الوخز بالإبر في فروة الرأس مع التمارين يحفز تنشيط PI3K/Akt ويحسن اللدونة المشبكية في الفئران المشنجة بعد السكتة الدماغية

ملخص

تهدف هذه الدراسة إلى دراسة تأثيرات الوخز بالإبر في فروة الرأس مع التمارين الرياضية على اللدونة المشبكية للقشرة الحركية في نموذج الجرذان لتشنج الأطراف بعد السكتة الدماغية، واستكشاف العلاقة بين نشاط مسار PI3K/Akt والتأثيرات العلاجية.

الملخص

لا تزال العلاجات الفعالة للتشنج بعد السكتة الدماغية محدودة، كما أن الآلية التي يخفف بها الوخز بالإبر في فروة الرأس مع التمارين (SAE) من خلالها PSS غير مفهومة بالكامل. بحثت هذه الدراسة في تأثيرات SAE على الفئران المصابة ب PSS واستكشفت ما إذا كان SAE ينظم اللدونة المشبكية عبر مسار PI3K/Akt. تم إنشاء نموذج للفئران في انسداد الشريان الدماغي الأوسط (MCAO)، وتم توزيع الفئران عشوائيا إلى خمس مجموعات: بلانك، شام، MCAO، SAE، وباكلوفين. تم تنفيذ جميع التدخلات لمدة 7 أيام متتالية. ثم تم تقييم الوظائف العصبية، حجم الاحتفال الدماغي، علم الأمراض النسيجي، البنية الفائقة المشبكية، والتعبير البروتيني المرتبط بها. مقارنة بمجموعة MCAO، حسن SAE العجز العصبي، وخفض فرط توتر العضلات، وخفض حجم الاحتماء، وخفف من إصابات الخلايا العصبية، وزاد عدد المشابك، وحسن شكل التشابك. كما عززت SAE من تنظيم العامل العصبي المغذي المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF)، وPI3K المفسفر (p-PI3K)، والبروتينات المفسفرة Akt (p-AKT)، والبروتينات المشبكية، بما في ذلك السينابتوفيسين (SYN)، وبروتين الكثافة بعد المشبكية 95 (PSD-95)، والبروتين 43 المرتبط بالنمو (GAP-43). أشارت التلوين المناعي الفلوري إلى زيادة في التعبير عن SYN و p-Akt في القشرة الحركية بعد علاج SAE. تشير هذه النتائج إلى أن SAE قد يكون مرتبطا بتنشيط إشارات PI3K/Akt عبر زيادة تنظيم GDNF، مما يحسن اللدونة المشبكية ويخفف أعراض PSS. بحثت هذه الدراسة في تأثيرات SAE على الفئران المصابة بمتلازمة PSS واستكشفت العلاقة المحتملة بين تدخل SAE، ونشاط مسار PI3K/Akt، واللدونة المشبكية.

المقدمة

لا يزال الاحتشاء الدماغي سببا رئيسيا للوفاة والإعاقة في جميع أنحاء العالم. يتسبب نقص الأكسجين ونقص الأكسجين في تلف الخلايا العصبية، ويخللان توازن الإثارة والتثبيط في الدوائر الحركية، ويؤديان إلى خلل في الوظائف الحركية¹. يظهر التشنج بعد السكتة الدماغية في زيادة توتر العضلات وانخفاض حركة المفاصل، مما يؤثر على أنشطة الحياة اليومية ويزيد من عبء مقدم الرعاية². على الرغم من أن العوامل المضادة للتنسج مثل الباكلوفين يمكن أن توفر راحة مؤقتة للأعراض، إلا أن الاستخدام طويل الأمد قد يؤدي إلى تحمل الأدوية وآثاره الجانبية، ولا يعيد ضعف الوظائف العصبية³. كما أن إعادة التأهيل الحركي التقليدية محدودة ببطء الفائدة وطول مدة العلاج. لذلك، هناك حاجة ماسة إلى استراتيجيات علاجية أكثر أمانا وفعالية، وتستحق الآليات الأساسية المزيد من التحقيق. اللدونة العصبية هي آلية مركزية للتعافي الوظيفي بعد السكتة الدماغية وتشمل إعادة تشكيل المشبك، وتجديد المحور، وبقاء الخلايا العصبية⁴. بعد السكتة الدماغية الإقفاري، تتعرض الخلايا العصبية في نواة الاحتشاء للموت السريع، بينما تؤدي الاستجابات الالتهابية الموضعية إلى تفاقم إصابة الأنسجة في الجزء الإقفاري الجزئي؛ معا، تدفع هذه العمليات إصابات الدماغ^5،6. يمكن تقييم اللدونة المشبكية، وهي مكون أساسي في المرونة العصبية، بواسطة بروتينات مرتبطة بالمشابك، بما في ذلك العلامات قبل المشبكية مثل السينابتوفيسين (SYN) والبروتين 43 المرتبط بالنمو (GAP-43)، بالإضافة إلى بروتين الكثافة بعد المشبكية 95 (PSD-95)^7,8,9.

توفر العوامل العصبية التغذية أساسا جزيئيا لللدونة المشبكية. يعد العامل العصبي التغذية العصبي المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF) مهما بشكل خاص لأنه يعزز بقاء الخلايا العصبية وإصلاحها، ويثبط الالتهاب، ويحسن البيئة الدقيقة المشبكية¹⁰. من خلال الارتباط بمستقبل Ret، يمكن ل GDNF تفعيل إشارة PI3K/Akt¹¹. يعد تسلسلات PI3K/Akt مسارا رئيسيا للبقاء في الجهاز العصبي، وتفعيله يثبط الاستماتة المبرمجة بينما يدعم تخليق البروتين المطلوب لإعادة تشكيل المشبك ^12,13. الوخز بالإبر بفروة الرأس مع التمارين الرياضية (SAE) هو استراتيجية إعادة تأهيل تكاملية تجمع بين تحفيز الوخز بالإبر في فروة الرأس والتدريب الحركي النشط. الهدف العام من هذه الطريقة هو تنظيم النشاط العصبي المركزي في الوقت نفسه وتعزيز التعافي الحركي المرتبط بالمهام، مما يقلل من فرط توتر العضلات وتحسين النتائج الوظيفية بعد السكتة الدماغية. يستخدم SAE على نطاق واسع في الصين لعلاج التشنج المرن بعد السكتة الدماغية (PSS). مبرر هذا النهج المشترك هو أن الوخز بالإبر في فروة الرأس قد يعدل استثارة القشرة وتروية الدماغ، بينما يوفر العلاج بالتمارين تدريبا حركيا معتمدا على النشاط يعزز التعافي الوظيفي وإعادة تشكيل التشابك. مقارنة بالعلاج بالتمارين فقط، أظهرت الأدلة السريرية السابقة أن الوخز بالإبر في فروة الرأس عند نقاط فروة الرأس مع العلاج بالتمارين يقلل من مرونة الأطراف ويحسن الوظائف الحركية والأنشطة اليومية لدى المرضى الذين يعانون من تشنج الأطراف بعد السكتة الدماغية¹⁴.

كما أشارت مراجعة منهجية حديثة وتحليل تلوي إلى أن الوخز بالإبر بالإبر على فروة الرأس بنمط الحركة أو التدخلات المتزامنة ذات الصلة بالإبر والتمارين في فروة الرأس توفر تحسينات أكبر في التشنجات، والوظائف الحركية، والتوازن، وأنشطة الحياة اليومية مقارنة بالتدخلات الفردية أو المتسلسلة، مما يدعم الميزة المحتملة للتعديل العصبي المتزامن والتدريب الحركي¹⁵. أظهرت الدراسات ما قبل السريرية أن بروتوكولات الوخز بالإبر في فروة الرأس ذات نمط الحركة SAE أو ذات الصلة يمكن أن تحسن تدفق الدم الدماغي وتخفف من المرونة من خلال إعادة تنشيط KCC2 الشوكي بعمل المستقبل 5-HT₂A^16,17. تشير دراسة حديثة أيضا إلى أن الوخز بالإبر يعزز المرونة العصبية عبر إشارات PI3K/Akt¹⁸. لذلك، قد يكون SAE مناسبا بشكل خاص للسياقات التجريبية والسريرية التي تكون فيها تعديل اللدونة العصبية بعد السكتة الدماغية، والتعافي الحركي، وتقليل التشنج أهدافا علاجية رئيسية. ومع ذلك، لا يزال الارتباط المحتمل بين إشارات SAE، وإشارات GDNF/PI3K/Akt، واللدونة المشبكية في تخفيف PSS غير مفهومة جيدا. أسست هذه الدراسة نموذجا للفئران ل PSS لتقييم تأثيرات SAE على العجز العصبي وتشنجات العضلات، ولتوصيف التغيرات في تعبير GDNF، ونشاط مسار PI3K/Akt، والبروتينات المرتبطة باللدونة المشبكية بعد التدخل. قد توفر هذه الدراسة أدلة تجريبية لتحديد ما إذا كانت SAE استراتيجية إعادة تأهيل مناسبة ل PSS ولتوضيح آلية عملها المحتملة.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة تشانغتشون للطب الصيني (رقم الموافقة 20251038) وأجريت وفقا لإرشادات أبحاث الحيوان: الإبلاغ عن التجارب في الجسم الحي (ARRIVE 2.0) بالإضافة إلى دليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. جميع المواد المستخدمة في هذه الدراسة معروضة في جدول المواد.

الإجراءات التجريبية
الحيوانات التجريبية والتجميع
تم شراء ثمانين فأر سبريغ-داولي بالغ خال من مسببات الأمراض (SPF) (220–250 جم) من مزرعة هونغدا لتربية الحيوانات (منطقة كوانتشنغ، تشانغتشون، الصين). تم إيواء الحيوانات في مركز الحيوانات التجريبية بجامعة تشانغتشون للطب الصيني تحت ظروف محكمة تتراوح بين 22–25 درجة مئوية، ورطوبة نسبية بين 50–60٪، ودورة ضوء/ظلام لمدة 12 ساعة، مع إمكانية الوصول المجاني إلى الطعام والماء. بعد أسبوع من التأقلم، تم توزيع الفئران عشوائيا على مجموعة فارغة (n = 12)، ومجموعة شام (n = 12)، ومجموعة احتياطي نموذجي (n = 56). تم تضمين المجموعة الفارغة كضابط طبيعي غير معالج لتوفير قيم أساسية لأداء السلوك، والخصائص النسيجية، والتعبير الجزيئي للعلامات في الفئران السليمة. خضعت مجموعة شام لنفس التخدير والتعرض الجراحي لمجموعة MCAO، باستثناء أن انسداد الشريان لم يجرى؛ لذلك، كانت هذه المجموعة بمثابة ضابط للتأثيرات المحتملة للتخدير والتلاعب الجراحي. سمح إدراج مجموعتي بلانك وشام بالتمييز بين آثار الإصابة الإقفاري وتلك المتعلقة بالإجراء الجراحي نفسه.

خضعت مجموعة الاحتياطي للنماذج لنماذج MCAO. تم تعريف أول 3 أيام بعد الجراحة بأنها فترة التحفيز النموذجي. خلال هذه الفترة، مات 8 من أصل 56 فأرا، ما يعادل معدل وفيات 14.29٪، وتم استبعاد 12 فأرا لأن النمذجة لم تنجح. تم تخصيص الجرذان ال 36 المتبقي الذين نجحوا في تأسيس النموذج بشكل عشوائي، باستخدام جدول أرقام عشوائي، إلى مجموعات MCAO وSAE وباكلوفين، مع 12 فأرا في كل مجموعة. كانت التدخلات الجماعية كما يلي: (1) المجموعة الفارغة: تغذية روتينية فقط، بدون تدخل. (II) مجموعة الشام: التعرض الجراحي للشريان السباتي الشائع، والشرايين السباتي الداخلية والخارجية، والعصب المبهم، دون الحاجة إلى ربط أو إدخال خيط كهربائي. (III) مجموعة MCAO: تم تأسيس MCAO تحت تخدير داخل الصفاق مع 3٪ صوديوم بنتوباربيتال، دون علاج لاحق. (IV) مجموعة SAE: بعد نمذجة MCAO الناجحة والتحقق منها، تلقت الفئران الوخز بالإبر في فروة الرأس مع التمارين. تم استخدام تخدير استنشاق الإيزوفلوران بنسبة 1.5٪–2.0٪ فقط خلال مرحلة إدخال الإبرة القصيرة. بدأ تدريب جهاز المشي فقط بعد استعادة الوعي الكامل واستعادة القدرة على المشي التلقائي. تم إجراء الوخز بالإبر في GV20 وEX-HN1 الثنائي الطرفين. تم إدخال الإبر بعمق 1 مم والاحتفاظ بها خلال فترة التدريب على جهاز المشي. تم تعريف فترة الإبقاء والتدريب الموحدة لمدة 30 دقيقة على أنها فترة تدريب على جهاز المشي، وتكونت من 6 م/دقيقة لمدة 10 دقائق تليها 12 م/دقيقة لمدة 20 دقيقة على ميل 0°. تم إجراء التدخل مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام متتالية. (V) مجموعة باكلوفين: بعد نمذجة MCAO الناجحة والتحقق منها، تلقت الفئران الباكلوفين عن طريق التجويز داخل المعدة بجرعة 0.4 ملغ/كغ مرة يوميا لمدة 7 أيام متتالية.

تأسيس نموذج MCAO
تم تأسيس نموذج MCAO للفئران باستخدام طريقة خيوط داخل الإضاءة المعدلة¹⁹. بعد 12 ساعة من الصيام وحرمان الماء، تم تخدير الفئران بحقن داخلي الصودييوم بنسبة 3٪ من بنتوباربيتال الصوديوم ووضعت في وضعية الاستلقاء على الظهر. بعد تعقيم الجلد، تم إجراء شق في منتصف الرقبة لكشف الشريان السباتي المشترك الأيمن (CCA) والأعصاب والعضلات المجاورة. تم تحديد الشريان السباتي الخارجي (ECA) وربطه، وتم عزل الشريان السباتي الداخلي (ICA). وضعت الأربطة في ال ICA القريب وCCA، وتم تثبيت CCA البعيد مؤقتا. ثم تم إجراء عملية شق شريان صغيرة في CCA بالقرب من المشبك. تم إدخال خيط نايلون بقطر 0.26 مم وتقدمه 18–20 مم عبر ICA لحجب مصدر الشريان الدماغي الأوسط. تم ربط ICA وCCA لاحقا، وتم خياطة الشق. بعد الجراحة، تم تدفئة الفئران أثناء التعافي وتلقيت حقنة بنسلين داخل الصفاق (40,000 وحدة معدنية) لمنع العدوى. في مجموعة شام، تم إجراء التعرض الوعائي فقط، دون إدخال الخيط؛ كانت جلسات إغلاق الجرح والرعاية بعد العملية متطابقة مع تلك الموجودة في مجموعة MCAO. تم تحديد النموذج الناجح بأنه درجة زيا لونغا ≥ 2 بعد 3 أيام من الجراحة¹⁹ و≥درجة مقياس آشورث المعدلة (MAS) لدرجة 1²⁰.

طرق التدخل
الوخز بالإبر في فروة الرأس يجمع بين تدخل التمارين
أظهرت الدراسات السابقة أن العجز العصبي في فئران MCAO يبلغ ذروته في اليوم الثالث ويبقى مرتفعا خلال 10 أيام بعد الجراحة، بينما تزداد مقاومة العضلات الطرفية تدريجيا من اليوم السادس إلى اليوم 9²¹. لذلك، بدأ العلاج في اليوم الثالث بعد العملية واستمر مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام متتالية لتقليل تأثير التعافي التلقائي. قبل النمذجة، خضعت الفئران المخصصة لمجموعة SAE لتدريب التكيف على جهاز المشي لمدة 3 أيام بسرعة 5 م/دقيقة لمدة 10 دقائق/يوم²². استخدم هذا التدريب التكيفي لتعريف الفئران بالجري على جهاز المشي ولتقليل احتمالية التعرض للمعاناة أو السقوط أو رفض الجري أو التوقف خلال فترة التدخل الرسمي. خلال التدريب التكيفي والتدخل الرسمي، تم تعريف الأحداث غير الطبيعية المتعلقة بجهاز المشي بأنها الصراع المستمر، السقوط من مسار الجري، رفض الجري لأكثر من دقيقة واحدة، أو التوقف لأكثر من دقيقة أثناء تدريب جهاز المشي. تم تسجيل هذه الأحداث في سجلات تجريبية عند ملاحظتها. التردد القصير أو التوقف المؤقت لم يكن يؤدي إلى الاستبعاد إذا كان بالإمكان استئناف الجري على جهاز المشي بعد تحفيز لطيف. تم استبعاد البيانات فقط إذا لم يتمكن الحيوان من إكمال جلسة المشي اليومية المخصصة له بسبب السقوط المتكرر، أو الرفض المستمر للجري، أو الضيق الشديد. بعد التحقق الناجح من النموذج في اليوم الثالث، تم إجراء تدخل SAE مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام متتالية.

في كل جلسة علاج، تم تخدير الفئران بنسبة 1.5٪ إلى 2.0٪ من إيزوفلوران. تم إيقاف التخدير مباشرة بعد إدخال الإبرة. في الممارسة التجريبية، عادة ما تستعيد الفئران وعيها الكامل خلال حوالي دقيقة إلى دقيقتين بعد سحب الأيزوفلوران. لم يبدأ تدريب جهاز المشي أثناء تخدير الفئران. تم تحديد نقاط الوخز بواسطة أخصائيي الوخز بالإبر الحيوانات ذوي الخبرة وفقا لتسمية وتحديد مواقع نقاط الوخز الشائعة في الحيوانات التجريبية الصادرة عن جمعية الصينية للوخز بالإبر والوخز في عام 2020. تم تعريف GV20 بأنه منتصف الخط الذي يربط بين الفونتانيل الأمامية والخلفية على خط منتصف الجمجمة. تم تحديد نقاط EX-HN1 الثنائية على بعد 2 مم جانبيا من GV20. تم إدخال الإبر ذات الاستخدام الواحد بقياس 0.25 مم × 13 مم عموديا إلى عمق 1 مم وتم الاحتفاظ بها طوال فترة التدريب الموحدة على جهاز المشي التي تبلغ 30 دقيقة. تم تثبيت الإبر بشريط طبي قابل للتنفس لمنع الإزاحة، وتم استبعاد اختراق الجمجمة عن طريق اللمس لضمان الاتساق الإجرائي. تم فحص موضع الإبرة وتثبيت الشريط قبل تدريب جهاز المشي، وخلال فترات توقف قصيرة إذا حدث سلوك جري غير طبيعي، ومباشرة بعد انتهاء التدريب. بالإضافة إلى ذلك، تم فحص وضعية الإبر بصريا كل 5 دقائق أثناء تدريب جهاز المشي، بغض النظر عن سلوك الحيوانات. تم تعريف إزاحة الإبر بأنها ارتخاء مرئي، أو تغير زاوية الإبرة، أو انسحاب جزئي، أو انفصال كامل أثناء الجري على جهاز المشي. إذا حدث ارتخاء خفيف دون فقدان موضع الإبرة، يتم تعزيز الشريط بلطف أثناء توقف جهاز المشي لفترة وجيزة. إذا تم سحب الإبرة جزئيا أو انزلاقها بالكامل، لم تعاد إدخالها خلال تلك الجلسة؛ أكمل الفأر التدريب المتبقي على جهاز المشي دون الحاجة إلى تعديل الإبر الإضافي، وتم توثيق الحدث في سجل التجارب. لم تستبعد الحيوانات فقط بسبب حدث إزاحة إبرة واحدة إلا إذا كان الحدث مصحوبا بعدم القدرة على إكمال تدريب جهاز المشي أو علامات ضيق شديد.

بدأت فترة الإبقاء والتدريب الموحدة لمدة 30 دقيقة عندما يبدأ الفأر الجري على جهاز المشي بعد التعافي الكامل من التخدير الإيزوفلوراني، وانتهى فورا بعد إكمال تدريب جهاز المشي، عندما تزال الإبر. لم يتم تضمين فترة التعافي القصيرة بعد إيقاف الإيزوفلوران ضمن فترة التدريب الموحدة البالغة 30 دقيقة. نظرا لأن الإبر كانت تدخل قبل التعافي، كان وقت البقاء الفعلي أطول بحوالي دقيقة إلى دقيقتين من فترة التدريب على جهاز المشي التي تستمر 30 دقيقة. تم تطبيق هذا التعريف بشكل متسق على جميع فئران مجموعة SAE. كان يعتبر الفأر متعافيا بما فيه الكفاية لبدء تدريب جهاز المشي عندما تم استيفاء المعايير التالية: استعادة الوعي الكامل، القدرة على الوقوف بشكل مستقل، القدرة على المشي بثبات على سطح مستو، والاستجابة الطبيعية للتحفيز الخارجي اللطيف. تم التحقق من هذه المعايير قبل وضعها على جهاز المشي.

أثناء احتباس الإبر، أجرت الفئران تمرين على جهاز المشي بزاوية 0°: 6 م/دقيقة لمدة 10 دقائق، تلتها 12 م/دقيقة لمدة 20 دقيقة. لم يستخدم الصدمة الكهربائية في أي وقت خلال الدراسة. إذا توقف الفأر عن الجري أو رفض الجري لأكثر من دقيقة واحدة أثناء التدريب الرسمي، كان يتم استخدام تحفيز سمعي لطيف غير منفور، مثل النقر الخفيف على جدار جهاز المشي، لتشجيع الحركة. تم توثيق استخدام مثل هذا التحفيز، بالإضافة إلى أي مقاومة أو سقوط أو توقف أو رفض للجري أو إزاحة الإبر، في سجل التجارب عند ملاحظته. تمت مراقبة هذه الأحداث وصفيا وتوثيقها في سجل التجارب عند ملاحظتها. تم تعديل شدة التمارين بشكل شامل بناء على بروتوكولات سابقة تجمع بين الوخز بالإبر على فروة الرأس والتدريب على جهاز المشي،^16,23. تم إجراء تدخل SAE مرة واحدة يوميا لمدة 7 أيام متتالية (الشكل 1A).

تدخل باكلوفين
بعد نجاح التحقق من صحة النموذج، تلقت الفئران في مجموعة باكلوفين محلول باكلوفين عن طريق التجويز داخل المعدة بجرعة 0.4 ملغ/كغ. تم إعطاء الدواء مرة واحدة يوميا في الساعة 9:00 صباحا لمدة 7 أيام متتالية.

النتيجة المتوسطة
ملاحظة عامة
تمت مراقبة الحالة العامة يوميا في جميع الفئات، بما في ذلك وزن الجسم، الحالة النفسية، تناول الطعام والماء، والنشاط التلقائي.

تقييم الوظائف العصبية وتوتر العضلات
تم تقييم العجز العصبي وتشنجات الأطراف في الأيام 1 و3 و5 و7 بعد التحقق من صحة النموذج باستخدام درجة زيا لونغا، ودرجة شدة الأعصاب المعدلة (mNSS)، ومقياس آشورث المعدل. تم إجراء جميع التقييمات السلوكية في جميع النقاط الزمنية بشكل مستقل بواسطة باحثين اثنين كانا أعمى عن تخصيص المجموعة طوال فترة المراقبة. تعرض معايير التقييم التفصيلية (الجداول 1–3).

تحديد حجم احتشاء الدماغ
تم تقييم حجم الالتهاب الدماغي باستخدام صبغة 2,3,5-ثلاثي فينيل تيترازوليوم كلوريد (TTC). بعد 7 أيام من التدخل، تم اختيار ثلاثة فئران من كل مجموعة عشوائيا وتم إعدامهم بالقتل الرحيم عن طريق جرعة زائدة داخل الصوديم بنتوباربيتال الصوديوم، تلاها قطع الرأس بسرعة لجمع الدماغ بالكامل. تم تجميد الأدمغة أولا عند −20 درجة مئوية ثم قطعت إلى مقاطع تاجية بسماكة 2 مم. تم حضن الأقسام في محلول TTC بنسبة 2٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة في الظلام، ثم ثبتت طوال الليل في بارافورمالديهيد 4٪ عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، تم تصوير جميع الأقسام بكاميرا رقمية. كانت الأنسجة الطبيعية في الدماغ ملطخة باللون الأحمر الداكن، بينما كانت الأنسجة المحتمة تبدو بيضاء فاتحة. تم قياس مناطق الاشتعاش باستخدام ImageJ، وتم التعبير عن حجم الانفاركت كنسبة مئوية باستخدام الصيغة:

حجم الاحتشاء (٪) = منطقة الاحتشاء / إجمالي مساحة قسم الدماغ × 100٪.   (1)

الفحص النسيجي المرضي لأنسجة الدماغ
تلوين الهيماتوكسيلين-إيوزين (HE)
تم استخدام صبغات الهيماتوكسيلين والإيوزين لتقييم التغيرات النسيجية المرضية في القشرة المحيطة بالاحتماء. بعد 7 أيام من التدخل، تم القتل الرحيم للفئران بسبب جرعة زائدة داخل الصوغ من بنتوباربيتال الصوديوم. ثم أجريت عملية تروية سريعة عبر القلب باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات بسعة 0.01 مليون (PBS) لإزالة الدم، تلاها 250 مل من بارافورمالديهيد بارد بنسبة 4٪ (4 درجات مئوية) للتثبيت. تم جمع أدمغة كاملة، وتم عزل وتثبيت نسيج قشري محيط الشهية وثبته في بارافورمالديهيد بنسبة 4٪ عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. تم تضمين الأنسجة بالبارافين وتقسيمها بشكل إكليلي عند 5 ميكرومتر. تم تركيب الأقسام على شرائح وخبز على درجة حرارة 60 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وتم فك البارافين في الزيلين I–III (كل منها 10 دقائق). ثم تم إجراء تلوينات HE، تلاها الجفاف والتنظيف. وأخيرا، تم تغطية الأقسام بطبقة من البلسم المحايد، وتم التقاط الصور باستخدام مجهر نيكون الضوئي.

تلوين نيسل
تم استخدام صبغة نيسل لتقييم بقاء الخلايا العصبية وكثافة جسم نيسل في المنطقة المحيطة بالاحتشاء. بعد 7 أيام من التدخل، تم القتل الرحيم للفئران وترمشها عبر القلب بحرارة 0.01 مليون PBS (37 درجة مئوية)، تلاها 250 مل من 4٪ بارافورمالديهايد (4 °م). تمت إزالة أدمغة كاملة، وتم تشريح الأنسجة القشرية حول الاحتشاء والجانب المقابل وتثبيتها طوال الليل في بارافورمالديهيد 4٪ عند 4 درجات مئوية. بعد دمج البارافين، تم تجهيز أقسام بحجم 5 ميكرومتر. تم إزالة البارافين من الأقسام في الزيلين لمدة 10 دقائق، وأعيد ترطيبها عبر سلسلة من محاليل الإيثانول المتدرجة (95٪، 90٪، 80٪، 70٪، و50٪؛ 5 دقائق لكل تركيز)، وصبغت بمحلول Nissl العامل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد شطف قصير بالماء المقطر، تم تجفيف الأجزاء عبر الإيثانول المدرج، وتنظيف الزيلين لمدة دقيقتين، وأخيرا تركيبها بأغطية الدرجات. تم التقاط الصور وتحليلها تحت المجهر الضوئي.

تحليل البقعة الغربية لاستكشاف البروتين
تم إجراء الصبغة الغربية لتقييم البروتينات المشاركة في إشارات PI3K/Akt واللدونة المشبكية. بعد 7 أيام من التدخل، تم إعدام الفئران بجرعة زائدة من بنتوباربيتال الصوديوم، وتم جمع نسيج القشرة الحركية حول الاحتشاء. تم توحيد الأنسجة بالكامل في اختبار التحليل المناعي الإشعاعي (RIPA) على الجليد وتم طرد مركزها عند 1610 × جرام عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة لاستخراج البروتين الكامل. تم قياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة اختبار بروتين تجارية لحمض البيسينكونينيك (BCA). تم فصل كميات متساوية من البروتين (50 ميكروغرام لكل مسار) بواسطة الرحلان الكهربائي الهلام دوديسيل كبريت-بولي أكريلاميد الصوديوم (SDS-PAGE) ونقلها كهربائيا إلى أغشية فلوريد البوليفينيليدين (PVDF). تم حجب الأغشية بمحلول ألبومين مصل البقري (BSA) بنسبة 5٪ لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة للقضاء على الارتباط غير النوعي، ثم حضنتها بأجسام مضادة أولية طوال الليل عند 4 درجات مئوية. بعد ثلاث جولات من الغسل باستخدام محلول ملحي مخزن بتريس مع محلول Tween-20 (TBST)، تم حضن الأغشية بأجسام مضادة ثانوية (نسبة التخفيف 1:1000) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تصور أشرطة البروتين باستخدام تعزيز التلميض الكيميائي (ECL)، وتم قياس شدة الشريط باستخدام ImageJ. تم حساب التعبير النسبي للبروتين كنسبة البروتين المستهدف إلى الضابط الداخلي. كانت الأجسام المضادة الأساسية كما يلي: GAPDH (1:1000)، PI3K (1:1000)، فوسفو-PI3K (1:1000)، Akt (1:1000)، فوسفو-Akt (1:1000)، GAP-43 (1:1000)، SYN (1:1000)، PSD-95 (1:1000)، وGDNF (1:1000).

ملاحظة البنية الفائقة المشبكي
تم استخدام المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) لتقييم عدد المشابك العصبية وسلامة البنيو. بعد 7 أيام من التدخل، تم تخدير الفئران وترشيها عبر القلب بمزيج مثبت يحتوي على 4٪ بارافورمالديهايد و2.5٪ جلوتارالديهايد. تم جمع كتل نسيج قشرية حول الاحتشاء (1 مم × 1 مم × 1 مم) وتثبيتها في جلوتارالديهايد بنسبة 2.5٪ لمدة ساعتين، تلتها عملية تثبيت لاحقة ب 1٪ رباعي أكسيد الأوزميوم لمدة ساعة واحدة. ثم تمت معالجة العينات بتجفيف الإيثانول بدرجة متدرجة، ودمج راتنج الإيبوكسي، وتقسيم القطع فائق الرقيق (بسماكة 50 نانومتر)، والتلوين المزدوج بأسيتات اليورانيل وسيترات الرصاص. تم فحص البنية الفائقة المشبكية باستخدام مجهر إلكتروني ناقل. تم التقاط الصور عند 8,000× لتقييم الهيكل، وتم احتساب المشابك العصبية عند 5,000×. تم تحليل ثلاثة حقول عشوائية من الخلايا العصبية لكل مجموعة لحساب متوسط عدد المشابك، وتمت مقارنة البيانات باستخدام تحليل التشابك العصبي أحادي الاتجاه.

اختبار التصنيف المزدوج بالفلورة المناعية
تم إجراء تلوين مزدوج الوسم بالتألق المناعي لتقييم تعبير وتوزيع SYN و p-Akt في قشرة ما حول الاحتشاء. بعد 7 أيام من التدخل، تم القتل الرحيم للفئران بجرعة زائدة داخل الصوديم من بنتوباربيتال الصوديوم، وتم تشريح الأنسجة القشرية حول الاحتشاء بسرعة. تم تثبيت العينات في بارافورمالديهيد بنسبة 4٪ لمدة 24 ساعة، مدمجة في مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT)، وقطعت إلى مقاطع بسماكة 10 ميكرومتر. تم تجفيف الأجزاء بالهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة وغسلها ثلاث مرات باستخدام مخزن TBST لإزالة بقايا مركب OCT. تم نفاذ المقاطع بمحلول ترايتون X-100 بنسبة 0.3٪ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وشطفها ب PBS، وتم حجبها بمحلول BSA بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. في ظروف مظلمة، تم حضنة الأقسام طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام الأجسام المضادة الأولية لأنتي-سين (تخفيف 1:200) والأرانب المضادة ل-p-Akt (تخفيف 1:200). في اليوم التالي، تم غسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام PBS وحضنتها في الظلام باستخدام الأجسام المضادة الثانوية (تخفيف 1:400) لمدة 50 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ست غسلات أخرى باستخدام مخزن TBST، تم تلوين نوى الخلايا بمحلول عمل 4′,6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI) لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تم التقاط الصور تحت إعدادات تعريض وخلفية متطابقة باستخدام مجهر فلوري. تم استخدام صور تمثيلية لتقييم أنماط تعبير SYN وp-Akt في القشرة الحركية عبر المجموعات.

التحليل الإحصائي
تم إجراء تحليلات إحصائية باستخدام GraphPad Prism 10.1.2 وIBM SPSS Statistics 25. تعرض البيانات كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم تحليل البيانات السلوكية التي جمعت في عدة نقاط زمنية، بما في ذلك درجة زيا لونغا، ودرجة شدة الأعصاب المعدلة، ومقياس أشوورث المعدل، باستخدام تحليل التنويف المتكرر ثنائي الاتجاه مع المجموعة كعامل بين المشاركين والوقت كعامل داخل المشاركين. عندما تم اكتشاف تأثيرات رئيسية أو تفاعلات ذات دلالة، استخدم اختبار المقارنات المتعددة لسيداك للتحليل اللاحق. تم تحليل بيانات أخرى باستخدام تحليل أنوفاس أحادي الاتجاه تلاها اختبار سيداك للمقارنات اللاحقة. تم اعتبار الورقة ذات الذيلين < 0.05 ذات دلالة إحصائية. في الرسوم البيانية الشريطية، يتم الإشارة إلى الدلالة الإحصائية بواسطة النجوم كما هو معرف في أسطوانات الأشكال المقابلة.

النتائج

SAE يحسن الوظائف العصبية ويقلل من تشنجات العضلات في فئران PSS
تم تقييم التأثيرات العلاجية ل SAE على الخلل السلوكي لدى الفئران المصابة بالتشنج بعد السكتة الدماغية باستخدام درجة زيا لونغا، ومعدل درجة شدة الأعصاب، ومقياس آشورث المعدل في الأيام 1 و3 و5 و7 بعد التحقق من صحة النموذج (n = 12 لكل مجموعة). تم استخدام درجة زيا لونغا وmNSS لتقييم العجز العصبي، بينما استخدمت درجة MAS لتقييم توتر العضلات/تشنجات العضلات. بعد النمذجة، أظهرت الفئران في مجموعتي بلانك وشام زيادة وزن مس...

المناقشة

أظهرت الدراسات السريرية السابقة أن الوخز بالإبر في فروة الرأس مع التمارين يمكن أن يخفف الأعراض التشنجية لدى مرضى التشنج بعد السكتة الدماغية، مع تحسين الوظائف الحركية والأنشطة اليومية (ADL)^14,24. تدعم هذه النتائج قيمته السريرية. أكدت الدراسة الحالية أيضا الفائدة العلاجية ل SAE في نموذج الفئران باستخدام ثلاثة مقاييس سلوكية، منها درجة زيا لونغا، mNSS، وMAS. أظهر التقييم السلوكي المتكرر أن SAE حسن العجز العصبي وقلل من فرط توتر العضلا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2,3,5-triphenyltetrazolium chloride staining solution	Beyotime	C0651	TTC staining
3MM Filter Paper	Whatman, UK	3030861	Western blot transfer
AKT Antibody	Affinity	AF0836	Primary antibody
Acetone	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10000418	Infiltration of electron microscopy specimens
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	Version 29.5 (64-bit), https://www.adobe.com/products/illustrator.html	64-bit version, used for graphic editing and scientific figure preparation
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092683	Deparaffinization of paraffin sections
Anti-fade mounting medium	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1020	coverslipping
BCA Protein Assay Kit	MDL	MD913053	Protein concentration determination
Bluishing solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	Hematoxylin staining
Chemiluminescence Imaging System	CLINX, China	ChemiScope6100	System Detect target protein
Concentrated normal goat serum	Boster Biological Technology	AR1009	serum blocking
DAPI	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1030	nuclear staining
Diamond Knife	Daitome	Ultra 45°	Slice ultrathin specimens
Differentiation solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	HE staining
Drying Oven	Tianjin Labory Instruments Equipment Co., Ltd.	GFL-230	Bake fixed tissue slices
EDTA (pH 9.0) antigen retrieval solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1052	Antigen retrieval
Electron microscopy fixative	ASPEN	AS1063	Fixation of electron microscopy specimens
Electrophoresis Power Supply	Longfang	LF-2000	Provide electrophoresis voltage
Embed 812 embedding medium	SPI	90529-77-4	Infiltration of electron microscopy specimens
EndNote X9	Clarivate Analytics (US) LLC	Version X9, https://endnote.com/	Used for reference management and academic citation formatting
Freezing Stage	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-L5	Freeze frozen tissue blocks
GAP-43 Antibody	Affinity	Df7766	Primary antibody
GAPDH Antibody	Affinity	AF7021	Primary antibody
GDNF Antibody	Biosynthesis	Bs-1024r	Primary antibody
Glacial acetic acid	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2138	Nissl staining
Glass Slides and Coverslips	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10212432C	Mount tissue sections
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Version 10.1.2 (324) for Windows 64-bit, https://www.graphpad.com/	64-bit version, used for statistical analysis and scientific plotting
Grinding machine	Beijing Herde	N.9548	Grind tissue samples
HE staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2103	HE staining
HRP-Conjugated Goat Anti-Mouse Secondary Antibody	Servicebio	C030205	Secondary Antibody
HRP-conjugated goat anti-rabbit antibody	SeraCare	5220-0336	Secondary antibody
Hydrogen peroxide (H2O2)	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C5101	preparation of TSA reagents
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	Version 25, 64-bit, https://www.ibm.com/products/spss-statistics	64-bit version, used for statistical data analysis and processing
Imaging System	Nikon, Japan	Nikon DS-U3	Capture microscopic images
Metal Bath	COYOTE	H203-H	Constant temperature incubation
Microwave Oven	Galanz Microwave Electrical Appliance Co., Ltd.	P70D20TL-P4	Antigen retrieval
NC Membrane (0.22 μm)	GVS, USA	ISEQ00010	Protein blot transfer
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10004160	dehydration and coverslipping
PBS buffer	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C0003	decolorization and washing
PI3K Antibody	Affinity	AF6241	Primary antibody
PSD-95 Antibody	Affinity	Af5283	Primary antibody
Pathological Microtome	Leica Instruments (Shanghai) Co., Ltd.	RM2016	Cut paraffin sections
Phospho-AKT Antibody	Affinity	Af0832	Primary antibody
Phospho-PI3K Antibody	Affinity	Af3241	Primary antibody
Pipette	Dragonlab	KE0003087/KA0056573	Quantitative liquid transfer
Protease Inhibitor Cocktail	Beyotime	P1005	Protease inhibition
RIPA Lysis Buffer (Medium)	Beyotime	P0013C	Tissue lysis
Refrigerated Centrifuge	SEILOGEX, China	CF1524R	Low-speed sample separation
SDS-PAGE Electrophoresis System	Beyotime	MiniProGel™ Gel Casting, Electrophoresis and Western Blot Transfer System	Protein electrophoretic separation
SDS-PAGE Precast Gel Kit	MDL	MD911919	SDS-PAGE electrophoresis
SYN (Synapsin) Antibody	Biosynthesis	bs-3501R	Primary antibody
Shaker	Qilinbeier	TS-8	Sample oscillation washing
Tissue Dehydrator	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JJ-12J	Dehydrate paraffin tissue
Tissue Embedding Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-P5	Embed tissue in paraffin
Tissue Spreading Machine	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	KD-P	Unfold paraffin slices
Toluidine blue staining solution	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2131	Nissl staining
Transmission Electron Microscope	FEI	Tecnai G2 20 TWIN	Observe ultrastructure
Tri-Color Pre-Stained Broad Range Protein Molecular Weight Marker (10–180 kDa)	Servicebio	G2091	SDS-PAGE electrophoresis
Tyramide-488	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6002	TSA reagents
Tyramide-CY3	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C6003	TSA reagents
Ultramicrotome	Leica	Leica UC7	Cut ultrathin EM sections
Ultrasonic Cell Disruptor