نموذج لالتهاب الأمعاء المعجل بالبيروكسيكام في فئران إنترلوكين-10 لدراسة التغيرات الأيضية الناتجة عن الالتهاب

ملخص

يستخدم هذا البروتوكول البيروكسيكام لتسريع تطور التهاب القولون في نموذج فأر الإنترلوكين (IL-10) - الضربة القاضية. يضمن البروتوكول تزامن التهاب القولون، مما يؤدي إلى نتائج صارمة وقابلة للتكرار مستقلة عن الجنس أو الإجهاد الخلفي أو حالات الحي الحيوي. يعد نموذجا مفيدا لدراسة التغيرات الأيضية أثناء التهاب الأمعاء.

الملخص

مرض الأمعاء الالتهابي (IBD) هو اضطراب التهابي مزمن في الجهاز الهضمي يصيب أكثر من 10 ملايين شخص حول العالم. بينما ركزت أبحاث كبيرة على الآليات المناعية والعواقب التي تكمن وراء التهاب الأمعاء، لم يفهم الكثير عن كيفية مساهمة التهاب الغشاء المخاطي في اختلال الأيض، بما في ذلك فقدان الوزن وانخفاض الشهية. هنا، يصف المؤلفون نموذج فأر لالتهاب الأمعاء المعوي المسرع بالبيروكسيكام في فئران الإنترلوكين-10-نوكاوت (IL-10-KO) لدراسة اختلال الأيض الناتج عن الالتهاب. من المعروف أن فئران IL-10-KO تصاب بالتهاب الأمعاء القولوني التلقائي ولديها زيادة في التعرض لالتهاب الأمعاء القولوني الناتج عن العدوى أو الأدوية. ومع ذلك، تم الإبلاغ عن ظروف الهيكل الحيوي وخلفية الإجهاد كعوامل محيرة في تطور التهاب القولون في هذا النموذج. البيروكسيكام، وهو دواء مضاد للالتهابات غير ستيرويدي (NSAID)، ثبت أنه يسبب أو يسرع التهاب الأمعاء القولوني في النماذج الحيوانية من خلال زيادة تعرض المخاط للبكتيريا اللومنالية. في هذا البروتوكول، تم إطعام ذكور وإناث فئران IL-10-KO بنظام غذائي مدعم بالبيروكسيكام بدلا من النظام الغذائي العادي للتشاو. تم قياس كمية الطعام ووزن الجسم يوميا لتعكس التغيرات الأيضية في الجسم بالكامل، إلى جانب المظاهر السريرية لالتهاب الأمعاء مثل الإسهال والنزيف الشرجي. البروتوكول فعال وقابل للتكرار، حيث يسبب التهاب الأمعاء القولوني في نفس الوقت لدى عدة فئران، ويسمح بتقييم اختلال الأيض في نموذج مرض الأمعاء الالتهابي. قد تبحث الدراسات الإضافية باستخدام هذا البروتوكول في تأثيرات التهاب الأمعاء على مكونات أخرى من خلل الأيض، مثل استهلاك الطاقة وتركيب الجسم، مما يكشف عن روابط أوسع بين مرض الأمعاء الالتهابي واستقلاب المضيف.

المقدمة

مرض كرون والتهاب القولون التقرحي، والمعروفان مجتمعان باسم مرض الأمعاء الالتهابي (IBD)، هما اضطرابات مناعية ذاتية مزمنة في الجهاز الهضمي تتميز بالتهاب مخاطي مع مظاهر سريرية تشمل ألم البطن، فقدان الوزن، الهيماتوشوزيا، والإسهال. يصيب مرض التهاب الأمعاء الالتهابي ملايين الأفراد حول العالم، مع أعلى معدل انتشار في المجتمعات الغربية¹. في الولايات المتحدة، يقدر أن أكثر من 3 ملايين شخص مصابون ^2,3، مع ارتفاع معدل الإصابة والانتشار، خاصة بين الأطفال والشباب ^4.5.

لا تزال الآليات الدقيقة وراء مسببات مرض التهاب الأمعاء غير مفهومة بشكل كامل، لكن يعتقد على نطاق واسع أن المرض ناتج عن استجابة مناعية مبالغ فيها تجاه ميكروبيوتا الأمعاء لدى الأفراد المعرضين للوراثة. تلعب السيتوكينات التي تعدل الاستجابات الالتهابية أدوارا حاسمة في الحفاظ على توازن الأمعاء وفي تطور مرض التهاب الأمعاء الالتهابي. من بين هذه السيتوكين، الإنترلوكين-10 (IL-10) هو سيتوكين مضاد للالتهابات مدروس جيدا يساعد في الحفاظ على التوازن المناعي لدى البشر من خلال تنظيم الأذرع الفطرية والتكيفية للاستجابة المناعية ^6,7. ومن الجدير بالذكر أن تعدد أشكال IL-10 ومستقبله (IL-10RA/B) تم تحديده لدى الرضع الذين لديهم التهاب الأمعاء الالتهابي المبكر جدا (VEO-IBD)، الذين ظهروا كلاسيكيا مع مرض حول الشرج خلال الأشهر الأولى^{من الحياة.} ويدعم هذا الارتباط أيضا تسلسل الإكسوم واسع النطاق للمرضى البالغين المصابين بمرض كرون، والذي حدد IL-10RA كموقع للحساسية للمرض في التهاب الأمعاء⁹ غير أحادي الجين. علاوة على ذلك، تم وصف مسار غير وراثي يتضمن الأجسام المضادة المعادلة ل IL-10 لدى مرضى مرض التهاب الأمعاء الالتهابي الداخلي (VEO-IBD)، مما يبرز أهمية هذا المسار في الحفاظ على التوازن المناعي المخاطي¹⁰.

استنادا إلى دراسات بشرية تربط IL-10 بمرض التهاب الأمعاء الالتهابي، تم تطوير فئران إنترلوكين-10-نوكاوت (IL-10-KO) كنموذج لدراسة دور IL-10 في التهاب الأمعاء الالتهابي. من المعروف أن فئران IL-10-KO تطور التهاب الأمعاء القولوني التلقائي مع استجابة مبالغ فيها ل CD4+ Th1 للمحفزات، وعادة ما تبدأ في الأسبوع الثامن إلى الثاني عشر من عمر¹¹ عاما. ومع ذلك، يمكن أن يكون تطور التهاب الأمعاء القولوني التلقائي في فئران IL-10-KO غير متوقع في غياب عامل مسرع 12,13,14، وذلك حسب السلالة الوراثية، وتركيب الميكروبيوتا، وظروف السكن ^15,16. يعد استخدام بروتوكول موثوق لتحفيز التهاب القولون أمرا بالغ الأهمية ليكون نموذج IL-10-KO مفيدا عمليا. استخدمت دراسات سابقة أدوية مضادة للالتهابات غير ستيرويدية مثل البيروكسيكام لتحفيز التهاب الأمعاء في فئران IL-10-KO^17,18. ومع ذلك، ركزت هذه الدراسات بشكل أساسي على التغيرات المناعية، مع تركيز قليل نسبيا على تأثيرات التهاب الأمعاء القولوني على الأيض أو على دور الجنس في شدة التهاب القولون¹⁹. يصف المؤلفون هنا استخدام نظام غذائي مدعم بالبيروكسيكام لتحفيز التهاب الأمعاء في فئران IL-10-KO ويصففون اضطرابات الأيض والاستجابات الالتهابية المخاطية في هذا النموذج باستخدام كل من الفئران الذكور والإناث. يقيس هذا البروتوكول وزن الجسم وكمية الطعام ليعكس التغيرات الأيضية في الجسم بالكامل، بالإضافة إلى المظاهر السريرية لالتهاب القولون والتغيرات النسيجة والنسخية التي تعكس الالتهاب المخاطي. يوفر هذا النموذج الفعال والقابل للتكرار أداة قيمة للتحقيق في العلاقة بين التهاب الأمعاء الالتهابي واستقلاب المضيف.

البروتوكول

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا للبروتوكول الذي أقره لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) في مركز جامعة تكساس ساوثويسترن الطبي، وفقا ل "دليل العناية واستخدام الحيوانات المختبرية" [رقم الموافقة: 2017-102011]. تم تنفيذ القتل الرحيم وفقا للإرشادات المؤسسية. لم تكن هناك حاجة للتخدير أثناء الإجراءات. التفاصيل المحددة للمواد موصوفة في جدول المواد.

1. تأسيس نموذج التهاب الأمعاء المعجل بالبيروكسيكام في فئران IL-10-KO

1. الحفاظ على فئران IL-10-KO في منشأة خالية من مسببات الأمراض (SPF) على دورة ضوء مدتها 12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء.
2. يؤوون بشكل فردي فئران تتراوح أعمارها بين 7 و8 أسابيع، ومتطابقة مع الجنس في أقفاص العوازل الدقيقة. اسمح للفئران بالتأقلم مع السكن الفردي والتعامل اليومي لمدة أسبوع على الأقل قبل بدء التجربة.
   ملاحظة: تأكد من أن أوزان الجسم هي >20 جرام للذكور أو >17 جرام للإناث، وأن الفئران خالية من جروح القتال.
3. تعيين الفئران لمجموعة تجريبية ومجموعة ضابطة. بالنسبة للمجموعة التجريبية، استبدل الطعام القياسي بطعام محصن بالبيروكسيكام. بالنسبة للمجموعة الضابطة، قدم طعاما عاديا جديدا. أضف 50 جرام طعام إلى كل قادوس قفص.
   ملاحظة: خصص على الأقل خمسة فئران لكل جنس لكل مجموعة. تم تحضير تشاو المدعم بالبيروكسيكام (200 جزء في المليون) بواسطة تيكلاد باستخدام البيروكسيكام الذي زوده الباحثون لإنتاج نظام غذائي مخصص للحيوانات المختبرية. لتقليل التفاوت بين الدفعات، يوصى بأن تتلقى جميع الحيوانات في التجربة الطعام من نفس دفعة الإنتاج. عندما يكون ذلك ممكنا، يجب أيضا استخدام نفس الدفعة عبر التجارب لتحسين قابلية التكرار.

2. مراقبة وزن الجسم وسلوك التغذية

1. باستخدام مقياس تحليلي، سجل وزن جسم كل فأر. قم بوزن كل فأر بشكل فردي في نفس الوقت يوميا، يوميا لمدة 7 أيام متتالية. أبلغ عن وزن الجسم اليومي كنسبة مئوية من الوزن الأساسي في اليوم 0 (تم تحديده 100٪).
   ملاحظة: فقدان الوزن الذي يزيد عن 20٪ يشير إلى التوتر المفرط وخطر الوفاة الوشيكة. يجب قتل الفئران إذا تم الوصول إلى هذا القدر.
2. باستخدام مقياس تحليلي، سجل الوزن الأولي للطعام المحصن بالبيروكسيكام والطعام القياسي في كل قفص.
3. ثم قس الطعام المتبقي في كل قفص في نفس الوقت يوميا، يوميا لمدة 7 أيام متتالية.
4. احسب استهلاك الطعام اليومي بطرح وزن الطعام اليومي من الكمية المتبقية من اليوم السابق.
   ملاحظة: تحقق من كمية الطعام وإعادة ملئها بشكل روتيني إذا كانت أقل من 10 جرام. لا تؤثر مقبولية طعام البيروكسيكام على تناول الطعام ويجب أن تشبه إلى حد كبير طعام الطهي العادي.

3. مراقبة نشاط الأمراض

1. في اليومين 0 و7، افحص بصريا حبيبات البراز من فئران فردية وحدد وجود دم في البراز.
2. إذا لم يكن هناك دم مرئي، قم بإجراء اختبار دم خفي في البراز عن طريق دهن حبة على بطاقة الاختبار، ثم إضافة مادة المعالجة المتوفرة. نتائج النتائج وفقا للجدول 1.
3. في اليومين 0 و7، افحص بصريا حبيبات البراز التي تم إفراغها حديثا لتقييم قوام البراز. استخدم ملقط مسطح للمساعدة في تحديد الاتساق. نتائج النتائج وفقا للجدول 1.
4. في اليومين 0 و7، حدد درجة الهبوط الشرجي عن طريق فحص المنطقة حول الشرج. نتائج النتائج وفقا للجدول 1.
5. قس وزن الجسم كما هو موضح أعلاه. نتائج النتائج وفقا للجدول 1.
   ملاحظة: يجب إجراء تقييم مؤشر نشاط المرض (DAI) بطريقة عمياء من قبل نفس الباحث طوال فترة التجربة لضمان الاتساق، وتقليل تحيز المراقب، وتحسين موثوقية التقييم.

4. جمع الأنسجة القولونية

1. قتل الفئران بالاختناق_بثاني أكسيد الكربون وانخلاع عنق الرحم كما تم الإبلاغ عنه في أماكن أخرى²⁰.
2. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء على الخلف ورش 70٪ إيثانول على البطن البطني.
3. ارفع الجلد بالملاقط واستخدم المقص الجراحي للقطع على طول خط المنتصف. كشف التجويف البريتوني وحدد موقع القولون.
4. كشف القولون والسيمور باستخدام تشريح غير حاد. أزل القولون على شكل كتلة، بما في ذلك السيكوم والكفة الشرجية.
5. ضع القولون على سطح مستو وأزل أي نسيج ضام.
6. قم بقياس وتسجيل طول القولون.
7. بعد قياس طول القولون، قم بإزالة الساق عن طريق القطع عند نقطة التقاء السيكو-القولون.
8. جهز حقنة بسعة 10 مل مملوءة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع إبرة جافاج فولاذية قابلة لإعادة الاستخدام برأس كرة 22 قياس مرفقة. أدخل الإبرة في القولون وطف محتويات الأمعاء.
9. ضع القولون المغسول في طبق بتري يحتوي على PBS وشطفه لإزالة المحتويات المتبقية. بعد الموافقة، استخدمها للاختبارات اللاحقة.

5. تحليل الأنسجة

1. ضع القولون بشكل مسطح على شريحة زجاجية. استخدم الملقط للف النسيج حول نفسه، بدءا من الطرف البعيد، لتشكيل "لفة سويسرية". بهذه الطريقة، يبقى الطرف البعيد/الشرجي في اللفة الداخلية مع امتداد المناطق القريبة إلى اللفة الخارجية.
2. باستخدام إبرة عيار 27، ثبت القولون الملفوف للحفاظ على اللفة وضعها داخل شريط نسيج مدمج (نسيج).
3. لتثبيت الأنسجة، يغمر أشرطة الأنسجة في محلول فورمالين مخزن بنسبة 10٪ لمدة 16 ساعة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   تحذير: 10٪ فورمالين ضار إذا لامس الجلد وقد يسبب حروقا شديدة في الجلد وتلف العين. تعامل بحذر مع قفازات واقية ونظارات علمية. يجب التخلص من الفورمالين المتبقي بشكل صحيح وفقا للإرشادات المؤسسية.
4. بعد تثبيت الفورمالين، قم بمعالجة الأنسجة لتثبيت البارافين وقطعها لتركيبها على شرائح زجاجية.
   ملاحظة: يجب تقديم العينات إلى مختبر الأنسجة مع المعدات اللازمة لمعالجة أشرطة الأنسجة باستخدام البارافين، وتقسيم التمرير، وتركيب الشريحة، وتلوين الهيماتوكسيلين والإيوزين.
5. نسيج الصبغة يمتلئ بالهيماتوكسيلين والإيوسين (HE)، وفقا للبروتوكولات^{المعتمدة 21}.
6. باستخدام نظام التقييم النسيجي الموضح في الجدول 2، قيم السمات النسيجية التالية في كل قسم: تلف الأنسجة الناتج عن التهاب الأمعاء، تسلل الخلايا الالتهابية في الصفيحة الطبيعية، ونسبة المساحة المعنية. اجمع الدرجات في كل قسم لتكوين مجموع نقاط (الجدول 2).
   الدرجة الكلية = السمات × التورط (تلف الأنسجة) + السمات × التورط (ترشيح الخلايا الالتهابية في اللامينا بروبريا) (1)
7. يمكن العثور على صور نسيجية ممثلة لتلف الأنسجة وتسلل الخلايا في منشور Erben وآخرون²².
   ملاحظة: يجب إجراء التقييم النسيجي بطريقة أعمى، ويفضل أن يكون من قبل أخصائي علم شرعي مدرب، لضمان اتساق وموثوقية التقييم.

6. التلوين المناعي الفلوري للأنسجة المثبتة بالبارافين

1. ضع شرائح المناديل في رف منزلق وفي مجفف شرائح بدرجة حرارة 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لإذابة البارافين.
2. ضع الشرائح في رف التلوين واغمره بشكل متسلسل لمدة 3 دقائق في برطمانات التلوين بالزيلين. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
3. اغمر رف التلوين لمدة 3 دقائق في برطمانات التلوين بإيثانول 100٪. كرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
4. اغمر رف التلوين لمدة 3 دقائق في جرة التلوين بنسبة 95٪ إيثانول.
5. اغمر رف التلوين لمدة 3 دقائق في جرة التلوين بنسبة 80٪ إيثانول.
6. اغمر رف التلوين لمدة 5 دقائق في برطمانات التلوين بماء منزوع الأيونات (DI).
   ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات السابقة في غطاء مهوى بسبب أبخرة الإكسيلين. تعامل بحذر مع قفازات واقية ونظارات علمية. يجب التخلص من البقايا من الزيلين بشكل صحيح وفقا للإرشادات المؤسسية.
7. انقل الشرائح إلى رف منزلقات واغمرها في جرة التلوين بمحلول سحب 1× سترات.
8. ضع جرة التلوين في دعامة طبق التلوين.
9. ضع دعامة طبق التلوين في قدر الضغط.
10. اطبخ لمدة 15 دقيقة في قدر الضغط.
11. استرجع الشرائح من قدر الضغط ودعها تبرد إلى درجة حرارة الغرفة.
12. حضانة الشرائح باستخدام محلول حاجز 300 ميكرولتر (3.5٪ مصل ماعز مخفف ب PBS) لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة. تأكد من تغطية الأنسجة بالكامل بحاجز الحاجز.
13. تعرض الشرائح ل 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المخففة في حاجز العزل لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية، داخل غرفة رطبة. تأكد من تغطية الأنسجة بالكامل بالجسم المضاد الأساسي. تم استخدام الجسم المضاد الأساسي التالي: مضاد S100A8/S100A9 (1:500).
    ملاحظة: تخفيفات الأجسام المضادة ستكون مخصصة للواشاف ويجب أن تتبع توصيات المورد.
14. قم بغمر الأقراص بشكل تسلسلي في PBS لمدة 5 دقائق في ثلاث مرات في جرة تلوين.
15. تعرض الشرائح ل 300 ميكرولتر من جسم مضاد ثانوي فلوري مخفف في حاجز حجب لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة، في غرفة رطبة. تأكد من تغطية الأنسجة بالكامل بالجسم المضاد الثانوي. تم استخدام الجسم المضاد الثانوي الفلوري التالي: أليكسا فلور 555 المضاد للأرانب (تخفيف 1:150).
    ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، يجب حماية الشرائح من الضوء لمنع تبييض الفلوريدات الضوئية. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية سيكون خاصا بالمواد الكيميائية ويجب أن يتبع توصيات المورد.
16. قم بغمر الأقراص بشكل تسلسلي في PBS لمدة 5 دقائق في ثلاث مرات في جرة تلوين.
17. تعرض الشرائح للتلوين النووي عن طريق غمرها في محلول هوشت مخفف بمقدار 1:5000 في PBS لمدة 20 دقيقة في جرة صبغ.
18. قم بغمر الأقراص بشكل تسلسلي في PBS لمدة 5 دقائق في ثلاث مرات في جرة تلوين.
19. امسح بعناية أي PBS من الشرائح باستخدام منديل غير كاشط. أضف 50 ميكرولتر من وسط تركيب مضاد التصبغ وغطاء داخلي.

7. استخراج الحمض النووي الريبي

1. قم بتجميد القولون بالكامل أو قطعة منها في النيتروجين السائل ثم خزنها عند -80 درجة مئوية. بدلا من ذلك، اغمر في محلول حفظ RNALater سعة 1.5 مل وتخزينه وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
2. قم بإذابة القولون المتجمد سابقا وضعه على سطح مستو. قم بتعطيل وتجانس الأنسجة باستخدام جهاز تجانس يدوي.
3. عزل الحمض النووي الريبي باستخدام الطقم، باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
4. قياس تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. تشير نسب_{A 260}/_{A 280} > 1.8 ونسب A₂₆₀/_{A 230} من 2.0–2.2 إلى نقاء RNA مقبول.
5. تابع عملية النسخ العكسي، تليها qPCR مع صبغة SYBR الخضراء المتداخلة.
6. حلل النتائج باستخدام منصة القياس أو أداة مشابهة.

النتائج

يصاب الذكور والإناث بفئران IL-10-KO بالتهاب الأمعاء بعد تعرض قصير لنظام غذائي مدعم بالبيروكسيكام (الشكل 1A–E). بحلول اليوم الثاني، أظهرت الفئران المعرضة للبيروكسيكام فقدانا أكبر إحصائيا ملحوظا مقارنة بفئران السائدة التي تناولت الطعام بانتظام من نفس الجنس، ولوحظ فقدان وزن مماثل بين الجنسين (الشكل 1B). ظل تناول الطعام اليومي الظاهر دون تغيير طوال فترة التعرض للبيروكسيكام وتطور التهاب الأمعاء القولون، وكان يشبه تناول الطعام القياسي، مما يشير إلى أن فقدان الوزن في هذا النموذج لا يكون مدفوعا أساسا بانخفاض الاستهلاك بل بعوامل أخرى تعزز الإنفاق الأيضي (الشكل 1C).

ولدراسة تطور التهاب الأمعاء، تم تقييم نشاط المرض من خلال تقييم مشترك لفقدان الوزن، والدم في البراز، وقوام البراز، ودرجة هبوط المستقيم. تم تقييم مؤشر نشاط المرض المعدل (DAI) في البداية واليوم السابع؛ تظهر نتائج اليوم السابع في الشكل 1D. بالإضافة إلى ذلك، ارتبط تطور التهاب الأمعاء القولوني في الفئران المعرضة للبيروكسيكام باتجاه قوي نحو زيادة الوفيات، رغم أن هذا الفرق لم يكن ذا دلالة إحصائية (p = 0.12؛ الشكل 1E). في هذا النموذج، الوفاة المبكرة ثانوية لوصول الفئران إلى نقاط إنسانية (فقدان الوزن > 20٪) وتؤثر بشكل مفضل على الذكور (الشكل 1E). إذا كان الوفيات نقطة نهاية تجريبية مطلوبة، فقد يؤخذ في الاعتبار عدد أكبر من الحيوانات التجريبية مقارنة بالمستخدم هنا. في هذه الدراسة، استخدم المؤلفون الحد الأدنى من الحيوانات اللازمة لتحقيق القوة الإحصائية من خلال إكمال الدراسة، مع احتساب الوفيات المتوقعة.

قصر القولون هو سمة مرتبطة بشدة التهاب القولون في نماذج الفئران. عند الحصاد، كان لدى كل من الذكور والإناث من فئران IL-10-KO التي تم تغذيتها بنظام بيروكسيكام أقصر من تلك التي تم إعطاؤها الطعام العادي (الأشكال 2A–B). عند التقييم النسيجي، أظهرت القولون من مجموعة التغذية بالبيروكسيكام تلفا في الظهارة وزيادة في تسرب الخلايا المناعية، وهي تغيرات مرتبطة بالتهاب القولون (الشكل 2C). وقد ترجمت هذه النتائج إلى درجة نسيجية أعلى (الشكل 2D). بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم مستويات النسخ للسيتوكينات الالتهابية المشاركة في نماذج التهاب الأمعاء الالتهابي والفئران البشرية لالتهاب القولون²³. تماشيا مع التقارير السابقة، أظهرت القولون من فئران IL-10-KO المغذية بالبيروكسيكام زيادة كبيرة في تنظيم السيتوكينات الالتهابية على مستوى النسخ (الشكل 3A–D). ومن الجدير بالذكر أن هذا التغير في النسخ لم يلاحظ في فئران IL-10-KO التي تلقت طعاما منتظما أو فئران WT التي تلقت نظاما غذائيا مدعما بالبيروكسيكام، مما يشير إلى أن توقيع النسخ كان مدفوعا بمزيج من نقص IL-10 والبيروكسيكام، وليس أي من العاملين بمفرده. وأخيرا، أكد المؤلفون أن التوقيع النسخي الذي لوحظ في القولون من فئران معالجة بالبيروكسيكام مرتبط بزيادة تلوين الكالبروتكتين في الغشاء المخاطي القولوني (الشكل 3E)^24,25.

الشكل 1: التهاب الأمعاء المعوي المسرع بالبيروكسيكام في فئران IL-10-KO. (أ) نظرة مخططية على البروتوكول التجريبي. (ب) وزن الجسم، (ج) تناول الطعام، (د) مؤشر نشاط المرض في اليوم السابع (DAI)، (ه) منحنى البقاء لدى الذكر البالغ من العمر 8 أسابيع والإناث في عمر 8 أسابيع من فئران IL-10-KO التي تتلقى نظاما غذائيا مدعما بالبيروكسيكام أو نظاما غذائيا عاديا. الضابط الذكوري: n = 5، البيروكسكام الذكري: n = 5، التحكم الأنثوي: n = 6، البيروكسيكام الأنثوي: n = 6 إنش (B)، (C)، و(D). الضابط الذكري: n = 6، البيروكسكام الذكري: n = 10، التحكم الأنثوي: n = 6، البيروكسكام الأنثوي: n = 7 إنش (E). * p ≤ 0.05، ** p ≤ 0.01، *** p ≤ 0.001 من خلال مقارنة زوجية بين الفئران الذكورية (النجوم العليا) والأنثى (النجوم السفلى) في (B). تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار t ثنائي الذيل غير المتوافق في (B)، (C)، و(D)، واختبار رتبة لوغاريتمية في (E). يتم تصوير القيم المتوسطة وأشرطة الخطأ التي تمثل الخطأ القياسي للمتوسط (SEM). في الرسوم البيانية الشريطية، يتم تصوير القياسات الفردية بواسطة مخططات التذبذب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: قصر القولون والتقييم النسيجي. (أ) عينات قولون ممثلة من فئران ذكور وإناث بعمر 8 أسابيع من فئران الإنترلوكين-10-نوكاوت (IL-10-KO) التي تتلقى حمية بيروكسيكام (الأعلى) أو نظاما نظاميا عاديا (الأسفل) لمدة 7 أيام. شريط المقياس = 1 سم. (B) طول القولون في اليوم السابع (ضابط ذكري: n = 5، البيروكسيكام الذكري: n = 5، التحكم الأنثوي: n = 6، البيروكسيكام الأنثوي: n = 6). (ج) صور تمثيلية للقولون الملطخ بطبقة HE. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. (D) درجة الأنسجة في اليوم السابع. اختبار t ذو الذيلين غير الزوجين في (B) و (D). يتم تصوير القيم المتوسطة وأشرطة الخطأ التي تمثل SEM. في الرسوم البيانية الشريطية، يتم تصوير القياسات الفردية بواسطة مخططات التذبذب. غير دلالة (NS)، * p ≤ 0.05، *** p ≤ 0.001، **** p ≤ 0.0001 حسب المقارنة الزوجية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: التغيرات الالتهابية في التهاب الأمعاء المسرع بالبيروكسيكام. نتائج RT-PCR الكمية ل (A) Tnf، (B) Il6، (C) Il1b، و(D) Ifng في أنسجة القولون من فئران ذكور من النوع البري (WT) وIL-10-KO (IL-10-KO) بعمر 8 أسابيع عند الحصاد. بالنسبة للألواح A–D، البيروكسيكام wt n = 7، KO piroxicam n = 6، KO control n = 3. (ه) تلوين تمثيلي بالكالبرتكتين المناعي الفلوري لأنسجة القولون لفئران IL-10-KO عمرها 8 أسابيع وقت الحصاد. تم إجراء تحليلات إحصائية باستخدام اختبار t ثنائي الذيل غير المرتبط. يتم تصوير القيم المتوسطة وأشرطة الخطأ التي تمثل الخطأ القياسي للمتوسط (SEM). في الرسوم البيانية الشريطية، يتم تصوير القياسات الفردية بواسطة مخططات التذبذب. شريط القياس في (E) = 200 ميكرومتر. غير دلالة (NS)، * p ≤ 0.05، ** p ≤ 0.01، *** p ≤ 0.001 حسب المقارنة الزوجية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المجال	الموسيقى التصويرية
الوزن	0 – دون تغيير
	1 – خسارة 1–5٪
	2 – خسارة 6–10٪
	3 – خسارة 11–20٪
	4 – ; خسارة تزيد عن 20٪
قوام البراز	0 – طبيعي ؛
	1 - ناعم لكنه مكون
	2 – البراز الفضفاض (غير مائي)
	4 – إسهال (براز سائل)
النزيف	0 – لا يوجد
	2 – البراز الإيجابي للدموية
	3 – دم ظاهر على البراز
	4 – نزيف زائد في المستقيم
تدلي المستقيم	0 – غائب
	1 – حتى الآن
النتيجة الإجمالية	الدرجة الكلية: مجموع (درجات النطاق) لكل مجال

الجدول 1: درجة نشاط المرض (DAI). نظام تقييم لتحديد نشاط المرض من خلال فقدان الوزن، وقوام البراز، والدم في البراز، وتدلي المستقيم. مقتبس من سيفوينتيس-دومينغيز وآخرون²⁶.

تلف الأنسجة					تسلل الخلايا الالتهابية لعناية اللامينا بروبريا
الميزات		المشاركة			الميزات		المشاركة
0	لا شيء	1	1–25٪ من السطح		0	نادرا	1	1–25٪ من السطح
1	نادر ؛	2	26–50٪ من السطح		1	زيادة في بعض العدلات	2	26–50٪ من السطح
2	تآكل المخاط وتقرحات	3	51–75٪ من السطح		2	وجود تجمعات الخلايا الالتهابية تحت المخاطية	3	51–75٪ من السطح
3	أضرار واسعة في عمق جدار الأمعاء	4	76–100٪ من السطح		3	تسرب الخلايا العابرة للجداريات	4	76–100٪ من السطح

الجدول 2: نظام التقييم النسيجي. نظام تسجيل لتحديد التغيرات النسيجة والأضرار. مقتبس من سيفوينتيس-دومينغيز وآخرون²⁶.

المناقشة

مرض الأمعاء الالتهابي هو اضطراب متعدد الجينات معقد حيث تستخدم النماذج ما قبل السريرية كأدوات لا تقدر بثمن لتحليل المسارات التي تسهم في نشوء أمراض الأمعاء الالتهابية وتطوير استراتيجيات تشخيصية وعلاجية جديدة. حاليا، تعتمد العديد من نماذج التهاب الأمعاء قبل السريرية على التعرض للمواد الكيميائية، مثل كبريتات الدكستران الصوديوم (DSS)، الأوكسازولون، وحمض السلفونيك الترينيتروبنزين (TNBS)، وذلك بسبب سهولة استخدامها. كما تتوفر نماذج جينية تطور التهاب القولون التلقائي. من بين هذه العوامل، يعد نموذج IL-10-KO ذا قيمة خاصة لأن التغيرات الجينية في مسار IL-10 معروفة بأنها تسبب التهابا معويا لدى البشر، وتطور فئران IL-10-KO التهاب أمعوي مزمن تلقائي يشبه الأمراض البشرية. ومع ذلك، فإن القيود الرئيسية لهذا النموذج هي عدم قدرته على أخذ التغيرات الظاهرية في الاعتبار. على الرغم من أن التهاب الأمعاء القولوني يتطور تلقائيا، إلا أن حدوثه يمكن أن يكون متغيرا حسب خلفية السلالة^{وحالة الجسم} الحي.

من خلال دمج التعرض الكيميائي مع نموذج جيني، يوفر البروتوكول الموضح هنا نموذجا موثوقا وقابلا للتكرار لمورس التهاب القولون التجريبي. يتسارع التهاب الأمعاء في فئران IL-10-KO بواسطة البيروكسيكام، ويبدأ المرض خلال 7 أيام بعد التعرض لنظام غذائي مدعم بالبيروكسيكام. يسمح هذا البروتوكول بمزامنة تطور التهاب القولون. يلخص النموذج خصائص لوحظت في نماذج الفأر الشائعة الأخرى لالتهاب القولون، بما في ذلك فقدان الوزن، والدم في البراز، والإسهال، وقصر القولون، والتلف النسيجي، والتغيرات في النسخ. علاوة على ذلك، يمكن تكرار هذا النموذج في سلالة C57Bl/6J المستخدمة على نطاق واسع، والتي تسهل فحص عيوب جينية إضافية مرتبطة بمرض التهاب الأمعاء من خلال سهولة توليد فئران تحمل طفرات إضافية في هذه السلالة.

يوفر النموذج الموضح هنا أداة مفيدة لدراسة التغيرات الأيضية أثناء التهاب الأمعاء. في هذا النموذج، تستمر الفئران المعرضة للبيروكسيكام التي تصاب بالتهاب الأمعاء الوريدي المتسارع في التغذي بشكل طبيعي دون انخفاض كبير في الاستهلاك اليومي. يشير هذا إلى أن فقدان الوزن في هذا النموذج لا يعود إلى ضعف في التغذية بل بسبب عوامل إضافية. هناك حاجة إلى دراسات إضافية لتحديد ما إذا كانت هذه النتائج ناتجة عن زيادة الإنفاق الحراري بسبب الالتهاب، أو فقدان مفرط للسعرات الحرارية بسبب الإسهال، أو ضعف تكوين الحرارة. علاوة على ذلك، يظهر الذكور والإناث من الفئران أنماطا متشابهة من شدة المرض، وهو اكتشاف يتناقض مع الملاحظات السابقة التي أجريت على نماذج IL-10-KO وDSS 28,29,30.

هناك عدة خطوات مهمة لاستكشاف الأخطاء لضمان قابلية تكرار هذا الطراز. أولا، يجب التعود على التعامل اليومي والمراقبة لمدة أسبوع قبل التعرض للبيروكسيكام. هذا يمنع فقدان الوزن المرتبط بالتوتر. ثانيا، يجب ألا تحتوي الأقفاص على أكثر من ثلاثة فئران، ويجب أن تدرج التجربة فقط الفئران التي تعيش بتناغم. الفئران التي تظهر سلوك قتالي أو جروح قتال تكون أكثر عرضة لتطور التهاب القولون وقد تستسلم قبل الحصاد^31,32. ثالثا، إذا كان من المقرر مراقبة تناول الطعام طوال التجربة، يجب أن تكون الفئران في مأوى فردي للسماح بقياس دقيق لاستهلاك الطعام. بالإضافة إلى ذلك، يجب وضع فقط حبيبات طعام كبيرة وسليمة في قادوس التغذية لمنعها من التفتت إلى الفراش، مما قد يؤثر على القياسات. الطرق الموضحة هنا لقياس كمية الطعام المدعومة تتوافق مع إرشادات تناول طعام القوارض المنشورة³³. أخيرا، يجب تجنب تغيير الأقفاص أثناء التجربة، حيث قد تقلل التغيرات البيئية المفاجئة من تناول الطعام لمدة يوم إلى يومين، خاصة في الفئران الصغيرة.

لهذا البروتوكول عدة قيود. أولا، يقتصر تقييم التغيرات الأيضية على وزن الجسم وتناول الطعام، بينما لم يتم تقييم مقاييس أخرى للأيض الجهازي، مثل نسبة تبادل الجهاز التنفسي (RER)، وإنفاق الطاقة، والنشاط البدني. بالإضافة إلى ذلك، لم يتم دراسة الآليات التي تكمن وراء فقدان الوزن؛ لذلك، لا تزال المساهمات النسبية لانخفاض تناول الطعام، وتغير استهلاك الطاقة، وسوء الامتصاص، وعوامل أخرى مرتبطة بالتهاب الأمعاء غير واضحة. ثانيا، تم جمع وتحليل أنسجة القولون فقط، بينما لم يتم فحص الأعضاء الأخرى المشاركة في تنظيم الأيض، بما في ذلك الأنسجة الدهنية والكبد والعضلات الهيكلية. ثالثا، تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام فئران C57BL/6 IL-10-KO، التي قد تظهر قابلية مختلفة لالتهاب القولون مقارنة بالخلفيات الجينية الأخرى. على الرغم من هذه القيود، يمكن تكييف البروتوكول بسهولة ليشمل المزيد من النماذج الأيضية وتحليل الأنسجة خارج الأمعاء، مما يسمح بدراسة آليات فقدان الوزن وكذلك العلاقة بين التهاب الأمعاء والتغيرات الأيضية الجهازية³⁴، أو تقييم المواد النانوية المضادة للالتهابات الجديدة³⁵. علاوة على ذلك، يجب أن يكون هذا النهج قابلا للتطبيق على سلالات فئران IL-10-KO الأخرى، رغم ضرورة دراسات التحقق الإضافية.

باختصار، يذكر المؤلفون بروتوكولا فعالا وقابلا للتكرار يسبب في الوقت نفسه التهاب الأمعاء في عدة فئران IL-10-KO ويسمح بتقييم سلوك التغذية. هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لدراسة تأثيرات التهاب الأمعاء القولي على استهلاك الطاقة وتركيب الجسم في هذا النموذج، مما يكشف عن روابط أوسع بين مرض التهاب الأمعاء الأيض واستقلاب المضيف.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
10% buffered formalin	StatLab	28600-1	1 Galllon
27 G needles	BD	305109
Anti-S100A8 + S100A9 antibody	Abcam	AB288715
Balance	Fisher scientific	S94792D	Fisher Science Education Portable Balances, 300 g
Citrate buffer	Sigma Aldrich	C9999-1000mL
DI water	Fisher scientific	STLSL301
Dissecting forceps	Fisher scientific	22-327379
Ethanol, 100% 200 proof	Fisher scientific	NC1675398	Pharmco Products ETHYL ALCOHOL 200 PROOF
Ethanol, 190 proof, 95%	Fisher scientific	AC615110010
Ethanol, 80%	Fisher scientific	T08204K7
EZ-Quick Slide Staining Dish	IHC world	IW-2511	Staining jar
EZ-Quick Slide Staining Rack	IHC world	IW-2512	Slide rack
Feeding needle	Fisher scientific	NC9924986	22 gauge, 25 mm
Fine scissors	Fisher scientific	14060-11
Flat forceps	Fisher scientific	21-125-109
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555	Thermo Fisher	AB_2535849
Handheld homogenizer	Fisher scientific	15-340-167
HemoCue	Danlee Medical Products, Inc.	BCK 64151A	Hemoccult Dev/ Single Slide Test Cards - CLIA Waived
Hoechst 33342	Invitrogen	62249
IL-10 KO Mice	The Jason Laboratory	Strain #: 002251	IL10-KO mice, genotype: B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC mouse caging	Allentown	Mouse 500
Liquid nitrogen	Airgas	NI UHP300
Microscope cover glass	Fisher scientific	12541033
Nanodrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Normal Goat serum	Vector labs	S-1000-20
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Petri dishes	Fisher scientific	FB0875713
Piroxicam	Sigma Aldrich	P0847	supply to inotiv for preparation of custom animal diet
Piroxicam-fortified chow	Inotiv	Custom	200 ppm
Primer: Mouse GAPDH forward	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' forward
Primer: Mouse GAPDH reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' reverse
Primer: Mouse IFN-G forward	Sigma Aldrich	N/A	5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' forward
Primer: Mouse IFN-G reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' reverse
Primer: Mouse IL-10 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3' (common)
Primer: Mouse IL-10 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3' (Wild type reverse)
Primer: Mouse IL-10 reverse (2)	Sigma Aldrich	N/A	5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3' (Mutant reverse)
Primer: Mouse IL-1B forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' forward
Primer: Mouse IL-1B reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' reverse
Primer: Mouse IL-6 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' forward
Primer: Mouse IL-6 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' reverse
Primer: Mouse TNF forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' forward
Primer: Mouse TNF reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' reverse
QuantStudio 7 Pro	Thermo Fisher	A43183
RNAlater solution	Invitrogen	AM7020	RNA Stabilization Solution, 100 mL
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
SHURDry SD-II Slide Dryer	General data	SD-ll-120
Simport Scientific EasyDip Slide Staining Rack	Fisher scientific	22-038-494	Staining rack
SlowFade Gold antifade reagent	Invitrogen	S36936
Staining dish support	BioSB	BSB7086
Staintray IHC slide staining system	IHC world	M918-1	Humidified chamber for IHC
SuperScript VILO	Invitrogen	11755050
SYBR Green Master mix	Applied Biosystems	A46109
Tintoretriever pressure cooker	BioSB	BSB7008
Tissue cassettes	Fisher scientific	50-197-8152	Research Products International Corp Tissue Processing Cassette, Pink, 500 per Case
Xylene	Pharmco	399000000	1 Gallon