تفاعل التهجين المتسلسل بمساعدة التوسع-smFISH والكيمياء المناعية في دماغ ذبابة الفاكهة

ملخص

يصف هذا البروتوكول سير عمل HCR-smFISH ومناوعي الكيمياء المناعية بمساعدة التوسع للتحليل الكمي الخاص بنوع الخلايا لتعبير الحمض النووي الريبي والبروتينات في دماغ ذبابة الفاكهة ، بما في ذلك التصوير باستخدام المجهر الضوئي أو الكونفوكلي والقياس الآلي للنسخ النووية والسيتوبلازمية.

الملخص

التحليل الكمي والمحلي لتعبير الجينات ضروري لتقييم الملفات الجزيئية الخاصة بنوع الخلية. في النظام البصري لذبابة الفاكهة ، تفتح الأدوات الجينية الواسعة إطارا للتقييم المباشر لكل من مستويات الحمض النووي الريبي والبروتينات في مجموعات عصبية محددة. هنا، نقدم بروتوكولا خطوة بخطوة يجمع بين HCR-smFISH المدعوم بالتوسع (تفاعل التهجين المتسلسل التوهج الفلوري الجزيئي المحدد في الموقع ) والكيمياء المناعية لتمكين التحليل الكمي للملفات الجزيئية الخاصة بنوع الخلية في أنواع الخلايا العصبية الوراثية المعرفة وراثيا. يتم تحسين سير العمل للخلايا الموسومة بعلامات موضعية نووية أو مرتبطة بالغشاء، مما يسمح بقياس مستويات النسخ والبروتين في نفس الخلايا العصبية. بعد توسع الأنسجة، يتم تصوير العينات باستخدام مجهر الصفائح الضوئية للحصول على حجم سريع، مع عرض سير عمل بديل للتركيب والتصوير لأجهزة المسح والأقراص الكونفوكال القياسية التي تعمل بالليزر المقلوب والدوارة في الميكروسكوبات. نوفر أيضا خوارزمية تقسيم آلية تميز بين النسخ النووي والسيتوبلازمي، مما يمكن من تحليل حالة النسخ وتحديد موقع الحمض النووي الريبي تحت الخلوي. يتم تقديم إرشادات عملية حول المعايير التجريبية والمشاكل الشائعة التي تؤثر على جودة الإشارة، وسلامة الأنسجة، والأداء الكمي. تشمل التطبيقات التمثيلية التحقق من تداخل الحمض النووي الريبي الخاص بنوع الخلية من خلال قياس التغيرات المقابلة في مستويات الحمض النووي الريبي والبروتينات. من خلال تمكين قياسات متكاملة على مستوى RNA والبروتين مع خصوصية نوع الخلية، يوفر هذا النهج استراتيجية قابلة للتوسع للتحليل الجزيئي القائم على الفرضيات، وفي السياقات المستهدفة، بديلا عمليا لاختبارات النسخ النصي لخلية واحدة. يوفر هذا البروتوكول نهجا عمليا للتحقق من الاضطرابات الجزيئية الخاصة بنوع الخلية مع الحفاظ على السياق التشريحي لدماغ ذبابة الفاكهة السليم.

المقدمة

لقد خدم نظام رؤية ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر نموذجا قويا لمعالجة مجموعة واسعة من الأسئلة في علم الأعصاب التطوري، بما في ذلك التمايز العصبي ^1,2، مواصفات نوع الخلايا ^3,4، والمنطق الجزيئي لأسلاك الدماغ ^5,6,7. وقد دفع هذا التقدم مجموعة أدوات تجريبية غنية بشكل غير معتاد، بما في ذلك مجموعات كبيرة من خطوط الدافع الجينية الخاصة بنوع الخلية ^8,9,10، وإعادة بناء الروابط الشاملة الحديثة^10,11,12، ونسخ خلية واحدة^{13,14 و15} متعددة الأدوار بشكل متزايد مجموعات البيانات. معا، تحدد هذه الموارد أنواع الخلايا العصبية بطريقة متعددة الوسائط وتمكن من التلاعب الجيني الدقيق. ونتيجة لذلك، يمكن للمجال الآن توليد فرضيات تنبؤية متزايدة حول كيفية تنظيم الجينات المحددة لهوية الخلايا العصبية، واتصالها، ووظيفتها¹⁶.. بينما يوفر تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية رؤى قوية حول حالات النسخ النسيجية، فإن وفرة الحمض النووي الريبي لا تتنبأ دائما بتعبير البروتين¹⁷، والعديد من تجارب الاضطراب تتطلب في النهاية قياسا مباشرا وكميا لكل من الحمض النووي الريبي والبروتين في نفس الخلايا العصبية.

تمكن التهجين الفلوري المحدد لجزيء واحد (smFISH)^18,19 من القياس الكمي لوفرة النسخ مع دقة خلوية وتحت خلوية مع الحفاظ على السياق التشريحي. وقد وسع دمج smFISH مع المجهر التوسعي 20,21,22 فائدته لتشمل الأدمغة السليمة من خلال تكبير الأنسجة فعليا داخل هيدروجيل قابل للتورم، مما يقلل من الازدحام الجزيئي، ويحسن الوصول البصري، ويزيد من الدقة المكانية الفعالة. عند دمجها مع تضخيم الإشارة المعتمد على تفاعل التهجين المتسلسل (HCR)²³، يسمح smFISH بمساعدة التوسع بالكشف القوي عن النصوص المنفصلة عبر الأنسجة العصبية السميكة ويدعم التصوير الكامل للدماغ باستخدام المجهر الضوئي أو المجهر الكونفوكلي.

تم تطبيق مجموعة من طرق تصوير الحمض النووي الريبي في الموقع على دماغ ذبابة الفاكهة ، مما يعكس أولويات تجريبية مختلفة. مكن HCR-FISH التكراري بمساعدة التوسع من اكتشاف RNA بالدماغ الكامل، ومحلوله^{مكانيا.} بالتوازي، تم استخدام طرق FISH كاملة غير التمدد لقياسات الحمض النووي الريبي في الخلايا العصبية الموسومة وراثيا، بما في ذلك استراتيجيات رسم خرائط النشاط المعتمدة على HCR التي تركز على الجينات^{المبكرة الفورية 25} ، وسير عمل عد النسخ المعتمد على التقسيم باستخدام علامات مشفرة جينيا^{مرتبطة بالغشاء 26}. وقد مكنت الطرق التجارية القائمة على المجسات مثل RNAscope من اكتشاف الحمض النووي الريبي متعدد القنوات في الأدمغة بالكامل، وغالبا ما يجمع بين الكيمياء المناعية لتحديد مجموعات الخلايا^{المستهدفة.} معا، تثبت هذه الأساليب أن تحليل الحمض النووي الريبي المحلي في دماغ الذبابة ممكن تقنيا. ومع ذلك، تفرض تجارب الاضطراب المدفوعة بالفرضيات مجموعة أكثر تحديدا من المتطلبات التي لا يتم التعامل معها بالكامل من قبل أي سير عمل قائم فقط. تعطي العديد من الطرق الأولوية إما لرسم خرائط النسخ بأسلوب اكتشاف متعدد الإصدارات، أو تحليل حالة النشاط، أو قياس كمية الحمض النووي الريبي فقط، حيث يعمل التلوين المناعي عادة كمعرف خلوي بدلا من أن يكون قراءة مطابقة للبروتين المضطرب، أو يطبق في غياب تعيين النوع الجيني²⁸. بالإضافة إلى ذلك، ستستفيد التطبيقات الروتينية من التوافق مع منصات تصوير متعددة ومن خطوط تحليل آلية وقابلة للتوسع.

هنا، نقدم سير عمل متكامل خطوة بخطوة لنظام رؤية ذبابة الفاكهة يجمع بين HCR-smFISH بمساعدة التوسع والكيمياء المناعية النسيجية التي تجرى قبل التوسع، مما يمكن من القياس المزدوج لمستويات الحمض النووي الريبي والبروتين في نفس الخلايا العصبية داخل نفس العينة البيولوجية. استنادا إلى إطار عمل FlySeg²⁹ الذي طورناه سابقا، نوفر خط أنابيب قياس آلي للتقسيم النووي وعد النسخ الذي يميز بين النقاط النووية والسيتوبلازمية، ويدعم كل من قياسات التعبير الكلي والتحليلات الحساسة للحالة النسخية. يتم عرض البروتوكول على مجهر من صفائح الضوء ونظامين كونفوكال مع سير عمل تركيب وتصوير بديل. وأخيرا، نوضح فائدة قراءة RNA والبروتين المتكاملة من خلال تجربة تحقق تمثيلية للاضطراب (أي إسقاط هدف محدد بوساطة RNAi)، مقدمة إرشادات عملية حول المعايير والعقبات التي تؤثر على جودة الإشارة، وسلامة الأنسجة، والأداء الكمي.

يبني هذا البروتوكول عموما على إطار²⁴ EASI-FISH الموصوف سابقا لاكتشاف الحمض النووي الريبي الكامل في ذبابة الفاكهة، ويحافظ على مبادئه الأساسية المتعلقة بتثبيت الحمض الريبي، وتمدد الهيدروجيل، وتضخيم الإشارات المعتمدة على HCR. يوسع البروتوكول الحالي هذا النهج ويطور هذا النهج من خلال دمج الكيمياء المناعية النسيجية قبل التوسع لتمكين قياسات مطابقة للحمض النووي الريبي والبروتينات في نفس الخلايا العصبية، ومراجعة خطوات معالجة ومعالجة متعددة خلال سير العمل لتحسين المتانة وقابلية التكرار، وتوفير استراتيجيات عملية للتركيب والتصوير لكل من المجاهر ذات الصفائح الضوئية والمجاهر الكونفوكالي المقلوبة التقليدية، ودمج تقسيم سوما الآلي وقياس النسخات مع فصل صريح بين برك الحمض النووي النووي النووي والريبي السيتوبلازمي.

هذا السير هو الأنسب للتجارب المستهدفة التي تهدف إلى قياس قراءات الحمض النووي الريبي والبروتينات المحددة في الخلايا العصبية المعروفة وراثيا مع الحفاظ على السياق التشريحي. وهو مفيد بشكل خاص للتحقق من الاضطرابات الجزيئية عندما يكون الهدف قياس تنظيم الجين المحدد أو التقليل أو التقليل لجين محدد أو مجموعة صغيرة من الجينات المرشحة، أو مقارنة التعبير عبر الأنماط الجينية أو مراحل النمو، أو تقييم الحالة التحويلية من خلال تحديد موقع النسخ النووي مقابل السيتوبلازمي. وهو أقل ملاءمة لاكتشاف النسخ غير المتحيز أو رسم خرائط تعبير الدماغ الكامل عالي التكتيك، حيث قد تكون التسلسل الخلوي الواحد، أو النسخ المكاني، أو طرق FISH التكرارية متعددة الإرسال أكثر ملاءمة.

البروتوكول

بيان الأخلاقيات

يستخدم هذا البروتوكول ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر. لم تستخدم أي حيوانات فقارية أو مواضيع بشرية. لذا لم تكن هناك حاجة لموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية.

ملاحظة: استخدم تقنية تنظيف RNase طوال الوقت. ارتد القفازات، وامسح الأسطح والأدوات باستخدام محلول تنظيف RNase، وحضر جميع الحلول بماء خال من RNase.

الشكل 1. سير العمل خطوة بخطوة لبروتوكول تحضير العينة (أ) الجدول الزمني التخطيطي للبروتوكول، الذي يشير إلى التقدم التقريبي يوميا وخطوات الحضانة الليلية. (ب–ي) نظرة عامة تخطيطية على الخطوات الرئيسية لتحضير العينة، من تشريح الدماغ وتثبيته مرورا بالكيمياء المناعية، وربط الحمض النووي الريبي والبروتينات، وتضمين الهيدروجيل، والهضم، وتهجين المجسات، وتضخيم إشارات HCR. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. تشريح الدماغ، التثبيت، والكيمياء المناعية (اليوم 1–3)

ملاحظة: قم بجميع الخطوات في لوحة متعددة الآبار على طراز تيراساكي ما لم يذكر خلاف ذلك. استخدم 10 ميكرولتر لكل بئر للحضانة والغسل. حافظ على الرطوبة بوضع منديل مختبر مبلل في أحد أركان الطبق.

تحذير: البارافورمالديهيد والمثبتات الجليوكسال سامة/مهيجة. ارتد غطاء بخار وارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة.

1. قم بتشريح الأدمغة في وسط حشرات S2 البارد جدا. نقل الأدمغة إلى الآبار، حتى 10 أدمغة في كل بئر (الشكل 1B–C).
   ملاحظة: في التجارب التمثيلية المعروضة هنا، تم استخدام دماغ عذارى عمره 72 ساعة.
2. استبدل وسط S2 ب 10 ميكرولتر مثبت لكل بئر، واستبدله مرة واحدة.
3. أثبت في جليوكسال خال من الحموضة من أداكس مع 5٪ (مع ضخامة) السكروز طوال الليل عند 4 درجات مئوية (الشكل 1C).
4. غسل الأدمغة 3× في 10 ميكرولتر PBST (0.5٪ ترايتون X-100 في PBS) لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة.
   تحذير: ترايتون X-100 مصدر إزعاج؛ تجنب التواصل البشري والتواصل البصري.
5. حضن الأدمغة في محلول أجسام مضادة أولية بسعة 10 ميكرولتر (في PBST، عند التخفيف المدرجة في جدول المواد) لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية (الشكل 1D).
6. اغسل الدماغ 3× لمدة 10 دقائق في 10 ميكرولتر PBST عند 4 درجات مئوية. في كل غسل، استبدل المحلول مرة واحدة في منتصف الحضانة (تبادلان في كل غسل).
7. حضن الأدمغة في محلول أجسام مضادة ثانوية بسعة 10 ميكرولتر (في PBST، عند التخفيفات المدرجة في جدول المواد) لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية (الشكل 1D).
   ملاحظة: احم العينات من الضوء.
8. اغسل الدماغ 3× لمدة 10 دقائق في 10 ميكرولتر PBST عند 4 درجات مئوية. في كل غسل، استبدل المحلول مرة واحدة في منتصف الحضانة (تبادلان في كل غسل).
   ملاحظة: استخدم تركيزات الأجسام المضادة الأولية والثانوية أعلى بمقدار 2–3 أضعاف تركيزات الكيمياء المناعية النسية الكاملة القياسية
   نقطة التوقف: تخزين الأدمغة في 10 ميكرولتر 1× PBS عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 96 ساعة.

2. تثبيت الحمض النووي الريبي والبروتينات التساهمي (اليوم 4) (الشكل 1E)

تحذير: الألكيلاترات المثبتة للرنا وACX خطرة (سامة/مهيجة؛ بعضها مشتبه في كونها مسرطنة). حضر وتعامل مع المحاليل في غطاء بخار كيميائي مع معدات الحماية الشخصية المناسبة. اجمع جميع النفايات كنفايات كيميائية خطرة.

1. احتضن الأدمغة في 10 ميكرولتر من مخزن MOPS بسعة 20 ملليمتر (pH 7.7) لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
2. تحضير محلول التثبيت بخلط 49.5٪ (v/v) 20 mM MOPS، 49.5٪ (v/v) مخزون ميلفالان (2.5mg·^m-1 في DMSO)، و1٪ (v/v) من AcX (10 mg·^m-1 في DMSO). وهذا ينتج تركيزات نهائية تبلغ 1.24 ملغ^·مل-1 ميلفالان و0.10 ملغ·^مل-1 AcX.
3. استبدل MOPS بمحلول تثبيت 7–8 ميكرولتر لكل بئر، واستبدل المحلول مرة واحدة، وحضنه طوال الليل عند حرارة 37 درجة مئوية في الظلام.
   ملاحظة: استخدم 7–8 ميكرولتر لتقليل الفائض والخلط عبر الآبار مع الحفاظ على تغطية كاملة للعينات.

3. التجلي (دمج الأدمغة في هيدروجيل) وهضم كامينات البروتيناز (اليوم الخامس)

تحذير: المونومرات الأكريليكية، وAPS، وTEMED هي مهيجات وسامة. التعامل مع معدات الحماية الشخصية؛ حضر المكونات المتطايرة/الطاردة للحرارة في غطاء بخار.

1. ثبت حشوة سيليكون لاصقة بسماكة 0.5 مم على شريحة مجهر زجاجي غير مشحونة (الشكل 1F، أسفل اليسار)، اضغط بقوة لضمان التلامس الكامل والختم.
2. أضف 200 ميكرولتر من محلول بولي-إل-ليسين إلى الحجرة ووزع المحلول بشكل متساو لتغطية السطح، ثم حضن المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، ثم أزل المحلول باستخدام ماصة.
3. اترك بولي-إل-ليسين يتبخر بالكامل حتى يصبح السطح جافا بشكل واضح.
   ملاحظة: تبخر بولي-إل-ليسين بطيء. للحصول على نتائج موثوقة، جهز الغرف مسبقا واتركها تجف طوال الليل في بيئة خالية من الغبار. بدلا من ذلك، تجفيف الغرف في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ≥ ساعة واحدة في يوم الاستخدام.
4. اغسل الدماغ 2× في 10 ميكرولتر 1× PBS لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة.
5. تحضير محلول المونومر الهلام وإضافة كواشف البلمرة مباشرة قبل الاستخدام عن طريق خلط محلول المونومر مع 4HT وTEMED وAPS (طازج) بنسبة 47:1:1:1. يحتوي محلول التجلات النهائي على 1 مليون من أكريلات الصوديوم، 14٪ أكريلاميد، 0.1٪ بيس-أكريلاميد، 1× PBS، 0.01٪ 4HT، 0.2٪ TEMED، و0.2٪ APS.
6. استخدم دوامة لفترة وجيزة وأبق محلول التجلات النهائي على التجمد. استخدم الحل فورا.
7. حضن الأدمغة في محلول جلات بارد بسعة 10 ميكرولتر لمدة 15 دقيقة على الثلج.
8. خلال مرحلة ما قبل التوازن، باستخدام شفرة حلاقة جديدة، اقطع قناة ضيقة واحدة على كل جانب من حشية السيليكون للسماح للهواء بالخروج أثناء التعبئة (الشكل 1F، أعلى اليسار)
9. باستخدام رأس الماصة، انقل الأدمغة إلى غرفة التجليم المحضرة، مع التأكد من بقاء كل دماغ مغمورا في محلول الهلام طوال الوقت.
   تحذير: بعد التثبيت والتوازن، تصبح الأدمغة شديدة الالتصاق وتلتصق بسهولة بالأسطح البلاستيكية. لمنع فقدان العينة، استخدم رؤوس الماصة عريضة القطر أو قص نهاية رأس قياسي لتوسيع الفتحة.
10. قم بإزالة البطانة الواقية من لاصق حشية السيليكون السطحية وضع غطاء زجاجي نظيف بسعة 1.5H برفق فوق الحجرة، لتجنب احتجاز فقاعات الهواء.
11. قم بببطء بإدخال 200 ميكرولتر من محلول التجليم الطازج إلى الحجرة عبر إحدى القنوات الجانبية، حتى تمتلئ الحجرة بالكامل.
12. ضع الحجرة المغلقة في وعاء مظلم وحضن الغرفة على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
    ملاحظة: ضع مناديل مختبر مبللة بالماء) داخل الحاوية. تأكد من أن السلايد لا يلامس الماء السائل مباشرة.
13. جهز محلول هضم مكون من 50 ملليمولر تريس-HCl (رقم الهيدروجيني 8.0)، 500 ملليمولار NaCl، 1 ملليمول EDTA، و0.5٪ (v/v) ترايتون X-100 في مياه خالية من RNase.
14. قبل الاستخدام مباشرة، أضف بروتيناز K عند 1:100 من مخزون 20 ملغ·^مل-1 إلى تركيز نهائي 0.2 ملغ^·مل-1.
    تحذير: بروتيناز K مهيج ويجب التعامل معه بالقفازات؛ تجنب الاستنشاق وملامسة الجلد.
15. اترك السلايد ليبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق قبل إزالة غطاء الغطاء. قم بقص الجل بالمشرط إلى شكل مستطيل باستخدام قطع مستقيمة واحدة. قلل من حجم الهلام الزائد المحيط بكل دماغ (الشكل 1F، أعلى اليمين).
16. ضع كل جل مقذف في بئر منفصل يحتوي على لوح يحتوي على محلول هضم بسعة 1000 ميكرولتر. تأكد من أن الجل مغمور بالكامل.
17. أغلق اللوح بفيلم بارا فيلم وحضن اللوحة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة على هزاز مداري بوزن 0.11 جرام (الشكل 1G).

4. هضم DNase وتهجين مسبار HCR-smFISH (اليوم السادس)

1. استنشق محلول الهضم بعناية باستخدام ماصة موضوعة على حافة البئر لتجنب ملامسة أو تشوه الجل.
2. جل الغسل 3× مع 500 ميكرولتر 1× PBS لمدة 15 دقيقة لكل منها في درجة حرارة الغرفة على هزاز مداري بوزن 0.11 جم.
   نقطة توقف: تخزين الجل مغمورة في 500 ميكرولتر 1× PBS عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام قبل المتابعة.
3. تحضير محلول عمل 500 ميكرولتر DNase لكل هلام عن طريق تخفيف مخزون DNase I من مجموعة QIAGEN RNase Free DNase 1:10 في مخزن RDD. يحتوي الحل النهائي العامل على حوالي 0.27 وحدة كونيتز·^μL-1.
4. حضن الهلام في محلول عمل DNase بسعة 500 ميكرولتر لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع تأرجح لطيف (الشكل 1H).
5. جل الغسيل 4× مع 500 ميكرولتر 1× PBS خالي من RNase لمدة 15 دقيقة لكل منها في درجة حرارة الغرفة.
6. جل التوازن في مخزن تهجين مسبار مسبقا مدفأ بسعة 500 ميكرولتر لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية
7. مخزون مسبار مخفف من HCR smFISH (1 ميكرومتر؛ Molecular Instruments) 1:300 في مخزن التهجين المجسي إلى تركيز نهائي ~3.3 نانومل. المزج عن طريق الدوامة
8. استبدل مخزن التوازن بخليط مجسات 500 ميكرولتر لكل جل واحتضن الحوض طوال الليل عند 37 درجة مئوية على هزاز مداري بوزن 0.11جرام (الشكل الأول).
   تحذير: تحتوي عازلات التهجين المجسية على الفورمايد، وهو سام. استخدم القفازات وتجنب الاستنشاق.

5. تفاعل التهجين المتسلسل (اليوم السابع) (الشكل 1J)

1. جل الغسل 3× مع مخزن غسيل مسبار مسخن مسبقا بسعة 500 ميكرولتر لمدة 30 دقيقة لكل منهما عند 37 درجة مئوية على هزاز مداري بوزن 0.11 جم.
   تحذير: تحتوي عازلات غسل المجسات على الفورمايد، وهو مادة سامة. استخدم القفازات وتجنب الاستنشاق.
2. جل الغسيل 3× مع 500 ميكرولتر 1× PBS لمدة 30 دقيقة لكل منها في درجة حرارة الغرفة على هزاز مداري بوزن 0.11 جم.
3. اترك الجل في 1 مل 1× PBS طوال الليل في درجة حرارة الغرفة على هزاز مداري بوزن 0.11 جرام.
   ملاحظة: الغسل الممتد طوال الليل يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء من خلال تقليل ارتباط المجس خارج الهدف ونقاط الخلفية. للمعالجة في نفس اليوم، انتقل مباشرة إلى تضخيم HCR.
   نقطة توقف: بعد الغسولات بعد التهجين، خزن الجل في 1 مل 1× PBS في درجة حرارة الغرفة أو 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 96 ساعة قبل تضخيم HCR.
4. استبدل PBS بمخزن تضخيم 500 ميكرولتر (كان سابقا متوازنا لدرجة حرارة الغرفة) لكل بئر وحضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على هزاز مداري بوزن 0.11 جرام.
5. لكل مجموعة مجسات، يتم تخفيف دبابيس الشعر h1 و h2 (مخزن 3 ميكرومتر؛ الأجهزة الجزيئية) في مخزن التضخيم 1:100 (تركيز نهائي 30 نانومل). حضر 350 ميكرولتر من خليط الدبوس الشعري المخفف لكل بئر.
6. محاليل دبوس الشعر المخففة بالحرارة في أنابيب PCR عند 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية في جهاز دورة حراري أو كتلة حرارية. استخدم حجم إجمالي 100 ميكرولتر لكل أنبوب لضمان تسخين منتظم وتوازن درجة الحرارة.
   ملاحظة: توصي إرشادات HCR عادة بتسخين القفل H1 وH2 بشكل منفصل ودمجهما فقط بعد التبريد، بدلا من ذلك، دمج H1 و H2 قبل التسخين السريع عند الحاجة إلى تبسيط التعامل.
7. اترك دبابيس الشعر تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في الظلام دون إزعاج.
8. أزل مخزن التضخيم وأضف 350 ميكرولتر خليط دبوس شعر لكل بئر.
9. احتضن الهلام لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في الظلام على هزاز مداري بوزن 0.11 جرام.
10. جل الغسيل 3× مع 500 ميكرولتر 5× SSCT لمدة 10 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة على هزاز مداري بوزن 0.11 جرام.
11. استرجع المحاليل الحساسة بعد التضخيم، وحمها من الضوء، وتخزينها عند -20 درجة مئوية لإعادة الاستخدام.
12. انقل الجل إلى 500 ميكرولتر 1× PBS واغسل 3× لمدة 30 دقيقة على درجة حرارة الغرفة.
13. تخزين الجل في 500 ميكرولتر 1× PBS عند 4 درجات مئوية، محمية من الضوء.
    نقطة التوقف: يمكن تخزين الجل المضخم لمدة تصل إلى أسبوعين قبل التصوير مع فقدان إشارة طفيف جدا.

6. تحضير وتركيب وتصوير العينات الموسعة (اليوم 8) (الشكل 2)

1. حضانة الهلام في 1× PBS يحتوي على DAPI (1:1000) خلال الليل عند 4 درجات مئوية على هزاز مداري بوزن 0.11 جم.
2. استخدم إضاءة UV قصيرة لتصوير الدماغ داخل الجل. قم بتوجيه العينة وقص الجل الزائد حسب الحاجة.
   تحذير: يستخدم الإضاءة فوق البنفسجية أثناء وضع العينة وتركيبها. ارتد واقي العين المناسب.
3. تركيب عينات في 1× PBS مع دعم DAPI (1:1000) باستخدام التكوين المناسب لمنصة التصوير المختارة (انظر الجدول 1).
4. اترك العينات لتتوازن لمدة ساعة على الأقل قبل الحصول عليها.
5. استخدم أهداف الغمر في الماء مع مسافة عمل كافية للتصوير عبر الجل الموسع.
6. عينات الصور باستخدام مجهر الصفائح الضوئية، أو المجهر الكونفوكالي بالليزر الشعاعي، أو المجهر الكونفوكالي الدوار للقرص. تم تلخيص معايير التركيب والاقتناء التمثيلية الخاصة بالمنصة المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 1.
   ملاحظة: بعد التصوير، يمكن إزالة المجسات ودبابيس HCR عن طريق هضم DNase كما هو موضح أعلاه. يمكن بعد ذلك تعريض الجل لجولات إضافية من تهجين المجس وتضخيم HCR.

المنصة	تصور العينة، التركيب، وتحديد الموقع	الهدف / الكاشف	إعدادات الاستحواذ التمثيلية
زايس لايتشيت 7	استخدم إضاءة UV قصيرة لتصور موقع الدماغ داخل الجل. قم بتقليم الجل الزائد ووجه كل دماغ نحو هدف الكشف. ضع 5–6 جلات على غطاء مغلف بولي-إل-ليسين بحجم 1 × 1 سم مع وجه الجل للخارج (الشكل 2A). تثبيت غطاء الغطاء على حامل عينة LS7 باستخدام قطرة صغيرة من اللاصق القابل للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية؛ أطفئ مصباح الأشعة فوق البنفسجية قبل تطبيق اللاصق. ركبوا في غرفة LS7 وموقعوا مناطق الدماغ باستخدام العرض المباشر في ZEN Black.	هدف 20×/1.0 للكشف عن الغمر المائي في الشمال الأمريكي؛ تكبير بصري 2.5× (50× تكبير كلي).	Z-step، 0.4 ميكرومتر عند 2.5× تكبير و2× توسعة. تم تفعيل مسح المحور. التعريض، 50 مللي ثانية لجميع القنوات. الليزر: 405 نانومتر عند 5٪، 488 نانومتر عند 2٪، 561 نانومتر عند 8٪. الانبعاث: 420–470 نانومتر، 505–545 نانومتر، 570–620 نانومتر.
			(الشكل 2C، على اليسار)
نيكون Ti2-E AXR NSPARC الكونفوكال بالليزر	استخدم إضاءة UV قصيرة لتصوير الدماغ داخل الجل. وجه جل واحد بحيث يواجه الدماغ للأسفل نحو الهدف المقلوب. الانتقال إلى طبق تصوير ذو قاع زجاجي مملوء ب 1× PBS + DAPI (الشكل 2B). تحديد موقع الدماغ بهدف 4×، وتحديد العائد على الاستثمار بهدف 20×، وتسجيل مواقع X-Y في عناصر NIS. أضف وسيط الانغماس، وأعد النظر في العائد على الاستثمار المسجل، واجعلها واضحة.	40× هدف غمر مائي لمسافة عمل طويلة (نيكون CFI APO LWD 40× WI، 1.15 NA لامبدا S، مسافة عمل 0.61 مم)؛ كاشف NSPARC في وضع الدقة الفائقة.	مسح الجلفانومتر، 2048 × 2048 بكسل، 1.6 ميكروثانية/بكسل، تكبير 8.0×. الليزر: 488 نانومتر عند 2٪، 640 نانومتر عند 20٪. الانبعاث: 502–546 نانومتر و666–732 نانومتر.
			(الشكل 2C، الوسط)
كونفوكال القرص الدوار Evident Scientific IXplore IX85 / Yokogawa CSU-W1	قم بتركيب العينات كما في التصوير الكونفوكالي المقلوب: وجه الجل بحيث يكون الدماغ مواجها للهدف وضعه في طبق تصوير ذو قاع زجاجي باستخدام 1× PBS + DAPI (الشكل 2B). حدد المناطق ذات الاهتمام كما هو موصوف في المجهر الكونفوكالي بالمسح بالليزر باستخدام برنامج cellSens.	60× هدف غمر مائي لمسافة عمل طويلة (أوليمبوس LUMFLN60XW دفع أمام، 1.10 شمال أمام، مسافة عمل 1.5 مم)؛ كاميرا Hamamatsu ORCA-Fusion BT GenIII (2304 × 2304 بكسل؛ 6.5 × 6.5 ميكرومتر).	إثارة 488 نانومتر عند 75٪ من الطاقة، وتعريض 200 مللي ثانية؛ إثارة 640 نانومتر عند قوة 100٪، وتعريض 800 مللي ثانية. الانبعاث: 500–550 نانومتر و665–705 نانومتر.
			(الشكل 2C، يمين)

الجدول 1: معايير التركيب التمثيلي، وتحديد موقع العينة، والتصوير عبر منصات المجهر. ملخص استراتيجيات تركيب العينات، وطرق التوطين، والأهداف، ومعايير الاستحواذ المستخدمة عبر منصات المجهر الصفائح الضوئية والكونفوكالية.

7. التحليل الكمي للحمض النووي الريبي وتعبير البروتين

ملاحظة: اختر سير عمل التحليل بناء على الهدف التجريبي. يتم تقديم مقارنة بين هذه الأساليب في الجدول التكميلي 1.

1. قياس النسخ على مستوى السكان باستخدام FlySeg.
   ملاحظة: يعتمد التحليل على النسخة المحدثة من خط أنابيب FlySeg²⁹ . يتم عرض نظرة عامة مخططية لسير عمل التحليل في الشكل 3A–B
   1. قم بتثبيت FlySeg، وهو حزمة تعتمد على بايثون، عن طريق إنشاء بيئة Conda باستخدام:
      conda env create -f environment.yml
   2. فعل البيئة قبل التحليل باستخدام :
      كوندا تفعيل فلايسغ
   3. ابدأ التحليل باستخدام:
      بايثون main.py --file <input_file>
      استخدم صيغ إدخال مدعومة، بما في ذلك ملفات CZI أو NPY.
   4. تخصيص التحليل باستخدام الوسطط الاختياري حسب الحاجة، بما في ذلك:
      عدد القنوات (--القنوات)
      قناة النوى (--nuclei_ch أو --nuclei_wavelength)
      قناة السيتوبلازم (--cytoplasm_ch أو --cytoplasm_wavelength)
      معلمات كشف النوى (--nuclei_sigma_range، --nuclei_threshold)
      عامل التمدد النووي (--nuclei_dilation)
      عتبات كشف الأسماك (--fish_threshold_range)
      دليل الإخراج (--output_dir)
      Visualization via Napari (--visualize)
   5. عرض جميع الخيارات المتاحة باستخدام:
      بايثون main.py –مساعدة
   6. فحص بيانات الصور الوصفية باستخدام:
      بايثون main.py --metadata_only.
      أكد حجم الفوكسل، وعدد القنوات، وهوية القناة.
   7. قم بتشغيل التحليل باستخدام معلمات معدلة بشكل مناسب لمجموعة البيانات. عادة، تحديد العدد الإجمالي للقنوات، قناة النوى، قناة السيتوبلازم (إذا كان متوفرا)، وعامل تمدد النواة.
      ملاحظة: اضبط قيمة --nuclei_dilation المناسبة للحدود النووية/السيتوبلازمية المطلوبة. انظر الشكل 3C–D كمثال.
   8. راقب سجل المعالجة. يتم حفظ جميع المخرجات في مجلد يحمل اسم ملف الإدخال.
   9. تحديد المخرجات الأساسية للتحليل اللاحق، بما في ذلك:
      1. <ملف>-Nuclei-df.csv
         والتي تحتوي على قياسات الميزات لكل نواة وعدد النقاط المرتبطة بها لكل قناة FISH وتوفر بيانات كمية للتحليل الإحصائي.
      2. <ملف>-Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
         وهو رسم بياني متشتت يستخدم لتحديد المؤشرات الشاذة للتقسيم بناء على حجم وكثافة النواة؛ استبعد النوى التي تم تصنيفها كاستثناءات من التحليل الإضافي.
   10. استخدم مخرجات وسيطة إضافية (مثل أقنعة التقسيم، جداول كشف النقاط (puncta)، وملفات ملخص FISH المدمجة) للمعالجة المتقدمة بعد المعالجة إذا لزم الأمر.
2. عد النسخ في الخلايا القابلة للتعرف بشكل فردي باستخدام إيماريس
   1. باستخدام أداة Surfaces، قم بتقسيم الخلية العصبية المعنية بناء على قناة سيتوبلازم أو قناة علامة غشائية.
   2. قم بضبط معايير تنعيم السطح وعتبة الشدة لضمان أن السطح الناتج يغطي السوما بدقة مع استبعاد الهياكل المجاورة.
   3. باستخدام أداة اكتشاف البقع، يمكنك تحديد نقاط النص في قناة FISH. حدد القطر النقعي المتوقع وعتبة الشدة بناء على حجم الثقب وشدة الإشارة (مثلا 0.25 ميكرومولار لتوسع الأنسجة 2x).
   4. تقييد الكشف النقطي إلى السطح المولود سابقا لضمان أن النقاط داخل الخلية العصبية فقط هي العداء.
   5. استخرج إجمالي النقاط المكتشفة داخل سطح الخلية العصبية باستخدام لوحة الإحصاءات.
   6. أعداد التصدير الفورية والقياسات المرتبطة بها للتحليل اللاحق.
3. القياس الفلوري القائم على العائد على الاستثمار باستخدام FIJI/ImageJ
   1. افتح مكدسات الصور في FIJI وتولد إسقاطات بأقصى شدة باستخدام مكدسات > الصورة > مشروع Z > الإسقاط القصوى . استخدم إعدادات إسقاط متطابقة لجميع العينات داخل التجربة.
   2. تحديد البنية العصبية محل الاهتمام باستخدام قناة علامة تشريحية (مثل GFP الغشائي أو السيتوبلازمي). باستخدام أداة اختيار المضلعات الحرة أو أداة اختيار المضلعات، قم برسم العائد على الاستثمار المقابل للهيكل يدويا (مثل التغصنات الألياف العملاقة).
   3. انتقل إلى قناة البروتين وقس شدة التألق ضمن العائد على الاستثمار المحدد باستخدام تحليل > قياس. سجل المعايير التالية: متوسط شدة الفلورة؛ الكثافة المتكاملة؛ منطقة العائد على الاستثمار.
   4. قس شدة التألق في عائد الإضاءة الداخلي القريب بحجم مشابه يفتقر إلى إشارة محددة ويقع خارج البنية العصبية الموسومة. استخدم نفس استراتيجية العائد على الاستثمار في الخلفية لجميع العينات داخل التجربة واطرح القيمة الخلفية من قياس العائد على الاستثمار.
   5. استخدم قيم الكثافة أو الشدة المتوسطة المصححة بالخلفية المصححة للمقارنة الكمية عبر الأنماط الجينية أو الظروف التجريبية. تأكد من استخدام إعدادات تصوير متطابقة لجميع العينات التي يتم مقارنتها.

النتائج

للتحقق من صحة سير عمل HCR-smFISH والكيمياء المناعية بمساعدة التوسع في بيئة ذات صلة بيولوجية، ركزنا على دائرة الهروب الوشيك في نظام رؤية ذبابة الفاكهة. تتكون هذه الدائرة من خلايا LC4 الإسقاط البصري المحددة وراثيا^30,31 التي تكتشف المحفزات الوشيكة وعصبونات ليف عملاقة (GF) هابطة موصوفة جيدا تدفع الإقلاع السريع^32,33، مما يوفر نظاما نمطيا تشريحيا لقياسات جزيئية خاصة بنوع الخلية في الأدمغة السليمة.

بروتين وصلات الفجوة في ذبابة الفاكهة Shaking-B (ShakB)³⁴ متورط في النقل الكهربائي داخل عدة مكونات من دائرة GF، بما في ذلك المشابك العصبية العصبية³⁵ والمدخلات السمعية³⁵. على الرغم من أن الأدلة المباشرة على الترابط الكهربائي عند التفرعات الخالية من التكوين أثناء الكشف عن الظهور محدود، تشير الدراسات الحديثة إلى أن خلايا LC4 تعبر عن مستويات عالية من shakB³⁶. حفزت هذه الملاحظات على استخدام استراتيجيات shakB للضرب والوسم كحالة اختبار لتقييم ما إذا كان البروتوكول قادرا على تقييم الاضطرابات الجزيئية المستهدفة كبدا عند مستويات الحمض النووي الريبي والبروتين في أنواع الخلايا العصبية المعرفة جينيا.

قمنا أولا بتقييم كفاءة تأثير shakB knockdown في GF وLC4 باستخدام HCR-smFISH مع تلوين الأجسام المضادة ShakB. تم تصنيف GF، وهو خلية عصبية واحدة لكل نصف دماغ، بعلامة غشاء (الشكل 4A). تم تصنيف LC4، وهو عدد من حوالي 60 خلية عصبية في كل نصف دماغ، بعلامة نووية لتمكين القياس على مستوى السكان (الشكل 4B). في الأدمغة الضابطة، تم اكتشاف نسخ shakB بوضوح في كل من الخلايا العصبية GF وLC4. أدى تعبير shakB RNAi إلى انخفاض كبير في نقاط ramRNA shakB في الخلايا العصبية المستهدفة من كلا نوعي الخلايا (الشكل 4C–D). تماشيا مع موقع التداخل السيتوبلازمي للحمض النووي الريبي، كان استنزاف النسخ أكثر وضوحا في الحجرة السيتوبلازمية. كشف فصل البونكتا النووية والخلوية باستخدام القياس القائم على FlySeg عن تقليل انتقائي في نسخ shakB السيتوبلازمية عبر مجموعة LC4، بينما كانت النقاط النووية أقل تأثرا بشكل ملحوظ (الشكل 4D، 69٪ مقابل 22٪ على التوالي).

وجدنا أن تلوين الأجسام المضادة ShakB يتمركز في المناطق التي تتداخل فيها شجرات GF مع محاور عصبون العصبون التعاونية العملاقة (GCI)، التي تربط الليفين العملاقة وتمكن الاستجابات البصرية المقابلة³⁷ (الشكل 4E). تتوافق هذه الملاحظات مع الدراسات^{السابقة 35} التي أظهرت الاقتران الكهربائي المعتمد على ShakB بين GF وGCI. لوحظ أيضا تلوين الأجسام المضادة ShakB في المناطق التي تلامس فيها محاور LC4 تغصنات GF، رغم أن تحديد الموقع في هذه المنطقة كان أقل وضوحا. بغض النظر عن تحديد الموقع الدقيق تحت الخلوي، انخفضت إشارة الأجسام المضادة ShakB المرتبطة بمنطقة التغصنات في GF بشكل ملحوظ بعد تعبير RNAi (الشكل 4F).

ومع ذلك، لا يسمح الكشف القائم على الأجسام المضادة بتعيين واضح لبروتين ShakB إلى أطراف LC4 قبل المشبكية مقابل شجرات GF بعد المشبك في مواقع التلامس. بالإضافة إلى ذلك، فإن التعبير الواسع النطاق لتأثير shakB في جميع أنحاء الجهاز البصري^34,36 يحد من القياس الكمية الخاص بنوع الخلية في خلايا LC4 باستخدام التلوين المناعي المضاد للشك بي. لتجاوز هذه القيود وتقييم توطين ShakB الخاص بنوع الخلية بشكل مباشر، استخدمنا أليل shakB موسوم داخليا وولدناه^{سابقا 36,38}. مكن ذلك من التصور الانتقائي لبروتين ShakB تحديدا داخل خلايا LC4. تم إثراء ShakB الموسوم ب SmGdP-10×V5 في كل من التغصنات (التي تتوافق مع مناطق الإدخال من الخلايا البصرية في أعلى التيار) وطرفات المحاور التي تلامس تغصنات GF (الشكل 4G). أدى تعبير shakB RNAi إلى اختفاء شبه كامل لإشارة V5 في كل من الحجرات التغصنية والمحورية (الشكل 4H). تظهر هذه النتائج أن البروتوكول يتيح حل مواقع البروتين الداخلي داخل الخلايا العصبية المعصبة بكثافة حسب نوع الخلية وتحت الخلية.

كضابط نوعي إضافي، اختبرنا FISH غير الموسع مع الكيمياء المناعية النسيجية في مجموعات عصبية محددة (الشكل التكميلي 1). تداخل إشارة FISH من grd مع LC22 سوماتا، بما يتوافق مع التعبير المتوقع من بيانات scRNA-seq للفص البصري (الشكل التكميلي 1A–C)¹³. في الخلايا العصبية Tm3 التي تعبر عن tdTomato، تداخل mRNA tdTomato مع بروتين tdTomatoes، بينما لم يتداخل mRNA VGlut1 مع Tm3 somata، بما يتوافق مع الهوية الكولينية لخلايا Tm3 (الشكل التكميلي 1)¹³. توضح هذه الأمثلة أن FISH + IHC غير الموسع كاف لتقييم الحضور/الغياب النوعي، بينما يتطلب التوسع للقياس الموثوق للنقاط الفردية.

يشير التطبيق الناجح لهذا البروتوكول إلى وضع علامات واضحة على نوع الخلية، ونقاط smFISH المنفصلة ذات خلفية منخفضة، وتقسيم موثوق للنوى الفردية أو أحجام الخلايا المعرفة يدويا، وتقليل مستمر لإشارة RNA أو البروتين المستهدف بعد الاضطراب. يجب أيضا تفسير النتائج السلبية أو منخفضة الإشارة: على سبيل المثال، أنتج shakB RNAi إشارة mRNA وبروتين ShakB منخفضة، بينما أظهر FISH غير الموسع نقصا في إشارة VGlut1 في سوماتا Tm3 رغم الكشف الواضح عن mRNA tdTomato الواضح. تشمل النتائج غير المثالية ضعف الأجسام المضادة أو إشارة smFISH، أو ارتفاع نقاط الخلفية المرتفعة، أو تقسيم غير مكتمل، أو خطأ في توزيع النقاط النقطية، أو انحراف العينة أثناء التصوير، وكلها يمكن أن تؤثر على القياس القياسي في اتجاه مجرى النهر.

الشكل 2. تم تركيب وتصوير العينات الموسعة باستخدام منصات المجهر المصنوعة من صفائح الضوء والمجهر الكونفوكلي. (أ) التصوير والقص للهيدروجيلين الموسع (1–2)، المشتركة في جميع منصات التصوير، يليه تركيب المجهر الخفيف (3–4؛ زايس لايتشيتش 7). (ب) صورة فوتوغرافية لعينة موسعة مركبة على مجهر كونفوكال معكوس بالليزر (Nikon Ti2-E AXR). (ج) مقاطع بصرية مفردة تمثيلية (مستويات Z مفردة) من عينة موسعة من نظام ذبابة الفاكهة البصري (خلايا LC4 موسومة بمؤشر نووي فلوري) تم فحصها لفحص mRNA شاك بي ( انظر الشكل 4)، تم الحصول عليها عبر ثلاث منصات تصوير. قضبان الحراشف، 10 ميكرومتر (نسيج ما بعد التمدد). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3. تحليل كمي لنقاط smFISH باستخدام FlySeg. (أ) نظرة عامة تخطيطية لسير عمل تحليل FlySeg للتقسيم الآلي وقياس نقاط النقاط داخل الخلايا المحددة. (ب) تسيلة فورونوي ثلاثية الأبعاد توضح منطق التقسيم الأساسي في فلاي سيغ. يتم تقسيم حجم التصوير إلى مجالات مكانية (كل منها يظهر بلون مميز)، مع تقييد كل تقسيم ليحتوي على نواة واحدة على الأكثر، مما يضمن تعيين خلية واحدة. داخل كل مجال فورونوي، يتم تقسيم النواة باستخدام إجراء تحسين وظيفي يحدد السطح النووي الأمثل بناء على قيم شدة السيتوبلازم النووي والمحيطة. (ج) عرض خيار --nuclei_dilation لتمييز النسخ النووية والسيتوبلازمية قسم بصري واحد يظهر نواة موسومة ب GFP محاطة بنقطة smFISH، مع إشارة DAPI منتشرة تحدد الحجرة السيتوبلازمية بعد معالجة DNase. تشير الخطوط إلى عوامل توسع 0 و0.5، والتي تتوافق مع أحجام نووية وأحجام سيتوبلازمية على التوالي. (د) الإسقاط الأقصى للشدة ل (C)، موضحا أن النقاط تحدد مواقع كل من الأقسام النووية والسيتوبلازمية. قضبان الحراشف، 10 ميكرومتر (نسيج ما بعد التمدد). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4. التحقق من صحة سير العمل الكمي باستخدام إسقاطات الاضطراب الجزيئي بوساطة RNAi (A) على شكل صفائح الضوء (سمك 10 ميكرومتر، لا تغطي حجم الخلية بالكامل) لسوما الألياف العملاقة (GF) الموسومة بعلامة غشاء وفحص mRNA shakB في ظروف التحكم (الأعلى) وshakB RNAi (الأسفل). تشير الخطوط الخضراء المتقطعة إلى حدود السوما لتسليط الضوء على استنزاف مخزون ال mRNA السيتوبلازمي ولكن ليس في النووي. n، الدماغ (جانب واحد لكل حيوان). (B) نفس ( A) لخلايا LC4 الموسومة بعلامة نووية. (ج) قياس نقاط shakB FISH في خلايا GF (المجموعات النووية والخلوية المجمعة) تحت ظروف RNAi المسيطر وshakB . النقاط تمثل الخلايا العصبية الفردية (خلية عصبية واحدة لكل دماغ، وجانب لكل حيوان). (د) نفس الوضع ( ج) لخلايا LC4. تمثل النقاط أدمغة فردية (جانب واحد لكل حيوان؛ عدد النقاط لكل خلية بمتوسط لكل دماغ). (ه) بروزات كونفوكال لتغصنيات GF موسمت بعلامة غشائية ومصبوغة لصالح ShakB في ظروف التحكم (الأعلى) وSHAKB RNAi (الأسفل). (و) قياس مستويات بروتين ShakB في التغصنات GF التي تم قياسها كمتوسط شدة فلورية تحت ظروف RNAi تحت السيطرة وGF>shakB . n، الدماغ (جانب واحد لكل حيوان). (G) إسقاطات كونفوكال لخلايا LC4 موسومة بعلامة غشاء وتعبر عن ShakB الموسوم ب smGdP-10xV5 في حالات RNAi في الأعلى، وshakB RNAi (الأسفل). تشير الخطوط الخضراء المتقطعة إلى مناطق من التغصنات LC4 والأطراف المحورية التي تم تقييم كثافة ShakB-V5 عندها (H) قياس مستويات بروتين ShakB-smGdP-V5 في التغصنات والطرفات المحاورية LC4 كمتوسط شدة فلورية تحت السيطرة وظروف LC4 > shakB RNAi. n، الدماغ (جانب واحد لكل حيوان). تشير أشرطة الخطأ إلى متوسط ± SEM. تم إجراء جميع المقارنات الإحصائية باستخدام اختبارات t ثنائية الجانب لويلش. أشرطة مقياس 10 ميكرومتر في جميع الصور (نسيج ما بعد التوسع). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

يجمع هذا البروتوكول بين HCR-smFISH المدعوم بالتوسعة، والكيمياء المناعية قبل التوسع، وقياس النسخ المعتمد على التقسيم لتمكين قياسات RNA وبروتينية مطابقة في نفس الخلايا العصبية المعرفة جينيا. من خلال دمج هذه المكونات في سير عمل واحد، يجب أن تسهل هذه الطريقة التحليل الجزيئي الكمي الخاص بنوع الخلية في دماغ ذبابة الفاكهة السليم.

تمثل عدة تعديلات عملية تم تقديمها هنا خطوات حاسمة لدمج الكيمياء المناعية النسيجية مع HCR-smFISH المدعوم بالتوسع في دماغ ذبابة الفاكهة ²⁴. أولا، يجب إجراء الكيمياء المناعية قبل توسع الأنسجة وSMFISH. نظرا لأن البروتوكول يتضمن خطوة هضم بروتيناز K، فإن إجراء الكيمياء المناعية بعد التمدد يمكن أن يقلل من سلامة الحواتم. ومن المهم أن حضانة الأجسام المضادة قبل التمدد (24 ساعة أولية + 24 ساعة ثانوية) لا تقلل بشكل ملحوظ من شدة إشارة الحمض النووي الريبي عند استخدام تقنية تنظيف RNase وتثبيت RNA التساهمي. ثانيا، يجب زيادة تركيزات الأجسام المضادة الأولية والثانوية، عادة 2–3× مقارنة ب IHC القياسي الكامل، لتعويض فقدان الإشارة المرتبط بهضم وتوسع الأنسجة. ثالثا، شروط التثبيت مهمة للحفاظ على كل من إشارة البروتين والحمض النووي الريبي. يعزز تثبيت الجليوكسال الخالي من الأحماض من الحفاظ على موقع البروتين المشبكي المثقوب، ويحافظ على السلامة الهيكلية للعمليات العصبية، ولا يؤثر على الكشف الكمي لنقاط mRNA. كما لاحظنا أن تثبيت الحمض النووي الريبي والبروتين في نفس الوقت متوافق مع كل من HCR-smFISH في الأسفل والكشف عن الفلورة المناعية. معا، تحسن هذه التعديلات التوافق بين الكيمياء المناعية النسية واكتشاف النسخ بمساعدة التوسع.

التوسع يضيف خطوة واحدة بين ليلة وضحاها وليس معقدا تقنيا، لكن استخدامه يعتمد على الهدف التجريبي. كما هو موضح في الشكل التكميلي 1، فإن FISH غير الموسع مع الكيمياء المناعية النسوية كاف لتقييم ما إذا كان الجين معبر عنه في نوع خلية معين، بينما يطلب التوسع عندما يحتاج كل نقطة smFISH إلى حل موثوق، وتخصيصها للسوماتا الفردية، وتحليلها كميا، بسبب الزيادة الكبيرة في الدقة المكانية الفعالة. وبالمثل، فإن ألواح التيراساكي متعددة الآبار ليست مطلوبة بشكل صارم، لكنها تقلل من استخدام الكاشف، وتسمح بمعالجة ظروف متعددة بالتوازي، وتساعد في الحفاظ على هوية العينة عبر دفعات صغيرة؛ يمكن أيضا استخدام أنابيب الطرد المركزي الدقيق القياسية عندما يكون حجم الكواشف أقل تقييدا. على الرغم من أن المجهر بالصفائح الضوئية يتيح التصوير الحجمي السريع للأنسجة المتوسعة، إلا أننا نثبت أن أنظمة الكونفوكال القياسية المعكوسة بالليزر المقلوب والدوارة في الأقراص كافية للتصوير الكامل للمجموعات العصبية المختارة في دماغ ذبابة الفاكهة الموسع. من القيود الشائعة في المجهر الكونفوكالي قصر مسافة العمل. ومع ذلك، نظرا لأن دماغ الذبابة صغير وتتوسع العينات بحوالي 2× في PBS، فإن أهداف الغمر في الماء لمسافات العمل الطويلة توفر عمق اختراق كاف. للمقارنات الكمية، يجب الحفاظ على إعدادات الاستحواذ متطابقة عبر العينات، وتجنب البكسلات المشبعة، وأن يكون حجم الفوكسل كافيا لحل نقاط smFISH الفردية. هذا يوسع إمكانية الوصول إلى البروتوكول إلى المختبرات التي لا تحتوي على أجهزة مخصصة لألواح الضوء.

يبني تنفيذ فلاي سيغ المحدث على إطار عمل فلاي سيج المنشور سابقا ويقدم إضافتين رئيسيتين لهذا البروتوكول. أولا، يسمح معامل توسع نووي قابل للتكوين بتصنيف بونكتا smFISH كنووية أو سيتوبلازمية بناء على علاقتها المكانية مع النوى المجزأة. يعد تلوين DAPI السيتوبلازمي بعد معالجة إنزيم DNase مهما لهذه الخطوة، لأنه يوفر إشارة منتشرة تحدد جسم الخلية ويدعم تقسيم نووي موثوق، مما يدعم فصل مجموعات النسخ النووي والسيتوبلازمي. ثانيا، يحدد الكشف الآلي للحالات الشاذة النوى المقسمة بشكل سيء، والتي يمكن استبعادها من القياس اللاحق. بعيدا عن تقييم التأثيرات الجزيئية لإزالة الجين الخاص بنوع الخلية، يمكن أن يكون فصل النسخ النووية عن النصوص السيتوبلازمية مفيدا عندما يعكس تحديد موقع النسخ نشاطا مستمرا في النسخ. في دماغ الثدييات، تظهر نسخ الجينات المبكرة الفورية الناتجة عن النشاط أولا في النواة ثم تتراكم في السيتوبلازم مع معالجة وتصدير mRNA³⁹، وهو مبدأ يستخدم في تحليل catFISH⁴⁰ لأوقات تنشيط الخلايا العصبية. ما إذا كانت ديناميكيات النسخ المماثلة تحدث في دماغ ذبابة الفاكهة غير معروفة حتى الآن، لكن يمكن استكشاف ذلك من حيث المبدأ باستخدام سير العمل الحالي. في أي تجارب مطاردة النبضات الأخرى، قد يوفر التمييز بين النووي والثقب السيتوبلازمي معلومات زمنية تتجاوز إجمالي عدد النسخ. وفي الوقت نفسه، فإن سير العمل ليس مقتصرا على تقسيم النوى ويمكن تكييفه لتقسيم الخلايا بالكامل (أي معرفة الغشاء). سير العمل الكمي الحالي محسن للسوماتا العصبية؛ على الرغم من إمكانية تصوير مناطق العصبية العصبية، إلا أن التعيين الكمي لنقاط mRNA إلى محاور أو تغصنات فردية يتطلب استراتيجيات تقسيم إضافية خاصة بكل قسم. يعد FlySeg أكثر فائدة في القياس الكمي الآلي عالي الإنتاجية في مجموعات الخلايا العصبية الكثيفة حيث تتطلب إحصاءات على مستوى السكان. بالنسبة للخلايا العصبية القابلة للتعرف بشكل فردي أو الأقسام المعرفة يدويا، قد تكون أدوات أخرى مثل Imaris أو FIJI/ImageJ أكثر ملاءمة. يقدم ملخص لهذه الاستراتيجيات الكمية، بما في ذلك تطبيقاتها الرئيسية ومزاياها وقيودها، في الجدول التكميلي 1.

تشمل نقاط حل المشكلات الشائعة ضعف إشارة الأجسام المضادة، ارتفاع خلفية smFISH، تلف الجل أو فقدان العينة، انحراف العينة أثناء التصوير، وضعف التقسيم. غالبا ما يمكن تحسين إشارة الأجسام المضادة الضعيفة عن طريق زيادة تركيز الأجسام المضادة أو تمديد حضانات الأجسام المضادة الأولية و/أو الثانوية من 24 ساعة إلى 48 ساعة. غالبا ما يمكن تقليل خلفية smFISH العالية عن طريق تمديد الغسولات بعد التهجين وتجنب إعدادات الاكتساب المشبعة. يتم تقليل تلف الجل وفقدان العينات باستخدام رؤوس واسعة التجويف، وتقليم الجل بقطع مستقيمة، وقطع قنوات التهوية لمنع الفقاعات أثناء تعبئة الحجرة. يتم تقليل انحراف العينات أثناء التصوير عن طريق توازن الجل المثبت لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل الاقتناء؛ إذا استمر الانجراف، يمكن تمديد التوازن إلى ساعتين أو أكثر. يمكن أن ينتج عن ضعف التقسيم السطحي في DAPI السيتوبلازمي أو عدم اكتمال توازن العينة، مما قد يقلل من إشارة حدود الخلية أو يسبب تحولات X-Y-Z أثناء الاكتساب؛ يجب التحقق من هذه الشروط قبل تعديل معلمات FlySeg. في هذا البروتوكول، يتم الحفاظ على الجل في 1× PBS، مما يؤدي إلى تمدد متساوي الخواص بحوالي 2×. إذا كانت هناك حاجة إلى دقة مكانية أعلى، يمكن تحقيق توسع أكبر في المياه المخففة أو المياه منزوعة الأيونات. وعلى العكس، عندما يكون الهدف فقط تقييم وجود أو غياب التعبير في نوع خلية محدد، قد يكون FISH غير المتوسع مع الكيمياء المناعية النسيجية كافيا، كما هو موضح في الشكل التكميلي 1. يظل البروتوكول متوافقا مع سير عمل FISH التكراري. يمكن إزالة المجسات ودبابيس HCR عن طريق معالجة DNase، مما يسمح بجولات إضافية من التهجين والتضخيم في نفس العينة. قد تشمل التوسعات التقنية المستقبلية HCR-smFISH التكرارية ذات البلكس الأعلى، والتسجيل الآلي عبر جولات التصوير، وتحسين تقسيم الخلايا الكاملة أو الخلايا العصبية، وخطوط تحليل أكثر توحيدا لمقارنة إشارات الحمض النووي الريبي والبروتينات عبر التجارب. يمكن أن يوسع تطوير استراتيجيات التقسيم الخاصة بكل قسم التحليل الكمي إلى ما هو أبعد من السوماتا العصبية إلى المحاور العصبية والتغصن. معا، يجعل هذا السير من قراءة RNA والبروتين، وقياس النسخ المحمول بتقسيم المقصورة، والتوافق مع منصات التصوير القياسية هذا العمل مناسبا لتجارب التحقق الجزيئي المستهدفة في الخلايا العصبية المعرفة وراثيا في دماغ ذبابة الفاكهة السليمة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
محلول هيدروكسيد الصوديوم 10N	فيشر ساينتيفك	كات# SS255-1
محلول هيدروكسيد الصوديوم 1N	فيشر ساينتيفك	كات# SS266-1
20X محلول محلول ملحي-صوديوم سترات	إنفيتروجين	Cat# AM9763
4-هيدروكسي-تمبو	سيغما-ألدريتش	كات# 176141
محلول كلوريد الصوديوم 5M	سيغما-ألدريتش	Cat# S5150
أكريلاميد	سيغما-ألدريتش	Cat# A9099
حمض الأكريليك	سيغما-ألدريتش	القط# 147230
Acryloyl-X، SE	إنفيتروجين	Cat# A20770
أدوبي إليستريتور	أدوبي	لا يوجد
أليكسا فلور 488 مضاد للدجاج من الماعز (1:200)	مختبرات جاكسون لأبحاث المناعة	التصنيف #103-545-155، RRID:AB_2337390
أليكسا فلور 568 مضاد للفئران ماعز IgG1 (1:200)	إنفيتروجين	Cat# A-21124، RRID:AB_2535766
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG1 (1:200)	إنفيتروجين	Cat# A-11011، RRID:AB_143157
الأمونيوم بيرسلفات	سيغما-ألدريتش	Cat# A3678
DMSO اللامائي	سيغما-ألدريتش	Cat# 900645-4X2ML
لاصق المعالجة بالأشعة فوق البنفسجية البونديك	بونديك	مجموعة البداية من بونديك
برنامج تصوير cellSens v4.4.1	علم واضح	لا يوجد
دجن متعدد النصوص مضاد لجرب الزيتوني (1:400)	أبكام	Cat# ab13970، RRID:AB_300798
كوندا (مدير البيئة)	شركة أناكوندا، إنك	لا يوجد
كورنينغ وتجارة؛ شرائح المجهر المصنوعة	كورنينغ	كات# 2948-75X25
حامل عينات مصمم خصيصا لكاميرا LS7	جانيليا تك	الرقم 2021-021
DAPI	سيغما-ألدرتش	Cat# D9542
مشرط معقم من الفولاذ المقاوم للصدأ قابل للتخلص	ميدبرايد	MPR-47101
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك	سيغما-ألدرتش	كات# EDS-100G
برنامج تحليل الصور في فيجي (ImageJ) v2.14.0	اتحاد ImageJ	لا يوجد
FlySeg (خط أنابيب مخصص)	https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH	لا يوجد
حل التثبيت في GAF	أداكس بايوساينسز	القط# VI25
GenClone® 24 لوحة زراعة خلايا بئر غير معالجة	جينيسي ساينتيفك	القط# 25-102
GMR-86D05-Gal4 (LC4)	مركز بلومينغتون للأسهم	#41315
قطيع متبرع بمصل الماعز	سيغما-ألدريتش	Cat# G6767
HCR & trade; مخزن مضخم RNA-FISH (v3.0)	الأدوات الجزيئية	لا يوجد
HCR & trade; مضخمات RNA-FISH (v3.0): AF546، JF669	الأدوات الجزيئية	لا يوجد
HCR & trade; مخزن التهجين المجسي RNA-FISH (v3.0)	الأدوات الجزيئية	لا يوجد
HCR & trade; مخزن غسيل المجس RNA-FISH (v3.0)	الأدوات الجزيئية	لا يوجد
HCR & trade; مسبار RNA-FISH (الإصدار 3.0) ShakB	الأدوات الجزيئية	لا يوجد
إيماريس 10.1	أكسفورد إنسترومنتس	لا يوجد
مجهر الكونفوكال القرص الدوار IXPlore IX85 SpinSR	علم واضح	لا يوجد
مجهر LS7 الخفيف	كارل زايس	لا يوجد
ميلفالان	شركة كايمان للكيماويات	Cat#16665
مخزن MOPS	فيشر ساينتيفك	كات# BP308-100
فأر وحيد النسيلة مضاد V5 (SV5-PK1) (1:100)	أبكام	Cat# ab27671، RRID:AB_471093
ن، ن، ن، ن، ن- تترام إيثيل إيليني ديامين	سيغما-ألدريتش	Cat# T7024
ن، ن'-ميثيلين بيساكريلاميد	سيغما-ألدريتش	Cat# M7279
ناباري	مجتمع مفتوح المصدر	لا يوجد
برنامج التصوير البحثي المتقدم من NIS-Elements	شركة نيكون	لا يوجد
مياه خالية من النوكلياز	تشياغن	كات# 129114
Nunc&Trade؛ ميني ترايرز مع Nunclon & trade؛ دلتا سيرفيس	إنفيتروجين	كات# 163118
PBS (10X)، pH 7.4	جيبكو	كات# 70011044
منظف فوتو-فلو	علوم المجهر الإلكتروني	القط# 74257
محلول بولي-إل-ليسين	تيد بيلا & nbsp;	Cat# 18026
نظارات الغلاف الدقيق، #1.5H السماكة	ثورلابز	كات# CG15CH2
الطباعة إلى الختم والتجارة؛ عازل سيليكون مع مادة لاصقة، بئر واحد، قطر 20 مم، عمق 0.5 مم	إنفيتروجين	Cat# P24740
بروتيناز K	نيو إنجلاند  مختبرات بيولوجية	Cat# P8107S
رابيت أنتي-شاك بي (1:400)	هدية من جورد أمير	لا يوجد
RNase AWAY & TRADE; مطهر السطح	إنفيتروجين	Cat# 7002
مجموعة DNase خالية من RNase	Qiagen	القط# 79256
شنايدر s ذبابة الفاكهة متوسطة	جيبكو	كات# 21720001
shakB-KDRT-stop-KDRT-smGdP-V5;;	فريغيتو وآخرون، 2025	PMID: 41278920
أزيد الصوديوم	سيغما-ألدريتش	Cat# S8032
المجهر ستيمي 508 الستيريو	كارل زايس	لا يوجد
SYTO & TRADE؛ 41 صبغة الحمض النووي الفلورية الزرقاء	إنفيتروجين	كات# S11352
المجهر الكونفوكال الماسح بالليزر Ti2E AXR NSPARC	شركة نيكون	لا يوجد
قاعدة تريس	فيشر ساينتفيك	Cat# BP152-500
ترايتون وتجارة؛ X-100	سيغما-ألدريتش	Cat# T8787
UAS-GFP-2A-KDR؛	سانفيليبو وآخرون 2024	PMID: 38262414
UAS-his2A-GFP؛	دومبروفسكي وآخرون، 2025	PMID: 40468081
UAS-mCherry RNAi	مركز بلومينغتون للأسهم	#35785
UAS-myr::GFP;	مركز بلومينغتون للأسهم	#32198
UAS-shakB RNAI	أامر وآخرون، 2022	PMID: 35385694
ألترا بيور والتجارة؛ 1M Tris-HCI، درجة حموضة 8.0	إنفيتروجين	كات# 15568025
VT042336-جال4 (ألياف عملاقة)	دومبروفسكي وآخرون، 2025	PMID: 40468081
زن بلاك 3.1	كارل زايس	لا يوجد