مقالة منهجية

نموذج خنزير صغير مبكر ترجمي لتعفن الدم الوليدي

124 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/71456

⸱

يوليو 10, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Comparative Pediatrics, Department of Veterinary and Animal Sciences, University of Copenhagen, 2BRIDGE Translational Excellence Programme, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نماذج الإنتان البكتيري لدى الأطفال الخدج ضرورية، لكن نماذج القوارض الحالية تفتقر إلى الصلة السريرية. تم تطوير نموذج عالي الترجمة لتعفن الدم الوليدي باستخدام خنازير صغيرة معرضة مصابة بالمكورات العنقودية الحية الجلدية.

الملخص

الأطفال الخدج معرضون بشكل خاص للعدوى البكتيرية التي قد تتطور بسرعة إلى تعفن دموي يهدد الحياة، وهو حالة من الالتهاب المفرط وخلل الأعضاء. لدراسة آليات المرض وتطوير العلاج، هناك حاجة ماسة إلى نماذج حيوانية انتقالية قوية تحاكي الفيزيولوجيا المرضية المعقدة والعرض السريري لتعفن الدم الوليدي. يقدم هذا البروتوكول نموذجا سريريا ذو صلة سريرية لخنازير خزائر مبكرة لمرض تعفن الدم الوليدي، يتم تحفيزها عبر تسريب المكورات العنقودية الحية داخل الشريان بعد الولادة بفترة قصيرة أو في اليوم الثالث بعد الولادة. يتم توليد الخنازير الصغيرة عند 90٪ من الحمل عن طريق الولادة القيصرية ويتم الاعتناء بها في ظروف العناية المركزة لحديثي الولادة. تشمل هذه الحاضنات التي يتم التحكم بها بدرجة الحرارة والأكسجين وقسطرة شريانية سفية تسكن تسمح بتوصيل التغذية الوريدية وأخذ عينات دم متسلسلة. بعد الإصابة بعجينة إبيديرميدس، يتم مراقبة الخنازير الصغيرة لمدة 24–48 ساعة. يمكن تعديل حدوث وشدة الإنتان بواسطة جرعة البكتيريا وتزويد الجلوكوز الوريدي. يؤدي توفير الجلوكوز الوريد إلى تسريع الاستجابات المناعية الالتهابية، مما يؤدي إلى تدهور الحالة السريرية. يتم تحديد الإنتان القاتل والنقاط النهائية الإنسانية من خلال معايير غازات الدم الشريانية (pH ≤ 7.1) مع علامات سريرية لضعف ديناميكي الدم مثل الخمول، تغير لون الجلد، وتسارع التنفس. يوفر هذا النموذج منصة فريدة لاستكشاف كيف تؤثر عمليات استقلاب الطاقة والتدخلات المناعية على إزالة البكتيريا، والالتهاب الجهازي، وإصابة الأنسجة أثناء العدوى الوليدية. يحمل هذا العلم إمكانات كبيرة لتوجيه استراتيجيات سريرية للوقاية وعلاج تعفن الدم عند حديثي الولادة.

المقدمة

تعد عدوى حديثي الولادة سببا رئيسيا للوفيات والمراضة طويلة الأمد على مستوى العالم، خاصة بين الرضع الخدج، ولكن أيضا في الرضع الذين يعانون من انخفاض الوزن عند الولادة أو المضاعفات المحيطة بالولادة 1,2. لا يزال التشخيص المبكر تحديا بسبب العلامات السريرية غير المحددة، والاستجابات المناعية غير الناضجة والمتغيرة للغاية، ونقص العلامات الحيوية الحساسة والمحددة القادرة على التمييز بين العدوى والالتهاب غير المعدي3،4. نتيجة لذلك، يبدأ الأطباء كثيرا العلاج التجريبي واسع الطيف بالمضادات الحيوية، غالبا قبل التأكيد الميكروبيولوجي، مما يساهم في الإفراط في استخدام المضادات الحيوية، وتعطيل استعمار الميكروبات في الحياة المبكرة، وتطور مقاومة مضادات الميكروبات5.

تعفن الدم الوليدي هو حالة تهدد الحياة ناتجة عن استجابة غير منظمة للعوائل للعدوى تؤدي إلى خلل في وظائف الأعضاء4. على الرغم من أن العدوى والإنتان يمثلان كيانين بيولوجيين وسريريين مميزين، إلا أن المصطلحين غالبا ما يستخدمان بالتبادل في أدبيات حديثي الولادة. سريريا، يصنف الإنتان الوليدي عادة على أنه تعفن مبكر أو متأخر (EOS، LOS)، ويحدث قبل أو بعد 72 ساعة من الحياة، على التوالي1. عادة ما يكون متلازمة EOS ناتجة عن مسببات الأمراض المنقولة أثناء الولادة، مثل الإشريكية القولونية أو المكورات العقدية من المجموعة B. وعلى النقيض من ذلك، غالبا ما يظهر LOS بأعراض غير محددة، وقد يكون سلبيا من الثقافة، ويرتبط بعوامل خطر مثل الإجراءات الغازية، والتغذية الوريدية، والدخول إلى المستشفى لفترة طويلة. تشمل الكائنات المسببة الأكثر شيوعا المكورات العنقودية سالبة التجلط من التخثر، وخاصة المكورات العنقودية الجلدية، بالإضافة إلى البكتيريا سالبة الجرام، رغم أن العدوى الفطرية ومتعددة الميكروبات تحدث أيضا 1,2,6. بغض النظر عن السبب، يمكن أن تتقارب عدوى حديثي الولادة على نمط تعفن الدم الشائع 1,2. ومن المهم أن الأطفال الخدج يظهرون عدم نضج تطوري لكل من المناعة الفطرية والتكيفية، إلى جانب محدودية الاحتياطيات الأيضية، مما قد يؤثر على الاستجابة للعدوى7.

لقد أعاقت الأنظمة التجريبية الحالية التقدم في التشخيص والعلاج بسبب محدودية الأنظمة التجريبية القائمة. تسمح الأساليب المختبرية بإجراء دراسات ميكانيكية لمسارات المناعة لكنها تفشل في التقاط الفسيولوجيا المتكاملة للاستجابات المناعية المعقدة. نماذج القوارض، رغم قيمتها للدراسات الجينية والجزيئية حول استجابات المناعة لحديثي الولادة، تختلف بشكل كبير عن البشر في تكوين المناعة، والتمثيل الغذائي، والحجم 8,9. يصعب دراسة الإدارة السريرية لتعفن الدم في هذه النماذج بسبب محدودية الفرص للمراقبة المكثفة، وأخذ عينات دم متكررة، واختبار الرعاية الداعمة أو العلاجية الواقعية سريريا.

نماذج الحيوانات الكبيرة، وخاصة الخنازير الصغيرة حديثة الولادة، تقدم نهجا مكملا قويا. تشترك الخنازير في تشابهات تشريحية وفسيولوجية ومناعية وثيقة مع البشر، بما في ذلك مجموعات خلايا مناعية مماثلة، وإشارات مستقبلات التعرف على الأنماط، وتنظيم الأيض10،11،12،13،14. ومن المهم أن الخنازير تستخدم على نطاق واسع كنماذج لتعفن الدم البالغ13،15. يسمح المقياس الفيزيائي للخنازير باستخدام الأدوات ذات الصلة سريريا، والمراقبة الفسيولوجية المستمرة، وأخذ عينات حيوية متكررة، وتدخلات العناية المركزة الموحدة مثل التغذية الوريدية، والعلاج بالسوائل، والمضادات الحيوية، ودعم الجهاز التنفسي. يمكن أيضا دراسة العدوى التجريبية في سياق عدم النضج التطوري، مما يمكن من دراسة مسارات المرض، واستجابات المضيفين، وتأثيرات العلاج في ظروف تشبه إلى حد كبير الممارسة السريرية.

تصف هذه الورقة نموذجا موحيدا لتعفن الدم لحديثي الولادة في الخنازير الخدج صمم كمنصة ترجمة مرنة. يسمح النموذج بتحفيز العدوى البكتيرية الجهازية بشكل محكم وتقييم استجابات سريرية ومنعية وأيضية طوليا، ويمكن استخدامها لاستكشاف الفيزيولوجيا المرضية لتعفن الدم الوليدي وتقييم فعالية التدخلات الوقائية والعلاجية الجديدة.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات المفصلة وفقا لتوجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63/الاتحاد الأوروبي للتجارب الحيوانية وتمت الموافقة عليها من قبل مفتشية تجارب الحيوانات الدنماركية (رقم الترخيص: 2020-15-0201-00520).

1. الإجراءات المتعلقة بالولادة

  1. إجراء عملية قيصرية اختيارية لإنجاب خنازير صغيرة في 90٪ من فترة الحمل (أيام الحمل 106–107).
    1. احصل على خنزيرة حامل (Landrace × Large White، التوازن الثالث أو الرابع) من مزرعة تجارية خالية من الممرضات الخاصة.
      ملاحظة: يجب تخبيس الخنزيرة عن طريق التلقيح الصناعي (× دوروك) لضمان معرفة اليوم الدقيق للحمل.
    2. صوم الخنزيرة طوال الليل (على الأقل 12 ساعة) مع إمكانية الحصول على الماء قبل الجراحة. تحفز التخدير عن طريق حقن عضلي لمزيج يحتوي على أتروبين (2 مل لكل خنزيرة)، بوتورفانول (2 مل/100 كجم وزن الجسم؛ 10 ملغ/ملم)، وزوليتيل 50 فيت (3.3 مل/100 كجم وزن الجسم؛ تيلتامين 25/مل وزولازيبام 25 ملغ/مل).
    3. بعد التخدير، يتم إدخال قسطرة وريد الأذن وتحفيز التخدير العام باستخدام بروبوفول (10 ملغ/مل)، مع تعديل حتى يتم فقدان منعكس الجنسان ونغمة الفك.
    4. إجراء التنبيب في القصبة الهوائية تحت تنظير الحنجرة المباشر لتأمين مجرى الهواء. حافظ على مستوى جراحي من التخدير طوال عملية الولادة القيصرية باستخدام الإيزوفلوران المبخر، الذي يتم تسليمه بنسبة 100٪ أكسجين (1–2 لتر/دقيقة) عبر جهاز تبخير معاير.
    5. ابدأ عند 5٪ وحافظ على 1.5–2.5٪، مع تعديل التركيز إلى أقل جرعة فعالة بناء على معدل ضربات القلب وتشبع الأكسجين المحيطي.
      ملاحظة: إذا حدث انقطاع التنفس، ابدأ التهوية الميكانيكية لضمان توفير الأكسجة الكافية.
    6. ضع الخنزيرة في وضعية الاستلقاء الجانبية اليمنى. قم بتحضير معقم لموقع الجراحة. أعط حجم إجمالي 120 مل ليدوكائين (10 ملغ/مل) عبر التسرب تحت الجلد والعضلي على طول خط الشق المقصود في الجانب الأيسر.
    7. قم بإجراء عملية فتح البطن على الجانب الأيسر باستخدام مشرط لكشف وخارج قرون الرحم. شق قرون الرحم على طول الانحناء الأكبر لتوليد خنازير صغيرة.
    8. قبل قطع الحبل السري، قم بحلبه من الحبل 2-3 مرات باتجاه الخنزير الصغير لزيادة تركيز الهيموغلوبين ومخزون الحديد. ضع مشبك سرة مكتوب عليه من A إلى Z حول الحبل السري مع الشاش لمنع النزيف، واقطع الحبل.
    9. بعد الولادة مباشرة، ضع كل خنزير صغير في كيس بولي إيثين، مع ترك الرأس مكشوفا. يقلل الكيس من فقدان الحرارة، مما يقلل من خطر انخفاض حرارة الجسم.
    10. أعط كمية ثابتة من 0.1 مل من الدوكسابرام (20 ملغ/مل) و0.1 مل من فلومازينيل (0.1 ملغ/مل) داخل العضلة في الرقبة. دوكسابرام يحفز التنفس التلقائي، بينما فلومازينيل، وهو مضاد للبنزوديازيبين، يعكس جزئيا التخدير المنقول من الخنزير أثناء العملية القيصرية.
    11. انقل الخنازير الصغيرة إلى وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة.
  2. الإنعاش، العشوائية، والقسطرة
    1. وزن وتحديد جنس كل خنزير صغير عند نقله إلى وحدة العناية المركزة لحديثي الولادة.
    2. بالنسبة للخنازير الصغيرة التي لا تستطيع التنفس بشكل تلقائي، قم بإجراء الإنعاش بشكل فردي. كرر جرعات دوكسابرام و/أو فلومازينيل، وقدم تهوية بالضغط الإيجابي حسب الحاجة لتثبيت التنفس.
    3. بمجرد أن تصبح الخنازير الصغيرة مستقرة فسيولوجيا وأثناء التخدير المنقول من الأم، استخدم تقنية المعقم لإدخال قسطرة شريانية سرية (أنبوب تغذية PVC 4 Fr) في أحد شرايين الحبل السري المقطوع. ارفع طرف القسطرة إلى الشريان الأبهر الظهري. ثبت القسطرة على الجلد بالغرز وربطها بخط تسريب لتوفير التغذية الوريدية.
      ملاحظة: في الخنزير الخدج، يعد الإعطاء داخل الشريان هو المعيار المعتمد على الوريد السري لتجنب النخر الكبدي المحتمل الناتج عن خطر خطأ في طرف القسطرة داخل نسيج الكبد بدلا من القناة الوريدية21.
    4. قم بتصنيف الخنازير الصغيرة حسب وزن الولادة والجنس ووزعها عشوائيا في مجموعات العلاج.
  3. ظروف السكن
    1. ضع كل خنزير صغير بشكل منفصل في حاضنة مدفأة ومبطنة مع تهوية مضبوطة.
    2. قدم أكسجين إضافيا (1–2 لتر/دقيقة) لمدة تصل إلى 12 ساعة بعد الولادة لمنع نقص الأكسجين.
    3. راقب درجة حرارة المستقيم خلال أول 12 ساعة بعد الولادة. قم بضبط ظروف التسخين حسب الحاجة للحفاظ على درجة حرارة النواة بين 38–39 درجة مئوية (الهدف: 38.5 درجة مئوية).
      ملاحظة: من المتوقع حدوث فترة قصيرة من انخفاض حرارة الجسم فور الولادة وأثناء وضع القسطرة.

2. التطعيم السلبي عبر حقن البلازما

ملاحظة: بما أن الخنازير لا تنقل الغلوبولينات المناعية عبر المشيمة، يجب توفير تطعيم سلبي جزئي للتجارب التي تستمر أكثر من 24 ساعة لمنع العدوى التلقائية.

  1. اجمع دم الأم من الخنزيرة بعد الولادة القيصرية في وعاء معقم مغطى بالهيبارين. قم بعمل الطرد المركزي في أنابيب فالكون المعقمة عند 4 درجات مئوية، 2500 × جرام، لمدة 10 دقائق، وكرر العملية مرة واحدة. بعد الفصل، اجمع البلازما بعناية في أنابيب فالكون المعقمة الجديدة وتخزينها عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  2. خلال 12 ساعة من الولادة، يتم إعطاء البلازما بجرعة 8 مل/كجم كعملية تسريب مستمرة داخل الشريان لمدة 30 دقيقة باستخدام مضخة تسريب مستمرة.

3. تحفيز العدوى التجريبية

ملاحظة: يمكن تحفيز العدوى التجريبية إما بعد 3–4 ساعات من الولادة أو في اليوم الثالث بعد الولادة.

  1. تحضير التعليق البكتيري
    1. قم بإذابة قارورة S . epidermidis المجمدة (WT-1457، 15–25٪ جلسرول) في درجة حرارة الغرفة. دوامة لفترة وجيزة (2–3 ثوان) للحصول على تعليق متجانس.
      ملاحظة: وفقا لتصنيف مجموعة الخطر للعوامل المعدية، يصنف S. epidermidis ككائن ميكروي من مجموعة المخاطر الأولى حسب منظمة الصحة العالمية. الكائنات الدقيقة من فئة المخاطر الأولى التابعة لمنظمة الصحة العالمية من غير المرجح أن تسبب أمراضا بشرية ولا تتطلب اعتبارات خاصة.
    2. جهز مزرعة ليلية عن طريق تلقيح 20 مل من مرق تسريب القلب الدماغي (BHI) مع 5 ميكرولتر من مخزون S. epidermidis المذائب في قارورة إيرلينماير معقمة بسعة 100 مل. الحضانة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز مداري عند 180 دورة في الدقيقة لمدة ~16 ساعة، مما يسمح للثقافة بالوصول إلى المرحلة الثابتة. تضمين التحكم في مرق BHI غير المطعم تحت ظروف متطابقة للتحقق من التعقيم المتوسط.
    3. جهز مزرعة جديدة عن طريق تلقيح 20 مل من مرق BHI ب 200 ميكرولتر من الزراعة الليلية (تخفيف 1:100) في قارورة إيرلينماير معقمة بسعة 100 مل. جهز كمية كافية من الزراعة لإصابة جميع الخنازير الصغيرة (انظر الحسابات في الخطوات 3.1.4 – 3.1.6). الحضانة عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز المدار بسرعة 180 دورة في الدقيقة لمدة 2.5 ساعة، حتى تصل البكتيريا إلى مرحلة النمو اللوغاريتمي المبكرة (الشكل الإضافي 1A).
    4. تقدير حجم الزراعة الكلي المطلوب لإصابة جميع الخنازير الصغيرة بناء على الجرعة المستهدفة المعدلة، ومتوسط وزن الجسم، وعدد الصغار، وكثافة التربية.
    5. افترض أن الزراعة ستصل إلى كثافة بصرية عند 600 نانومتر (OD) بمقدار ≥1 (الشكل التكميلي 1B) بعد فترة حضانة 2.5 ساعة، واستخدم معدل تحويل محدد ل OD يبلغ 1 = 3 × 10وحدات تكوين مستعمرات (CFU)/مل.
    6. أضف 15٪ زيادة في حجم التكاليف لتعويض خسائر التعامل مع النفقات. احسب حجم الزراعة المقدر باستخدام الصيغة:
      تقدير V = [الجرعة المستهدفة (CFU/kg BW) × وزن بني) × وزن × N × 1.15] / 3 × 108 CFU/mL (1)
      حيث:
      تقدير V = حجم الزراعة الكلي المقدر المطلوب (mL)
      الوزن الزائد = متوسط وزن جسم الخنزير الصغير (كجم)
      N = إجمالي عدد الخنازير الصغيرة
    7. بعد الحضانة، حدد مقدار جرعة الزراعة الزائدة. قم بتخفيف العينة حسب الحاجة للحفاظ على القراءات ضمن النطاق الخطي للمقياس الطيفي.
    8. احسب حجم الزراعة النهائي المطلوب لتحقيق تركيز CFU المستهدف باستخدام الصيغة:
      Vالنهائي = OD1 · تقدير V / الكمية الزائدة المقاسة (2)
      حيث:
      VFinal = حجم الزراعة النهائي المطلوب (mL)
    9. انقل VFinal المحسوب إلى أنابيب فالكون بسعة 50 مل وجهاز طرد مركزي بحرارة 3000 × جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    10. تخلص من السوبرناتانت بعناية.
    11. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 3 x VFinal من محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ للتحضير للإعطاء داخل الشريان (3 مل/كجم وزن الجسم خلال 3 دقائق). تأكد من أن الحل خال من التجميعات.
    12. جهز محاقن تسريب بسعة 50 مل باستخدام التعليق البكتيري.
    13. جهز حقنة تسريب منفصلة بسعة 50 مل مع محلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪ للأشخاص غير المصابين.
  2. إجراء العدوى
    1. أعط التعليق البكتيري أو محلول ملحي معقم لكل خنزير صغير عبر القسطرة الشريانية السرية باستخدام مضخة تسريب مضبوطة لإعطاء الجرعة المستهدفة خلال 3 دقائق. حافظ على فاصل 5 دقائق بين الخنازير الصغيرة المتتالية.
    2. مباشرة بعد العدوى، ابدأ بحقن مستمر من التغذية الوريدية لغسل القسطرة وضمان توصيل الجرعة بالكامل.
    3. تأكد من الجرعة عن طريق حفظ التعليق البكتيري عند 4 درجات مئوية. لاحقا، يمكن تخفيف هذا القرص وتثبيته على ألواح الأجار الدموية لتحديد كثافة البكتيريا (انظر الخطوة 8)

4. التغذية الدورية

  1. توفير تغذية وريدية كاملة (TPN) للخنازير الصغيرة طوال مدة التجربة. على سبيل المثال، استخدم كيس TPN بشري بثلاث حجرات، مثل Kabiven بسعة 1900 سعرة حرارية، معدل لتلبية متطلبات المغذيات الكبرى للخنازير الصغيرة حديثي الولادة.
  2. حضر محلول التغذية الوريدية في ظروف معقمة.
    1. أزل 300 مل من غرفة الجلوكوز.
    2. أزل 70 مل من غرفة الدهون.
    3. أضف 155 مل من الجلوكوز بنسبة 50٪ إلى غرفة الجلوكوز.
    4. أضف 214 مل من فامين إلى غرفة الجلوكوز.
    5. أضف 150 مل من الماء المعقم إلى غرفة الجلوكوز.
    6. أضف 0.1 مل من الهيبارين (5000 IE/mL) إلى غرفة الجلوكوز.
    7. اخلط محتويات الغرف الثلاث جيدا.
      ملاحظة: ينتج عن ذلك محلول تغذية وريدية يحتوي على تركيبة المغذيات الكبرى الموضحة في الجدول 1. استخدم هذه التركيبة كنظام غذائي قياسي للتحكم عند تقييم تأثيرات الأنظمة الغذائية البديلة على استجابات العدوى.
    8. احتفظ بالتغذية الوريدية عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. حضر المحلول على دفعات، ولا تستخدمه بعد 48 ساعة من التحضير.
      ملاحظة: يمكن تعديل النموذج لتقييم تأثيرات التغذية المعوية وتحفيز الأمعاء عن طريق تركيب أنابيب تغذية فمائية للخنازير الصغار.
  3. توصيل التغذية الوريدية
    1. املأ حقن التسريب المعقمة بسعة 50 مل بالتغذية الوريدية وحقنه باستمرار عبر القسطرة داخل الشريان باستخدام مضخة التسرب.
    2. اضبط معدل التسريب على 6 مل/كجم/ساعة. وزن الخنازير الصغيرة يوميا وعدل الجرعة حسب الوزن المحدث للجسم.
      ملاحظة: للدراسات طويلة الأمد، إذا لوحظ وذمة محيطية (فرط الترطيب)، قلل معدل التسريب إلى 4 مل/كغ/ساعة.
    3. راقب مضخات التسريب بانتظام لضمان أن الحقن لا تفرغ. أعد تعبئة الحقن حسب الحاجة.

5. المراقبة السريرية

  1. قيم الخنازير الصغيرة بانتظام طوال الدراسة لتحديد ما إذا كان هناك حاجة لاتخاذ إجراء. بعد حقن البكتيريا، يجب مراقبة الحيوانات كل ساعة إلى ساعتين من قبل موظفين ذوي خبرة حتى يتم التخطيط لعملية القتل الرحيم.
    ملاحظة: التدهور السريري، وهو التطور من عدم ظهور أعراض إلى نقاط نهاية إنسانية، يمكن أن يحدث بسرعة خلال 30–60 دقيقة.
    1. لاحظ الأعراض المتعلقة بالتنفس، بما في ذلك تسارع التنفس، ضيق التنفس، الزرقة، والتنفس المضطرب.
      ملاحظة: في حالات نقص الأكسجين (تشبع الأكسجين < 80٪)، يجب بدء أو زيادة إمداد الأكسجين.
    2. لاحظ الأعراض المتعلقة بالدورة الدموية، بما في ذلك تغير اللون، وبرودة الأطراف، وطول فترة إعادة تعبئة الشعيرات الدموية، وتسرع القلب، وبطء القلب.
    3. راقب الأعراض المرتبطة بالنشاط، بما في ذلك الخمول، وعدم القدرة على الوقوف أو المشي (ذات صلة من اليوم الثالث بعد الولادة)، وردود الفعل تجاه محفزات الألم.
    4. لاحظ الأعراض المتعلقة بالتخثر، مثل النزيف العضلي أو النزيف الخلفي في الجلد. اضغط بلطف على المناطق المتغيرة اللون؛ إذا لم يتحول الاحمرار، صنف النتيجة كنزيف جلدي.
  2. إذا لوحظت أعراض سريرية، قم بإجراء قياسات لغازات الدم لتقييم الرقم الهيدروجيني، واللاكتات، وتشبع الأكسجين، والضغط الجزئي لثاني أكسيد الكربون بالنسبة للقيم الأساسية (انظر الخطوة 6.3).
    ملاحظة: قد يستخدم المراقبة السريرية المستمرة (مثل ضغط الدم، معدل ضربات القلب، ومعدل التنفس) لكنها لا تستخدم بشكل روتيني في هذه التجارب.

6. أخذ عينات الدم

ملاحظة: يمكن إجراء أخذ عينات دم طولية في الخنازير الصغيرة عبر القسطرة داخل الشريان أو عن طريق الوريد الوريدي الوداجي. يجب ألا يتجاوز حجم الدم المأخوذ 7.5٪ من إجمالي حجم الدم المقدر (~7٪ من وزن الجسم). يجب أن تلتزم جميع إجراءات أخذ عينات الدم بالإرشادات الأخلاقية المحلية.

  1. أخذ عينات دم القسطرة داخل الشريان
    1. باستخدام يدين نظيفتين ومغطاتين بالقفازات، ابدأوا بالوصول إلى منفذ القسطرة. قم بتعقيم موقع الوصول بالإيثانول قبل الافتتاح. تجنب تلوث خط التسريب.
    2. اسحب ما لا يقل عن 2 مل من الدم وضعه جانبا، لأن هذا الحجم قد يكون ملوثا بالتغذية الوريدية من خط التسريب. حافظ على تعقيم العينة المسحوبة.
    3. اجمع حجم الدم المطلوب للتحليل. على سبيل المثال، يجب جمع الدم لتحليل أمراض الدم في أنابيب مغطاة ب EDTA، بينما يجب الحصول على عينات لتحليل غازات الدم باستخدام حقن مغطاة بالهيبارين.
    4. بعد الانتهاء من أخذ العينة، أعد حقن 2 مل من الدم المسحوب في البداية في الخنزير الصغير وأعد توصيل القسطرة بعناية بخط التغذية الوريدية.
  2. أخذ عينات دم من ثقب الوداجي
    1. أخرج الخنزير الصغير من الحاضنة وضعه في وضعية الاستلقاء الظهرية لكشف منطقة الرقبة. قيد الخنزير الصغير بإحكام لمنع الحركة والسماح له بالوصول الآمن إلى الوريد الوداجي.
      ملاحظة: يرتبط الورد الوداجي بمخاطر محتملة، بما في ذلك النزيف، وتكون الورم الدموي، وضعف مجرى الهواء. يجب موازنة قرار إجراء هذا الإجراء بعناية مقابل الأهمية العلمية للنتائج.
    2. حدد الموقع التشريحي التقريبي للوريد الوداجي وتعقيم موقع الثقب بالإيثانول.
    3. قم بإجراء الورد الوريدي الوداجي باستخدام نظام فاكوتينر وجمع حجم الدم المطلوب. على سبيل المثال، اجمع 0.2 مل من الدم واحتفظ بالعينة عند 4 درجات مئوية حتى يتم الطلاء بالبكتيريا.
    4. اضغط على موقع الورد حتى يتم الوصول إلى الوردة الدموية. ثم أعد الخنزير الصغير إلى الحاضنة الخاصة به.
    5. استمر في مراقبة الخنزير الصغير بحثا عن علامات النزيف المتجدد. إذا حدث نزيف كبير، قم بقتل الخنزير الصغير. راقب أيضا وجود ورم دموي تحت الجلد أو نزيف داخلي قد يضعف مجرى الهواء.
  3. قياسات غازات الدم
    1. افحص عينة الدم في الحقنة الهيبارينية بحثا عن فقاعات هواء. إذا كانت هناك فقاعات، قم بطردها أو إخراجها بلطف عن طريق النقر على الحقنة لتجنب تغيير قياسات الغاز.
    2. انقل العينة إلى محلل غازات الدم واتبع تعليمات الشركة المصنعة. تأكد من معالجة العينة بسرعة للحفاظ على الدقة.

7. معايير الإنتان ونقاط النهاية الإنسانية

  1. قم بقتل الخنازير الصغيرة عند الوصول إلى نقاط إنسانية محددة مسبقا تدل على تعفن الدم.
    ملاحظة: للأمراض الأخرى أو الإصابات العلاجية، يرجى الرجوع إلى الإرشادات الأخلاقية المحلية لنقاط النهاية الإنسانية.
    1. استخدم درجة حموضة الدم كمؤشر رئيسي لتعفن الدم والنقطة الأساسية للإنسان. قم بقتل الخنازير الصغيرة ذات درجة حموضة الدم ≤ 7.1 فورا. بالنسبة للخنازير الصغيرة ذات درجة حموضة الدم ≤ 7.2، كرر قياسات غازات الدم كل 15-30 دقيقة وراقب نقاط النهاية الإنسانية الثانية.
    2. كنقطة نهاية ثانوية إنسانية، يتم القتل الرحيم للخنازير الصغيرة بغض النظر عن درجة حموضة الدم عند ظهور التخثر المنتشر داخل الأوعية الدموية، بما في ذلك النزيف الداخلي أو النزيف الداخلي، توقف التنفس، الخمول الشديد، و/أو عدم الاستجابة لمحفزات الألم (يتم تأكيده بغياب رد فعل الانسحاب بعد قرصة خفيفة في المساحة بين الأرجل باستخدام الملقط التشريحي).
  2. تخدير الخنزير الصغير عن طريق الحقن العضلي لخليط قائم على الزوليتيل (0.1 مل/كجم).
    ملاحظة: أعد تركيب قارورة واحدة من زوليتيل 50 فيت (تيليتامين 125 ملغ، زولازيبام 125 ملغ) إلى 10 مل باستخدام 6.25 مل زيلازين (20 ملغ/مل)، 1.25 مل كيتامين (100 ملغ/مل)، و2.5 مل بوتورفانول (10 ملغ/مل). التركيزات النهائية هي 12.5 ملغ/مل لكل من التيليتامين، الزولازيبام، الزيلزين، الكيتامين، و2.5 ملغ/مل من البوتورفانول.
  3. تأكيد عمق التخدير المناسب من خلال غياب رد فعل انسحابي استجابة لمحفز مؤلم (انظر الخطوة 7.1.2).
  4. إجراء القتل الرحيم عن طريق الحقن داخل القلب بجرعة زائدة من بنتوباربيتال الصوديوم (3 مل/كغ؛ 400 ملغ/مل).
    ملاحظة: قد يتم أخذ عينات دم داخل القلب قبل القتل الرحيم باستخدام نظام فاكوتينر.

8. الطلاء البكتيريا والقياس الكمية

  1. قم بقياس كثافة بكتيريا الدم باستخدام عينات من الورد الوداجي الذي تم جمعه خلال التجربة وعينات ثقب القلب التي جمعت أثناء القتل الرحيم.
    ملاحظة: لا تستخدم الدم المسحوب من القسطرة الشريانية، فقد تحتوي على بكتيريا متبقية من العدوى التجريبية الأولية، مما قد يربك القياسات.
    1. جهز لوحة أغار دم الغنم لكل عينة دم، وضع علامات على الأرباع 0، -1، -2، و-3 في الأسفل، ووضع علامة على اللوحة برقم تعريف الحيوان ونقطة الزمن.
    2. باستخدام 50 ميكرولتر من الدم من كل عينة، حضر تخفيفات بمقدار 10 مرات من 10-1، 10-2، و10-3 في 450 ميكرولتر من PBS المعقمة في أنابيب الطرد المركزي الدقيق بحجم 1.5 مل.
    3. ضع كل لوحة بثلاث قطرات بحجم 20 ميكرولتر من التخفيف المقابل في الربع المخصص، مع تباعد قطرات لتجنب التلامس أو الانتقال ومنع التنفس الجوي.
    4. تحتضن الصحون طوال الليل عند 37 درجة مئوية، ثم تخزن الألواح عند 4 درجات مئوية حتى يتم العد.
    5. عد جميع مستعمرات البكتيريا في التخفيف الذي يحتوي على حوالي 10 مستعمرات في كل بقعة. تشمل فقط مستعمرات S. epidermidis، التي تكون عادة بيضاء ودائرية وذات حواف ناعمة. افحص وسجل بعناية أي مستعمرات ذات شكل متغير في الشكل، حيث قد تشير هذه إلى وجود تلوث، مثل أخذ العينات. احسب CFU/mL باستخدام المعادلة التالية:
      (CFU/mL) = [(عدد المستعمرات · عامل التخفيف)/(3 · 20 μلتر)] · [1000μلتر/مل] (3)

النتائج

تم إجراء تجربة جرعة-استجابة على خنازير خدج تم تربيتها حتى اليوم الخامس بعد الولادة (الشكل 1). في اليوم الثالث بعد الولادة، تلقت الخنازير الصغيرة جرعة منخفضة من S. epidermidis (109 CFU/kg، n = 9)، أو جرعة عالية من S. epidermidis (5 ×10 9 CFU/kg، n = 9)، أو محلول ملحي كضابط (n = 3)، وتمت مراقبتها لمدة 44 ساعة.

بعد حقن S. epidermidis ، ظل عبء البكتيريا في الدم أعلى طوال فترة المتابعة التي استمرت 44 ساعة في الخنازير الصغيرة التي تلقت الجرعة العالية مقارنة بالمجموعة منخفضة الجرعة (الشكل 2A، P < 0.05). فقط الخنازير الصغيرة في مجموعة الجرعات العالية (3/9) طورت تعفن الدم، وبدأ الظهور بعد حوالي 12–15 ساعة من العدوى (الشكل 2B). تماشيا مع ذلك، أظهرت الخنازير الصغيرة التي تلقت جرعة عالية من S. epidermidis انخفاض في درجة حموضة الدم عند 12 ساعة (الشكل 2C، P < 0.001)، مصحوبة بزيادة ملحوظة في الضغط الجزئي لثاني أكسيد الكربون (pCO₂) (الشكل 2D، P < 0.01)، مقارنة بالمجموعة ذات الجرعات المنخفضة.

خلال المرحلة الحادة من العدوى (6 ساعات)، أظهرت كلتا المجموعتين المصابتين فائض قاعدة أقل ومستويات لاكتات أعلى مقارنة بمجموعة السيطرة الملحة، مع تغييرات أكثر وضوحا استمرت حتى 12 ساعة في مجموعة S. epidermidis ذات الجرعة العالية (الشكل 2E، F، P < 0.01 – 0.05). لم تختلف مستويات الجلوكوز في الدم بين المجموعات (الشكل 2G).

عند 6 ساعات، أظهرت كلتا المجموعتين المصابتين أيضا استنفادا قويا في العدلات الدموية مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المصابة (الشكل 3A، كلاهما P< 0.001). لاحقا خلال مسار العدوى، لوحظ تعويض العدلات في كلتا المجموعتين المصابتين، لكنه كان أكبر في مجموعة S. epidermidis منخفضة الجرعة (الشكل 3A، P < 0.05). أصيب كلتا المجموعتين المصابتين بنقص التخثر خلال التجربة؛ ومع ذلك، انخفض عدد الخلايا الخثرية مبكرا وبشكل أكثر وضوحا في مجموعة S. epidermidis ذات الجرعات العالية مقارنة بكل من مجموعة الجرعات المنخفضة والمجموعة غير المصابة (الشكل 3B، P < 0.01–0.05). كانت مستويات البلازما من TNF-α وIL-6 وIL-10 مرتفعة في كلتا المجموعتين المصابتين بعد 6 و12 ساعة من الإصابة مقارنة بالمجموعات الضابطة (الشكل 3C، P < 0.001–0.05). عند 24 ساعة، بقيت مستويات TNF-α وIL-10 في البلازما مرتفعة فقط في مجموعة S. epidermidis ذات الجرعة العالية مقارنة بالمجموعة غير المصابة (P < 0.05)، بينما بحلول 44 ساعة، بقيت مستويات TNF-α فقط مرتفعة (P < 0.05).

في حالة القتل الرحيم، عندما وصلت الخنازير الصغيرة إلى نقاط نهاية إنسانية أو تم إعدامها في نقطة زمنية محددة وهي 44 ساعة بعد العدوى، تم قياس مستويات البلازما من المتفاعلات السلبية في المرحلة الحادة وعلامات إصابة الأعضاء (الشكل 4A–G). من بين هذه المواد، كان الكوليسترول (وهو متفاعل طور حاد سلبي) أقل بشكل ملحوظ في الخنازير الصغيرة المصابة بجرعة عالية من S. epidermidis مقارنة بالمجموعة ذات الجرعات المنخفضة (الشكل 4B، P < 0.05). كانت مستويات مؤشرات إصابة الكبد، بما في ذلك إنزيم الألانين أمينوترانسفيراز وإنزيم الأسبارتات أمينوترانسفيراز، بالإضافة إلى مؤشرات إصابات الكلى مثل الكرياتينين ونيتروجين اليوريا في الدم، أعلى عدديا في مجموعة S. epidermidis ذات الجرعات العالية مقارنة بمجموعة الضابطين غير المصابين (الشكل 4D–G).

figure-results-1
الشكل 1: التصميم التجريبي. تم ولادة خنازير صغيرة خدجا عن طريق الولادة القيصرية في 90٪ من فترة الحمل. في اليوم الثالث بعد الولادة، تلقت الخنازير الصغيرة حقنة داخل الشريان من S. epidermidis الحي عند 109 أو 5 × 109 وحدة CFU/كجم، أو محلول ملحي كنوع من الضابطة. بعد الإصابة، تم مراقبة الخنازير الصغيرة لمدة 44 ساعة، مع أخذ عينات دم طولية في نقاط زمنية محددة. شخصية تم إنشاؤها باستخدام Biorender.com. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: عبء البكتيريا الدموية، والبقاء على قيد الحياة، ومعايير غازات الدم في الخنازير الخدج بعد حقن شرياني بالمحلول الملحي (CON) أو العدوى ب S. epidermidis الحي. (أ) كثافة S. epidermidis في عينات الدم المجمعة بعد 6 و24 و44 ساعة من العدوى. (ب) منحنيات البقاء التي تظهر الوقت للوصول إلى نقطة نهاية إنسانية أو القتل الرحيم المجدول بعد 44 ساعة من العدوى. (C–G) معايير غازات الدم الشريانية عند 0، 6، 12، 24، و44 ساعة بعد العدوى. تعرض البيانات كمتوسط ± SD. (A)، منحنيات البقاء (B)، أو مخططات نقاط الكمان بما في ذلك الوسيط (الخط الصلب) وIQR (الخطوط المنقطة) (C–G). n = 9 لكل مجموعة مصابة؛ n = 3 للمجموعة غير المصابة. تم تحليل البيانات باستخدام نموذج خطي مختلط التأثيرات يشمل تفاعلات زمن × المجموعة (A، C–G) أو نموذج المخاطر النسبية لكوكس (B). *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001. الاختصارات؛ CON = التحكم; pCO2 = الضغط الجزئي لثاني أكسيد الكربون2؛ SE = S. epidermidis. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: العلامات الالتهابية المنتشرة في الخنازير الخديقة بعد حقن شرياني بالمحلول الملحي (CON) أو العدوى ب S. epidermidis الحي . (A, B) عد العدلات والصفائح الدموية المتداولة عند 6، 12، 24، و44 ساعة بعد العدوى. (ج) مستويات البلازما ل TNF-α وIL-6 وIL-10 عند 6 و12 و24 و44 ساعة بعد العدوى. تعرض البيانات كمخططات نقاط للكمان تشمل الوسيط (الخط الصلب) وIQR (الخطوط المنقطة) (A–C). n = 9 لكل مجموعة مصابة؛ n = 3 للمجموعة غير المصابة. تم تحليل البيانات باستخدام نموذج خطي مختلط التأثيرات يشمل تفاعلات × الزمنية الجماعية (A–C). *P < 0.05، **P < 0.01، ***P < 0.001. الاختصارات؛ CON = التحكم; IL = إنترلوكين؛ SE = S. epidermidis; TNF = عامل نخر الورم. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: معايير البلازما الكيميائية الحيوية في الخنازير الخديقة بعد الحقن الشرياني بالمحلول الملحي (CON) أو العدوى ب S. epidermidis الحي (109 أو 5 × 109 CFU/kg). (A–G) مستويات الألبومين، الكوليسترول، ALP، ALAT، ASAT، الكرياتينين، وBUN في البلازما عند النهاية الإنسانية أو عند القتل الرحيم المجدول بعد 44 ساعة من العدوى. تعرض البيانات كمخططات شواربية تظهر النطاق الكامل (من الحد الأدنى إلى الأقصى) (A–G). تشير نقاط البيانات الفردية باللون البنفسجي الداكن إلى خنازير صغيرة أصيبت بتعفن الدم. n = 9 لكل مجموعة مصابة؛ n = 3 للمجموعة غير المصابة. تم تحليل البيانات باستخدام نموذج الانحدار الخطي المتعدد (A–G). *P < 0.05. الاختصارات؛ ALAT = ألانين أمينوترانسفيراز؛ ALP = الفوسفاتاز القلوية؛ ASAT = إنزيم الأسبارات أمينوترانسفيراز؛ BUN = اليوريا في الدم نيتروجين؛ CON = التحكم; SE = S. epidermidis. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المبلغ الإجماليالتركيز
الطاقة7762kJ3525kJ/L
المغذيات الكبرى
الأحماض الأمينية92g42g/L
الدهون66g30g/L
الجلوكوز221g100g/L
المغذيات الدقيقة
نا64MMOL29mmol/L
K48MMOL22mmol/L
MG8MMOL4mmol/L
كاي4MMOL2mmol/L
PO418MMOL8mmol/L
SO48MMOL4mmol/L
Cl93MMOL42mmol/L
الأسيتات78MMOL35mmol/L

الجدول 1: تركيب التغذية الوريدية الكلية المعدلة. الكميات والتركيزات الإجمالية للطاقة، والمغذيات الكبرى (الأحماض الأمينية، الدهون، والجلوكوز)، والمغذيات الدقيقة في محلول التغذية الوريني.

الشكل الإضافي 1: حركيات نمو S. epidermidis WT-1457. تم زراعة البكتيريا في مرق تسريب القلب في الدماغ عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز الحجاج عند 180 دورة في الدقيقة. تم قياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر مع مرور الوقت. تعرض البيانات على مقياس لوغاريتمي (A) ومقياس خطي (B) (n = 3 تجارب مستقلة). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

تم تصميم نموذج تعفن موحد لحديثي الولادة في الخنازير الخدج لدراسة عدوى بكتيرية جهازية تحت ظروف ذات صلة سريرية لعدم نضج حديثي الولادة. يجمع النموذج بين التحكم في عمر الحمل، والإحياء، ودعم العناية المركزة، وتوقيت العدوى، وأخذ عينات الدم الطولية. يهدف هذا النهج إلى سد الفجوة بين أنظمة التجارب على القوارض والمختبر والفسيولوجيا المعقدة التي يواجهها الرضع حديثي الولادة المصابين. ومن المهم أن هذا النموذج استخدم لتأكيد الارتباط المعروف بين الجنس، وانخفاض وزن الولادة، وسن الحمل، مع الحساسية للتعفن التي لوحظت لدى الأطفال الخدج16، 17، 18.

تعد الخنازير نموذجا ذو صلة كبيرة للحيوانات الكبيرة في أبحاث العدوى بسبب التشابهات الكبيرة مع البشر في وظيفة المناعة والفسيولوجيا. تظهر المكونات الرئيسية للجهاز المناعي الفطري، بما في ذلك مجموعات الكريات البيضاء وإشارات مستقبلات التعرف على الأنماط، واستجابات السيتوكين، تطابقا وثيقا بين الخنازير والبشر. الفروق المناعية الرئيسية بين الخنازير الصغيرة حديثة الولادة والبشر تكمن في الاستجابات المناعية التكيفية. نظرا لعدم وجود نقل عبر المشيمة لغلوبولين المناعي G (IgG) خلال حمل الخنازير، يولد الصغار حديثي الولادة ساذجا فيهذا الصدد. وبالمثل، بينما لا تخضع خلايا B للرضع لتحول متساوي الشكل من IgM إلى IgG قبل عمر 3–6 أشهر، فإن خلايا B الخنازيرية قادرة على تنفيذ استجابات IgG بعد الولادة بفترة وجيزةفي سن 20.

في هذا النظام النموذجي، يتم التخفيف من هذه الفروقات عن طريق تحفيز العدوى بعد الولادة مباشرة، قبل حدوث استجابات مناعية تكيفية، وتزويد الغلوبولينات المناعية للأم عبر نقل البلازما. يؤدي هذا النهج إلى مستويات IgG في الدوران مشابهة للرضع الخدج جدا المولودين حديثي الولادة الذين يتعرضون لانقطاع نقل IgG عبر المشيمة بسبب الولادة المبكرة17. بالإضافة إلى ذلك، فإن حجم الجسم الكبير نسبيا عند الولادة (~800 جم) يعزز النموذج أكثر مقارنة بالفئران حديثة الولادة (~3 جم). نتيجة لذلك، فإن التأثيرات البيئية مثل درجة الحرارة والرطوبة وتوتر الأكسجين تشبه إلى حد كبير تلك التي يعاني منها حديثي الولادة البشر. يتيح هذا المقياس أيضا استخدام معدات سريرية، ومراقبة جراحية، ووسائل رعاية داعمة مثل الوصول الوعائي، ودعم التنفس، والمراقبة الفسيولوجية المستمرة، وهي غير ممكنة في نماذج القوارض الوليدة. على وجه التحديد، يتم الوصول الوعائي للحقن مثل التغذية الوريدية في نموذج الخنازير المبكر عبر قسطرة شريانية سرية. بينما يختلف هذا عن الطريقة الوريدية القياسية المستخدمة في طب حديثي الولادة السريري، إلا أنه ضروري بسبب القيود التشريحية للخنازير الخديجة، حيث نادرا ما تعبر قساطر الأوردة السرية قناة الوريد بشكل تلقائي، بل تتراكم بشكل غير مستقر داخل نسيج الكبد21. يوفر التوصيل داخل الشريان مسارا موثوقا وقابلا للتكرار للحقن المستمر دون الخطر العالي لحدوث نخر كبدي مرتبط بخلل في الوريد السري. وبالمثل، يسمح ذلك بأخذ عينات من الدم الشرياني لتحليل غازات الدم.

العدوى الجهازية في هذا النموذج تحدث عن طريق التسريب داخل الشريان لجرعة S. epidermidis الحية، وهي سبب رئيسي لبداية الإنتان المتأخر في وحدات العناية المركزة لحديثي الولادة 1,2. ومع ذلك، فإن مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض تسبب تعفن الدم الوليدي، كما أن المكورات العنقودية السلبية للتخثر، مثل S. epidermidis، معروفة أيضا بأنها تسبب عدوى أقل حدة وخطر أقل للتعفن مقارنة بمسببات الأمراض الأخرى الأكثر ضراوة، مثل الإشريكية القولونية 1,2. بينما يستخدم النموذج ممرض منخفض الضراوة، تعكس التدهور السريري الملحوظ، والتنشيط الالتهابي، وعدم الاستقرار الفسيولوجي علامات رئيسية لتعفن الدم الوليدي. تعد مجموعة الضابط غير المصابة (n = 3) في هذه الدراسة مرجعا أساسيا لإظهار الحالة الفسيولوجية للخنازير الخديقة "الصحية" تحت ظروف العناية المركزة المتطابقة. بينما يؤدي ذلك إلى خلل في التصميم، تهدف هذه المقارنات إلى تمثيل استجابة المضيف للعدوى. كما هو موضح في الشكل 2، كان هناك علاقة جرعة-استجابة واضحة مع زيادة جرعات S. epidermidis، بما يتوافق مع النتائج السابقة في الخنازير الصغيرة المصابة في اليوم الأول من الحياة22. فقط الخنازير الصغيرة التي تلقت أعلى جرعة من S. epidermidis تدهورت حتى وصلت إلى النهاية الإنسانية التي تتطلب القتل الرحيم. ومع ذلك، طورت كلتا المجموعتين المصابتين الحماض الأيضي، بينما لوحظ وجود مكون تنفسي كبير (ارتفاع pCO₂) فقط في مجموعة S. epidermidis ذات الجرعة العالية. وبالمثل، أظهرت كلتا المجموعتين ضعف العدلات الملحوظ بعد 6 ساعات من العدوى، تلاها إعادة تعبئة العدلات بعد 24 ساعة، وكان ذلك أكبر في مجموعة الجرعات المنخفضة. كان هناك أيضا تثبيط الصفقات في كلا المجموعتين، مصحوبا بزيادة في السيتوكينات البلازما ومؤشرات إصابات الأعضاء، مع استجابات أكثر وضوحا في الخنازير الصغيرة التي تلقت أعلى جرعة من S. epidermidis.

في الخنازير الصغيرة الخدج، تسبب عدوى S. epidermidis في اليوم الأول بعد الولادة نفس الأعراض السريرية لتعفن الدم الوليدي (الحماض الأيضي، اللوبين اللوبيني، الجلطة الصفيحية، الالتهاب)، بالإضافة إلى الخمول، واعتلال التخثر، واستهلاك المكملات 17,22,23. كما تسبب العدوى اضطرابات جهازية في استقلاب الطاقة، وأبرزها انخفاض الفسفرة التأكسدية للميتوكوندريا، إلى جانب تغييرات في بروتيوم البلازما والاستقلاب مشابهة لتلك المبلغ عنها لدى مرضى الإنتان الوليدي 24,25,26. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخنازير الصغيرة الخديجة (90٪ من الحمل) أكثر عرضة بكثير للإصابة بتعفن الدم مقارنة بالخنازير الصغيرة التي ولدت في السنةالسابعة عشرة كاملة. يؤثر التركيب الغذائي أيضا على الاستجابات السريرية والمناعية. يدفع TPN القائم على الجلوكوز الأيض الجليكوليتيكي، الذي يعزز الاستجابات المناعية الالتهابية، بينما يضعف تحمل الأمراض في الأنسجة الطرفية24,26. يرتبط مزيج هذه الاستجابات بإصابة الأعضاء وتطور النمط الظاهري للتعفن27. تعديل تركيب TPN، سواء عن طريق تقليل محتوى الجلوكوز أو استبدال الجلوكوز بمغذيات بديلة مثل الجالاكتوز أو الأحماض الأمينية الجلوكوجينية أو β-هيدروكسي بيوتيرات28,29، يخفف الاستجابة الالتهابية ويحافظ على تحمل الأنسجة للمرض. كما يؤدي تناول تكميلات عالية للجلوكوز عبر TPN إلى ارتفاع سكر الدم (≈10–20 ملميول). ومع ذلك، لا يزال من غير الواضح إلى أي مدى تكون الاستجابات الالتهابية المرتبطة بالتحلل السكري الملحوظة متأثرة مباشرة بارتفاع مستويات جلوكوز الدم.

تشير الملاحظات التجريبية إلى اختلافات واضحة في الاستجابات السريرية حسب يوم الإصابة بعد الولادة. كل من خطر الإصابة بتعفن الدم وشدة الأعراض السريرية يكونان في أعلى درجات عندما يتم تحفيز العدوى بعد الولادة مباشرة. يؤدي تحفيز العدوى في اليوم الثالث بعد الولادة إلى نمط تعفن أخف مع سلوكيات مرضية، وحماض تنفسي واستقصابي خلال أول 24 ساعة بعد التحفيز، تليها تعافي سريري رغم ارتفاع مؤشرات إصابات الأعضاء. الآليات التي تقوم عليها هذه الفروقات بين الحث المبكر والمتأخر غير معروفة حاليا وتمثل مجالا قيد البحث. ومع ذلك، يتحسن توازن الجلوكوز بعد بدء التغذية الوريدية خلال الأيام الثلاثة الأولى بعد الولادة في الخنازير الخدج، مما يؤدي إلى انخفاض ارتفاع سكر الدم رغم تقاربه تناول الجلوكوز. بشكل عام، يسمح تغيير يوم العدوى بعد الولادة وتوفير الجلوكوز للنموذج بالتقاط سمات الإنتان الحاد والشديد المهدد للحياة أو نمط ظاهري أخف. معا، تتيح هذه التعديلات اختبار التدخلات المستهدفة المصممة خصيصا لأنماط مرضية محددة. يمكن تعزيز التطبيق السريري لهذا النموذج أكثر من خلال مواءماته مع أنظمة تسجيل التقييم المعتمدة المرتبطة بالإنتان النفسي، مثل تقييم فشل الأعضاء التسلسلي لحديثي الولادة (nSOFA). لم يتم تطبيق نظام تسجيل في الوقت الحقيقي القائم على nSOFA في الدراسة الحالية بسبب عدم جدوى المراقبة المستمرة لضغط الدم الشرياني وعدد الصفائح الدموية الفوري المطلوب لتقييم القلب والأوعية الدموية. قد تتضمن التحسينات المستقبلية للبروتوكول إطار عمل nSOFA متكيف لتصنيف شدة المرض بشكل أفضل.

على الرغم من قوته الانتقالية، إلا أن لهذا النموذج عدة قيود مهمة. هذه التجارب تستهلك مواردا كثيفة، وتتطلب مرافق متخصصة وطاقم مدرب تدريبا عاليا لأداء الولادة القيصرية، وإحياء حديثي الولادة، والإسكان بعد الولادة، ورعاية الخنازير الصغيرة الخدج. تتطلب تجارب العدوى أيضا مراقبة مستمرة وعملية من قبل اثنين إلى ثلاثة من الموظفين ذوي الخبرة لضمان رفاهية الحيوانات وجمع البيانات بشكل موثوق، كما أن المتابعة طويلة الأمد تزيد التكاليف. مقارنة بنماذج القوارض، فإن توفر الكواشف الخاصة بالنوع أكثر محدودية، خصوصا في الكيمياء المناعية النسيجية وقياس تدفق الخلية، رغم أن العديد من الأجسام المضادة البشرية يمكن استخدامها بنجاح بعد التحقق المناسب. بالإضافة إلى ذلك، تؤدي طبيعة الخنازير الخارجية إلى تنوع بيولوجي كبير داخل وبين الصغار، مما يستلزم زيادة حجم المجموعات لاكتشاف اختلافات طفيفة في استجابات العدوى. بينما يزيد هذا التباين من تعقيد التجريب، فإنه يعكس أيضا بشكل أوثق التباين الذي لوحظ في مجموعات حديثي الولادة السريريين، مما يعزز الصلة الترجمية للنموذج. في الختام، سيكون هذا البروتوكول المعتمد لتعفن الدم لدى حديثي الولادة أداة مفيدة للتحقيقات المستقبلية في طب حديثي الولادة ولاختبار التدخلات الوقائية والعلاجية الجديدة.

الإفصاحات

لا يوجد لدى المؤلفين تضارب مصالح للكشف عنها.

شكر وتقدير

وقد دعم هذا العمل فريق مجموعة طب الأطفال المقارن في جامعة كوبنهاغن، وتم تمويله من مؤسسة نوفو نورديسك (NNF23OC0085457 و NNF22OC0078747).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
 0.1–10 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790010
1 mL disposable syringes (sterile)e-power150001S
1 mL syringe with 25 G X 16 mm needle (sterile)B. Braun Melsungen AG9161465V
1.5 mL tubesEppendorf30125215
10 mL disposible syringe (sterile)e-power150010S
100 mL Erlenmeyer flasksDuran Wheaton Kimble212162403
1000 μL pipetteSartorius 46880171
12 G “Intraflon 2” needles (sterile)Vygon122.27
16 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300637
18 G X 40 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson303262
19 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG466 5112
2 mL disposible syringe (sterile)e-power150002S
2-0 70 cm suture “ Vicryl plus” (sterile)Johnson & Johnson  VCP453
20 G X 25 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson304827
20 mL disposable syringe (sterile)e-power150020S
20 μL pipetteSartorius46886095
200 μL pipetteSartorius39486615
20G Venflon "Pro" 1.1 x 32 mmBeckton Dickinson393255
21 G x 25 mm Vacutainer blood collection needles (sterile)Becton Dickinson301746
21 G X 40 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG4665643
22 G X 50 mm “Microlance 3” needles (sterile)Becton Dickinson300094
23 G X 25 mm “Medoject” needles (sterile)Chirana T. InjectaCH23100
25 G X 16 mm “Microlance 3” needles (sterile)Beckton Dickinson300600
25 G X 25 mm “Sterican” needles (sterile)B. Braun Melsungen AG9186158
25 mL plastic pipettes (sterile)LP Italian Spa162510
30 mL disposible syringes (sterile)e-power150030S
4L plastic freezer bagsCater.LineABN-105004
5–350 μL pipette tips “Optifit”Sartorius790350
5 mL disposible syringe (sterile)e-power150005S
5 mL syringe (sterile) B. Braun Melsungen AG4617053V
50–1200 μL pipette tips “Optifit”Sartorius791200
50 mL Luer Lock Original Perfusor Syringe B. Braun Melsungen AG8728844F-06
50 mL tubes (sterile)Sarstedt AG and Co. KG62.547.254
82% ethanol + 0.5% chlorhexidine disinfection wipesMediq527497
Atropine "ATROpin" 1 mg/mLAmgros741124
Bandage scissors, stainless steel, 180 mmB. Braun Melsungen AGBC849R
Blood gas machine ABL90Radiometer994-667 (service manual)
Brain Heart Infusion broth (BHI/B)Produced in-houseN.A. Commercially available equivalent product: Brain Heart Infusion Broth (Merck, Cat. No. 53286)
Butorphanol "Butomidor vet" 10 mg/mLVetViva Richter53 19 43
Cell incubator “HeraCell 150i”Thermo Fisher Scientific51032719
Centrifuge, Rotina 380 RHettich 1701
Clinical chemistry system “Advia 2120i”Siemens Healthcare GmbH10488923
Closing cones “Combi-Stopper” (sterile)B. Braun Melsungen AG4495101
Columbia agar + 5% sheep blood platesBioRad63784
Disposable soft underpads, Abri-Soft classicAbena4115
Doxapram-V 20 mg/mLDechra34144/G
EDTA 3 mL collection tubes (sterile)Becton Dickinson368856
Endotracheal tube (12 mm x 55 cm, 150 cc), Silicone, cuffedMilaGVPmL-METC955
Enteral feeding tube 04Fr-L.40cm - PVC (sterile)Vygon310.04Used as umbilical arterial catheter
Ethanol 70% VWR83801.36
Extension line “Q-Style” (sterile)Becton Dickinson385151
Flowmeter for oxygenDamecaP/N 32018-00
Flumaznil 0.1 mg/mLHamelm pharmacy gmbh33659
Gloves, “Gentle Skin” (sterile)Meditrade9021

المراجع

  1. Shane, A. L., Sánchez, P. J., Stoll, B. J. Neonatal sepsis. The Lancet. 390 (10104), 1770-1780 (2017).
  2. Strunk, T., Molloy, E. J., Mishra, A., Bhutta, Z. A. Neonatal bacterial sepsis. The Lancet. 404 (10449), 277-293 (2024).
  3. Wynn, J. L., et al. Time for a neonatal-specific consensus definition for sepsis. Pediatric critical care medicine : a journal of the Society of Critical Care Medicine and the World Federation of Pediatric Intensive and Critical Care Societies. 15 (6), 523-528 (2014).
  4. Schlapbach, L. J., et al. International Consensus Criteria for Pediatric Sepsis and Septic Shock. JAMA. 331 (8), 665-674 (2024).
  5. Fleiss, N., Hooven, T. A., Polin, R. A. Can we back off using antibiotics in the NICU?. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine. 26 (3), 101217 (2021).
  6. Strunk, T., et al. Impaired Cytokine Responses to Live Staphylococcus epidermidis in Preterm Infants Precede Gram-positive, Late-onset Sepsis. Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 72 (2), 271-278 (2021).
  7. Collins, A., Weitkamp, J. H., Wynn, J. L. Why are preterm newborns at increased risk of infection?. Archives of Disease in Childhood - Fetal and Neonatal Edition. 103 (4), F391-F394 (2018).
  8. Kowalski, G. M., Bruce, C. R. The regulation of glucose metabolism: implications and considerations for the assessment of glucose homeostasis in rodents. Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (10), E859-E871 (2014).
  9. Bailey, M., Christoforidou, Z., Lewis, M. C. The evolutionary basis for differences between the immune systems of man, mouse, pig, and ruminants. Veterinary Immunology and Immunopathology. 152 (1-2), 13-19 (2013).
  10. Mair, K. H., et al. The porcine innate immune system: An update. Developmental & Comparative Immunology. 45 (2), 321-343 (2014).
  11. Ezquerra, A., et al. Porcine myelomonocytic markers and cell populations. Developmental & Comparative Immunology. 33 (3), 284-298 (2009).
  12. Gerner, W., Käser, T., Saalmüller, A. Porcine T lymphocytes and NK cells – An update. Developmental & Comparative Immunology. 33 (3), 310-320 (2009).
  13. Meurens, F., Summerfield, A., Nauwynck, H., Saif, L., Gerdts, V. The pig: a model for human infectious diseases. Trends in Microbiology. 20 (1), 50-57 (2012).
  14. Pabst, R. The pig as a model for immunology research. Cell and Tissue Research. 380 (2), 287-304 (2020).
  15. Goldfarb, R. D., Dellinger, R. P., Parrillo, J. E. Porcine models of severe sepsis: emphasis on porcine peritonitis. Shock (Augusta, Ga). 24 Suppl 1 (SUPPL. 1), 75-81 (2005).
  16. Bæk, O., Ren, S., Brunse, A., Sangild, P. T., Nguyen, D. N. Impaired neonatal immunity and infection resistance following fetal growth restriction in preterm pigs. Frontiers in Immunology. 11, 1808 (2020).
  17. Bæk, O., et al. Diet Modulates the High Sensitivity to Systemic Infection in Newborn Preterm Pigs. Frontiers in Immunology. 11, 1019 (2020).
  18. Bæk, O., et al. Sex-Specific Survival, Growth, Immunity, and Organ Development in Preterm Pigs as Models for Immature Newborns. Frontiers in Pediatrics. 9, (2021).
  19. Porter, P. Transfer of immunoglobulins IgG, IgA, and IgM to lacteal secretions in the parturient sow and their absorption by the neonatal piglet. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure. 181 (2), 381-392 (1969).
  20. Butler, J. E., et al. The piglet as a model for B-cell and immune system development. Veterinary immunology and immunopathology. 128 (1-3), 147-170 (2009).
  21. Sangild, P. T., et al. The preterm pig as a model in pediatric gastroenterology. Journal of Animal Science. 91, 4713-6359 (2013).
  22. Brunse, A., Worsøe, P., Pors, S. E., Skovgaard, K., Sangild, P. T. Oral Supplementation with Bovine Colostrum Prevents Septic Shock and Brain Barrier Disruption During Bloodstream Infection in Preterm Newborn Pigs. SHOCK. , 1 (2018).
  23. Krogh, A. K. H., Brunse, A., Thymann, T., Bochsen, L., Kristensen, A. T. Staphylococcus epidermidis sepsis induces hypercoagulability in preterm pigs. Research in veterinary science. 127, 122-129 (2019).
  24. Bæk, O., et al. Altered hepatic metabolism mediates sepsis preventive effects of reduced glucose supply in infected preterm newborns. eLife. 13, (2024).
  25. Wu, Z., et al. Regulation of host metabolism and defense strategies to survive neonatal infection. Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease. 1870 (8), (2024).
  26. Muk, T., Brunse, A., Henriksen, N. L., Aasmul-Olsen, K., Nguyen, D. N. Glucose supply and glycolysis inhibition shape the clinical fate of Staphylococcus epidermidis–infected preterm newborns. JCI Insight. 7 (11), (2022).
  27. Zhong, J., et al. Reduced parenteral glucose supply during neonatal infection attenuates neurological and renal pathology associated with modulation of innate and Th1 immunity. Biochimica et biophysica acta. Molecular basis of disease. 1871 (4), (2025).
  28. Wu, Z., et al. Harnessing systemic glycolysis-TCA cycle axis to boost host defense against neonatal infection. EMBO Molecular Medicine. , (2026).
  29. Bæk, O., et al. Rethinking parenteral nutrition as supportive therapy for neonatal sepsis. Med. , (2026).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

233 233
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة