الإنتاج واسع النطاق للحويصلات خارج الخلية من مزارع خلايا ثلاثية الأبعاد عالية الكثافة في مفاعلات الألياف المجوفة

ملخص

تقدم تعليمات لإعداد واستخدام مفاعل حيوي مجوف ثلاثي الأبعاد من ألياف التروية لإنتاج الحويصلات خارج الخلايا من MSC وأنواع خلايا أخرى. يصف هذا البروتوكول طريقة لإنتاج الحويصلات خارج الخلية بتركيزات عالية بشكل مستمر مع التحكم في كثافة الخلايا في المفاعلات الحيوية الليفية المجوفة.

الملخص

يعيق التقدم في مجال أبحاث الإكسوسومات قلة وإنتاجية الإكسوسومات المفرزة في الزراعة التقليدية للخلايا ثنائية الأبعاد. تسمح الزراعة الخلوية عالية الكثافة في المفاعلات الحيوية الليفية المجوفة (HFBRs) بإنتاج مستمر للجزيئات الحيوية المفرزة والحويصلات خارج الخلية (EVs)، من أعداد كبيرة من الخلايا، على مدى فترات طويلة وبتركيزات عالية في الزراعة ثلاثية الأبعاد. يصف هذا البروتوكول جمع الإكسوسومات المركزة المفرزة مع الحفاظ على كتلة الخلية المثلى وظروف زراعة التروية ثلاثية الأبعاد التي تدعم نمو الخلايا عالي الكثافة على مدى عدة أسابيع أو أشهر من الإنتاج المستمر في HFBR المتوفر تجاريا. النظام مدمج، مغلق، لمرة واحدة الاستخدام، يمكن أن يكون متوافقا مع cGMP، سهل الاستخدام، ويتناسب مع حاضنة CO 2 القياسية. قد تظهر بعض الخلايا، مثل الخلايا الجذعية الميزنكيمية (MSCs) والخلايا الجذعية للسائل الأمنيوسي البشري (HAFSCs)، تكاثرا أقل في هذه الظروف، مما قد يؤثر على التمايز والنمط الظاهري مع مرور الوقت. تظهر النتائج التمثيلية إنتاجية EV النموذجية وفعالية الخلايا على مدى أسابيع أو أكثر من الإنتاج المستمر. توفر هذه الطريقة حصادا عالي الجودة وقابلا للتكرار من السيارات الكهربائية مناسبة للتطبيقات البحثية والسريرية.

المقدمة

تعرف الحويصلات خارج الخلايا بشكل متزايد بدورها في التواصل بين الخلايا والتطبيقات العلاجية، بما في ذلك الطب التجديدي. طرق زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد التقليدية تتطلب جهدا كبيرا وذات عائد محدود، وأحيانا تتطلب مئات القوارير الصناعية للحصول على عدد كاف من المركبات الكهربائية للتجارب أو الدراسات الحيوانية ^1,2. عادة ما يستخدم التوسع السريري في الترجمة المفاعلات الحيوية المختلطة التقليدية باستخدام حاملات دقيقة أو دعائم أخرى. هذه الأنظمة بطبيعتها غير فسيولوجية، وغير فعالة، ويمكن أن تؤدي إلى نتائج متغيرة. توفر المفاعلات الحيوية الليفية المجوفة بيئة ثلاثية الأبعاد تعتمد على التروية تدعم زراعة الخلايا عالية الكثافة ضمن مساحة مدمجة وعلى نطاق مناسب للتطبيقات السريرية ^3,4.

تقدم أجهزة HFBR نظام زراعة خلايا مدمج عالي الكثافة يتيح الإنتاج المستمر للسيارات الكهربائية المركزة بجهد ووقت ومساحة أقل مقارنة بزراعة ثنائية الأبعاد التقليدية⁵. تمكن هذه الأنظمة زراعة الخلايا عالية الكثافة في مساحة مدمجة، تدعم إنتاج المركبات الكهربائية على نطاق واسع في أي مختبر. تزرع HFBRs أعدادا كبيرة من الخلايا (1X10⁹ إلى 1×^{10 10}) في حجم صغير (20–60 مل)، في حاضنة CO₂ قياسية، ولا تتطلب أي معدات متخصصة. تسمح هذه الأنظمة بحصاد مستمر ومركز من المركبات الكهربائية على مدى أسابيع أو شهور مع تسهيل استخدام مصل منخفض أو وسائط معرفة كيميائيا. في HFBR، تحتجز الخلايا في الحجم الصغير للمساحة الشعرية الإضافية (ECS) المفصولة عن الوسط المعاد تدويره بواسطة غشاء ألياف مجوف شبه منفذ بوزن جزيئي محدد (MWCO) (الشكل 1). يمكن للجزيئات الصغيرة مثل الجلوكوز واللاكتات عبور الألياف بسهولة، بينما تحتفظ العناصر الأكبر مثل الأجسام المضادة أو الحويصلات خارج الخلية وتركزها في ECS، حيث يمكن جمعها.

ثلاث خصائص أساسية تميز زراعة الخلايا الليفية المجوفة عن أي طريقة أخرى: 1) نسبة المساحة السطحية إلى الحجم العالية (200^{سم 2}/مل) تسمح بكثافات الخلايا الشبيهة بالخلايا الحية، 1–2 × 10⁸خلايا لكل مل. 2) الخلايا مرتبطة بدعامة مسامية، وليست بطبق بلاستيكي غير مسامي. تقسيم الخلايا غير مطلوب³. يمكن التحكم في قطع الوزن الجزيئي (MWCO) لللياف. يتم الاحتفاظ بالمنتجات المفرزة وتركيزها بمقدار 10–100 مرة مقارنة بثقافة القارورة ثنائية الأبعاد داخل نظام ECS الخاص بالخرطوشة. أيضا، يمكن تطبيق مصفوفات بروتينية محددة مثل الفيبرونكتين أو الكولاجين بسهولة على سطح الألياف دون التأثير على التدفق عبر الألياف.

يوفر HFBR بيئة زراعة ثلاثية الأبعاد تعتمد على التروية تشبه إلى حد كبير في الجسم الحي مقارنة بزراعة ثنائية الأبعاد⁶، ويقلل بشكل فريد من اعتماد الخلايا على دعم المصل ويبسط احتياجاتها الوسطية. قد تدعم بيئة الزراعة عالية الكثافة هذه اختلافات في معالجة البروتينات مقارنة بزراعة الزراعة ثنائية الأبعاد، إلى جانب زيادة النشاط الحيوي المدفوع ^{المدفوع 7,8,9} المعلنة. المفاعلات الحيوية ذات الألياف المجوفة "مركزية النسيج"؛ تحاول محاكاة خصائص الأنسجة في فسيولوجيا الخلايا الحية ¹⁰. الخاصتان الرئيسيتان للمفاعل البيولوجي المركزي النسيجي هما 1) كثافة عالية للخلايا، مما يسمح للخلايا بتوليد بيئتها الدقيقة الخاصة، و2) لا يتطلب انقسام أو مرور الخلايا، مما يسمح بالتطور التفاعلي بين الخلايا والهياكل ثلاثية الأبعاد مثل الكرويدات بشكل عضوي مع مرور الوقت. تمكن هذه الطريقة من تحقيق كثافات خلايا يصعب تحقيقها باستخدام أنظمة الزراعة ثنائية الأبعاد التقليدية، ويمكن أن تسهل استخدام وسائط مبسطة، خالية من البروتين، ومعرفة كيميائيا.

أي نوع من الخلايا يمكن زراعته في قوارير يمكن زراعته في مفاعل حيوي من الألياف المجوفة. خطوط الخلايا المتحولة ستكون تكاثرية¹¹. المعامل الرئيسي للمراقبة هو معدل امتصاص الجلوكوز. يوفر مراقبة الجلوكوز مقياسا مباشرا للنشاط الأيضي، مما يمكن من تحسين توقيت الحصاد والتحكم في كثافة الخلايا¹². من المهم التحكم في كتلة الخلية داخل الخرطوشة حتى لا يتجاوز معدل امتصاص الجلوكوز قدرة النظام على توصيل الأكسجين وإزالة ثاني أكسيد الكربون^. يتم ذلك ببساطة عن طريق إزالة كتلة الخلية أثناء الحصاد. لا تتكاثر الخلايا الصلبة الصلبة وHAFSCs في المفاعل الحيوي الألياف المجوف لكنها تبقى ساكنة. تتطلب هذه الخلايا التوسع قبل التلقيح في المفاعل الحيوي. ومع ذلك، بمجرد تأسيس الزرعة، يمكن حصاد المركبات الكهربائية بشكل مستمر لأسابيع أو شهور. لا يتغير النمط الظاهري للMSC خلال 30 يوما من الزراعة، باستثناء ربما تعبير CD105، الذي ينخفض خلال هذه الفترة. عندما تم طلاء الخلايا الصلبة الصلبة من المفاعل الحيوي لاحقا في قارورة تحتوي على وسط يحتوي على المصل، عاد تعبير CD105 إلى المستوى^{الأولي 13}. قد يكون تعبير CD105 علامة على ثقافة vs. 3D ثنائية الأبعاد. يمكن أيضا استخدام تقنيات النقل العابر لصنع ترانسفكتانت شبه مستقر¹⁴.

تشمل أمثلة ظروف ومزايا زراعة الخلايا الحية في الزراعة الليفية المجوفة ثلاثية الأبعاد التعديلات الكاملة والموحدة بعد الترجمة على مدى الزمن^15،16، وتكوين الزغب بواسطة ظهارة المعدة لزراعة كريبتوسبوريديوم¹⁷، ونموذج الكبد ثلاثي الأبعاد¹⁸، ونموذج الحاجز الدموي الدماغي^{ثلاثي الأبعاد 19}، وتكوين البلازموديوم سبوروزويت²⁰، والزراعة المشتركة لنخاع العظم/الخلايا الجذعية²¹.

في HFBR، تكون الخلايا الكهربائية مركزة بشكل كبير، مع تقليل التلوث من البروتينات داخل الخلية وشظايا الغشية، حيث يكون تحلل الخلايا محدودا. المفاعلات الحيوية ذات الألياف المجوفة متوافقة مع أي وسط، بشرط ألا تكون هناك مكونات ذات وزن جزئي عالي لا تعبر الألياف. إذا لزم الأمر، يمكن إضافة هذه الجزيئات الكبيرة مباشرة إلى نظام ECS للمفاعل الحيوي. يفضل الوسائط عالية الجلوكوز مثل DMEM. يمكن لوسائط زراعة الخلايا الأقل تعقيدا والخالية من البروتين أن تبسط التنقية عن طريق تقليل حمل البروتين. تم زراعة الخلايا الجذعية الميزنكيمية والخلايا الجذعية للسائل الأمنيوسي البشري في الأوساط القاعدية القياسية وFBS، بالإضافة إلى عدة تركيبات تجارية متوفرة من وسائط MSC. يمكن ل HFBR إنتاج كميات جرامية من الإكسوسومات باستخدام خراطيش جاهزة. المفاعل الحيوي المصنوع من الألياف المجوفة هو طريقة مفيدة للإنتاج واسع النطاق للإكسوسومات تحت ظروف محتملة ل cGMP ويمثل تحولا جذريا في تطوير أبحاث الإكسوسومات والترجمة السريرية.

الاستخدام الناجح لمفاعل بيولوجي من الألياف المجوفة لإنتاج الحويصلات خارج الخلية يعتمد بشكل كبير على البروتوكولات. يمكن أن تساهم التلاعب بالمفاعل الحيوي، وكثافة بذر الخلايا، وتكرار الحصاد، والوسط المستخدم كلها في نجاح تشغيل المفاعل الحيوي. يصف هذا البروتوكول طريقة موحدة لاستخدام مفاعل حيوي من الألياف المجوفة لإنتاج وجمع الحويصلات خارج الخلية من مزارع خلايا عالية الكثافة. الهدف هو توفير نهج قابل للتكرار لجمع السيارات الكهربائية، بما في ذلك إرشادات حول إعداد النظام، وتطعيم الخلايا، وصيانة الزرعات، وإجراءات الحصاد. تهدف الطريقة إلى دعم إنتاج متسق للطاقة الكهربائية لتطبيقات البحث وتوفير إطار يمكن تكييفه لأنواع الخلايا المختلفة والأهداف التجريبية.

البروتوكول

جميع الإجراءات تلتزم بإرشادات الممارسات المخبرية الجيدة (GLP) والممارسات الجيدة لزراعة الخلايا والأنسجة.

ملاحظة: الخرطوشة مجمعة مسبقا ومعقمة بغاما. يتم تعبئة الكيس المزدوج، وأغطية لوئر على كل اتصال، لذا فهي مغلقة تماما وستبقى معقمة خارج الأكياس. انظر الشكل 2 لتحديد منفذ الخرطوشة. تم تنفيذ جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة باستخدام غطاء تدفق طبقي.

1. تحضير وتعقيم غطاء الخزان.

1. قم بإزالة قطعتي الأنبوب القصيرتين من الخرطوشة ذات الكيس المزدوج.
2. ثبت الأنبوب على أشواك الخرطوم على أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ لغطاء الخزان.
3. لف الأنبوب القصير ونهايات أنبوب الفولاذ المقاوم للصدأ المكشوفة بورق ألمنيوم للحفاظ على التعقيم بعد التعقيم الداخلي. ضع المكونات المجمعة في كيس معقم (أوتوكلاف).
4. يستخدم دورة جافة عند 121 درجة مئوية لمدة 15–30 دقيقة. اترك الغطاء ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

2. تثبيت خرطوشة الألياف المجوفة على زجاجة الخزان

1. انقل 50 مل من PBS من زجاجة 1 لتر إلى أنبوب مخروطي بسعة 50 مل لاستخدامه لاحقا.
2. قم بإزالة غطاء الخزان من كيس الأوتوكلاف وإزالة ورق الحماية من أنابيب الفولاذ الطويلة.
3. أزل الغطاء من زجاجة PBS وثبت غطاء الخزان في مكانه. أزل الخرطوشة من الكيس المعقم الداخلي.
4. قم بإزالة ورق الألمنيوم من إحدى قطع الأنابيب الموجودة في أعلى غطاء الخزان.
5. قم بإزالة غطاء اللوئر من أحد قطع أنبوب الخرطوشة الطويلة وثبته على أنبوب الخزان الموجود على غطاء الخزان. استخدم قليلا من الدوران الخلفي لمنع الانحناء.
6. كرر ذلك للاتصال الثاني للأنابيب.
7. اضغط بلطف على أنبوب المضخة البنية لتشغيل PBS عبر النظام حتى تتم إزالة جميع فقاعات الهواء.

3. ملء الفراغ الإضافي للشعيرات الدموية (ECS)

1. سحب 20 مل PBS في حقنة معقمة باستخدام إبرة كبيرة القياس لا يقل طولها عن 1.5 بوصة؛ الإبرة غير الحادة مفضلة للسلامة.
2. قم بتعقيم كلا وصلة اللوئر الجانبية بالكحول واتركهما ليجفوا.
3. قم بتوصيل الحقنة المملوءة ب PBS إلى منفذ جانبي واحد وحقنة معقمة فارغة على المنفذ المقابل. أغلق كلا المنافذ الطرفية وافتح كلا المنافذ الجانبية.
4. حقن PBS ببطء في نظام ECS مع تثبيت الخرطوشة بزاوية طفيفة لتقليل فقاعات الهواء. الحقنة الفارغة على المنفذ المقابل ستمتلئ بالهواء.
5. إذا كان الهواء موجودا في ECS، افتح المنفذ الأيمن واسحب السائل إلى الحقنة الفارغة حتى يمتلئ ECS بالسائل (وهذا يسحب PBS من زجاجة الخزان، عبر الألياف، إلى ECS).
6. أغلق مشابك الشريحة الجانبية من المنفذ، وافتح كلا مشابك نهاية المنفذ، وتحقق من تدفق التدفق عن طريق ضغط أنبوب المضخة بلطف بأصابعك.
7. اترك الحقن الفارغة متصلة بالمنافذ الجانبية لتعمل كأغطية. استبدل الحقن بأخرى جديدة في كل مرة تخرج فيها من غطاء التدفق الطبقي.

4. طلاء الألياف وتطعيم الخلايا

ملاحظة: إجراءات تغطية الألياف ببروتين مصفوفة معين وتطعيم الخلايا هي في الأساس نفسها. سيتدفق سائل زائد عبر الألياف إلى الخزان، بينما تبقى الخلايا أو مادة الطلاء على الخارج من الألياف في نظام ECS. يوصى باستخدام 1 × 10⁸ خلايا للبذر. يوصى باستخدام 100–500 ميكروغرام من بروتين المصفوفة في 20 مل من PBS لبروتين HFBR بحجم 4000 سم² . البروتينات المصفوفة المرتبطة بأسطح الألياف لا تؤثر على MWCO

1. جهز محلول الطلاء أو تعليق الخلية في أنبوب مخروطي معقم بحجم 50 مل. 1 × 108 خلية في وسط مكيف نتيجة تمدد القارورة أو بروتين مصفوفة 100–500 ميكروغرام في PBS. المجلد 20 مل.
2. سحب 20 مل من الخلايا أو محلول الطلاء إلى حقنة معقمة باستخدام إبرة كبيرة الحجم.
3. قم بتثبيت الحقنة التي تحتوي على المحلول إلى منفذ جانبي واحد وحقنة معقمة فارغة على المنفذ الجانبي الآخر.
4. أغلق كلا المنافذ الطرفية وافتح كلا المنافذ الجانبية.
5. اخلط المحلول بلطف عن طريق نقل السائل بين المحقنتين. اترك نصف المحلول في كل حقنة. أغلق كلا المنافذ الجانبية.
6. افتح منفذ الطرف الأيمن وفك غطاء الخزان بمقدار ربع دورة.
7. حقن المحلول من حقنة واحدة في ECS. أغلق المنفذ الجانبي المرفق.
8. حقن المحلول من الحقنة الأخرى. أغلق المنفذ الجانبي المرفق. افتح كلا المنفذين الطرفيين.
9. إذا كنت تتلقيح الخلايا، اترك الخرطوشة في وضع أفقي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم قم بتدوير 180° على المحور الطويل واتركها لمدة 30 دقيقة إضافية.
   1. إذا غطيت الألياف ببروتين المصفوفة، اتركها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
10. ضع الخرطوشة في نظام مضخة Duet وابدأ التدفق عند 25.

5. التحضير للحصاد (انظر الشكل 2)

1. قم بتوصيل حقنة معقمة فارغة مع صمام توقف ثلاثي الاتجاه وفلتر معقم على المنفذ الأيمن.
2. اضبط صمام التوقف ثلاثي الاتجاهات للسماح بالتهوية عبر الفلتر المعقم. اربط حقنة معقمة ثانية فارغة على المنفذ الأيسر.

6. جمع الوسط المكيف (الحصاد)

1. افتح المنفذ الأيمن وحافظ على التهوية المعقمة عبر الفلتر.
2. قم بإمالة الطرف الأيمن من الخرطوشة للأعلى واسحب الوسط المعدل (المنتج) إلى الحقنة اليسرى. قم بتفريغ محتويات ECS بالكامل في الحقنة اليسرى.
3. أغلق المنفذ الأيمن. أغلق المنفذ الأيسر، وأخرج المحقنة، واجمع الحصاد في أنبوب مخروطي بحجم 50 مل.
4. استبدل الحقنة على المنفذ الأيسر. افتح المنفذ الأيسر. افتح المنفذ الأيمن.
   فك غطاء الخزان بربع دورة.
5. قم بإمالة الطرف الأيسر من الخرطوشة للأعلى واملأ ECS عن طريق سحب الحقنة المتصلة بالمنفذ الأيسر. املأ جهاز ECS بالكامل حتى يصبح الغضروف الهلالي السائل في منتصف أنبوب المنفذ الجانبي.
6. أغلق المنفذ الأيمن. افتح المنفذ الأيمن واضبط صمام التوقف ثلاثي الاتجاهات ليخرج من خلال الفلتر.
7. افتح المنفذ الأيسر. قم بإمالة الخرطوشة إلى اليمين وأفرغ نظام ECS بالكامل في الحقنة اليسرى.
8. أغلق المنفذ الأيسر. أزل الحقنة واجمع ECS المحصود داخل أنبوب مخروطي بسعة 50 مل.
9. أعد الحقنة إلى المنفذ الأيسر. أغلق المنفذ الأيمن. افتح المنفذ الأيمن
10. قم بإمالة الجانب الأيسر من الخرطوشة للأعلى واملأ جهاز ECS عن طريق سحب الحقنة اليسرى. املأ جهاز ECS بالكامل حتى يصبح الغضروف الهلالي السائل في منتصف أنبوب المنفذ الجانبي.
11. أغلق المنفذ الأيسر. افتح المنفذ الأيسر. شد غطاء الخزان.
12. تأكد من تدفق النظام عن طريق ضغط أنبوب المضخة يدويا قبل إعادة الخرطوشة إلى مضخة Duet.

7. إدخال المفاعل الحيوي في نظام المضخة.

1. اضبط معدل تدفق المضخة على إعداد 25 في صندوق التحكم. الخرطوشة أسهل في التركيب أثناء تشغيل المضخة.
2. أمسك الحافة اليمنى لحامل مسار التدفق. قم بإدخال أنبوب المضخة داخل أنبوب المضخة.
3. قم بإدخال قاعدة مسار التدفق إلى الفتحة الموجودة على قاعدة المضخة. تأكد من أن السجل المستطيل يثبت في فتحة القطع على حامل مسار التدفق.
4. ضع زجاجة الخزان في التجويف على جانب قاعدة المضخة.
5. السلك الرقيق للطاقة يتناسب بين حشية الحاضنة. صندوق التحكم يحتوي على مغناطيس لتوصيله بجانب الحاضنة.

8. مراقبة مستويات الجلوكوز

1. باستخدام ماصة بسعة 1 مل، أزل عينة 1 مل من وسط من زجاجة الخزان.
2. قم بقياس تركيز الجلوكوز باستخدام مقياس جلوكوز متوافق عن طريق وضع قطرة صغيرة من وسط مأخوذ عينات على شريط اختبار الجهاز.

9. حساب معدل امتصاص الجلوكوز

ملاحظة: يتم حساب معدل امتصاص الجلوكوز بطرح قياس الجلوكوز بعد 24 ساعة من القياس الأولي للجلوكوز. نظرا لأن المعدل يعتمد على حجم الخزان، اضرب انخفاض تركيز الجلوكوز في حجم الخزان باللتر. على سبيل المثال، إذا كان هناك 250 مل في زجاجة الخزان، اضرب في 0.25 (25٪). (جلوكوز1-جلوكوز2) X (زجاجة خزان باللتر). 250 مل يساوي 0.25 لتر. إذا مر أكثر من يوم، اقسم ذلك على عدد الأيام. على سبيل المثال: الجلوكوز الابتدائي 4.5 جم/لتر؛ قياس الجلوكوز بعد 24 ساعة: 2.7 جرام/لتر؛ زجاجة الخزان: 250 مل. 4.5-2.7=1.8 جرام. 1.8X.25 (زجاجة الخزان 0.25 لتر)، 0.45 جرام من الجلوكوز مستهلك. معدل امتصاص الجلوكوز هو 450 ملغ يوميا.

10. فحص الجدوى

1. اجمع عينة صغيرة من الخلايا باستخدام بروتوكول الحصاد.
2. ضع خلايا الألواح في قارورة T 25 مع وسط يحتوي على مصل طازج بنسبة 10٪. قيم التعلق والقدرة على الاستمرار بصريا.

11. صيانة الخرطوشة يوميا والأسبوع الأول من الزرعة.

ملاحظة: خلال الأسبوع الأول من الزراعة، ستتوسع الخلايا التكاثرية إلى معدل مستهدفها البالغ 1–2 جرام من الجلوكوز يوميا.

1. اليوم 0: تلقيح الخلايا، تحديد تركيز الجلوكوز الابتدائي من تركيبة الوسط. حجم الخزان الابتدائي: 125 مل.
2. اليوم 1-2: قس الجلوكوز يوميا. عندما ينفد الجلوكوز الابتدائي بنسبة 50٪، استبدل خزان 125 مل بوسط طازج بسعة 250 مل، وخفض المصل إلى 7.5٪.
3. اليوم 3-4: قياس الجلوكوز. عندما ينفد الجلوكوز الأولي بنسبة 50٪، استبدل خزان 250 مل بوسط طازج بسعة 500 مل، وقلل المصل إلى 5٪.
4. اليوم الرابع إلى الخامس: قس الجلوكوز. عندما ينفد الجلوكوز الابتدائي بنسبة 50٪، استبدل 500 مل ب 1 لتر من الوسط الطازج. قلل المصل إلى 2.5٪ وانتقل إلى وسط محدد كيميائيا إذا رغبت.
5. اليوم 6+: قياس الجلوكوز، وحصاد ECS. تحكم في كثافة الخلايا عن طريق الحصاد للحفاظ على امتصاص الجلوكوز بين 1 إلى 2 جرام يوميا.
6. بالنسبة للخلايا غير التكاثرية، ابدأ ب 125 مل في زجاجة الخزان، وغير الوسط كل 3 أيام.
7. إذا كان هناك استهلاك كبير للجلوكوز، قم بزيادة الخزان إلى 250 مل. أزل المصل من ECS في الأيام 3-4 واستبداله بوسط قاعدي.

النتائج

وفقا لهذا البروتوكول، عادة ما تستهلك خرطوشة بحجم 4000 سم² مزروعة بخطوط خلايا متضخمة من 1–2 جرام من الجلوكوز يوميا. وهذا يترجم إلى 1 لتر من الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام عند استخدام وسط عالي الجلوكوز مثل DMEM. تصل الخلايا إلى أقصى كثافة خلال أسبوع واحد بعد البذر. يجب أن يبدأ الحصاد بعد 5-7 أيام أو عندما يصل معدل امتصاص الجلوكوز إلى 1 جرام يوميا، ويجب أن يتم بعدها يوميا إذا أمكن. خلال الأسبوع الأول من الزراعة، يمكن استبدال الوسط المحتوي على المصل في ECS بوسط قاعدي خال من المصل مع الحفاظ على المصل في الوسط المتداول، إذا كانت هناك حاجة إلى المصل. عندما يصل معدل امتصاص الجلوكوز إلى 1 جرام يوميا، يمكنك بسهولة التحول إلى وسط مصلي منخفض أو وسائط كيميائية أخرى. تستهلك الخلايا الميثولة الهيكلية وHAFSCs الجلوكوز بمعدل أقل بكثير من خطوط الخلايا المحولة، مثل CHO، 293، أو الهجينات. تكوين الكرويدات هو أمر نموذجي في MSC وHAFSC، إلى جانب أنواع أخرى من الخلايا (الشكل 3). يوفر المراقبة اليومية للجلوكوز مقياسا موثوقا لصحة الزراعة ونشاط الأيض. تم استخدام وسائط عادية ومتاحة تجاريا خالية من الأجانب بنجاح مع MSC وHAFSC. حجم الحصاد حوالي 20 مل. فترات 24 ساعة بين الحصاد هي الأمثل حيث تصل تركيزات EV إلى الحد الأقصى بعد 24 ساعة (الشكل 4). تتراوح تركيزات الإكسوسومات النموذجية في الوسط المحصود بين 1–5 × 10^{إلى 12} جسيم/مل، وذلك حسب نوع الخلية، وأعداد البذر، وعوامل أخرى، وقد تؤدي إلى ظهور حبيبات مرئية بعد الطرد المركزي (الشكل 5). يمكن زرع أعداد كبيرة من الخلايا ويجب أن تعتمد على عدد الخلايا وليس مساحة الزراعة (الشكل 6).

تظهر النتائج أن إنتاج EV يرتبط بالنشاط الأيضي كما يقاس باستهلاك الجلوكوز، مما يوفر معاملا عمليا لمراقبة وتحسين أداء الزرعة. الحصاد اليومي بفواصل زمنية 24 ساعة يعظم تركيز المركبات الكهربائية مع الحفاظ على استقرار الزرعة. تدعم هذه النتائج استخدام مراقبة الجلوكوز وتكرار الحصاد المتحكم به كمعايير رئيسية لإنتاج المركبات الكهربائية القابلة لتكرار في المفاعلات الحيوية ذات الألياف المجوفة.

الشكل 1: المقطع العرضي لمفاعل الألياف الحيوي المجوف. يتدفق الوسط عبر داخل الألياف، وتلتحق الخلايا بخارجها. المكونات ذات الوزن الجزيئي الصغير مثل الجلوكوز واللاكتات يمكن أن تعبر الألياف بسهولة. المنتجات المفرزة، مثل EVs، لا يمكنها عبور الألياف وتصبح مركزة بشكل كبير في المنطقة خارج الألياف، وتسمى ECS (الفضاء خارج الشعيرات الدموية). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: صورة للخرطوشة مع تحديد المنافذ والمشابك. تولد صمامات الفحص أحادية الاتجاه على مسار التدفق تدفق إعادة تدوير الوسط. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: الخلايا الجذعية الميزنكيمية، الخلايا الجذعية السائلة الأمنيوسية البشرية، السلف القلبي، وبعض أنواع الخلايا الأخرى ستشكل كرويا عند بذرها في الخرطوشة بأعداد كافية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: قياس تركيزات EV بعد حصاد فترات زمنية مختلفة. بعد 24 ساعة، يصل تركيز EV إلى أقصى تركيز. الحصاد الأمثل بعد 24 ساعة. (البيانات مقدمة من باولو نيفياني، نواة EV، مستشفى الأطفال في لوس أنجلوس). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: حصاد أسبوع من المركبات الكهربائية من خلايا DIFI المزروعة في مفاعل الألياف المجوفة C2011. المركبات الكهربائية معزولة بواسطة الطرد المركزي التفاضلي. (البيانات بإذن من جيف فرانكلين، جامعة فاندربيلت)^{18، 19}. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: يمكن زرع عدد كبير بشكل مفاجئ من الخلايا في مفاعل الألياف المجوفة. تحتل مراكز MSC مساحة كبيرة في ثقافة ثنائية الأبعاد؛ عندما تزرع ككروية في ثقافة ثلاثية الأبعاد، تحتل مساحة أقل. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

المفاعلات الحيوية الليفية المجوفة غير قادرة على تصنيع البروتينات أو الأجسام المضادة بكميات تجارية حقيقية بشكل معقول. ومع ذلك، لديها قدرة فريدة على زراعة أعداد كبيرة نسبيا من الخلايا بكثافة عالية وإفراز منتج مركز من الخلايا الكهربائية على نطاق سريري ذو صلة. لم يتم التعرف على المزايا الحقيقية للمفاعل البيولوجي المركزي النسيجي إلا في السنوات القليلة الماضية. تؤدي ظروف زراعة التروية عالية الكثافة إلى تركيز المركبات الكهربائية باستخدام وسط متوافق مع cGMP، بكميات قد تكون مناسبة للأبحاث والتطبيقات السريرية المحتملة. قد يحتوي حصاد واحد من 4,000 سم^مربع على 5 × 10^{إلى 1} × 10¹⁴ كهربائية في حجم 10–20 مل. هذه النتائج ضمن النطاق المبلغ عنه في الدراسات التي قيمت جرعة EV²².

المراقبة اليومية لمعدل امتصاص الجلوكوز هي معلمة مهمة لتقييم أداء الزراعة ومؤشر مباشر على استقلاب الخلية، وعدد الخلايا، وصحتها. بشكل عام، يفضل الوسطاء الأعلى من الجلوكوز، مثل DMEM، الذي يكون تركيزه الابتدائي 4.5 جم/لتر. يجب استبدال الوسط إلى وسط طازج عندما يتم استهلاك الجلوكوز بنسبة 50٪. بعض الخلايا، مثل الخلايا الميثوية، تبدو أنها تستهلك الجلوكوز وتنتج اللاكتات بتركيزات تزيد عن 3 جرام/لتر، ثم تتحول إلى استهلاك الجلوتامين وإنتاج الأمونيا بتركيزات أقل من 3 جرام/لتر. لم يتم بعد إجراء تحليل أيضي كامل للكربون الصلبيين الميثويين في الزراعة ثلاثية الأبعاد.

أهم عامل لنجاح زراعة المفاعل الحيوي هو رقم تلقيح الخلية. الحد الأدنى لخلية التطعيم لمفاعل^{بيولوجي}2 C2011 بحجم 4000 سم هو 1 × 108^خلايا . بالنسبة للخلايا غير المتكاثرة مثل MSC أو HAFSC، يفضل عدد أكبر من الخلايا حتى 1 ×^{10 9} خلايا إجمالا. يجب أن يكون حجم الخزان متناسبا مع عدد الخلايا في الخرطوشة. يجب أن تستخدم 1 × 10⁸ خلايا خزانا لا يزيد حجته عن 125 مل. يجب أن يكون خزان 1 × 10⁹ خلايا لا يزيد حجته عن 1 لتر. الخزان الكبير جدا قد يدفع الخلايا إلى مرحلة التأخير. يتميز ذلك بعدم استهلاك الجلوكوز من قبل الخلايا، رغم أنها قابلة للحياة كما يحددها تلوين تريبان بلو. في هذه الحالة، قلل حجم الخزان أو زرع المزيد من الخلايا. قد تكون هناك حاجة إلى تطعيمات متعددة للخلايا للحصول على أعداد كافية من الخلايا لزراعة مفاعل حيوي فعالة. ببساطة قم بزرع المزيد من الخلايا فوق الخلايا الموجودة بالفعل في الخرطوشة. عند تقييم أداء المفاعل الحيوي، لاحظ حجم اللقاح الخلوي. زيادة بذر الخلايا بمقدار 10 أضعاف يمكن أن تؤدي إلى زيادة إنتاج الطاقة الكهربائية الكهربائية بعشر أضعاف.

قد تشمل التعديلات على البروتوكول تغييرات في تركيبات الوسائط، أو الطلاءات السطحية، أو أعداد الخلايا، أو حجم الحصاد، أو تكرار الحصاد، أو حجم المحقنة، وذلك حسب نوع الخلية والعائد المطلوب. تمكن الثقافة المستمرة من تحسين الحالة بسهولة وفي الوقت الحقيقي، حيث يمكن إجراء تغييرات أثناء الثقافة والحصول على النتائج^{في الوقت الحقيقي}. يجب أن يركز حل المشكلات على الحفاظ على العقم ومراقبة النشاط الأيضي. تأكد من عدم وجود انسدادات أو انحناءات في الأنبوب، خاصة حول مشابك السلايد. التلوث البكتيري سيؤدي إلى استهلاك سريع للجلوكوز وتعكر زجاجة الخزان. يشير التلوث الفطري إلى تراكم أبيض ناعم عند غطاء الطرف الأيسر للخرطوشة، مما يعيق التدفق. يتطلب استخدام نظام المفاعل الحيوي الألياف المجوف التعامل الماهر والالتزام الصارم بالبروتوكولات. تشمل الخطوات الحيوية زرع العدد الصحيح من الخلايا، والحفاظ على التعقيم أثناء الحصاد، ومراقبة استهلاك الجلوكوز بعناية لمنع النمو الزائد أو استنزاف العناصر الغذائية. معظم الخلايا تلتصق بالألياف، وأحيانا تعتمد على مصفوفة البروتين المغطاة بالفيبرونكتين، مما يسهل التصاق الخلوي السريع. بعض الخلايا، مثل الخلايا الصلبة الصلبة الصلبة، والخلايا الصلبة الصلبة (MSCs)، والمركبات القلبية السلفية، تبقى متصلة بالألياف وتشكل كرويدات ثلاثية الأبعاد.

يدعم نظام HFBR زراعة عالية الكثافة، معرفة كيميائيا، وخالية من الزينو لمعظم أنواع الخلايا، مما يسهل الإنتاج واسع النطاق للسيارات الكهربائية²³. يوفر المراقبة اليومية للجلوكوز مقياسا موثوقا لأداء المفاعل الحيوي. النظام المغلق القائم على التروية متوافق مع معايير cGMP، ويمكن توسيع التقنية باستخدام خراطيش أكبر أو حتى عدة خراطيش. قد يكون من الممكن إنتاج المركبات الكهربائية على نطاق غرامي في ظروف مثالية. يوفر مفاعل الألياف المجوفة منصة قابلة للتكرار لإنتاج وجمع المركبات الكهربائية بشكل مستمر تحت ظروف محكمة. يركز البروتوكول الموضح هنا على اعتبارات عملية، بما في ذلك إعداد النظام، والتعامل مع التعقيم المعهر، والمراقبة الأيضية، لدعم التشغيل المتسق والنتائج الموثوقة. قد تكون هناك حاجة إلى دراسات إضافية لتقييم خصائص وخصائص المركبات الكهربائية الوظيفية تحت ظروف زراعة مختلفة ولمقارنة الأداء مع أنظمة الإنتاج البديلة.

تنطبق هذه الطريقة على نطاق واسع في الأبحاث وإنتاج المركبات الكهربائية السريرية، بما في ذلك الطب التجديدي والتطبيقات العلاجية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
16 gauge 1.5" needle	Stellar Scientific	SOLM-111615
3-way stopcock, sterile	Cole-Parmer	UX-48523-28
20mL luer lock syringe	Becton Dickenson	302830
25mL serological pipette, sterile	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
25mm syringe filter, sterile	Thomas Scientific	1162B74
38 mm reservoir cap	FiberCell Systems	A1006
50 mL conical centrifuge tubes	Stellar Scientific	T50-101-PK
500 mL Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
CVS Sterile Alcohol Prep Pads, 480 CT	CVS Pharmacy	Item # 376560
Hollow fiber bioreactor	FiberCell Systems	C2011
Human Fibronectin, 1 mg	Corning	354008