التوصيف الوظيفي للشركاء الفرديين قبل وما بعد المشبك في الجهاز العصبي المركزي ليرقات ذبابة الفاكهة باستخدام CaMPARI

Summary

يقيم هذا البروتوكول النشاط المشبكي الوظيفي بين الشركاء العصبيين المحدد في الجسم الحي في الجهاز العصبي المركزي ليرقات ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر باستخدام أدوات مشفرة وراثيا. تحفيز البصريات البصرية التي يوساها CsChrimson للخلايا العصبية الحسية قبل المشبكية cIVda يحفز التحويل الضوئي المعتمد على الكالسيوم لكامباري في الخلايا العصبية الداخلية بعد المشبكية في الحوض-4.

Abstract

لقد وسعت دراسات الكونكتوم بشكل كبير الفهم للترابط المشبكي في الأنظمة العصبية لأنواع مختلفة. بينما يوفر توصيف الشركاء المشبكيين باستخدام المجهر الإلكتروني (EM) معلومات تشريحية مفصلة، تتطلب الجوانب الوظيفية للشبكات العصبية أساليب تكميلية. كشفت دراسات حديثة في ذبابة الفاكهة ليس فقط عن كامل النسيج العصبي لليرقة، بالإضافة إلى الجهاز العصبي المركزي للبالغين الذكر والإناث، بل أيضا عن المكونات الخلوية للشبكات العصبية التي تنظم سلوكيات محددة، مثل شبكة اليرقات الحساسة للألم. بحلول المرحلة الثالثة من اليرقة، تؤسس الخلايا العصبية الحسية متعددة الأششاب من الفئة الرابعة (cIVda) معظم الاتصالات المشبكية مع خلايا حوض-4. لتقييم الأهمية الوظيفية لهذه الروابط التشريحية، تم استخدام مؤشر الكالسيوم المشفر وراثيا CaMPARI (المدمج النسبي المعدل بالكالسيوم القابل للتنشيط الضوئي) في يرقات المرحلة الثالثة الحية غير المفككة كتقرير يعتمد على النشاط لتقييم الاتصال التشابكي بين خلايا cIVda وخلايا الحوض-4. CaMPARI هو مؤشر فلوري نسبي يتغير طيف انبعاثه استجابة لارتفاع مستويات الكالسيوم داخل الخلية. في الظروف الأساسية، يفلور كامباري باللون الأخضر؛ في وجود تركيزات عالية من الكالسيوم وعند تعرضه لضوء تحويل الضوء (~400 نانومتر)، يتحول بشكل لا رجعة فيه إلى التألق الأحمر. نظرا لأن تدفق الكالسيوم إلى الخلايا العصبية بعد المشبكية هو علامة مميزة لتنشيط التشابك، يوفر تحويل الفوتونسولز من CaMPARI قراءة للإشارات المشبكية الوظيفية. تم تقديم طريقة خطوة بخطوة لتثبيت يرقات المرحلة الثالثة على شريحة مجهر لتنشيط مستقبلات الألم cIVda باستخدام القنالات القنائية CsChrimson المنزيحة للأحمر، مع تحويل ضوئي متزامن من CaMPARI في خلايا Basin-4. يوفر التحويل الضوئي المعتمد على الكالسيوم في خلايا Basin-4، رغم الحركات الداخلية وتغيرات المستوى البؤري، دليلا وظيفيا على الترابط المشبكي بين هذه الخلايا. يعد هذا دليلا على استخدام CaMPARI مع التحفيز البصري قبل المشبكي في يرقات ذبابة الفاكهة السليمة وغير المقسمة.

Introduction

تحديد شركاء مشبكيين دقيقين في الجهاز العصبي المركزي (CNS) يمكن تتبع تكوين وتحسين الاتصالات المشبكية أثناء تطور الجهاز العصبي. وبناء عليه، ركزت الجهود على استخدام المجهر الإلكتروني الحجمي (EM) لإعادة بناء ليس فقط الروابط الكاملة في كائنات نموذجية وراثية قوية مثل Caenorhabditis elegans ^1,2 وذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ^3,4,5، بل أيضا أحجام EM على مستوى المليمتر لأدمغة الثدييات المعقدة، بما في ذلك القشرة البصرية الأولية للفأر⁶ والقشرة الصدغية البشرية⁷. توفر هذه الدراسات رؤى فريدة حول المبادئ التنظيمية التي تقوم عليها الترابط المشبكي على المستوى التشريحي. ومع ذلك، يوفر التوصيف الوظيفي للشركاء المشبكي رؤى تكميلية للاتصال العصبي وضروري للتحقق من النتائج التشريحية.

تقدم ذبابة الفاكهة العديد من المزايا لدراسة الترابط العصبي، بما في ذلك توفر وصلات كاملة لليرقة³ وكذلك للجهاز العصبي المركزي للإناث^{4 والذكر 5} للبالغين، بالإضافة إلى دوائر عصبية محددة جيدا تنظم السلوكيات المتوقعة ^8,9,10. تمثل شبكة الحساب الألم لليرقات واحدة من هذه الدوائر المناسبة لدراسة الاتصال المشبكي الدقيق¹¹. كشف إعادة بناء هذه الشبكة بالأشعة الكهرومغناطيسية عن شراكات مشبكية مفصلة مطلوبة لمعالجة المحفزات الحسبية، مما أدى إلى سلوك الهروب المميز المعروف باسم التدحرج الألم^12,13.

داخل هذه الشبكة، تعمل خلايا العصبون التشتجيرية من الفئة الرابعة (cIVda)¹⁴ كمستقبلات حساسة أولية مسؤولة عن اكتشاف الألم 11,12,13,15,16. تقع أجسام خلاياها والتغصنات الجانبية في جدار الجسم، بينما تخرج محاورها العصبية إلى الحبل العصبي البطني اليرقي (VNC)¹⁵. داخل الجهاز العصبي المركزي، تقوم الخلايا العصبية cIVda بتشكيل أطرافها المحورية بنمط نمطي وتشكل غالبية اتصالاتها المشبكية مع خلايا الحوض-4^{11،12،13،17}. تؤسس هذه العلاقة المشبكية المحددة خلايا CIVda وخلايا Basin-4 العصبية الخلفية كزوج مثالي لتقييم وظيفي الاتصال المشبكي في الجسم الحي. سيسهل تطوير طرق لتحليل الروابط الوظيفية بين شركاء التشابك المشبكي المحددين بشكل فردي دراسة الآليات الكامنة وراء تطور وتحسين التشابك العصبي، خاصة في الأنظمة الوراثية القابلة للحل مع دوائر عصبية نمطية.

CaMPARI (المدمج النسبي القابل للتنشيط الضوئي بالكالسيوم المعدل بالكالسيوم)¹⁸ هو مؤشر فلوري مشفر وراثيا يتغير طيف انبعاثه استجابة لارتفاع مستويات الكالسيوم داخل الخلية. في الظروف الأساسية، يفلور كامباري باللون الأخضر؛ في وجود تركيزات عالية من الكالسيوم وعند التعرض لضوء تحويل الضوء (~400 نانومتر (نانومتر))، يتحول بشكل لا رجعة فيه إلى فلورة حمراء¹⁸. نظرا لأن تدفق الكالسيوم إلى الخلايا العصبية بعد المشبكية هو علامة مميزة لتنشيط التشابك، يوفر تحويل الفوتوكسون من CaMPARI قراءة للإشارات المشبكية الوظيفية^19,20.

بالإضافة إلى CaMPARI، يمكن رؤية النشاط العصبي باستخدام حساسات قابلة للعكس مثل مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا (GECIs) بما في ذلك GCaMP أو RCAMP²¹، بالإضافة إلى مؤشرات الجهد المشفرة وراثيا (GEVIs)²² مثل Arclight²³، Ace2N-mNeon²⁴، أو VARNAM²⁵. بينما هذه الحساسات السريعة والقابلة للعكس مناسبة جيدا لمراقبة النشاط العابر في الوقت الحقيقي، إلا أنها عرضة لتشوهات الحركة أثناء التصوير الحي . على النقيض من ذلك، تمكن خصائص التحويل الضوئي التكاملي وغير القابل للعكس في CaMPARI من التقاط النشاط خلال نافذة زمنية محددة، مما يسمح بالكشف عن تنشيط الخلايا العصبية حتى عند تحرك مستويات البؤرة أثناء التصوير²⁰. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ضبط تحويل الضوء في CaMPARI عن طريق ضبط شدة الضوء البنفسجي، مما يتيح اكتشاف انخفاض قوة المشبك أو مدخلات تحت العتبة²⁶. مكنت هذه الخصائص من رسم خرائط النشاط في الحيوانات الحرة دون تثبيت الرأس أو الربط بالرأس، بما في ذلك دراسات على قشرة الفئران²⁷، دماغ سمك الزرد²⁸، C. elegans²⁹، وذبابة الفاكهة²⁰ البالغة.

تم وصف بروتوكول لرؤية الشركاء المشبكيين الوظيفيين عبر تحويل الضوء إلى CaMPARI مع التحفيز البصري قبل المشبكي باستخدام المجهر الكونفوكلي في يرقات ذبابة الفاكهة سليمة وغير مفككة. في هذا النهج، يستخدم كامباري للكشف عن تدفق الكالسيوم بعد المشبك في خلايا الحوض 4 بعد التنشيط البصري لخلايا cIVda في يرقات المرحلة الثالثة الحية. تعبر الخلايا العصبية cIVda عن القنالية رودوبسين المنشط بالضوء الأحمر CsChrimson^30,31، بينما تعبر الخلايا العصبية الحوضية-4 عن CaMPARI. التعرض للضوء الأحمر ينشط مستقبلات الألم بشكل انتقائي، ويحاكي محفزا حساسا للدم بطريقة زمنية محكومة^16,30. تمكن هذه الاستراتيجية من تقييم ما إذا كان التنشيط قبل المشبكي يحفز تحويل ضوئي CaMPARI المعتمد على الكالسيوم في الخلايا العصبية بعد المشبكية، مما يوفر دليلا وظيفيا على الاتصال المشبكي.

تدعم عدة مزايا تقنية استخدام CaMPARI مع CsChrimson لتحليل اتصال cIVda–Basin-4. أولا، تشكل التغصنات cIVda تبليطا كاملا غير متداخل لجدار جسم اليرقة³²، مما يمكن من التنشيط البصري للخلايا العصبية الحسية السليمة دون تأثيرات مربكة من الضرر الناتج عن التشريح¹⁶. ثانيا، رغم أن اليرقات مشلولة جسديا على شريحة المجهر، إلا أن الحركات الداخلية غالبا ما تغير موقع الجهاز العصبي المركزي ومستوى البؤرة أثناء التصوير؛ تحويل CaMPARI الضوئي أقل حساسية لهذه التشوهات الحركية ويوفر قراءة مستقرة متكاملة زمنيا لنشاط الخلايا العصبية. ثالثا، تمكن الخصائص التكاملية والقابلة للتعديل في CaMPARI من اكتشاف النشاط المشبكي حتى عند تقليل قوة المشبك أو رقم التماس، مثل المراحل المبكرة من التطور، مما يدعم الدراسات المستقبلية لتكوين وتحسين المشابك العصبية.

Protocol

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية المتعلقة بذبابة الفاكهة الميلانوغاستر وفقا للإرشادات المؤسسية. النمط الجيني w؛ Basin4-LexA/CyO-TwGFP; تم استخدام ppk-GAL4/ppk-GAL4 (تم الحصول عليه من إعادة دمج RRID:BDSC_54899¹² وRRID:BDSC_32079¹⁶) لدفع التعبير البصري والتعبير عن CaMPARI (باستخدام الخط w^-، UAS-IVS-CsChrimson.mVenus، LexAOp-CaMPARI2؛ Sp/Cyo الحاصل من إعادة دمج RRID:BDSC_81085 مع علامات الكروموسومات الثانية) في الشركاء قبل وما بعد المشبك، على التوالي. الأدوات البحثية المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير اليرقات

1. أنشأ تهيجات جينية بين الإناث البذارات UAS-CsChrimson، LexAop-CaMPARI؛ CyO/sp (RRID:BDSC_81085) والذكور من خط ذبابي يحتوي على نظامين ثنائيين، على سبيل المثال، حيث يدفع العصبون قبل المشبكي المعني تعبير GAL4 والخلية العصبية بعد المشبكية المعنية التي تحرك LexA ^33,34.
2. ضع الهزيجات الجينية في قوارير بلاستيكية تحتوي على وسط دقيق الذرة القياسي 35,36,37,38 مع تغذية 0.5 ملليمول لكل شبكية ترانس (ATR) لتنشيط CsChrimson ^30,33. جهز قوارير متوازية بدون ATR كضوابط بدون ATR.
   ملاحظة: اذيب متوسط دقيق الذرة بدون غلي. دعه يبرد دون أن يتصلب. حضر محلول ATR بسعة 40 مللي مول (مسحوق ATR مخفف بنسبة 95٪ إيثانول حسب تعليمات الشركة المصنعة)، ثم قم بتخفيف المحلول إلى 0.5 مللي مولار في الوسط وامزجه جيدا.
3. غط القوارير بالكامل بورق الألمنيوم لمنع التعرض للأضواء.
   ملاحظة: الحفاظ على ظروف التربية في ظلام مستمر بسبب الطبيعة الحساسة للضوء لمقاومة المقاومة العصبية ولمنع تنشيط الخلايا العصبية غير المقصود. على الرغم من أن CsChrimson أكثر حساسية للضوء الأحمر (590–680 نانومتر)، إلا أنه يمكن أيضا تفعيله بواسطة أطوال موجية مرئية أخرى^31,39.
4. حضن القوارير عند 25 درجة مئوية ورفع اليرقات إلى المرحلة الثالثة.

2. تثبيت اليرقة

1. اجمع يرقة المرحلة الثالثة باستخدام فرشاة الطلاء. اغسل اليرقات في صفيحة صغيرة بثلاث آبار تحتوي على 0.1 مليون PBS لإزالة الطعام.
   ملاحظة: لا تزيل PBS الزائد؛ يساعد في الحفاظ على الترطيب.
2. ضع كمية صغيرة من طين النمذجة عند كل زاوية من غطاء نظيف (18 × 18 مم). ضع اليرقة في قطرة من PBS على الغطاء ودعها توجه الجانب البطني للأسفل.
   ملاحظة: لتصوير الحبل العصبي البطني (VNC)، قم بتركيب اليرقة على جانبها الظهري بحيث يلامس السطح البطني السليب الغطائي. يسمح هذا التوجيه للخلايا الداخلية في حوض 4 في VNC بمواجهة الهدف عبر الانزلاق الداخلي.
3. ضع شريحة مجهرية نظيفة فوق غطاء الغطاء الذي يحتوي على اليرقة.
4. ثبت غطاء الغطاء بوضع طين نمذجة إضافي على الزوايا. اضغط على كمية كافية لتثبيت اليرقة مع تجنب تمزق اليرقة أو الانزلاق الداخلي.

3. التحفيز، تحويل الصور، وسير عمل التصوير

1. احصل على مكدس Z أساسي من الخلايا العصبية بعد المشبكية التي تعبر عن CaMPARI باستخدام قنوات خضراء (488 نانومتر، 0.8٪ طاقة ليزر) وحمراء (~561 نانومتر، 0.8٪ طاقة ليزر) في نفس الوقت. استخدم خطوة Z بحجم 1 ميكرومتر، ودقة 256 × 256 بكسل، ومتوسط خط 2، وسرعة مسح ثنائية الاتجاه وسرعة مسح 9 على مجهر كونفوكال مزود بهدف 40×/1.2. قم بإجراء جميع التصوير في بيئة مظلمة. حافظ على معلمات z-stack متطابقة طوال التجربة.
   ملاحظة: توقع وجود أجسام خلايا خضراء زاهية في مواقع نمطية في اليرقة العصبية العصبية ولا يوجد فلورة حمراء قابلة للكشف في النقطة الأساسية.
2. حفز اليرقة بشكل مستمر لمدة 30 ثانية باستخدام ضوء تحويل الضوء المتزامن (405 نانومتر، 0.5٪ طاقة ليزر) وضوء تحفيز بصري (594 نانومتر، 0.8٪ طاقة ليزر).
3. احصل على مكدس z بعد التحفيز باستخدام نفس المعلمات الموجودة في الخطوة 3.1 تحت قناتي الحمراء (~561 نانومتر) والأخضر (488 نانومتر). توقع أن تكون أجسام خلايا VNC في مواقع مشابهة لما هو عليه في خط الأساس. اكتشاف فلورة كامباري الحمراء في الخلايا العصبية التي تم تنشيطها أثناء التحفيز في يرقات متلقية ب ATR، مع تحويل ضوئي طفولي في الضوابط غير المقاومة للكائنات المضادة.
   ملاحظة: يتم تلخيص سير العمل والمعلمات في الشكل 1.

الشكل 1: سير العمل للتحفيز، تحويل الصور (PC)، والتصوير. تم استخدام ثلاث مراحل تصوير متتالية لتقييم نشاط الكالسيوم في خلايا حوض 4. خلال المرحلة الأساسية، تم الحصول على مكدس Z باستخدام ليزرات 488 نانومتر و561 نانومتر لالتقاط فلورة كامباري الأخضر والأحمر قبل التحفيز. خلال مرحلة التحفيز، تم تنشيط خلايا cIVda بصريا عبر CsChrimson (594 نانومتر) بينما كان الإضاءة المتزامنة 405 نانومتر يحول كامباري النشط ضوئيا من فلورة خضراء إلى حمراء؛ لم يتم إجراء أي تصوير خلال فترة الثلاثينيات هذه. خلال مرحلة ما بعد التحفيز، تم إعادة جمع المكدسات z باستخدام نفس إعدادات الليزر كما في البداية لاكتشاف الإشارة الحمراء المحولة ضوئيا في أجسام خلايا Basin-4. تم الحصول على جميع المكدسات z-Stack عند 256 × 256 بكسل مع خطوات Z بحجم 1 ميكرومتر، ومتوسط خطي 2، والمسح ثنائي الاتجاه في ظروف مظلمة باستخدام مجهر كونفوكال مزود بهدف 40×/1.2 NA. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. تحليل التصوير

1. افتح صور z-stack في فيجي (RRID:SCR_002285) مع تفعيل Bio-Formats. قم بتعيين عرض المكدس على Hyperstack، وضع الألوان على Composite، وفعل التدرج التلقائي. تصفح مستويات Z واختر المستوى الذي يحصل على التركيز الأمثل. تكرار المستوى المختار (صورة → تكرار؛ القنوات: 1–2؛ اختار مستوى Z).
2. انقسام القنوات الحمراء والخضراء (صورة → ألوان → القنوات المقسمة).
   ملاحظة: قم بضبط السطوع والتباين باستخدام Image → Adjust → السطوع/التباين → Auto لكلا القناتين.
3. اطرح الخلفية من كلا القناتين (العملية → طرح الخلفية) باستخدام نصف قطر كرة متدحرجة بقيمة 50 بكسل.
4. قم بتكوين القياسات (تحليل قياسات → المجموعات) لتشمل المساحة، القيمة الرمادية المتوسطة، الكثافة المتكاملة (IntDen)، الانحراف المعياري، وقيم الرمادي الأدنى والأقصى.
5. ارسم مناطق الاهتمام (ROIs) حول كل خلية في القناة الخضراء باستخدام أداة Freehand. أضف العائد على الاستثمار إلى مدير العائد وقيس. طبق نفس العائد على المؤشر على القناة الحمراء وقم بالقياس.
6. سجل جميع القياسات في جدول بيانات، بما في ذلك معرفات اليرقات والخلايا.
   ملاحظة: قم بإجراء قياسات لكل من الصور قبل وبعد التحفيز.
7. حساب نسب الفلورة من الأحمر إلى الأخضر باستخدام قيم الكثافة المتكاملة للحصول على (R/G)_post و (R/G)_pre لكل خلية. متوسط قيم مستوى الخلية لكل يرقة.
   ملاحظة: تسمح الكثافة المتكاملة (متوسط المساحة ×) بالمقارنة بين الخلايا ذات الأحجام المختلفة.
8. احسب Δ(R/G) ك (R/G) _بعد − (R/G)_pre باستخدام متوسطات اليرقة. تفسير قيم Δ(R/G) الإيجابية على أنها زيادة في نشاط الكالسيوم بعد المشبك أثناء التحويل الضوئي.
   ملاحظة: قد تنشأ قيم Δ(R/G) سالبة من الضوضاء أو عدم تماثل الخلفية. اضبط القيم السالبة إلى 0. في هذه المجموعة، أظهرت إحدى اليرقات قيمة سالبة (−0.008)، والتي تم ضبطها على 0.

Results

وفقا لهذا البروتوكول، تم تقييم الاتصال الوظيفي بين خلايا CIVda وخلايا الحوض-4 في يرقات الطور الثالث من D. melanogaster الحية وغير المفككة باستخدام CaMPARI (الشكل 2). قبل أي تحفيز بضوء تحويل الضوء (PC) أو التنشيط البصري، أظهرت خلايا العصبون الداخلية في حوض 4 فلورة خضراء بسبب تعبير CaMPARI السيتوزولي (الشكل 2A). لم يتم اكتشاف أي فلورة حمراء تحت ظروف الأساس (الشكل 2B)، مما يؤكد غياب التحويل الضوئي قبل التحفيز.

Discussion

البروتوكول الموضح هنا يتيح التقييم النوعي والكمي للاتصال المشبكي بين الشركاء المشبكي المحددين في يرقات D. melanogaster السليمة. يستفيد هذا النهج من مزيج التحفيز البصري لخلايا العصبون الحسية cIVda مع التصور القائم على CaMPARI لخلايا العصبون الداخلية المنشطة بعد المشبكية في Basin-4 لمراقبة النشاط المشبكي في الجهاز العصبي المركزي (CNS) لليرقات غير المفككة. ركزت التطبيقات السابقة ل CaMPARI في D. melanogaster بشكل أساسي على المراحل²⁰ للبالغين أو التحف...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK	المواد الكيميائية المستخدمة في المحلول لترطيب وريش اليرقات
All-trans-retinal (ATR)	Sigma Aldrich	R2500-500mg	مادة كيميائية تضاف إلى الطعام لتنشيط أدوات optogenetic
Confocal Microscope	ZEISS	LSM900 Confocal	مجهر تكاملي، عدسة الهدف (40×/1.2 NA)، مصدر الضوء/الليزر (405، 488، 561 نانومتر)
Coverslips (18x18mm)	VWR	48366-205	يستخدم لتركيب الحيوانات للتصوير
Ethanol (95%)	Sigma Aldrich	E7023	يستخدم كمذيب لمسحوق ATR
Fiji (ImageJ)	مصدر مفتوح	RRID:SCR_002285	يستخدم لتحليل الصور
Prism version 10.4.1	GraphPad Software Inc.	RRID:SCR_002798	يستخدم للتحليل الإحصائي
Microscope slides	VWR	48300-041	يستخدم لتركيب الحيوانات للتصوير
Modeling clay	Flinn scientific	FB0600	يستخدم لتثبيت الزجاج الشفاف على شريحة المجهر مع اليرقات بينهما
Paintbrush	Genesee scientific	59-204	يستخدم لنقل اليرقات بين الأماكن
Standard cornmeal agar medium	Genesee scientific	66-123	يمكن أيضًا تحضير الطعام باستخدام وصفات ومكونات قياسية مماثلة
Standard Drosophila plastic vials (25mm x 95mm Drosophila narrow vials)	Genesee scientific	32-109	يمكن أيضًا استخدام القوارير أو الزجاجات الكبيرة
Three-well micro spot plate	Electron Microscopy Sciences	71561-01	اللوحة المستخدمة لفصل وتنظيف اليرقات الفردية
Drosophila stock (genotype: w; Basin4-LexA/CyO-TwGFP; ppk-GAL4/ppk-GAL4)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_54899 & RRID:BDSC_32079	تم الحصول عليها من إعادة التركيب بين RRID:BDSC_54899 و RRID:BDSC_32079
Drosophila stock (genotype: w, UAS-IVS-CsChrimson.mVenus, LexAOp-CaMPARI2; Sp/CyO)	Bloomington Drosophila Stock Center	RRID:BDSC_81085	تم الحصول عليها من إعادة التركيب بين RRID:BDSC_81085 وعلامات الكروموسوم الثاني