مقالة منهجية

تحرير الجينوم في الخلايا الثديية الأولية عبر التسامح الكهربائي للحمض النووي الريبي المحرر

154 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/71449

⸱

يوليو 31, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

في هذه المقالة

ملخص

يعد تسليم محرري الجينوم كحمض RNA وسيلة فعالة بشكل خاص لتعديل جينومات الخلايا وخطوط الخلايا الثديية الأولية. هدف هذا البروتوكول هو توصيل محررات الجينوم ك mRNA إلى الخلايا وخطوط الخلايا الأولية في الثدييات، تليها تسلسل وتحليل Illumina المستهدف لقياس نتائج التحرير.

الملخص

يمكن لمحرري كريسبر بما في ذلك النوكليز، والمحررات الأساسية، والمحررات الأساسية تصحيح المتغيرات الجينية المسببة للأمراض بكفاءة أو تعطيل الجينات المستهدفة. عادة ما يتم تقييم نتائج التحرير في الخلايا الأولية المزروعة، أو الخلايا المشتقة من المرضى، أو خطوط الخلايا الهندسية لدراسة تأثير التنوع الجيني أو كخطوة أولى قبل بدء دراسات الحيوانات أو الترجمة السريرية. يمكن أن يؤدي تسليم المحررات ك mRNA إلى جانب الحمض النووي الريبي التوجيهي الصناعي إلى الخلايا الثديية إلى تحسين كفاءة التحرير مقارنة بالأساليب القائمة على البلازميدات ويمنع مشاكل مثل دمج الحمض النووي أو التحرير خارج الهدف من التعبير المستمر. تقدم هذه المقالة سير عمل لإعداد mRNA لمحرر الجينوم عن طريق النسخ في المختبر (IVT)، بما في ذلك التغطية النصية المشتركة والنيوكليوتيدات المعدلة كيميائيا، وmRNA لمحرر التوزيع الكهربائي، والRNA الموجه إلى الخلايا الليفية البشرية الأولية، والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs)، أو خطوط الخلايا اللمفاوية (LCLs)، وقياس نتائج التحرير من خلال تسلسل الأمبكونات المستهدف على منصة Illumina تليها التحليل باستخدام CRISPResso2. يتيح هذا السير إجراء المقارنة الكمية للحمض النووي الريبي الإرشادي، ومعلمات التعرض الكهربائي، ومتغيرات المحرر، ويدعم التطبيقات التالية بما في ذلك الاستنساخ في خلية واحدة، والاختبارات الظاهرية، ودراسات الحيوانات قبل السريرية، والتطوير العلاجي.

المقدمة

يدعم التحرير الجيني الفعال في الخلايا الثديية الأولية توليد النماذج الجينية والتقييم قبل السريري للاستراتيجيات العلاجية المرشحة. التطورات الحديثة في تقنيات كريسبر، بما في ذلك تحرير القواعد والتحرير الأولي، تتيح تعديلات دقيقة على النيوكليوتيدات دون إدخال انقطاعات مزدوجة في الحمض النووي، مما يحسن نقاء نتائج التحرير 1,2. تم تطبيق هذه التقنيات بنجاح في دراسات نمذجة الأمراض وتحرير الجينوم العلاجي، بما في ذلك استراتيجيات لتصحيح المتغيرات التي تؤدي إلى مرض فقر الدم المنجلي3 والتليف الكيسي4.

استراتيجية فعالة بشكل خاص لتوصيل مكونات تحرير الجينوم إلى خلايا الثدييات هي الحفر الكهربائية لحمض mRNA المنسوخ في المختبر (IVT) الذي يشفر إنزيم التحرير مع RNA التوجيه الصناعي (gRNAs). يتيح توصيل mRNA التعبير المؤقت لمحرري الجينوم، مما يقلل من نشاط النيوكلياز المطول ويقلل من احتمالية حدوث أحداث تحرير غير هدفية. حسنت التطورات في تكنولوجيا IVT كفاءة وعائد وجودة تخليق mRNA 4,5,6. تستخدم قوالب الحمض النووي البلازميدي وقوالب الحمض النووي المشتقة من PCR بشكل شائع في النسخ الصناعي، ولكل منها مزايا وقيود مميزة. في هذا البروتوكول، يفضل القوالب التي تولدها PCR لتجنب المشاكل المرتبطة بانتشار المسارات الطويلة متعددة الأجزاء (A) في البلازميدات، والتي تكون عرضة لإعادة التركيب وتغير الطول. ومع ذلك، فإن استخدام قوالب PCR كما هو موضح في هذا البروتوكول يتطلب تمهيدا عكسيا مكلفا يحتوي على ذيل بولي(A) المكون من 120 نيوكليوتيدا، وقد يكون PCR أكثر عرضة للأخطاء من انتشار البلازميدات البكتيرية للتسلسلات غير المشفرة في البادئات. كبديل، يمكن لمزودين تجاريين مثل Elegen و4basebio توفير قوالب DNA عالية الدقة، مما يوفر خيارا موثوقا، وإن كان أكثر تكلفة، لإنشاء قوالب النسخ.

تصميم RNA الموجه بعناية هو عنصر حاسم آخر في تجارب تحرير الجينوم الناجحة. تم تطوير عدة أدوات حسابية لمساعدة الباحثين في تحديد تسلسلات gRNA المثلى بناء على الكفاءة المتوقعة على الهدف والنشاط الخارج عن الهدف بالحد الأدنى. تشمل المنصات المستخدمة على نطاق واسع CHOPCHOP وCRISPOR، التي تتيح تحديد تسلسلات الدليل المتوافقة مع متطلبات النمط المجاور للبروتوسبايس (PAM) لإنزيمات Cas وتوفر مقاييس تقييم لإعطاء الأولوية للأدلة المرشحة ذات النشاط المتوقع والخصوصية العالية7،8. تم وصف المبادئ الأساسية وأفضل الممارسات لتصميم الحمض النووي الريبي الإرشادي بشكل موسع في أدبيات كريسبر9,10,11,12,13.

يستخدم التوزيع الكهربائي عادة لتوصيل كواشف تحرير الجينوم إلى الخلايا الثديية لأنه يحقق كفاءة توصيل عالية في أنواع الخلايا التي عادة ما تكون مقاومة لطرق النقل المعتمدة على الدهون. يقوم التساميم الكهربائي باختراق غشاء الخلية بشكل مؤقت، مما يسمح للأحماض النووية الخارجية مثل mRNA وgRNA بالدخول إلى السيتوبلازم. تم تطوير بروتوكولات تحسين للاحتراق الكهربائي لأنواع متعددة من الخلايا الثديية، بما في ذلك الخلايا الأولية، والأرومات الليفية، وخطوط الخلايا اللمفاوية، والخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة14. توفر منصات التسامح الكهربائي التجارية مثل أنظمة لونزا 4D وأماكسا برامج وكواشف خاصة بنوع الخلايا مصممة لتحسين كفاءة التوصيل مع الحفاظ على حيوية الخلية. تمكن أنظمة الحفر الكهربائية عالية الإنتاجية مثل منصة المكوك Amaxa ذات 96 بئر تجارب تعديل الجينوم القابلة للتوسع عبر ظروف تجريبية متعددة. يستخدم نظام التقشير الكهربائي النيون أيضا بشكل شائع لكنه ليس محور هذا البروتوكول.

بعد تسليم مكونات تحرير الجينوم، يتم عادة تقييم نتائج التحرير باستخدام تسلسل الجيل القادم المستهدف (NGS) للمنطقة الجينومية المحيطة بموقع التحرير. يتم توليد مكتبات التسلسل عن طريق تضخيم PCR للموقع المستهدف، يليه الفهرسة والتسلسل عالي الإنتاجية. يتم تحليل قراءات التسلسل الناتجة باستخدام خطوط أنابيب معلوماتية حيوية متخصصة مصممة لتجارب تحرير الجينوم. في هذا البروتوكول، يتم قياس نتائج التحرير باستخدام CRISPResso2، وهي منصة حسابية واسعة الاستخدام تتيح تحليلا تفصيليا لنتائج تحرير الجينوم من بيانات التسلسل15. يقوم CRISPResso2 بمحاذاة قراءات التسلسل مع تسلسل مرجعي ويحدد نتائج التحرير، بما في ذلك كفاءة التحرير العامة، وترددات الإدخال–الحذف (indel)، والاستبدال الدقيق للنيوكليوتيدات، وتوزيعات التحرير عبر المنطقة المستهدفة. يوفر البرنامج أيضا تصورات رسومية وملخصات إحصائية تسهل المقارنة بين ظروف التجربة وتحسين معلمات التحرير.

معا، يوفر دمج إنتاج mRNA عالي الجودة في IVT، وتحسين التوصيل عبر التقميم الكهربائي، وتحليل التسلسل عالي الدقة سير عمل قوي لتقييم استراتيجيات تحرير الجينوم في الخلايا المزروعة (الشكل 1). يتيح هذا النهج التحسين التكراري لكفاءة التحرير، والخصوصية، والمعايير التجريبية قبل تطوير استراتيجيات تحرير الجينوم نحو الدراسات الحية والتطبيقات العلاجية المحتملة.

البروتوكول

بيان الأخلاقيات:
تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بخطوط الخلايا المشتقة من الإنسان وفقا للإرشادات المؤسسية والبروتوكولات المعتمدة.

1. إنشاء قالب DNA خطي باستخدام PCR

تحذير: قم بجميع خطوات RNA باستخدام المواد الاستهلاكية الخالية من RNase وأسطح العمل. ضع في اعتبارك محررات mRNA المدرجة ومتغيرات مختلفة عند اختيار المحرر المناسب للتعديل الجيني المقصود (الجدول 1).

  1. قم بتجميع تفاعل PCR على حمض نووي من البلازميد تم استخراجه من البكتيريا باستخدام مجموعة miniprep أو midiprep. استخدم 20 نانوغرام من حمض البلازميد النووي لكل تفاعل PCR بحجم 50 ميكرولتر مع إنزيم NEBNext Ultra II Q5 Master Mix، مع تجميع PCR كما هو موضح في الجدول 2.
    1. استخدم برايمر أمامي يصحح محفز T7 غير النشط على البلازميد، مما يمنع النسخ الدائري.
    2. استخدم تمهيدا عكسيا يقدم ذيلا 120-NT poly(A)₁₂₀ لدعم النسخ الفعال واستقرار mRNA.
    3. استخدم N1-ميثيل-بسودوريدين بدلا من اليوراسيل وأضف CleanCap AG لتحسين ترجمة mRNA وتقليل تنشيط المناعة الفطرية 1,2,3,4 (الشكل 1).
      ملاحظة: تتوفر نظائر نوكليوتيدية أخرى وكواشف غطاء، لكنها أظهرت باستمرار نشاطا عاليا في رنا الرينوم الملكي لتحرير الجينوم. التوصيل القائم على الجسيمات النانوية هو بديل مناسب لكنه غير متحدث في هذا البروتوكول.
  2. تضخيم تسلسل ترميز المحرر بواسطة PCR لمدة 30 دورة باستخدام بادئات تقدم محفزا وظيفيا T7 أعلى منطقة الترميز وتسلسل poly(A) في الأسفل (الجدول 2 والجدول 3).
    ملاحظة: تسلسل النيوكليوتيدات في قالب IVT موضح تحتها في الجدول 4.
  3. تحقق وتنقية منتج PCR
    1. شغل 5 ميكرولتر من منتج PCR على جل أجاروز بنسبة 1٪ في مخزن TE بجهد 180 فولت لمدة 30 دقيقة. تأكد من وجود نطاق واحد عند حوالي 4000-6500 قاعدة أساس (حسب المحرر الذي يتم نسخه) قبل الانتقال إلى تنقية المنتجات بتقنية PCR.
    2. قم بتنقية منتج PCR باستخدام مجموعة تنظيف PCR (جدول المواد).
      ملاحظة: إذا لوحظت عدة نطاقات أو جودة منتجات PCR ضعيفة، قم بتحسين ظروف الدورة الحرارية (الجدول 5 – جدول استكشاف المشكلات).
    3. قم بقياس الحمض النووي المنقى باستخدام اختبار dsDNA الفلورومتري. لتحليل الكيوبت dsDNA، حضر خليط الصبغة الرئيسية بدمج 796 ميكرولتر من محلول الكيوبت عالي الحساسية مع 4 ميكرولتر من الصبغة، وكلاهما متوفر في المجموعة.
    4. في أنابيب منفصلة، اخلط 198 ميكرولتر من خليط الصبغة الحازمة مع 2 ميكرولتر من معيار منخفض التركيز S1، ومعيار عالي التركيز S2، والعينة. أدرج كل معيار وعينة كما هو مطلوب في جهاز فلوروميتر الكيوبت لقياس تركيز المخزون.
      ملاحظة: إذا كانت العينات فوق نطاق التحليل، فقد تحتاج إلى تحضير تخفيفات.

2. نسخ ال mRNA

  1. تحضير تفاعل IVT على الثلج باستخدام بوليميراز T7 RNA، وNTPs، وهو نظير للغطاء للتغطية المشتركة، وN1-ميثيل-سودوريدين ثلاثي الفوسفات كبديل لليوريدين لتقليل تنشيط المناعة الفطرية1˒5˒6.
  2. حضر خليط تفاعل IVT وفقا للجدول 4. استخدم تسلسل القوالب المشروحة المرفق في الجدول 4. تجميع كل تفاعل نسخ في حجم نهائي بسعة 40 ميكرولتر.
  3. جهز 5–10 أنابيب تفاعل لتوليد كمية كافية من mRNA لعدة تجارب. كل تفاعل بحجم 40 ميكرولتر يولد حوالي 100 ميكروغرام من mRNA. مع استخدام 1 ميكروغرام من mRNA لتحرير الحفر الكهربائي الأولي و3 ميكروغرام من mRNA لتحرير الأساس الكهربائي، يكون هذا كافيا ل~33–100 عملية اقتراب.
  4. نسخ الحمض النووي الريبي
    1. اخلط تفاعل IVT جيدا عن طريق التقطيع. حضن التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
  5. تنقية الحمض النووي الريبي
    1. انقله إلى أنبوب بسعة 1.5 مل وأضف محلول كلوريد الليثيوم (LiCl) بسعة 7.5 مولار إلى تفاعل IVT بحجم يساوي نصف إجمالي حجم التفاعل لتحقيق تركيز نهائي ل LiCl يبلغ 2.5 M. للحصول على تفاعل IVT بقوة 40 ميكرولتر، أضف 20 ميكرولتر من 7.5 مليون ميل LiCl. اخلط جيدا عن طريق العزف اللطيف على الماصات.
    2. حضن التفاعل عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. قم بعمل الطرد المركزي للعينة عند 16,000 × جرام عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. أزل الفائق باستخدام ماصة وتخلص منه. اغسل الحبيبة ب 1 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ عند 4 درجات مئوية. ليس من الضروري إزعاج الحبيبة. الطرد المركزي عند 16,000 × جرام عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
    4. أزل الإيثانول تماما ودع الحبيبة تجف في الهواء لمدة دقيقة إلى دقيقتين في خزانة سلامة حيوية خالية من RNase. لا تجف الحبيبات أكثر من اللازم وإلا قد يكون من الصعب إعادة تعليقها.
  6. أعد تعليق وقياس كمية الحمض النووي الريبي
    1. أعد تعليق الحمض النووي الريبي في ماء خال من النوكليز. في البداية، أعد تعليق كل تفاعل في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ثم قم بتخفيف التفاعل أكثر بعد قياس تركيز الحمض النووي الريبي. قم بقياس الحمض النووي الريبي باستخدام اختبار RNA فلورومتري مثل النانودروب.
      نقطة التوقف: بعد قياس وتكوين الكميات من الحمض النووي الريبي، تخزين معادلات mRNA عند -80 درجة مئوية حتى الاقتراب الكهربائي. تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان؛ قم بإذابة كل أليكوت مرة واحدة فقط قبل الاستخدام.
    2. تأكد أن إنتاج mRNA المنقى هو تقريبا 100-400 ميكروغرام لكل تفاعل IVT بمقدار 40 ميكرولتر. قم بتخفيف ال mRNA إلى 2 ميكروغرام·ميكرولتر-1 باستخدام ماء خال من النوكلياز قبل التماثل. خزن الأكواد عند −80 درجة مئوية.
      ملاحظة: تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان. جهز أليكوات للاستخدام مرة واحدة وتخلص من المواد المذابة غير المستخدمة. حضر 12.5 ميكرولتر أليكوت في شرائط PCR ل 8–20 إلكتروبوريشن لكل أليكوت.
  7. تقييم سلامة الحمض النووي الريبي
    1. تقييم حجم وسلامة الحمض النووي الريبي باستخدام الرحلان الكهربائي بجل الأغاروز أو الرحلان الكهربائي الآلي (الشكل 2)
    2. حضر جل أغاروز بنسبة 0.8٪ يحتوي على 10,000x SYBR Gold مخفف. استخدم سلم RNA أحادي السلسلة، مثل علامة nesb ssRNA.
    3. قم بإزالة طبيعة ال mRNA باستخدام صبغة تحميل جل RNA مرتين وتسخين العينات إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق قبل تحميل العينات على الهلام.
    4. تأكد من أن mRNA يظهر كنطاق سائد عند حوالي 4000-6500 نات تاونت، حسب المحرر الذي يتم نسخه، مع تشويش طفيف أو منتجات منخفضة الوزن الجزيئي. تخلص من عينات RNA التي تظهر تدهورا كبيرا أو تلطخا أو نطاقات غير متوقعة متعددة.

3. تصميم وتحضير الحمض النووي الريبي الإرشادي

ملاحظة: حدد تسلسلات النقوش المجاورة للبروتوسبايس (PAM) داخل الموقع الجيني المستهدف واختر الحمض النووي الريبي الموجه المتوافق مع المحرر المختار والتعديل الجيني المقصود. يمكن استخدام منصات تصميم RNA الإرشادية مثل CHOPCHOP، CRISPOR، CRISPRware، IDT Cas9 Checker، Benchling، وVectorBuilder لترتيب أولويات RNA التوجيهية ذات النشاط المتوقع والخصوصيةالمتوقعة 6،7،8،9،10،11،12،13.

  1. تحديد مواقع PAM داخل الموقع الجيني المستهدف المتوافقة مع متحور النوكلياز المختار، بما في ذلك المتغيرات المتوافقة مع NGN، باستخدام أدوات تصميم RNA الإرشادية.
  2. اختر RNA دليل ذو نشاط مرتفع متوقع على الهدف ونشاط خارج الهدف متوقع منخفض. أكد نافذة التحرير للحمض النووي الريبي الدليل.
  3. بالنسبة لتطبيقات التحرير الأساسي أو التحرير الأولي، اختر RNA الدليل الذي يضع التعديل المقصود ضمن نافذة النشاط المثلى للمحرر المختار.
  4. اطلب sgRNA أو pegRNA يحتوي على نظائر قاعدة 2'-O-Methyl لأول 3 ونوكليوتيدات وآخر 3 نوكليوتيدات، بالإضافة إلى ارتباط فوسفوروثيوات 3' بين أول 3 وآخر قاعدتين من الدليل.
  5. أعد تعليق الحمض النووي الريبي التوجيهي في ماء خال من النوكلياز أو مخزن TE (100 ميكرومول). جهز 5 ميكرولتر أليكوات وتخزين الأليكوات عند −80 درجة مئوية. عند الاستخدام، يتم إذابة وتخفيف التخفيف في مخزن التسامية الكهربائية قبل التسامية الكهربائية.

4. تحضير زراعة الخلايا

ملاحظة: قيم سلامة الخلية بالمجهر وفحوصات القابلية للبقاء قبل الحفر الكهربائي.

  1. زراعة الخلايا الليفية الأولية أو خلايا HEK293T في DMEM مع مكمل 10٪ FBS، 4.5 جرام· L-1 جلوكوز، جلوتا ماكس، و110 ملغ· L-1 بيروفات الصوديوم. قم بتغليف الخلايا على قوارير T75 المعقمة (سطح TC) عند 20٪ من التقاء لكل قارورة. حافظ على الخلايا بين الممرات من 1 إلى 20. قسم الخلايا عند التقاء 80٪ واستخدم الخلايا عند التقاء 70-80٪ للتربية الكهربائية.
  2. زراعة الخلايا الجذعية متعددة القدرات في وسائط mTeSR Plus. قم بتغليف الخلايا على قوارير T75 المعقمة المغطاة بالجيلتريكس عند تلاقي 20٪ لكل قارورة. غير الوسائط يوميا وحافظ على الخلايا بين الفقرات من 1 إلى 20. أضف كوكتيل CEPT إلى الوسائط لمدة 24 ساعة بعد كل مقطع. قسم الخلايا عند التقاء 80٪ واستخدم الخلايا عند التقاء 70-80٪ للتربية الكهربائية.
  3. حافظ على حرارة الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ حتى تصل الخلايا إلى الكثافة المناسبة للتثقيف الكهربائي، عادة 70٪–80٪ تقاطع.
  4. إزالة الوسائط عندما تكون الخلايا عند العدد المناسب والتقاء الكهربائي.
  5. أضف إنزيم TrypLE Express إلى الخلايا (1 مل لقارورة T75) وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قم بعمل البايبر بلطف على القارورة للحصول على تعليق خلية واحدة. أوقف التفكك بإضافة 3 مل من وسط زراعة الخلايا، وتأكد من غياب تجمعات الخلايا الكبيرة قبل العد.
  6. قم بتسخين الخلايا على 1000 × جرام لمدة 5 دقائق، ثم غسل الخلايا مرة واحدة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات من دالبيكو (DPBS) بسعة 15 مل، ثم قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى.
  7. قيم تركيز الخلية وقابليتها للبقاء باستخدام اختبار قابلية مواكبة آلي مثل Nucleocounter NC-3000 مع الحل 13. ادمج 11.4 ميكرولتر من الخلايا مع 0.6 ميكرولتر من المحلول 13 قبل القياس على جهاز النيوكليوونتر. تابع عملية التثقيف الكهربائي فقط عندما تكون صلاحية الخلية على الأقل 85٪، ثم تخلص أو أعد تحضير العينات تحت هذا العتبة.
  8. أعد تعليق الخلايا بكثافة تقارب 0.5 × 106–2 × 106 خلايا·مل-1 في DPBS. عد الخلايا وقيم قابلية البقاء باستخدام جهاز قياس الدم أو عداد الخلية.
  9. المضي قدما فقط إذا كانت صلاحية الخلية ≥ 85٪.
  10. أعد تعليق الخلايا في مخزن كهربائي. أعد تعليق 2 ×10 5 خلايا في 5 ميكرولتر من مخزن التقميم الكهربائي البارد لكل تفاعل.
  11. جهز مخزن الحفر الكهربائي باستخدام محلول المكمل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مباشرة قبل الاستخدام وحافظ على المخزن على الثلج.
  12. حافظ على برودة الخلايا وتابع بسرعة. حافظ على الخلايا على الجليد وانتقل فورا إلى إعداد التسامية الكهربائية.

5. التقشير الكهربائي

ملاحظة: جهز تحرير الحمولة في أنابيب شرائط PCR لتسهيل التوصيل متعدد القنوات. بعد التسامح الكهربائي، أعد تعليق الخلايا في وسط مغذي بكوكتيل CEPT لتعزيز بقاء الخلية12.

  1. جهز شحنة RNA.
    1. تحضير شحنة RNA على الجليد عن طريق دمج mRNA المحرر وRNA التوجيه في مخزن الاختراق.
    2. بالنسبة لمحررات القواعد والنوكليز، حضر محلول نهائي للتقشير الكهربائي يحتوي على 1.5 ميكرولتر (3 ميكروغرام) من mRNA، و0.5 ميكرولتر (50 بيومول) من RNA التوجيه، و15 ميكرولتر من مخزن التوزيع الكهربائي لكل عينة.
    3. بالنسبة للمحررات الأولية، حضر محلول نهائي للتقشير الكهربائي يحتوي على 0.5 ميكرولتر (1 ميكروغرام) من mRNA، و1.5 ميكرولتر (150 بيومول) من RNA التوجيهية، و15 ميكرولتر من مخزن التقشير الكهربائي لكل عينة.
    4. جهز حلول شحن RNA كخليط رئيسي 1.2× لتعويض فقدان الحجم أثناء النقل والتعامل مع العينات. قم بتحسين أحجام وأحجام النسب لكل موقع مستهدف ونسخة محرر حسب الحاجة.
  2. وزع الخلايا، والحمولة، والكهرباء.
    1. أضف 5 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر إلكتراقية.
    2. أضف 17 ميكرولتر من حمولة RNA في مخزن التوزيع الكهربائي إلى 5 ميكرولتر من الخلايا. اخلط التعليق عن طريق التوصيل مرتين.
      تحذير: قم بسرعة بعد دمج الخلايا وحمولة RNA لأن النازات التي تفرزها الخلايا يمكن أن تتلف بسرعة ال mRNA الخاص بالمحرر. أكمل عملية التقشير الكهربائي خلال دقيقتين بعد خلط الخلايا وحمولة RNA.
    3. شغل برنامج التقميم الكهربائي المحسن لنوع الخلية المختار (الجدول 6؛ الشكل 2؛ الشكل 3).
      1. بالنسبة للأرومات الليفية الجلدية الأولية أو الخلايا HEK293T، استخدم نظام لونزا 4D للتقمية الكهربائية مع المخزن الكهرومغناطيسي (buffer SF). أضف 200,000 خلية في كل تفاعل إلى مسطح كهرباء بسعة 20 ميكرولتر. شغل البرنامج CM-130. أضف فورا 80 ميكرولتر من DMEM المدفأ مسبقا + 10٪ FBS، 4.5 جرام· L-1 جلوكوز، 4 ملليمولار L-جلوتامين، و110 ملغ· L-1 بيروفات الصوديوم. استرجع الخلايا لمدة 10 دقائق قبل تخفيفها إلى صفيحة تحتوي على 96 أو 24 بئرا.
      2. بالنسبة للخلايا الجذعية متعددة القدرات، استخدم نظام لونزا للتقسيمات الكهربائية رباعي الأبعاد مع المخزن P3. أضف 200,000 خلية في كل تفاعل إلى كوفيت مسامية كهربائية بسعة 20 ميكرولتر. شغل البرنامج DN-100. أضف فورا 80 ميكرولتر من وسائط mTeSR Plus المسخنة مسبقا. استرجع الخلايا لمدة 10 دقائق قبل تخفيفها إلى صفائح بسعة 24 بئرا.
    4. افحص الخلايا يوميا بعد الطلاء لمراقبة صحة الخلية وتعافيها.

6. استخراج الحمض النووي الجيني

ملاحظة: تأكد من أن الحمض النووي الجيني ذو جودة كافية وخال من المثبطات قبل تضخيم PCR، حيث يمكن أن تؤثر جودة الحمض النووي على إعداد مكتبة التسلسل والقياس الدقيق لنتائج تحرير الجينوم9,10,11.

  1. اغسل واحصد الخلايا.
    1. اجمع الخلايا بعد 2-3 أيام من التوزيع الكهربائي. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام DPBS ثم تابع فورا إلى استخراج الحمض النووي الجيني.
    2. تحضير مخزن تحلل غير مكتمل بدمج 10 مل من محلول 1 متر تريس-HCl (درجة حموضة 8.0)، و5 مل من محلول كبريتات الصوديوم الدودسيل (SDS) بنسبة 10٪ (وزن لكل فول)، وماء خال من النوكلياز إلى حجم نهائي يبلغ 1 لتر. تخزين مخزن التحلل غير المكتمل في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    3. تحضير مخزن التحلل الكامل حديثا عن طريق إضافة بروتيناز K بتخفيف بنسبة 1:1,000 (حجم/حجم) إلى عدد من الكمية غير الكاملة من مخزن التحلل غير الكامل. أضف مخزن التحلل الكامل إلى الخلايا لبدء التحلل. أضف 40 ميكرولتر من مخزن التحلل الكامل إلى كل بئر يحتوي على حوالي 80,000 خلية في صفيحة بئر بسعة 96. لا تستخدم المزج صعودا وهبوطا لأن ذلك قد يسبب فقدان العينة.
  2. اهضم العينات.
    1. حضن العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة لإكمال تحلل الخلايا وهضم البروتيناز K.
  3. تعطل إنزيم البروتيناز K.
    1. انقل الليزاتات إلى أنابيب PCR أو إلى لوحة PCR بسعة 96 بئر. حضن العينات عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتعطيل البروتيناز K.
  4. خزن الليزيتات.

نقطة التوقف: تخزين الليزاتات عند −20 درجة مئوية حتى يتم تضخيم PCR.

7. تسلسل المضخمات المستهدف لتحرير التحليل

ملاحظة: مجموعة منتجات PCR بكميات متساوية الأضرار قبل التسلسل. حوالي 10,000 قراءة تسلسل لكل عينة كافية عموما لقياس نتائج تحرير الجينوم الجماعي.

  1. تصميم تمهيدات خاصة بالموقع لتوليد حوالي 300 مضخم قاعدة تمتد على الأقل 25 بت في الاتجاه العلوي و25 قاعدة في اتجاه أسفل موقع التحرير (الجدول 7).
  2. تضخيم الموقع الجيني المستهدف عن طريق إجراء PCR1 وفقا للشروط المقدمة في الجدول 8، الجدول 9.
  3. أضف مؤشرات عينة فريدة بواسطة PCR باستخدام منتج PCR1 كقالب، كما هو الحال مع البادئات المعروضة في الجدول 7 "أمثلة على بادئات فهرسة PCR". استخدم حالات PCR كما هو موضح في الجدول 2 من الجدول 8 والجدول 9.
  4. شغل منتجات PCR1 و PCR2 على جل أجوروز بنسبة 1.5٪ للتأكد من وجود نطاقات مفردة بالحجم المتوقع.
  5. اجمع منتجات PCR2 بكميات متساوية المضطرب. نظف مكتبة PCR2 المجمعة باستخدام نسبة الخرزات إلى العينة في AMPure XP 0.65:1 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإخراج المكتبة المنقاء في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز وتأكيد إزالة الديمرات المحول بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي قبل التسلسل.
  6. قم بقياس المكتبة النهائية المجمعة باستخدام اختبار dsDNA الفلوريمتري. تقييم توزيع حجم الشظايا بواسطة الرحلان الكهربائي الشعري.
  7. تسلسل المكتبات باستخدام قراءات أحادية الطرف 300 دورة على جهاز Illumina MiSeq. قم بتخفيف المكتبة المجمعة النهائية إلى 4 نانومتر. اجمع 5 ميكرولتر من مكتبة 4 نانومتر المجمعة مع 5 ميكرولتر من 0.1 M NaOH وماصة للخلط. حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتغيير الطبيعة (denature)، ثم أضف 990 ميكرولتر من محلول HT المبرد المرفق مع مجموعة MiSeq لتحييد المحلول وتخفيفه إلى 20 بيسمال. زيادة في سيطرة 15٪ على PhiX. تحميل المكتبة على خرطوشة Illumina MiSeq وتشغيل تسلسل أحادي الطرف لمدة 300 دورة باستخدام إعدادات التشغيل القياسية من الشركة المصنعة. يهدف إلى توليد حوالي 30,000 قراءة لكل عينة، رغم أن 10,000 قراءة لكل عينة كافية لتحرير التحليل12. يمكن إجراء تسلسل MiSeq لكل عينة في بعض الشركات مثل Genewiz أو Quintara.

8. تحليل نتائج تحرير الجينوم

ملاحظة: يمكن تحليل CRISPResso2 من قياس كفاءة التحرير العامة، وتكرارات تحويل النيوكليوتيدات، وترددات الإدخال/الحذف (indel)، ويمكن استخدامه لتوصيف نتائج التحرير عبر ظروف التجربة15.

  1. قم بفك إرسال بيانات التسلسل وتنظيم ملفات FASTQ حسب الموقع الجيني والحالة التجريبية.
  2. قم بتثبيت CRISPResso2 وفقا للتعليمات المرفقة في مستودع Github (https://github.com/pinellolab/crispresso2).
  3. شغل تحليل دفعات CRISPResso2 باستخدام ملفات batch.txt التي تحدد ملفات FASTQ المدخلة ومعلمات التحليل (أمثلة موفقة في الجدول 7). اضبط الحد الأدنى لدرجة جودة القراءة إلى 30. اضبط عرض نافذة "w" على 20. إذا كنت تستخدم محررات قواعد السيتوزين، يمكن أن تتمركز بعض الإندلز حول النيوكليوتيدات المعدلة بالقاعدة بالإضافة إلى موقع النيتوزين. في هذه الحالة، قم بضبط مركز نافذة "WC" إلى -10 بدلا من المركز الافتراضي في موقع ال nick لالتقاط هذه الرموز بشكل أفضل.
  4. استخلاص المخرجات الكمية، مثل ترددات تحويل النيوكليوتيدات، وترددات الإدخال/الحذف (indel)، و(إذا كان ذلك مناسبا) ترددات HDR أو تحرير الأوليات من ملفات الإخراج الملخصة المناسبة. عادة ما توجد هذه الملفات في الملفات المسماة "CRISPRessoBatch_quantification_of_editing_frequency.txt" و"Nucleotide_percentage_summary.txt"، والتي يمكن فتحها في مايكروسوفت إكسل أو برامج تحرير الجداول الأخرى.
  5. تصدير قيم التحرير الكمي للرسم التخطيطي وتفسير البيانات لاحقا، كما في الأشكال 3-4. استخدم ملفات "alleles_frequency_table_around_sgRNA.pdf" (كما هو موضح في الشكل 5) لتقييم نتائج تحرير الأليل.

النتائج

استخدام محرر فعال مع موقع اختبار سهل الوصول، مثل محرر ABE8e الأساسي مع موقع التحكم HEK3، غالبا ما يؤدي إلى كفاءة تحرير تزيد عن 90٪ إذا كان نظام التوصيل مناسبا جيدا للخلايا المستخدمة في التجربة. قد تحدث كفاءة تحرير أقل إذا ظهرت مشاكل في mRNA المحرر، أو RNA التوجيه، أو الموقع المستهدف، أو ظروف التسليم التي تجعل أي منها أقل ملاءمة للتحرير. استخدام نسخ Cas9 التي تصل إلى تسلسلات PAM أكثر تنوعا لكنها تربطها بشكل أقل إحكاما أو استهداف المحررات بالنوكليوتيدات التي تقع خارج نافذة التحرير المثالية، يمكن أن يقلل من كفاءة التحرير. عادة ما تظهر ال mRNA الناجحة المولدة بواسطة IVT كنطاق سائد واحد مع منتجات تملخة قليلة أو تدهور جزيئي منخفض، مما يدل على سلامة نسخ عالية مناسبة للتثقيف الكهربائي في الأسفل (الشكل 2).

بعد التشعب الكهربائي للرنا الريبي المحرر والحمض النووي الريبي الدليل الاصطناعي، تستعيد معظم الخلايا السيطرة خلال 24–48 ساعة وتحافظ على شكلها النموذجي مع برامج التقميم الكهربائية المناسبة (الشكل 3–4). يجب تخصيص ظروف التسامح الكهربائي لتناسب نوع الخلية المحدد، حيث يمكن أن تؤدي المخازل المختلفة إلى نتائج مختلفة بشكل ملحوظ. يقدم مركز لونزا للمعرفة الإلكتروني توصيات لرموز المخزن المؤقت والإلكترونيات لأنواع الخلايا الشائعة، ويقدم لونزا مجموعات تحسين منفصلة لخطوط الخلايا والخلايا الأولية. يمكن أن تساعد المقارنة التجريبية بين المخازن في تحديد الظروف المثلى للتسليم الكفء. قد تؤدي البرامج غير المناسبة إلى عدم التوصيل على الإطلاق أو قد تكون شديدة السمية للخلايا (تفقد أكثر من 50٪ أو تمنع استمرار دورة الخلية). أظهرت تجارب التحسين التمثيلي اختلافات كبيرة في نتائج التحرير عبر ظروف التسامح الكهربائي، حيث حققت بعض البرامج كفاءة تحرير عالية بينما أنتجت أخرى تعديلا محدودا، مما يبرز أهمية التحسين التجريبي لكل نوع من الخلايا (الشكل 3–4).

عبر iPSCs، والأروميات الليفية، وLCLs، يستخدم تسلسل المضخمات المستهدف متبوعا بتحليل CRISPResso2 لقياس كفاءة التحرير والمنتجات الثانوية (الشكل 4). يظهر هنا تعديل قواعد الأدينين لموقع اختبار HEK3 (الشكل 4)، مما أدى إلى تحويلات النيوكليوتيدات المقصودة بترددات منخفضة من الإندل في العينات المحللة. يتيح تحليل CRISPResso2 تصور الأليلات المعدلة وغير المعدلة في الموقع المستهدف ويسهل قياس تحويلات النيوكليوتيدات المقصودة، وترددات الإندل، ونواتج التحرير الأخرى، مما يوفر تقييما شاملا لنتائج التحرير (الشكل 5). يتم قياس كفاءة التحرير بقياس تكرار هذا الاستبدال الدقيق للنوكليوتيد الواحد في الموقع المستهدف. يستخدم موقع HEK3 كموقع نموذجي بسبب ملفه التحريري المميز جيدا وقابليته للتكرار عبر الأنظمة التجريبية، مما يتيح تقييما قويا لأداء التحرير الأساسي تحت ظروف مختلفة. نوصي باختبار هذا الدليل كدليل إيجابي في الخلايا البشرية عند تحسين إجراءات التحرير الجديدة. عادة ما يتم إثراء التحرير الأساسي لتحويلات النيوكليوتيدات المقصودة ذات ترددات إندل منخفضة، بينما ينتج التحرير الأولي مزيجا من التعديلات الدقيقة والنواتج منخفضة التردد 3,12. تفاوتت كفاءات التحرير عبر الظروف، مع لوحظة فروق واضحة بين أنواع الخلايا وبرامج الاختراقية الكهربائية (الشكل 3-4). من المرجح أن تعكس هذه التغيرات اختلافات في امتصاص الخلية، وقابلية البقاء، ونشاط إصلاح الحمض النووي، بالإضافة إلى تأثير معايير التوزيع الكهربائي على كفاءة التوصيل. تسلط هذه النتائج مجتمعة الضوء على أهمية تحسين إعدادات التقشير الكهربائي حسب نوع الخلية لتحقيق نتائج تحرير متسقة وقصوى.

figure-results-1
الشكل 1. إعداد mRNA للمحرر بواسطة النسخ الصناعي.
نظرة عامة تخطيطية لتوليد mRNA في المحرر. (الخطوة 1) تحضير قالب البلازميد الذي يحتوي على تسلسل ترميز المحرر ومروج T7. (الخطوة 2) تضخيم PCR لتوليد قالب DNA خطي. (الخطوة 3) النسخ في المختبر باستخدام بوليميراز T7 RNA لتخليق mRNA مغلف. (الخطوة 4) تنقية mRNA لإزالة الحمض النووي النموذجي، الإنزيمات، والنيوكليوتيدات الحرة. ال mRNA المغطى الناتج مناسب للنقل إلى الخلايا الثديية عبر التوزيع الكهربائي أو الجسيمات الدهنية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2. صورة نموذجية لتحليل الرحلان الكهربائي الهلام لل mRNA 
صورة الرحلان الكهربائي لثلاثة رنا رنا محرر جينوم تعمل على هلام أغاروز بنسبة 1٪ باستخدام صبغة ذهبية من SYBR. يظهر سلم ssRNA من NEB على اليسار مع علامات الحجم التي تشير إلى طولها. غياب التشويش الكبير أو الأشرطة الصغيرة يشير إلى أن هذه ال mRNA ذات جودة مناسبة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3. تحسين ظروف التقشير الكهربائي لتحرير الجينوم في الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs). 
تظهر كفاءات التحرير التي تم الحصول عليها تحت ظروف التقشير الكهربائي المختلفة في وحدات iPSCs. تم تجميع الخلايا باستخدام عدة مخازن وتركيبات برامجية، بما في ذلك مخزن التخزين المؤقت CB-150 P4، ومخزن CD-118 P3، ومخزن DN-100 P3، ومخزن DC-100 P3، جميعها على جهاز لونزا 4D Nucleofection. تم تقييم التحرير باستخدام جهاز النيون الكهربائي مع معايير (1600 فولت، 20 مللي ثانية، نبضة واحدة). تم قياس كفاءة التحرير من خلال تحليل تسلسل مستهدف للموقع المعدل. N=1 لكل عينة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4. تحسين ظروف التعرض الكهربائي لتحرير الجينوم في الخلايا الليفية.
كفاءة التحرير بعد التقشير الكهربائي باستخدام برامج النيوليفكشن المختلفة. تم تهيئة الأرومات الليفية باستخدام عدة برامج لونزا للنوى (CA-137، CM-138، DS-150، EH-100، EN-150، EO-114، وFF-113)، وتم قياس نتائج التحرير بواسطة تسلسل مستهدف. تظهر النتائج لنسختين (P2، P3). يتضمن التحكم السلبي بدون تسليم المحرر. تبرز مقارنة رموز الحفر الكهربائي الفروقات في كفاءة التحرير عبر إعدادات الحفر الكهربائي، مما يمكن من تحديد المعلمات المثلى لتحرير جينوم الأرواح الليفية. N=1 لكل عينة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5. توصيف نتائج تحرير الجينوم في الموقع المستهدف. 
جدول تردد الأليل الناتج من CRISPResso2، الذي يعرض الوفرة النسبية للأليلات المعدلة وغير المعدلة حول منطقة هدف sgRNA كما تم تحديدها بواسطة تحليل التسلسل عالي الإنتاجية بعد التحرير. تشير التعليقات الحمراء إلى نافذة تحرير القاعدة والتعدد المتغاير الموجود مسبقا في خط الخلية المستخدم. تسلسل فاصل الحمض النووي الريبي الموجه مخطئ باللون الرمادي. "موضع الانقسام المتوقع" الموضح بخط منقط يتحرك بالنسبة للموقع النموذجي "PAM ناقص 3" ل SpCas9 بسبب تعديل مركز النافذة "wc" في ملف الدفعة التحليلي لدينا (مثال في الجدول 8). هذا لا يغير فعليا موقع الانقسام المتوقع الحقيقي، لكن المخرج يظهر بهذه الطريقة للدلالة على أن الإندل المحيط بالخط المنقط ضمن نافذة من 20 نيوكليوتيدا سيتم تقييمه، مما يلتقط كل من الإندل المتمركز في موقع القطع الحقيقي وكذلك تلك التي تمركز عند النيوكليوتيدات المنزوعة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول 1. المحررات والتسلسلات المستخدمة في هذه الدراسة 
العمود 1: محررو الجينوم المتاحون على AddGene للنسخ الصناعي. أسماء ومعرفات الجين الإضافية للبلازميدات المتاحة والتي يمكن استخدامها في المختبر كما هو موضح في هذا البروتوكول. العمود 2: تسلسلات فواصل RNA الإرشادية المستخدمة في هذه الدراسة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2. كواشف PCR لتضخيم قالب بلازميد mRNA.
قائمة الكواشف ومكونات التفاعل المستخدمة في تضخيم PCR لقالب البلازميد لتوليد DNA خطي للتطبيقات اللاحقة، بالإضافة إلى تسلسل بادئات النسخ الأمامي والعكسي. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 3. ظروف دورة PCR لتضخيم قالب mRNA. 
يسرد هذا الجدول ظروف الدورة الحرارية المستخدمة لتضخيم قالب mRNA من الحمض النووي البلازميدي قبل التطبيقات التالية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 4. المواد المستخدمة في تفاعلات النسخ في المختبر . 
يسرد هذا الجدول الكواشف ومكونات التفاعل المستخدمة في النسخ الصناعي لتخليق mRNA للمحرر من قالب الحمض النووي الخطي. يتم عرض تسلسل قالب مثال (ABE8e) مع عناصر ملونة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 5. دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها للخطوات الرئيسية في سير عمل تحرير الجينوم. 
يلخص هذا الجدول المشكلات التقنية الشائعة التي قد تظهر أثناء تحضير المحرر لتقنية mRNA من خلال النسخ الصناعي (IVT)، وتحليل تسلسل MiSeq. لكل خطوة من خطوات العمل، يتم توفير المشاكل المحتملة، والأسباب المحتملة، والحلول الموصى بها للمساعدة في تحسين كفاءة التحرير وضمان الكشف الدقيق لنتائج التحرير. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 6. برامج التقميم الكهربائية المثلى لأنواع خلايا الثدييات المختلفة. 
يسرد هذا الجدول رموز برامج التوزيع الكهربائي وظروف المخزن المستخدمة لتوصيل mRNA المحرر بكفاءة وتوجيه الحمض النووي الريبي إلى أنواع مختلفة من خلايا الثدييات. تم اختبار معايير التوزيع الكهربائي المدرجة لتحديد الحالات التي تعزز كفاءة تحرير الجينوم مع الحفاظ على بقاء الخلية. قد لا يعمل نفس البرنامج لكل خط خلوي أو مصدر للخلايا الأولية، لذا ينصح باختبار بدائل من هذه القائمة إذا لم ينجح التعديل في البداية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 7. معايير تحليل CRISPResso2 لقياس نتائج تحرير الجينوم. 
يعرض التبويب الأول مثالا على تصميم تمهيد HTS1 المستخدم في تضخيم موقع الهدف. يوفر التبويب الثاني مثالا على مقدمات الفهرسة المستخدمة أثناء إعداد المكتبة. يوضح التبويب الثالث مثالا على ترتيب الفهرسة المستخدم لتعيين مؤشرات فريدة لكل عينة أثناء التسلسل. يحتوي التبويب الرابع على ملف دفعة إدخال مثال لتحليل CRISPResso2، ويوفر التبويب الخامس مثالا إضافيا لملف دفعة لتحليل CRISPResso2. لاحظ أن مركز النافذة "wc" تم تعديله لمحررات القواعد لتسهيل اكتشاف الإندل التي تكون مركزة على القواعد المنزوعة بالإضافة إلى تلك التي تتركز حول نقطة النيوكلياز أو موقع الخدش. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 8. كواشف PCR1 (تبويب 1) وPCR2 (تبويب 2) لتحضير مكتبة MiSeq.
يسرد هذا الجدول الكواشف ومكونات التفاعل المستخدمة في التابوليبوب 1 (PCR1) لتضخيم المواقع الجينومية المستهدفة، وفي التابول 2 (PCR2) لدمج تسلسلات مؤشرات خاصة بالعينة ومحولات تسلسل Illumina، مما يولد مكتبات جاهزة للتسلسل لتحليل MiSeq. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 9. PCR1 (تبويب 1) وPCR2 (تبويب 2) يعملان على شروط الدورة التشغيلية لتحضير مكتبة MiSeq.

يسرد هذا الجدول ظروف الدورة الحرارية المستخدمة في التبويب 1 (PCR1) لتضخيم المناطق الجينومية المستهدفة، وفي التبويب 2 (PCR2) لدمج تسلسلات المؤشرات الخاصة بالعينة ومحولات تسلسل Illumina، مما يولد مكتبات جاهزة للتسلسل لتحليل MiSeq. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول سير عمل لتحرير الجينوم في الخلايا الثديية الأولية باستخدام التوزيع الكهربائي للرنا الريبي المحرر والحمض النووي الريبي الدليل الاصطناعي. يميل التوصيل كmRNA إلى تحرير أكثر كفاءة مقارنة بتوصيل البلازميد، بينما يكون mRNA أبسط وأكثر اتساقا بين الدفعات مقارنة ببروتين المحرر أو الريبونوكليوبروتين. عندما تمت مقارنة أشكال المحررات القاعدية mRNA والريبونوكليوبروتين وجها لوجه في بعض الأعمال السابقة، حقق mRNA كفاءة تحرير أفضل3. مقارنة بطرق توصيل البلازميدات أو الفيروسات، يتيح التوصيل القائم على mRNA التعبير المؤقت وتقليل خطر الاندماج الجيني، رغم أنه قد يتطلب تحسينا لأنواع الخلايا المختلفة. بالإضافة إلى انخفاض كفاءة التحرير، يحمل استخدام الحمض النووي البلازميدي في تحرير الجينوم خطر الاندماج العشوائي في جينوم الخلايا المستهدفة، وقد يزيد من خطر التحرير غير المستهدف بسبب التعبير المطول للمحرر. يتيح الجمع بين تسلسل الأمبلكونات المستهدف وCRISPResso2 القياس المعياري لكفاءة التحرير وتوصيف أي نتائج أليلية3.

هناك عدة عوامل حيوية للنجاح. تشمل الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي من خلال التعامل الصارم مع الحمض النووي الريبي، واختيار الحمض النووي الريبي الإرشادي الأمثل، وتحسين ظروف الحفر الكهربائية بعناية لكل نوع من أنواع الخلية. تؤثر سلامة الحمض النووي الريبي والتحكم الدقيق في الحمض النووي الريبي بشكل قوي على النتائج، ويظل اختيار الحمض النووي الريبي الموجه العامل الأساسي في تحديد الكفاءة وملفات المنتجات الثانوية. تتطلب إعدادات التقشير الكهربائي تحسينا تجريبيا حسب نوع الخلية، وبعض البرامج التي تنتج تحريرا عاليا قد تسبب أيضا سمية. إذا لوحظت كفاءة تحرير منخفضة، يجب النظر في تحسين معلمات الاقتراب الكهربائي، أو جودة الحمض النووي الريبي، أو تصميم الدليل الرابي. إذا حدث سمية مفرطة، فقد يؤدي تقليل قوة التساقيح الكهربائي أو مدخلات RNA إلى تحسين قدرة الحمض النووي الريبي على تحسين قدرة الخلايا. تشمل استراتيجيات التحسين الإضافية اختبار مخازن وبرامج بديلة للاحتراق الكهربائي المصممة لنوع الخلية المستهدفة أو تعديل تركيزات الحمض النووي الريبي المحرر أو الإرشاد. يوفر هذا السير منصة عملية لمقارنة المحررين وإنتاج خلايا معدلة قبل الاستنساخ اللاحق لخلية واحدة، أو التنمذجة الظاهرية، أو الدراسات في الجسم الحي، أو التطوير الانتقالي. هذا السير على نطاق واسع قابل للتطبيق لتقييم استراتيجيات تحرير الجينوم في الخلايا الأولية، مما يتيح المقارنة المنهجية لأنماط التحرير عبر السياقات الجينومية وأنواع الخلايا. يدعم نمذجة الأمراض من خلال إدخال أو تصحيح المتحورات ذات الصلة سريريا، بالإضافة إلى الاستجواب الوظيفي للعناصر التنظيمية المشفرة وغير المشفرة. بالإضافة إلى ذلك، يوفر منصة لتحسين أساليب التحرير العلاجية، بما في ذلك تقييم الكفاءة الدقيقة، والنشاط خارج الهدف، ومتانة التحرير. يمكن أيضا استخدام سير العمل لفحص وترتيب أولويات الحمض النووي الريبي الإرشادي وأنظمة التحرير، وتقييم استراتيجيات التوصيل، واختبار المتغيرات الخاصة بالمريض في إطار الطب الدقيق. وبشكل جماعي، يعمل كجسر متعدد الاستخدامات بين علم الأحياء الجينومي الأساسي، والأبحاث الترجمية، والتطور ما قبل السريري. من قيود هذه الطريقة أن كفاءة التقسيم الكهربائي وحيوية الخلية يمكن أن تختلف بشكل كبير بين أنواع الخلايا، مما يتطلب تحسينا تجريبيا. بالإضافة إلى ذلك، قد تعتمد نتائج التعديل على تصميم الدليل والنقاء، وسهولة الوصول إلى الموقع المستهدف، مما قد يحد من قابلية التكرار عبر أنظمة تجريبية مختلفة. على الرغم من هذه القيود، يمكن أن يقلل التحسين الدقيق للمعلمات التجريبية وتصميم الدليل من التباين، مما يمكن من تطبيق هذا النهج بشكل موثوق وقابل للتكرار عبر أنظمة خلايا متنوعة.

الإفصاحات

قدمت N.W. وE.V.B. طلبات براءات اختراع لتقنيات تحرير الجينوم من خلال جامعة جونز هوبكنز. قدمت G.A.N. طلبات براءات اختراع تتعلق بتقنيات تحرير الجينوم عبر معهد برود وجامعة جونز هوبكنز.

مساهمة المؤلفين:
قام كل من M.V.، J.N.W.، E.V.B، D.M.E.، J.D.، وG.A.N. بصياغة أقسام منفصلة من النص. قام م.ف. بتجميع وتحرير النص النهائي تلاه تعديلات من جميع المؤلفين.

شكر وتقدير

نشكر بياتريس أولالا ساستري على المناقشات المفيدة المتعلقة بهذا البروتوكول. وقد دعم هذا العمل جائزة تحدي بيغ بيت من مؤسسة القلب البريطانية لمنظمة كيورهارت (رقم مرجع الجائزة). BBC/F/21/220106)، ومؤسسة التليف الكيسي (جائزة NEWBY23XX0)، والمعاهد الوطنية للصحة الأمريكية (R00HL163805 و DP2OD038783 إلى G.A.N.). تعترف J.N.W. بدعم منحة NIH رقم T32 GM148383.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1M Tris-HCl, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15568025
Agarose Thermo Fisher Scientific R0491 Agarose UltraPure 16500500 ThermoFisher 500g
AMPure XP SPRI Beads Beckman Coulter B23317 A63880, AMPure XP Beads for DNA Cleanup, 5 mL, Beckman Coulter
ATP (100 mM) New England Biolabs N0450 
CEPT Cocktail Bio-Techne / Tocris 7200 
CleanCap AG Reagent TriLink Biotechnologies N-7113 CleanCap AG 3′ OMe CleanScript IVT Kit, 125 x 20 µL rxns, 
CTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Custom DNA Primers Integrated DNA Technologies Custom 
DNA Loading Dye New England Biolabs B7024 
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific 14190-144 D8537-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965-092 DMEM High Glucose [4,500 mg/L] with [4.0 mM] L-Glutamine and [110 mg/L] Sodium Pyruvate, 500 mL
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 
GTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Illumina Indexing Primers Illumina FC-131-2001 10uM stocks
Illumina MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003 
Lithium Chloride RNA Precipitation Solution Thermo Fisher Scientific AM9480 
Lonza 4D Nucleofector System Lonza AAF-1002X 
ssRNA Ladder NEBNEBN0362S5ul/ reaction
MiSeq Reagent Kit v3 (300 cycles) Illumina MS-102-3002 
N1-Methyl-Pseudouridine-5′-Triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081 
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544 
Nuclease-Free Water Thermo Fisher Scientific AM9937 
NucleoCounter NC Slide A8 ChemoMetec 941-0008 
NucleoCounter NC-3000 ChemoMetec NC-3000 10ul of cell solution and 0.4167 μL of DAPI solution 
Solution 15, Hoechst 33342, 1 mL 910-3015 ChemometecChemometec910-3013 500 μg/ml ~ 0.9 mM ~ 0.05%
Nucleocuvette Strips Lonza V4XP-3032 
P3 Primary Cell Nucleofector Solution Lonza V4XP-3032 1 x 0.675 mL P3 Primary Cell Nucleofector® Solution
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530L 
Proteinase K Thermo Fisher Scientific EO0491 Quantity: 1mL, >600 U/mL (~20 mg/mL)
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491 2,000 units/ml 100 units 
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q33230 
Qubit RNA Broad Range Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q10211 
Qubit™ Assay TubesThermo Fisher ScientificQ32856
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo Fisher ScientificR06415ul/ reaction
RNA Purification Kit Zymo Research R1017 
RNase Away Thermo Fisher Scientific 1236B62 
SDS, 10% solutionThermo Fisher Scientific 15553027
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainThermo Fisher ScientificS11494
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102 
Synthetic sgRNA / pegRNA Synthego / IDT Custom 2ug 
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, 250 reactionsNew England Biolabs E2040L
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 100 mL
TE buffer (Tris-EDTA)Thermo Fisher Scientific AM9849TE, pH 8.0, RNase-free Thermo
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 1X 
Fetal Bovine Serum (FBS), Premium, 500 mLThermo Fisher ScientificA5670701
mTSER PLUS STEM cell Technologies# 100-0276
Penicillin/Streptomycin Mixture 10,000 ug/mL, 100 mL, 4-packQuality Biological120-095-721 

المراجع

  1. Gao H, Gao S, Kan G, Valentovich LN, An Y. Research progress of base editing and prime editing tools based on the CRISPR/Cas system. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36.
  2. Chen PJ, Hussmann JA, Yan J, et al. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell. 2021;184(22):5635–5652. doi:10.1016/j.cell.2021.09.018.
  3. Newby GA, Yen JS, Woodard KJ, et al. Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice. Nature. 2022;595(7866):295-302. doi:10.1038/s41586-021-03609-w.
  4. Sousa AA, Hemez C, Lei L, et al. Systematic optimization of prime editing for the efficient functional correction of CFTR F508del in human airway epithelial cells. Nat Biomed Eng. 2024;9(1):7. doi:10.1038/s41551-024-01233-3.
  5. Mayuranathan T, Newby GA, Feng R, et al. Potent and uniform fetal hemoglobin induction via base editing. Nat Genet. 2023;55(7):1210-1217.
  6. He W, Zhang X, Zou Y, et al. Effective synthesis of high-integrity mRNA using in vitro transcription. Molecules. 2024;29(11).
  7. Popova PG, Lagace MA, Tang G, Blakney AK. Effect of in vitro transcription conditions on yield of high-quality messenger and self-amplifying RNA. Eur J Pharm Biopharm. 2024;198.
  8. Zhang F, Wang Y, Wang X, et al. RT-IVT method allows multiplex real-time quantification of in vitro transcriptional mRNA production. Commun Biol. 2023;6(1).
  9. Montague TG, Cruz JM, Gagnon JA, Church GM, Valen E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 2014;42(W1)-W407.
  10. Concordet JP, Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1)-W245.
  11. Mohr SE, Hu Y, Ewen-Campen B, Housden BE, Viswanatha R, Perrimon N. CRISPR guide RNA design for research applications. FEBS J. 2016;283(17):3232-3245.
  12. Huang TP, Newby GA, Liu DR. Precision genome editing using cytosine and adenine base editors in mammalian cells. Nat Protoc. 2021;16(2):1089-1106. doi:10.1038/s41596-020-00450-9.
  13. Doman JL, Sousa AA, Randolph PB, Chen PJ, Liu DR. Designing and executing prime editing experiments in mammalian cells. Nat Protoc. 2023;18(6):1780-1818. doi:10.1038/s41596-022-00724-4.
  14. Chicaybam L, Barcelos C, Peixoto B, et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Front Bioeng Biotechnol. 2017;4:99.
  15. Clement K, Rees H, Canver MC, et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nat Biotechnol. 2019;37(3):224-230.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

233 233 mRNA nucleofection IVT iPSCs fibroblasts base editor prime editor
تحرير الجينوم في الخلايا الثديية الأولية عبر التسامح الكهربائي للحمض النووي الريبي المحرر
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.