قياس تدفق الدم الكامل للصفائح الموجبة لعوامل الأنسجة: سير عمل متعدد المراكز متناغم

ملخص

هنا، نقدم سير عمل متناغم لقياس كمية الصفائح الدموية الموجبة لعوامل الأنسجة في الدراسات متعددة المراكز. يصف البروتوكول إجراءات موحدة لجمع الدم، وتثبيت الدم الكامل، والتلوين، وتناغم الأجهزة، مما يسمح بإجراء التحليل إما محليا أو مركزيا، حسب قدرات المختبر.

الملخص

تمثل الصفائح الدينية المحتملة لعامل الأنسجة (TF^{) مجموعة} فرعية من مجموعة الصفائح الدموية. مؤخرا، ثبت أن هذه المجموعة تتنبأ بوفيات القلب والأوعية الدموية لدى مرضى مرض الشريان التاجي، مما يجعلها علامة حيوية مفيدة لتصنيف مخاطر الجلطة. يتطلب القياس الدقيق لصفائح الصفائح^{المثبتة} في التيار الهوائي بواسطة قياس تدفق الخلايا توحيدا صارما للمعالجة التحليلية الأولية، وإجراءات التلوين، وإعدادات الأجهزة، خاصة في الدراسات متعددة المراكز حيث قد تؤثر التغيرات التقنية على قياسها. يصف هذا البروتوكول سير عمل متناغم لتقييم قياس تدفق الدم الكامل لصفائح الدم^{المثبتة} المتداولة في الدم الزائد، مصمما لضمان قابلية التكرار عبر المختبرات ذات البنى التحتية التقنية المختلفة. يشمل الإجراء جمع دم موحد وتثبيت الدم الكامل للحفاظ على نمط الصفائح الدموية في الجسم الحي. يتم توفير طريقتين مختلفتين لتحضير العينات وفقا لقدرات المختبرات المحلية: شحن عينات ثابتة إلى المختبر الأساسي للتلوين المركزي، والاقتناء، والتحليل للمراكز التي لا تملك مرافق قياس تدفق الليتومترية، أو التلوين والاقتناء المحلي للمراكز المجهزة بأجهزة قياس التدفق والأفراد المدربين. يتم تقييم نسبة الصفائح الدموية^{المثبتة} من الصفائح الدموية من خلال وضع العلامات المباشرة باستخدام الأجسام المضادة المضادة ل TF Star Fluor 488 وAnti-CD41 PerCP-Cy5.5 لتحديد البروتين المستهدف ومؤشر تجمع الصفائح الدموية على التوالي. يتم تحقيق توحيد مقياس تدفق الخلايا إما من خلال قالب اقتناء مشترك لنماذج مقياس الخلوية المتطابقة أو من خلال محاذاة الألواح المعتمدة على الخرزات لمنصات مختلفة. يتضمن سير العمل أيضا نهج تحديد موحدة وتحليل مركزي للبيانات لتمكين المقارنة الموثوقة لقياسات^{الصفائح الوضعية} في الفروع الخلفية عبر المواقع. أظهرت النتائج التمثيلية أن هذا السير يدعم القياس القابل للتكرار لصفائح^{توسعة التثبيت} عبر إعدادات الاستحواذ متعددة المراكز المعتمدة. قد يسهل هذا البروتوكول تطبيقا أوسع لتقييم الصفائح^{الدموية الزائدة} في تصنيف مخاطر الجلطات الدموية ويدعم توحيد أوسع لقياس تدفق الصفائح الدموية في الأبحاث الانتقالية والسريرية.

المقدمة

عامل النسيج (TF) هو المحرك الرئيسي لسلسلة تخثر الدم وعامل محدد رئيسي لتوليد الثرومبين. بعيدا عن تعبيره الكلاسيكي من خلايا تحت البطانة وكريات الدم البيضاء (الكريات البيضاء اللوثولوجية)، يرتبط TF أيضا بالصفائح الدموية الدورية 1,2,3,4,5. أثناء تلوين التخثر، تنقل الخلايا الميغاكارية النواة TF إلى مجموعة فرعية من الصفائح الدموية⁶. في الظروف الفسيولوجية، يحتوي حوالي 20–30٪ من الصفائح الدموية المتداولة على TF مخزن داخل الجهاز القنواتي المفتوح، مفصولة مكانيا عن عامل البلازما VII⁷. في هذه الحالة المقسمة، يكون التسمين محميا وظيفيا من عوامل التخثر المتداولة ويبقى غير نشط. وبناء عليه، يظهر جزء صغير فقط من الصفائح الدموية السطحية القابلة للكشف عند تحليل الدم الكامل من أفراد أصحاء بواسطة قياس تدفق الخلية، مما يعكس التوازن الفسيولوجي ^2,8. يمكن أن تؤدي الحالات المرضية التي تتميز بتنشيط الصفائح الدموية واختلال التوازن الالتهابي في الخثرات إلى اضطراب هذا التوازن، مما يؤدي إلى زيادة التعرض السطحي للصفائح الدموية. تم الإبلاغ عن نسب مرتفعة من الصفائح الدموية الإيجابية للجثال الخلفي (TF^pos) في عدة اضطرابات تخثرية 9,10,11,12,13,14,15. ومن الجدير بالذكر أنه في أمراض الشريان التاجي، فإن مستويات الصفائح^{الدموية الزائدة} التي تتجاوز 4٪ تتنبأ بشكل مستقل بوفيات القلب والأوعية الدموية في متابعة لمدة 5 سنوات، مما يثبت نسبة الصفائح^{الضوئية} الزائدة كمؤشر حيوي ذو صلة سريرية لخطر الجلطات¹⁶.

لذلك، فإن القياس الدقيق والقابل للتكرار لصفائح^{الصفائح المثبتة} في الفصيحات التوزيفية ضروري لكل من التطبيقات البحثية الانتقالية والسريرية. وقد حسن سير عمل قياس تدفق وخلايا الصفائح الدموية المنشور سابقا لتقييم الصفائح الدموية^{الخالية} من الصفائح الدموية دراسة هذا البروتين في بيئات مركزية واحدة^{، مقدما} نصائح لتحسين خطوات ما قبل التحليلية أو التحليلية المختارة. ومع ذلك، لم يصمم هذا النهج خصيصا لمعالجة التحديات اللوجستية والتحليلية الإضافية للدراسات متعددة المراكز، بما في ذلك إجراءات الشحن، ومعالجة العينات الموحدة، والنظر أيضا في الحاجة إلى توحيد جمع العينات عبر منصات قياس تدفق الخلايا المختلفة. علاوة على ذلك، يجب أيضا مراعاة البنى التحتية المختلفة ومستويات الخبرة الفنية للمراكز المشاركة.

في هذا السياق، تكمن القيمة المضافة للبروتوكول الحالي في توفير سير عمل مفصل يجمع بين جمع الدم الموحد وتثبيت الدم الكامل، وبروتوكولات معالجة العينات المرنة، وتوحيد الاكتساب عبر المنصات، والتلوين المباشر والتحكم المركزي في الجودة من خلال تحليل البيانات.

لذا فإن هدف هذا العمل هو توفير إطار تشغيلي لتنفيذ متعدد المراكز المتناغم لتحليل^{الصفائح الدموية المثبتة} في الدم الكامل عن طريق قياس تدفق التومترية. يقلل هذا التصميم المتكامل من التباين قبل التحليلي والتحليلي وبين الأجهزة، مما يمهد الشرط لتقييم متسق لصفائح^{الصفائح المثبتة} في البيئات متعددة المراكز.

البروتوكول

قدم جميع المتبرعين بالدم موافقة خطية مستنيرة معتمدة من اللجنة الأخلاقية للمؤسسة (رقم 70/24، CE 18.06.24).

يتم تلخيص سير العمل متعدد المراكز لقياس قياس تدفق الدم الكامل لصفائح^{الدم المثبتة} في الصفائح الدموية الخالية من الدم في الشكل 1. البروتوكول الموضح أدناه سيرشد المستخدم عبر خمس خطوات رئيسية.

الشكل 1: سير العمل متعدد المراكز لتحليل الصفائح^{الدموية المثبتة}. تمثيل تخطيطي لخط التحليل لتقييم متعدد المراكز لصفائح^{الدم الزائدة} المتداولة بواسطة قياس تدفق الدم الكامل. بعد تسجيل المرضى وسحب الدم، يتم تثبيت العينات ومعالجتها وفقا للموارد التقنية المتاحة في كل وحدة سريرية. تقوم المراكز التي لا تملك مرافق قياس تدفق الخلايا بشحن عينات ثابتة إلى مختبر النواة للتلوين والاقتناء والتحليل. قد تقوم المراكز المجهزة بأجهزة قياس تدفق الخلايا بإجراء التلوين والاقتناء في الموقع باستخدام قوالب اقتناء موحدة. يتم تحقيق توحيد الأجهزة إما من خلال قوالب مشتركة (نفس نموذج الأداة)، أو القوالب التي يتم إنشاؤها في المختبر الأساسي (نموذج مختلف متاح للمحاذاة)، أو المعايرة باستخدام خرز فلوري عندما لا يكون التوافق المباشر للقوالب ممكنا. يتم إجراء تحليل البيانات مركزيا باستخدام سير عمل بوابات موحد. تم إنشاء المخطط باستخدام ChatGPT (OpenAI). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. جمع الدم

ملاحظة: يتطلب تقييم الصفائح الدموية^{الإيجابية} للدم الخفيف الحد الأقصى 50 ميكرولتر من الدم الكامل.

1. اجمع الدم الوريدي المحيطي من الوريد الأمامي باستخدام إبرة فراشة عيار 19. ضع الرباط الضواقيط فقط لعلاج الورد الوريدي وأطلقه فورا بعد وضع الإبرة لتقليل تنشيط الصفائح الدموية خارج الجسم الحي.
2. تخلص من أول أنبوب EDTA. ثم اجمع الدم في مخلف سترات الصوديوم بوزن 0.129 مل، واملأ الأنبوب حسب علامة الشركة المصنعة للحفاظ على نسبة الدم إلى مضادات التخثر الصحيحة.
3. اقلبها بلطف 5 مرات لخلط الدم مع مضاد التخثر بشكل جيد.
4. حافظ على الأنبوب في وضع مستقيم عند درجة حرارة الغرفة، متجنبا التحريك أو التبريد أو النقل الهوائي.
5. معالجة العينة خلال 3 ساعات من الجمع.

2. تحضير العينة

ملاحظة: يجب شراء جميع الأجسام المضادة من قبل مختبر النواة ويجب أن تأتي جميعها من نفس الدفعة. إذا أصبح تغيير الدفعة ضروريا أثناء الدراسة الجارية، يجب ربط دفعة الكاشف الجديدة مباشرة بالدفعة المستخدمة من خلال اختبار متوازي تحت نفس ظروف الاختبار، واعتمادها فقط إذا تم تأكيد أداء مماثل. يمكن شراء الكواشف الشائعة الاستخدام (مثل PBS – محلول ملحي مخزن بالفوسفات – وPFA – بارافورمالديهايد) من قبل كل مركز مشارك؛ ومع ذلك، يجب أن تتطابق رموز المنتجات مع تلك المستخدمة في مختبر النواة، ويجب الحفاظ على اتساق الدفعات طوال فترة الدراسة.

1. أصلح العينة.
   ملاحظة: قبل بدء معالجة الدم، حضر 1٪ PFA عن طريق تخفيف 4٪ PFA مع PBS في درجة حرارة الغرفة.
   تحذير: PFA سام ويجب التعامل معه بغطاء كيميائي مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف مختبر، قفازات، وحماية للعين). تجنب الاستنشاق وملامسة الجلد أو العينين. التخلص من النفايات: اجمع جميع المحاليل التي تحتوي على الأقدام الخيالية، والعينات الثابتة، والمكونات الاستهلاكية الملوثة في حاويات نفايات خطرة مغلقة ومعلمة بشكل صحيح وفقا للوائح المؤسسية والمحلية.
   1. اقلب المكنسة الكهربائية بلطف 5 مرات لخلط الدم مع مضاد التخثر.
   2. انقل 50 ميكرولتر من الدم إلى أنبوب بسعة 2 مل يحتوي على 950 ميكرولتر من 1٪ من PFA.
   3. اخلط العينة بلطف وحضن لمدة ساعة و30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   4. أضف 500 ميكرولتر من PBS.
   5. الطرد المركزي عند 1500 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   6. أزل المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من PBS.
      ملاحظة: نقطة تفتيش تقنية: بعد الطرد المركزي، تأكد من أن الحبيبة مرئية قبل إزالة السوبرناتان. أزل الفائق بعناية دون الإزعاج بالحبيبة. بعد إعادة التعليق، تحقق من أن العينة متجانسة وخالية من الكتل أو التجمعات المرئية.
   7. يتم شحن العينة الثابتة إلى مختبر النواة في عبوات مضبوطة في درجة الحرارة ويتم الحفاظ عليها عند 2-8 درجات مئوية خلال 24 ساعة من التثبيت. لا تتجمد. وقت جمع المستندات، وقت التثبيت، ووقت الشحن.
2. وسم العينات لتحليل قياس تدفق السيارة.
   ملاحظة: مضاد TF ستار فلور 488 (نسخة HTF1؛ مضاد CD142) موجه ضد عامل الأنسجة، بينما يتعرف مضاد CD41 PerCP-Cy5.5 على إنتغرين الصفائح الدموية alphaIIb. قبل بدء إجراء التلوين، استخدم الأجسام المضادة للطرد المركزي بقوة 17000 × جرام لمدة 5 دقائق عند +4 درجة مئوية لإزالة أي تجمع¹⁸. مخفف الجسم المضاد المضاد ل TF ستار فلور 488 (1:100) مع PBS. لا يتطلب مضاد CD41 PerCP-Cy5.5 تخفيفا متوسطا ويجب استخدامه بالحجم الموصى به من قبل الشركة المصنعة.
   1. جهز أربعة أنابيب بولي بروبيلين بسعة 2 مل.
   2. توزيع 80 ميكرولتر من العينة الثابتة في كل أنبوب.
   3. أضف إلى كل أنبوب الحجم الصحيح من PBS والجسم المضاد لمضاد TF Star Fluor 488 كما هو موضح في الجدول 1  (اليوم 1).
   4. اخلط العينات بلطف.
   5. حضن الأكسجين عند 4 درجات مئوية في الظلام.
   6. في اليوم التالي (اليوم الثاني)، أضف مضاد CD41 PerCP-Cy5.5 إلى الأنابيب 3 و4 كما هو موضح في الجدول 1.
   7. اخلط العينات بلطف.
   8. حضن لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
   9. قم بتخفيف كل أنبوب بسعة 300 ميكرولتر من PBS.
   10. خزن العينات الملونة في الظلام حتى تحصل على قياس تدفق الخلايا.
       ملاحظة: يمكن تخزين العينات عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أيام^و17. يؤدي التخزين الأطول إلى تراجع تدريجي للإشارة ويجب تجنبه.

		اليوم الأول		اليوم الثاني
لا.	معرف الأنابيب	1X PBS (μL)	ضد قوة المهام ستار فلور 488 (ميكرولتر)	Anti-CD41 PerCP-Cy5.5 (μL)
1	غير ملطخة	20	0	0
2	TF	12.5	7.5	0
3	CD41	15	0	5
4	TF/CD41	7.5	7.5	5

الجدول 1: بروتوكول التلوين لتقييم الصفائح^{الدموية الجادة} للصفائح الدموية.

3. توحيد اكتساب مقياس تدفق الخلايا

1. إعداد قالب اقتناء (بواسطة مختبر النواة).
   1. تم إعداد القالب لمقياس التدفق الخلوي A.
      1. افتح برنامج A v2.6.
      2. أنشئ مخطط نقاط FSC-A/SSC-A [جميع الأحداث] على مقياس لوغاريتمي لتصور مجموعات الخلايا (الشكل 2A).
      3. إنشاء مخطط نقطي CD41 PerCP-Cy5.5-A/SSC-A [جميع الأحداث] على مقياس لوغاريتمي لتحديد الصفائح داخل بوابة [الصفائح الدموية] (الشكل 2B).
      4. أنشئ مخطط شبه لون PerCP-Cy5.5-A/نجمة فلور 488-A [جميع الأحداث] للتحقق من وجود تسرب/تعويض (الشكل 2C).
      5. أنشئ مخطط نقاط FSC-A/FSC-H في بوابة [الصفائح الدموية] وحدد منطقة لتحديد القطع المنفردة ([Singlets]; الشكل 2D).
      6. أنشئ مخطط نقطة CD41 PerCP-Cy5.5-A/TF نجم فلور 488-A في بوابة [Singlets] لتحديد الصفائح^{المثبتة} من TF (الشكل 2E).
      7. اضبط العتبة على 1000 في SSC-H.
      8. اضبط معدل التدفق على "بطيء".
      9. اضبط كسب B525 إلى 315 لضمان التمييز الأمثل بين الأحداث الإيجابية والسلبية؛ قم بالضبط إذا لزم الأمر حسب الآلة المستخدمة.
      10. اضبط كسب B690 حسب مراقبة الجودة اليومية. الاكتساب مقبول فقط إذا تم حل مجموعة^{الصفائح الدموية الإيجابية} في CD41 بالكامل من الخلفية السلبية وبقيت ضمن بوابة المرجع المحددة مسبقا التي تم تحديدها في القالب أثناء الاكتساب.
      11. تصدير القالب باستخدام "قالب تصدير التجربة".
      12. تحميل: قالب الاستحواذ لتحليل الصفائح^{الضوئية} على جهاز قياس تدفق الخلايا A متاح للتحميل كملف مكمل 1 وشكل تكميلي 1.
          ملاحظة: يتضمن رسم بياني للتحقق من وجود تسرب/تعويض (الشكل 2C)، رغم أنه غير ضروري لهذا التحليل متعدد المقياسات. ومع ذلك، يجب النظر فيما إذا كان سيتم استخدام مزيج من الفلوروكروم المختلف عن المقترح في هذا البروتوكول.
   2. أنشئ قالب لمقياس التدفق الخلوي B.
      1. أنشئ ملف بروتوكول يتضمن إعداد الاستحواذ بالكامل كما هو موضح في 3.1.1.
      2. تصدير القالب باستخدام وظيفة "تصدير البروتوكول" في البرنامج B v1.6، لتوليد ملف بروتوكول.
      3. على الأداة المستقبلة، يستورد ملف البروتوكول باستخدام وظيفة "استيراد البروتوكول" داخل البرنامج.
   3. إنشاء قالب لمقياس خلوي التدفق C.
      1. أنشئ ملف مساحة عمل يتضمن إعداد الاستحواذ بالكامل كما هو موضح في 3.1.1. وتصديرها.
      2. على الجهاز المستقبل، يستورد ملف مساحة العمل باستخدام وظيفة "النسخ" في البرنامج C v3.1.
2. تنسيق مقياس تدفق الخلايا باستخدام خرزات المعايرة.
   ملاحظة: استخدم خرز معايرة قوس قزح بست قم.
   1. تعريف القيمة المستهدفة.
      ملاحظة: استخدم الصيغة التالية لتعريف شدة التألق الوسيط (MdFI) لأول قمة في قناة التألق B525:
      MdFI_CU =
      حيث CU: أدوات الوحدة السريرية وRI: أداة مرجعية.
   2. تحضير العينة.
      1. دوامة قارورة الخرز.
      2. أضف 5 قطرات من الخرزات إلى أنبوب العينة.
      3. أضف 1 مل من PBS.
      4. Vortex لمدة 5-10 ثوان.
   3. الحصول على الخرز.
      1. أنشئ مخطط نقاط FSC-A/SSC-A بمقياس لوغاريتمي يعرض [All Events]، وحدد منطقة تسمى [Beads] (الشكل 3A).
      2. أنشئ مخطط نقاط FSC-A/FSC-H في بوابة [Beads] وحدد منطقة لتحديد المقاطع المنفردة [Singlet] (الشكل 3B).
      3. أنشئ مخطط مدرج لقناة فلورة نجمة فلور 488 (B525).
      4. عرض فقط [Singlet]  على المخطط التكراري.
      5. ارسم بوابة عبر عرض القمة الأولى بالكامل (المنطقة B في الشكل 3C).
      6. في شريط الإحصاءات، يعرض قيم X الوسيطة (X-Medi).
      7. قم بإزالة أي تعويض موجود.
      8. اضبط معدل التدفق على "بطيء".
      9. ابدأ الاكتساب في وضع "التشغيل".
      10. من "إعداد الاستحواذ"، قم بتعديل جهد/كسب B525 للوصول إلى هدف X-Med المحسوب وفقا لقيمة الهدف.
      11. سجل ملف بيانات يحتوي على 10,000 حدث في بوابة [Singlet] فقط بعد تحقيق معيار القبول هذا. لا تحصل على عينات دراسية حتى يتم تحقيق النطاق المستهدف.

الملف الإضافي 1: قالب الاستحواذ لتحليل الصفائح^{الدموية المحتملة} على جهاز قياس التدفق الخلوي A متاح للتحميل. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 1: لقطة شاشة لقالب الاستحواذ لتحليل الصفائح^{الوضعية} في TF على جهاز قياس التدفق الخلوي A. (A) يوفر مخطط النقاط FSC-A مقابل SSC-A تمثيلا بصريا لتوزيع الحدث العام. (ب) يتم تحديد الصفائح الدموية في مخطط CD41 مقابل SSC-A ويتم تثبيتها ك [الصفائح الدموية]. (ج) يتضمن مخطط PerCP-Cy5.5 مقابل نجم فلور 488 لتقييم الاحتمال للتسرب المحتمل. (د) يتم استبعاد الدوبلت داخل بوابة [الصفائح الدموية] باستخدام مخطط FSC-A مقابل FSC-H، الذي يحدد مجموعة [الصفائح الدموية]. (ه) يتم تحديد الصفائح الصفائح^{الإيجابية} -TF داخل بوابة [المفردات] بناء على تألق PerCP-Cy5.5 وفلورة ستار فلور 488. (F-H) يتم عرض إعدادات الاكتساب، بما في ذلك معدل تدفق العينة (بطيء)، العتبة الأساسية (SSC)، وكسب الكاشف (B525 وB690)، كما تم تنفيذها في القالب. تم توفير التفاصيل الكاملة لإعداد الاستحواذ وسير العمل في القسم 3.1. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل 2: قالب الاستحواذ واستراتيجية البوابة لتحديد الصفائح^{المثبتة} في الفروع الميدانية. (A) مخطط نقاط FSC-A/SSC-A (مقياس لوغاريتم) يعرض جميع الأحداث المكتشفة. (B) مخطط CD41-A/SSC-A يستخدم لتحديد تجمع الصفائح الدموية. (ج) مخطط PerCP-Cy5.5/نجم فلور 488 يستخدم لتقييم متطلبات التدفق الطيفي والتعويض. (D) مخطط FSC-A/FSC-H في بوابة [الصفائح الدموية] يستخدم لاستبعاد الدوبلات وتعريف الصفائح المنفردة. (ه) مخطط نقطة PerCP-Cy5.5/فلور نجمي 488 في [القطع المفردة] المستخدم لتحديد الصفائح^الضحية الطارئة. يتم ملء حقول الإحصائيات المعروضة بين قوسين تلقائيا بقيم خاصة بالعينة عند تطبيق القالب أثناء جمع العينة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: إجراء معايرة الأدوات المعتمدة على الخرز. (أ) رسم FSC-A/SSC-A يستخدم لتحديد أحداث الخرز. (ب) رسم FSC-A/FSC-H داخل أحداث الخرزات المستخدم لاستبعاد التجمعات وتعريف الطبقات الفردية. (ج) مخطط الفلورة لفلورة نجمة 488 يعرض قمم القطرات مع تطبيق بوابة على أول قمة للخرزة لتحديد شدة الفلورة الوسيطة. يجب اعتبار الإحصائيات المرئية تمثيلية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. جمع عينات قياس التدفق الخلوي لتحليل الصفائح^{الطارئة الإيجابية}

1. احصل على نموذج FCM.
   1. استيراد قالب الاستحواذ باستخدام وظيفة "استيراد قالب" داخل البرنامج A.
   2. احصل على العينات المحضرة في الخطوة الثانية.
   3. تحقق من تطابق بوابات الصفائح الدموية والصفائح الدموية مع هندسة الرسم المرجعي قبل تسجيل البيانات. قم بضبط البوابات إذا لزم الأمر.
   4. ابدأ التسجيل بعد 5–10 ثوان من تدفق مستقر. سجل ملف بيانات يضم 20,000 حدث داخل بوابة  [السينغلتس]  (راجع الشكل 2D). احفظ ملفات .fcs غير المكافأة وقم بتوجيهها إلى مختبر النواة.
2. الاستحواذ بدون قالب FCM.
   1. أعد إنشاء ورقة عمل اقتناء كما ورد في القسم 3.1، بما في ذلك المخططات الخمسة الموصوفة وتسلسل البوابات: جميع الأحداث > الصفائح الدموية > الصفائح المفردة > أرباع TF/CD41.
   2. اضبط العتبة على 1000 في SSC-H.
   3. اضبط معدل التدفق على "بطيء".
   4. اضبط B525 الجهد/الكسب كما هو معرف في 3.2.3.
   5. احصل على النموذج الجاهز في الخطوة 2. ابدأ التسجيل بعد 5–10 ثوان من التدفق المستقر؛ الحصول على 20,000 فعالية داخل بوابة [العزلة]. احفظ ملفات .fcs غير التعويضية، وقم بتوجيهها إلى مختبر النواة.
      ملاحظة: الاستحواذ مقبول فقط إذا تم تمرير جهاز مراقبة الجودة اليومي. إذا لم يتم الوصول إلى هدف 20,000^نقطة من الصفائح الدموية في CD41، يجب الحصول على ما لا يقل عن 10,000 حدث^مثبت CD41.

5. تحليل البيانات

ملاحظة: سير عمل التحليل الموضح أدناه يهدف إلى دعم أنشطة المختبر الأساسي المسؤول عن معالجة البيانات المركزية ومراقبة الجودة.

1. افتح ورقة عمل تحليل جديدة وحمل ملفات .fcs.
2. لكل عينة، أنشئ قالب تحليل كما هو موضح في الشكل 2. بالنسبة للمنصات غير المتطابقة، استخدم قالبا مكافئا مخصصا للمنصة بنفس هيكل البوابة والمخرجات الإحصائية.
3. تحقق من أن البوابات تحدد بشكل صحيح مجموعة الصفائح الدموية وفقا لخصائص التشتت المحددة مسبقا واستراتيجية التمييز بين الصفائح المفردة (الشكل 4A، B، D).
4. تحقق من وجود تداعب/تعويض باستخدام رسم شبه ألوان [جميع الأحداث] (الشكل 4C).
   ملاحظة: فلور النجم 488 الفلوروكروم ينبع طيفا عند 520 نانومتر، مقارنة ب PerCP-Cy5.5، الذي ينبع طيفا عند 676 نانومتر، مما يفسر عدم وجود تداخل والحاجة إلى تعويض.
5. طبق تسلسل البوابات التالي في مخطط ستار فلور 488 نقطة (الشكل 5):
   1. غير مصبوغ: حدد الأرباع باستخدام التحكم غير المصبوغ بحيث تبقى أحداث^الوضع الخلفية عند أو أقل من 0.01٪ من أحداث الصفائح الدموية، مع استثناء التألق الذاتي للصفائح الدموية (الشكل 5A).
   2. TF: تطبيق إحداثيات الربع المحددة في العينة غير الملونة لتحديد إشارة^{TF pos-الإشارة} في العينات الملونة بلون واحد (الشكل 5B).
   3. CD41: تحديد الأرباع باستخدام عينة CD41 المصبوغة أحادية لاستبعاد التألق الخلفي للصفائح الدموية (الشكل 5C).
   4. TF/CD41: تطبيق نفس إحداثيات الأرباع لتحديد إشارة^{نقطة التثبيت} في العينات المصبوغة ب TF/CD41 (الشكل 5D).
      ملاحظة: يتم الحصول على النسبة النهائية من الصفائح^الضحية من خلال الإحصائيات التي يولدها برنامج التحليل، ويتم الإبلاغ عنها كنسبة من أحداث^الوضع في CD41 التي تقع ضمن ربع^مثبت TF لمجموعة الصفائح المحبوطة.
6. قم بإجراء مراقبة مركزية في جودة تحديد أسماء الملفات، دفعات الكواشف، فترة التثبيت إلى الاستحواذ، درجة حرارة الشحن، عدد الأحداث، وتوزيعات الفلورة الشاذة. يجب تمييز الملفات التي تظهر انحرافات موثقة في التعامل المحلي أو الشحن أو توقيت التثبيت أو إعدادات الاستحواذ، ومراجعتها مركزيا، واستبعادها أو تكرارها وفقا لخطة إدارة الانحراف الخاصة بالدراسة.

الشكل 4: استراتيجية البوابات التسلسلية لتحليل الصفائح^{الدموية المثبتة}. يوضح سير عمل التحليل التمثيلي تحديد تجمعات الصفائح الدموية بعد تحميل ملفات .fcs. (أ-ب) مخططات نقطية تؤكد البوابة الصحيحة لتجمعات الصفائح الدموية. (ج) مخطط ألوان زائفة PerCP-Cy5.5/فلور النجوم 488 المستخدم لتقييم التدفق الطيفي. (د) مخطط FSC-A/FSC-H داخل بوابة الصفائح الدموية المستخدم لاستبعاد الدوبلتات ولتعريف الطبقات المنفردة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: قالب لتحليل البيانات. مخططات النقاط التمثيلية ل (A) التحكم غير المصبوغ تستخدم لتعريف التألق الذاتي الأساسي وتحديد موقع الربع. (ب) عينة TF ملونة بلون واحد؛ (C) عينة CD41 الملونة المفردة المستخدمة لتحديد تحديد موقع الربع. (د) عينة مزدوجة اللون من TF/CD41 تستخدم لتحليل الصفائح^{المزدوجة} من TF. تشير الأرقام إلى نسبة الصفائح^{المثبتة} من الصفائح التوزيحية في عينة ممثلة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

تم تصميم هذا السير خصيصا للسماح للمراكز ذات البنى التحتية التقنية المتجانسة بالمشاركة في دراسات متعددة المراكز تتطلب قياس الصفائح^{المثبتة} في الفروع الميدانية. يوضح الشكل 1 مخطط سير العمل التنظيمي المصمم لدعم الدراسات متعددة المراكز التي تهدف إلى قياس الصفائح^{الدموية المثبتة} للدم الزائدة المنتشرة بواسطة قياس تدفق الدم الكامل. يتم تنفيذ إجراءات تحضير عينات مختلفة حسب الموارد التقنية المتاحة في المراكز المشاركة. تحديدا، (1) عندما تفتقر الوحدة السريرية إلى منشأة قياس تدفق الخلايا أو موظفين مدربين، تخضع عينات الدم الكامل للتثبيت فور جمعها ثم ترسل إلى المختبر الأساسي للتلوين المركزي والحصول على التحليل والتحليل. (2) بدلا من ذلك، قد تقوم المراكز المجهزة بمرافق قياس التدفق بإجراء التلوين والاقتناء محليا. في هذه الحالات، يتبع جمع البيانات سير عمل متناغم يحدده المختبر الأساسي. إذا تطابق نموذج الجهاز المستخدم في مختبر النواة، يتم الاستحواذ باستخدام قالب موحد مقدم من المختبر الأساسي. عند استخدام نماذج أدوات مختلفة، يمكن تحقيق التوحيد إما من خلال نقل القالب - عندما تتوفر الأجهزة للمحاذاة في المختبر الأساسي - أو من خلال إجراءات معايرة تعتمد على الخرزات قبل جمع العينات. يمكن بعد ذلك الحصول على العينات وتحليلها وفقا لسير العمل الموحد.

تهدف النتائج الممثلة التالية إلى توضيح جدوى سير العمل وخطوات التوحيد الرئيسية، بدلا من تقديم تحقق رسمي لاختبارات متعددة المراكز. لضمان اكتشاف موثوق لأشعة الطيف، تم تقييم استراتيجية التلوين أولا من حيث التوافق الطيفي واستقرار الإشارة. تم تحديد الصفائح الدموية باستخدام مضاد CD41 PerCP-Cy5.5، بينما اعتمد اكتشاف الصفائح الدموية على جسم مضاد وحيد النسيلة مضاد ل TF مرتبط بستار فلور 488. تم استخدام أدوات التحكم ذات اللون الواحد للتحقق من غياب تسرب الفلورة بين قنوات الكشف. كما هو موضح في الشكل 6A، لم تنتج عينات CD41 PerCP-Cy5.5 الملونة أحادية الإشارة أي إشارة قابلة للكشف في قناة ستار فلور 488. بشكل ثابت، كانت نسبة الصفائح^{الصبغية الثنائية} الخالية من الألياف المقاسة في عينات مزدوجة اللون مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها في عينات TF ذات صبغ واحد (الشكل 6B).

الشكل 6: التحقق من خصوصية التلوين. (أ) تم تحليل عينة مضاد CD41 PerCP-Cy5.5 ملونة واحدة في مخطط نقطة PerCP-Cy5.5/نجمة فلور 488 للتحقق من خصوصية الإشارة. (ب) تظهر نسب الصفائح^{الضوئية} من الصفائح المزدوجة من التيمابل التي تم قياسها في عينات TF الملوونة أحادية مقابل عينات TF/CD41 مزدوجة اللون كقياسات مزدوجة فردية (نقاط) ومتوسط ± SD (n = 18 شخصا مستقلا). تم تحليل البيانات من خلال اختبار ويلكوكسون الموقع-رتبة الموقع. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.تم تقييم الحساسية التحليلية للاختبار المقترح على عينات من n=200 شخص سليم. باستخدام عينات بيولوجية فارغة، كان الحد المحسوب للفراغ (LoB) 0.39٪، وحد الكشف (LoD) 0.77٪، وحد القياس (LoQ) 1.12٪، معرفا كأدنى مستوى مرتبط بCV ≤ 20٪. تم تقييم قابلية تكرار استراتيجية البوابات بين المشغلين على 40 عينة مستقلة تم تحليلها بواسطة 6 مشغلين باستخدام قالب التحليل المحدد مسبقا، مما أدى إلى تقييم ICC بلغ 0.985 (فاصل الثقة 95٪: 0.978-0.990).

ثم تم تقييم استقرار اكتشاف الحصى بعد تثبيت الدم الكامل من خلال صبغ عينات ثابتة طوليا. مقارنة بالعينات الأساسية التي صبغت في يوم التثبيت (D0)، ظلت مستويات الصفائح^{الضوئية} المستقرة لمدة تصل إلى أربعة أيام بعد التثبيت (D3-D4)، مع إظهار انخفاض غير ذي دلالة فقط بنسبة تقارب 22٪ عند D3-D4 (77.8 ± 7.2٪ - نسبة نسبية في الصفائح^الضحية في الصفائح الضوئية في التوزيعة الزائدة) مقارنة بمستوى D0. عند إجراء التلوين عند D5-D6، انخفض اكتشاف الصفائح الدموية^{المثبتة} للصفائح الدموية بشكل ملحوظ إلى 53.8٪ ± 20.7٪ (نسبة نسبية في الصفائح^{الضوئية} الزائدة من الصفائح التوبي؛ ص< 0.0001؛ الشكل 7). تشير هذه النتائج إلى أن العينات الثابتة يمكن تحليلها بشكل موثوق خلال أربعة أيام بعد التثبيت مع فقدان بسيط فقط للإشارة الآن.

الشكل 7: تحليل المسار الزمني بعد تثبيت العينة. تم قياس الصفائح^{المثبتة} من الفصيحات الخالية من الدم عند نقاط زمنية مختلفة بعد التثبيت في المحور x كما يلي: D0 = يوم جمع الدم؛ D1 = اليوم الأول؛ D2 = اليوم الثاني؛ D3-4 = اليوم الثالث أو الرابع؛ D5-6 = اليوم الخامس أو السادس. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± نسبة مئوية لل SD مقارنة ب D0 (n = 7-10 أشخاص أصحاء، تم تقييمها عبر نقاط زمنية ما بعد التثبيت المشار إليها). تم تحليل البيانات باستخدام أنوفا تلاها اختبار المقارنة المتعددة الذي أجراه دانيت. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم تقييم أداء سير عمل الاستحواذ المتناغم لاحقا عبر منصات قياس التدفق الخلوي المختلفة. تم تقييم التوافق القائم على القوالب أولا باستخدام أجهزة FACSLyric وMACSQuant كأجهزة مرجعية للخلايا. تم استخدام أجهزة إضافية من نفس الطرازات الموجودة في منشآت خارجية كمنصات اختبار. تم الحصول على عينات دم كاملة تحتوي على صفائح دموية أثناء الراحة باستخدام كل من الأدوات المرجعية والاختبارية باستخدام قالب الاستحواذ الموحد. كما هو موضح في الشكل 8A,B، تم الحصول على نسب مماثلة من الصفائح^{الضوئية} المثبتة عبر أجهزة القياس المرجعية والاختبارية، مما يؤكد قابلية تكرار نهج القالب المشترك.

الشكل 8: قابلية إعادة الإنتاج عبر الأجهزة باستخدام قوالب الاستحواذ المشتركة. تم قياس نسب الصفائح^{الدموية الإيجابية} في الدم الكامل من n=6 أشخاص أصحاء تم الحصول عليهم باستخدام أجهزة مرجعية واختبار FACSLyric (A) أو MACSQuant (B) باستخدام قالب اكتساب مشترك مطبق عبر الأجهزة. يتم التعبير عن البيانات كتحديد فردي (نقاط) ومتوسط ± SD. تم تحليل البيانات بواسطة اختبار t مزدوج. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

وأخيرا، تم تقييم التوافق القائم على الخرزات لمحاذاة الأدوات ذات التكوينات المختلفة. تم استخدام جهاز Cytometer A كأداة مرجعية، وجهاز FACSymphony كأداة اختبار. تم تنفيذ المحاذاة باستخدام حبيبات معايرة قوس قزح ذات 6 قمم عن طريق ضبط جهد كاشف FACSymphony 488 نانومتر حتى تنخفض شدة الفلورة للخرزات ضمن نطاق الهدف المحدد مسبقا. تظهر ملفات الرسم التكراري التي توضح توزيعات ذروة الخرزات قبل وبعد المحاذاة في الشكل 9A. ثم تم جمع عينات دم كامل باستخدام أداة الاختبار قبل وبعد المعايرة. قبل التناغم، كانت نسب^{نقاط الثبات} إلى الصفائح الدموية الخلفية تختلف بين المنصتين. بعد محاذاة الخرز، تطابقت القيم بشكل وثيق مع تلك التي تم الحصول عليها على جهاز القياس الخلوي المرجعي (الشكل 9B)، مما أظهر نجاحا في التوافق عبر المنصات وقياس TF القابل لتكراره.

الشكل 9: توحيد الآلات المعتمد على الخرز. (أ) مخطط فلورية تمثيلي لحبيبات معايرة قوس قزح ذات 6 قمم تم الحصول عليها قبل (القمم الحمراء) وبعدها (القمم الخضراء) محاذاة الأدوات. (ب) نسب الصفائح^{المثبتة} من الصفائح الجبرية الخالية من الطيور المقاسة في عينات الراحة المحضرة من n=6 أشخاص أصحاء تم الحصول عليهم على أداة الاختبار قبل (قبل) وبعد (بعد التناغم). تعرض القياسات التي تم الحصول عليها على الجهاز المرجعي للمقارنة. تم تحليل البيانات بواسطة اختبار t مزدوج. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول سير عمل خطوة بخطوة لقياس كمية تدفق الدم الكامل للصفائح المثبتة^{في الصفائح} الدموية المثبتة، مصمما خصيصا لتنفيذ متعدد المراكز. ميزته المنهجية الرئيسية مقارنة بسير العمل التقليدية القائمة على تحليل قياس تدفق الصفائح الدموية هو أنه يوحيد العملية التحليلية بالكامل، من جمع الدم وتثبيت الدم الكامل إلى وضع علامات العينات، وتنسيق الأدوات قبل جمع العينات، والتحليل المركزي ومراقبة جودة البيانات. وهذا يسمح للمراكز التي لا تملك القدرة على معالجة العينات بالمشاركة في دراسات متعددة المراكز، إذا تمكنت من توفير عينات دم. يتناول سير العمل الحالي المصادر العملية للتباين بين المراكز الأكثر أهمية، مع الأخذ في الاعتبار أن نسبة صغيرة فقط من الصفائح الدموية تظهر TF مرتبط بالسطح قابل للكشف تحت الظروف الفسيولوجية ^7,8. تشمل هذه المصادر اختلافات في التعامل مع العينات المحلية، والوصول إلى مرافق قياس التدفق الخلوي، وتكوين الأجهزة، وتحليل البيانات المعتمد على المشغل.

لتجاوز هذه المشاكل، يتم تثبيت الدم الكامل بعد الجمع بفترة قصيرة، مما يثبت نمط الصفائح الدموية في الجسم الحي ، ويتجنب الحاجة إلى وضع علامات فورية وجمع العينات. تشير النتائج الممثلة إلى أن هذا النهج الثابت يسمح بمعالجة مركزية متأخرة ضمن الفترة المثبتة بعد التثبيت. هذا يوسع إمكانيات المشاركة في الدراسة لتشمل مراكز لا تحتوي على مرافق قياس تدفق الخلايا في الموقع، مع الحفاظ على سير عمل ما قبل التحليل المتسق. ميزة ثانية للبروتوكول هي استخدام استراتيجية تلوين مباشرة مبسطة مع لوحة بسيطة بلونين، مما يقلل من تعقيد الإجراء.

في اللوحة، استخدمنا نسخة HTF1 من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة ل TF الموصوفة جيدا، والتي تتعرف على الموقع التحفيزي للفاكتور الفصائل وتتنافس مع ارتباط العامل VII، مما يجعله واحدا من أكثر الكواشف موثوقية المتاحة للكشف عن الصفائح الدموية^{14، 16، 17}. تم اقتران الجسم المضاد مع ستار فلور 488، وهو فلوروكروم ساطع وقابل للضوء، مشابه طيفا ل FITC لكنه يتمتع باستقرار إشارة محسن. ومن المهم أن الإثارة عند 488 نانومتر تسمح باكتشاف العينات باستخدام تكوين الليزر الأزرق المتوفر في جميع أجهزة قياس تدفق الخلايا التقليدية تقريبا، بما في ذلك الأجهزة المبتدئة. هذا المزيج من خصوصية الحواتم واكتشاف الفلوروكروم المباشر يحسن الحساسية التحليلية وقابلية التوسع عبر مواقع متعددة. في هذا الاختبار، تم تحديد عتبات الإيجابية باستخدام ضوابط غير مصبوغة وضوابط FMO كخيار أفضل مقارنة بالتحكم بالنمط النظيري لوضع العتبة في مجموعات منخفضة التردد¹⁸.

قد يمثل استخدام مقاييس تدفق مختلفة مصدرا للتغير في دراسات قياس التدفق متعدد المراكز 19,20,21. لقد قدمنا سابقا نصائح حول التعامل مع التحليل المسبق، وتركيب التلوين، وتحسين الأدوات المحلية¹⁷. لكن هذه الإجراءات لا تضمن إشارات فلورية متسقة عبر منصات مختلفة. يتعامل سير العمل الحالي مع هذه المشكلة من خلال الجمع بين التحليل المركزي وتوحيد الاستحواذ المحتمل. يمكن استخدام قوالب الاستحواذ المشتركة عندما تتوفر أجهزة قياس خلوية متطابقة، بينما يمكن تطبيق المحاذاة القائمة على الخرزات عندما يجب تضمين منصات مختلفة. تقدم هذه الاستراتيجية المزدوجة ميزة عملية مقارنة بالنماذج التحليلية متعددة المراكز التي تعتمد فقط على التحليل المركزي بعد الاستحواذ المحلي غير المتجانس من خلال تقليل تباين تحليل البيانات منذ البداية ودعم تطبيق البوابات الأكثر قابلية للتكرار عبر المواقع.

لا ينبغي المبالغة في تعميم سير العمل. تم التحقق من صحة البروتوكول باستخدام ظروف تثبيت الدم الكامل المحددة، وتركيبة مضاد TF-Star Fluor 488 ومضاد CD41 PerCP-Cy5.5، وإجراءات التوافق، ومجموعة محدودة من تكوينات مقياس تدفق الخلايا الخلوي. إذا تم استخدام نسخ مضادة أخرى لمقاومة التوزيعات التيثوية، أو تركيبات فلوروكروم، أو توقيتات تثبيت، أو تركيزات تثبيت، أو مقاييس تدفق الخلايا ذات بصريات مختلفة جوهريا، يجب فحص الأداء التحليلي لسير العمل. بشكل عام، يجب إدارة أي فشل في البروتوكول من خلال قواعد الانحراف المحددة مسبقا المقترحة. اعتمادا على شدة الانحراف، قد يتم تمييز البيانات أو تكرارها أو استبعادها وفقا لخطة الانحراف الخاصة بالدراسة. ضمن هذه الحدود، يجب اعتبار البروتوكول الحالي إطارا تشغيليا لتنفيذ تحليل^{الصفائح الوضعية} متعددة المراكز لتحليل الصفائح المزدوجة النقطية. يتم حاليا معالجة التحقق التحليلي الرسمي، بما في ذلك تقييم الأداء بين المختبرات الأوسع، والتحقق من صحة الشحنات، وتكرار الاختبارات، في دراسة توحيد قياسية دولية مخصصة من الجمعية الدولية للجلطات والدم. تؤكد الأدلة التي تظهر قيمتها التنبؤية في أمراض الشرايين التاجية ذات الصلة السريرية لقياس الصفائح الدموية الإيجابية للصفائح الدموية السطحية الصحيحة (pos) في أمراض الشرايين التاجية، حيث تتنبأ مستويات الصفائح الدموية الزائدة التي تتجاوز 4٪ بشكل مستقل بوفيات القلب والأوعية الدموية طويلة الأمد في متابعة لمدة خمس سنوات¹⁶. لذا فإن القياس متعدد المراكز الموثوق ضروري للتحقق من صحة الصفائح^{الدموية الزائدة} كمؤشر حيوي ولتوسيع تطبيقه ليشمل التجارب السريرية المستقبلية والسجلات الواقعية. قد يقلل التنفيذ المستقبلي لخوارزميات التطبيع الآلي واستراتيجيات التوصيل الآلي بشكل أكبر من تحيز المشغل ويدعم التحليل اللامركزي مع الحفاظ على قابلية المقارنة بين المواقع^22,23.

في الختام، يوفر هذا السير الموحد نهجا عمليا وقابلا للتكرار لقياس الصفائح^{المثبتة} من الصفائح الدموية الخالية من الدم بواسطة قياس تدفق الدم الكامل في بيئات متعددة المراكز. من خلال الجمع بين الإجراءات التحليلية الموحدة، ومعالجة العينات المبسطة، واستراتيجيات تنسيق الأجهزة، يمكن البروتوكول من المقارنة الموثوقة عبر المواقع لقياسات^{الصفائح الحساسة} في الصفائح الطاردة. بعيدا عن دعم تقييم الصفائح^{الدموية الزائدة} كمؤشر حيوي لمخاطر الجلطة، قد تسهم المبادئ الموضحة هنا في جهود أوسع لتوحيد قياس تدفق الصفائح الدموية لتطبيقات البحث الانتقالي والسريري.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1X PBS بدون الكالسيوم والمغنيسيوم	Gibco	10010-015	لتخفيف الأجسام المضادة والعينات
Anti-CD41 PerCP-Cy5.5  (clone HIP8)	BD	333148	Anti human CD41a monoclonal antibody used as platelet population marker; should be provided by the Core Laboratory
Anti-TF Star Fluor 488  (clone HTF1)	Cyanagen	CR304	Anti human Tissue Factor (CD142) monoclonal antibody; should be provided by the Core Laboratory
BD FACSLyric Flow Cytometer	BD	non catalog item	في النص، Flow Cytometer B
BD FACSuite software v1.6	BD	non catalog item	في النص، software B
Butterfly Needle G19	PIKDARE	02044019030010	لسحب الدم
CytExpert Software	Beckman Coulter	non catalog item	في النص، software A
CytoFLEX S flow cytometer	Beckman Coulter	non catalog item	في النص، Flow Cytometer A
MACSQuant Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	non catalog item	في النص، Flow Cytometer C
MACSQuantify software v3.1	Miltenyi Biotec	non catalog item	في النص، software C
Eppendorf tubes 2 mL	Eppendorf	120094	لتثبيت الدم الكامل
Paraformaldehyde	Antibioticos – Divisione Carlo Erba Reagenti	387507	لتثبيت العينات
Pipet tips 10 µL	Gilson	F161630	لنقل عينات الدم
Pipet tips 1000 µL	Gilson	F161670	لنقل عينات الدم
Pipet tips 200 µL	Gilson	F161930	لنقل عينات الدم
Polystyrene Round-Bottom Tube 5 mL	Corning	352052	مطلوب لاكتساب عداد الجريان الخلوي
Rainbow calibration beads (6 peaks)	Spherotech (BD)	556286	لتنسيق عداد الجريان الخلوي
Vacutainer EDTA	BD	368857	لجمع أول 3 مل من الدم
Vacutainer multiple sample luer adapter	BD	367300	لسحب الدم
Vacutainer one use holder	BD	364815	لسحب الدم
Vacutainer with 0,129 M sodium citrate	BD	363079	لجمع الدم