني، DOI: 10.1016/j.cell.2013.12.044
حضّانة ذات باب معتمكارون7340-25تربية البعوض
صمام ثنائي باعث للضوء بالأشعة تحت الحمراءAdafruit387جهاز الدورات الحرارية الضوئي وبطانية تدفئة الدم
شريط صمامات ثنائية باعثة للضوء بالأشعة تحت الحمراء (Infrared LED Strip)إضاءة Waveform7031.85جهاز تدوير حراري ضوئي، وبطانية دم، وبنية غشائية ضوئية
مرشح تمرير الأشعة تحت الحمراءEdmund Optics65-796تسجيل مقاطع الفيديو للمقايسات 
قفص حشراتBugdormDP1000قفص البعوض البالغ
أداة جانيليا الآلية لتعليق سلوك الحيوان (JAABA)مختبر برانسون في مزارع جانيليا التابعة لمعهد هوارد هيوز الطبي (HHMI)لم يتم تقديم نص للمراجعة. يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.بيانات مستنسخة من جهاز المدوّر الحراري الضوئي (الشكل 2)؛ الإصدار 0.5.0
كوب حساء كبيرWebstaurantStore50016SOUPPLAتربية البعوض
مبدد حراري لمصباح LEDLuxeon StarN25-15Bجهاز التدوير الحراري البصري وبطانية تدفئة الدم
عدسة LEDLuxeon Star10209جهاز الدورة الحرارية الضوئي وبطانية تدفئة الدم
حامل عدسة LEDLuxeon Star10235جهاز التدوير الحراري الضوئي وبطانية تدفئة الدم
شريط عدسات LEDلوكسيون ستار (Luxeon Star)LT-01جهاز التدوير الحراري البصري وبطانية تدفئة الدم
إضاءة LEDلوكسيون ستار (Luxeon Star)SP-01-D9تحفيز بالضوء الأحمر لجهاز Opto-thermocycler وبطانية الدم
شريط حراري لمصابيح LEDLuxeon StarLXT-S-12جهاز تدوير حراري بصري وبطانية تدفئة الدم
قضبان التركيب البصريThorlabsXE25L12, XE25L24, XE25L09, XE25T4, RA90, TRA6, TR12بنية جهاز التدوير الحراري الضوئي وبطانية الدم
دعامة بصرية ThorlabsTR12بنية مغذي الغشاء الضوئي
مناشف ورقيةباسيفيك بلو (Pacific Blue)27385تنظيف العلبة
بارافيلم (Parafilm)AmcorPM-996غشاء غطاء الدم، وعاء وجبات ذو غشاء بصري
جهاز التدوير الحراري لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)Eppendorf2231001196جهاز التدوير الحراري الضوئي وبطانية تدفئة الدم
كوب بلاستيكي للحصص الغذائيةخيار999P2Cتغذية البعوض البالغ
غطاء كوب حصص بلاستيكيالاختيار999PL2تغذية البعوض البالغ
وعاء من البولي كربوناتCambro21410CWCHCLتربية اليرقات 
وعاء بولي كربونات نصف حجمكامبرو (Cambro)24CW135 تنظيف الغشاء البصري من بقايا الوجبات
غطاء وعاء بولي كربونات نصف الحجمCambro20CWCH135 تنظيف غشاء الـ Opto-membrane
غطاء وعاء من البولي كربوناتCambro10CWCH135تربية اليرقات
أنبوب بولي كربوناتMcMaster-Carr8585K56عبوة تغذية ذات غشاء بصري 
مقياس القدرةمتسق1299161جميع المقاييس التحليلية
بعوض QUAS-CsChrimsonنظرًا لعدم وجود نص مصدر، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.نظرًا لعدم وجود نص مصدر، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته إلى العربية وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.كاشف جيني، DOI: 10.7554/eLife.76663
أضواء RGBDigikey 289-1189-NDتقديم تحفيز عبر مغذي الغشاء البصري
مشبك بزاوية قائمةThorlabsRA90بنية وحدة التغذية ذات الغشاء البصري
شريط Scotch Magic اللاصق3M104جهاز التدوير الحراري الضوئي وغطاء أكريليك لبطانية الدم
حشية سيليكون، 0.5 ممMcMaster-Carr١٤٦٠ن٢٢طبق تغذية بـ"غطاء دموي"
SLEAPمختبر تالمو (Talmo Lab)نظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى العلمي الذي ترغب في ترجمته إلى اللغة العربية، وسأقوم بصياغته وفقًا للمعايير الأكاديمية والتقنية المحددة لـ JoVE.الإصدار 1.4.1a2، تتبع وضعية البعوض في كل مقايسة من المقايسات
بيكربونات الصوديوم، محلول منظم بتركيز 1 مولار، والرقم الهيدروجيني 8.0Thermo ScientificJ62495.APوجبة دم اصطناعية
محلول كلوريد الصوديومSigma-AldrichS5150-1L 100 3532552وجبة دم اصطناعية
SpinViewTeledyne Vision Solutionsنظرًا لعدم وجود نص مصدري للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي المطلوب نقله إلى اللغة العربية لكي أتمكن من صياغته وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.الإصدار 1.27.0.48، برنامج تسجيل فيديو لجميع المقايسات الثلاثة
زجاجة رشيولاين (Uline)S-11686التعقيم
سكروزSigma AldrichS0389-500Gتغذية البعوض البالغ
المزدوجة الحرارية (النوع T)شركة هارولد جي شيفيتز للصناعات ذ.م.م (Harold G Schaevitz Industries LLC)CPTC-120-X-Nجهاز التدوير الحراري الضوئي وبطانية تدفئة الدم
مضخم المزدوجة الحراريةAdafruitMAX31856جهاز التدوير الحراري الضوئي وبطانية تدفئة الدم
مؤقتإندورالايت (EnduraLight)RAC-MTالتحكم في الدورة الضوئية لتربية البعوض
ماصة نقل Thermo ScientificSAM-225تقليل كثافة اليرقات
كيس نفاياتيولاين (Uline)S-23040نقل الحشرات
شبكة مقاومة للأشعة فوق البنفسجيةMcMaster-Carr 87655K13أسطوانة تغذية ذات غشاء بصري
الماءSigma AldrichW4502-1Lوجبة دم اصطناعية لغطاء الدم
خيط مشمعMcMaster-Carr6356K91غطاء علبة الغشاء البصري
شبكة سلكيةMcMaster-Carr9322T65بنية وحدة التغذية بالغشاء الضوئي

المراجع

  1. UNICEF, UNDP, World Bank, WHO Special Program for Research and Training in Tropical Diseases. Global vector control response 2017-2030. Geneva: World Health Organization; 2017.
  2. Knight KL, Stone A. A catalog of the mosquitoes of the world (Diptera: Culicidae). Lanham (MD): Entomological Society of America; 1959.
  3. Raji JI, DeGennaro M. Genetic analysis of mosquito detection of humans. Curr Opin Insect Sci. 2017;20:34-38.
  4. Coutinho-Abreu IV, Riffell JA, Akbari OS. Human attractive cues and mosquito host-seeking behavior. Trends Parasitol. 2022;38(3):246-264.
  5. McMeniman CJ, Corfas RA, Matthews BJ, Ritchie SA, Vosshall LB. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 2014;156(5):1060-1071.
  6. Gillies MT. The role of carbon dioxide in host-finding by mosquitoes (Diptera: Culicidae): a review. Bull Entomol Res. 1980;70(4):525-532.
  7. Geier M, Bosch O, Boeckh J. Influence of odor plume structure on upwind flight of mosquitoes towards hosts. J Exp Biol. 1999;202(Pt 12):1639-1648.
  8. Sorrells TR, Pandey A, Rosas-Villegas A, Vosshall LB. A persistent behavioral state enables sustained predation of humans by mosquitoes. eLife. 2022;11:e76663.
  9. Dekker T, Geier M, Cardé RT. Carbon dioxide instantly sensitizes female yellow fever mosquitoes to human skin odors. J Exp Biol. 2005;208(15):2963-2972.
  10. van Breugel F, Riffell J, Fairhall A, Dickinson MH. Mosquitoes use vision to associate odor plumes with thermal targets. Curr Biol. 2015;25(16):2123-2129.
  11. Liu MZ, Vosshall LB. General visual and contingent thermal cues interact to elicit attraction in female Aedes aegypti. mosquitoes. Curr Biol. 2019;29(13):2250-2257.e4.
  12. Chandel A, DeBeaubien NA, Ganguly A, et al. Thermal infrared directs host-seeking behavior in Aedes aegypti. mosquitoes. Nature. 2024;633(8030):615-623.
  13. Tang R, Busby R, Laursen WJ, Keane GT, Garrity PA. Functional dissection of mosquito humidity sensing reveals distinct Dry and Moist Cell contributions to blood feeding and oviposition. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(35):e2407394121.
  14. Burgess L. Probing behavior of Aedes aegypti. (L.) in response to heat and moisture. Nature. 1959;184(4703):1968-1969.
  15. Hol FJ, Lambrechts L, Prakash M. BiteOscope, an open platform to study mosquito biting behavior. eLife. 2020;9:e56829.
  16. Martin-Martin I, Williams AE, Calvo E. Determination of mosquito probing and feeding time to evaluate mosquito blood feeding. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(6):pdb.top107659.
  17. Boyd MF, Stratman-Thomas WK. Studies on benign tertian malaria. VII. Some observations on inoculation and onset. Am J Epidemiol. 1934;20(2):488-495.
  18. Swanson MM, Poodry CA. The shibire(ts) mutant of Drosophila: a probe for the study of embryonic development. Dev Biol. 1981;84(2):465-470.
  19. Sweeney ST, Broadie K, Keane J, Niemann H, O'Kane CJ. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 1995;14(2):341-351.
  20. Baines RA, Uhler JP, Thompson A, Sweeney ST, Bate M. Altered electrical properties in Drosophila neurons developing without synaptic transmission. J Neurosci. 2001;21(5):1523-1531.
  21. Hamada FN, Rosenzweig M, Kang K, et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 2008;454(7201):217-220.
  22. Corfas RA, Vosshall LB. The cation channel TRPA1 tunes mosquito thermotaxis to host temperatures. eLife. 2015;4:e11750.
  23. Greppi C, Laursen WJ, Budelli G, et al. Mosquito heat-seeking is driven by an ancestral cooling receptor. Science. 2020;367(6478):681-684.
  24. Allen WE, DeNardo LA, Chen MZ, et al. Thirst-associated preoptic neurons encode an aversive motivational drive. Science. 2017;357(6356):1149-1155.
  25. Inagaki HK, Jung Y, Hoopfer ED, et al. Optogenetic control of Drosophila courtship using a red-shifted channelrhodopsin reveals experience-dependent influences. Nat Methods. 2014;11(3):325-332.
  26. Sahel JA, Boulanger-Scemama E, Pagot C, et al. Partial recovery of visual function in a blind patient after optogenetic therapy. Nat Med. 2021;27(7):1223-1229.
  27. Klapoetke NC, Murata Y, Kim SS, et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 2014;11(3):338-346.
  28. Deisseroth K. Optogenetics. Nat Methods. 2011;8(1):26-29.
  29. Potter CJ, Tasic B, Russler EV, Liang L, Luo L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 2010;141(3):536-548.
  30. Herre M, Goldman OV, Lu TC, et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 2022;185(17):3104-3123.e28.
  31. Wohl MP, McMeniman CJ. Batch rearing Aedes aegypti. Cold Spring Harb Protoc. 2023;2023(3):pdb.prot108017.
  32. American Committee of Medical Entomology, American Society of Tropical Medicine and Hygiene. Arthropod containment guidelines, version 3.2. Vector Borne Zoonotic Dis. 2019;19(3):152-173.
  33. Pleil JD, Wallace MAG, Davis MD, Matty CM. The physics of human breathing: flow, timing, volume, and pressure parameters for normal, on-demand, and ventilator respiration. J Breath Res. 2021;15(4):042002.
  34. Pereira TD, Tabris N, Matsliah A, et al. SLEAP: a deep learning system for multi-animal pose tracking. Nat Methods. 2022;19(4):486-495.
  35. Mathis A, Mamidanna P, Cury KM, et al. DeepLabCut: markerless pose estimation of user-defined body parts with deep learning. Nat Neurosci. 2018;21(9):1281-1289.
  36. Goodwin NL, Choong JJ, Hwang S, et al. Simple Behavioral Analysis (SimBA) as a platform for explainable machine learning in behavioral neuroscience. Nat Neurosci. 2024;27(7):1411-1424.
  37. Tillmann JF, Hsu AI, Schwarz MK, Yttri EA. A-SOiD, an active-learning platform for expert-guided, data-efficient discovery of behavior. Nat Methods. 2024;21(4):703-711.
  38. Skovorodnikov P, Zhao J, Buck F, et al. FERAL: a video-understanding system for direct video-to-behavior mapping. bioRxiv. 2025. doi:10.1101/2025.11.16.688666.
  39. Kabra M, Robie AA, Rivera-Alba M, Branson S, Branson K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nat Methods. 2013;10(1):64-67.
  40. Autrum H, Bennett MF, Diehn B, et al. Comparative physiology and evolution of vision in invertebrates. A: Invertebrate photoreceptors. Berlin: Springer; 1979.
  41. Alberto DAS, Rusch C, Zhan Y, Straw AD, Montell C, Riffell JA. The olfactory gating of visual preferences to human skin and visible spectra in mosquitoes. Nat Commun. 2022;13(1):555.
  42. Dekker T, Cardé RT. Moment-to-moment flight maneuvers of the female yellow fever mosquito (Aedes aegypti. L.) in response to plumes of carbon dioxide and human skin odor. J Exp Biol. 2011;214(Pt 20):3480-3494.
  43. Demir M, Kadakia N, Anderson HD, Clark DA, Emonet T. Walking Drosophila navigate complex plumes using stochastic decisions biased by the timing of odor encounters. eLife. 2020;9:e57524.
  44. Goldman OV, DeFoe AE, Qi Y, et al. A single-nucleus transcriptomic atlas of the adult Aedes aegypti. mosquito. Cell. 2025;188(25):7267-7290.e26.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

سلوك البعوضالدوائر العصبيةالتنشيط باستخدام علم البصريات الوراثيالمقايسات السلوكيةالبحث عن المضيفالتغذية على الدمالرؤية الحاسوبيةالمحفزات الحسية

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.