يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير الزمني لعملية بلعمة الخلايا البلعمية لخلايا سرطان الثدي ثلاثي السلبية الموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر والموجهة بالأجسام المضادة

162 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71461

⸱

أغسطس 14, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة للتصوير الحي للخلايا بنظام الفاصل الزمني (time-lapse) لتصور عملية البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة من قبل الخلايا البلعمية (macrophages) لخلايا سرطان الثدي ثلاثي السلبية المكتسية بالبروتين الفلوري الأخضر، وذلك باستخدام خلايا بلعمية مشتقة من الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي ومجهر آلي.

الملخص

تعد البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة آلية رئيسية تقوم من خلالها البلاعم بابتلاع الخلايا السرطانية المغلّفة بالأجسام المضادة (opsonized). يصف هذا البروتوكول طريقة تصوير الخلايا الحية بفاصل زمني (time-lapse) لتصور عملية البلعمة التي تقوم بها البلاعم المعتمدة على الأجسام المضادة لخلايا سرطان الثدي ثلاثي السلبية التي تعبر عن CD24 والموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر. يتم اشتقاق البلاعم من خلايا الدم المحيطية وحيدة النواة البشرية، وتمايزها باستخدام عامل تحفيز مستعمرات البلاعم، وتوجيهها باستخدام إنترفيرون غاما والليبيد أ متعدد السكاريد لتوليد نمط ظاهري محفز للالتهاب. يتم تغليف الخلايا السرطانية بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ CD24 قبل الزرع المشترك مع البلاعم بنسبة محددة من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة. يتم تسجيل أحداث البلعمة على مدار فترة زمنية تبلغ 16 h باستخدام مجهر آلي مجهز بنظام تحكم بيئي للحفاظ على الظروف الفسيولوجية. يتم التصوير باستخدام قنوات الحقل المضيء والفلورية، مما يسمح بتحديد الخلايا السرطانية ومراقبة استيعابها داخلياً بواسطة البلاعم. وتظهر الصور الممثلة بفاصل زمني الابتلاع التدريجي للخلايا السرطانية الفلورية بمرور الوقت. ولتمكين التقييم الكمي، يتم إجراء اختبار نقطة نهاية موازٍ تحت ظروف زرع مشترك متطابقة، حيث تتم إزالة الخلايا السرطانية غير المستوعبة داخلياً قبل التصوير للسماح بالقياس الدقيق لأحداث البلعمة. توفر هذه الطريقة نهجاً معيارياً وقابلاً للتكرار لتصور البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة في المختبر (in vitro). والأهم من ذلك، أن دمج التصوير بفاصل زمني مع التكميم القائم على نقطة النهاية يتيح تقييماً تكميلياً لحركية ومقدار البلعمة. يدعم هذا البروتوكول تقييم الأجسام المضادة العلاجية والعلاجات المناعية للسرطان الموجهة نحو البلاعم في بيئة مختبرية محكومة.

المقدمة

يعد سرطان الثدي أكثر أنواع الأورام الخبيثة تشخيصاً بين النساء في جميع أنحاء العالم، حيث يسجل ما يقرب من 2.3 مليون حالة جديدة سنوياً1. يتميز المرض بتغاير سريري ويصنف إلى أربعة أنماط جزيئية فرعية رئيسية على الأقل بناءً على حالة مستقبلات الهرمونات — مستقبل الإستروجين (ER) ومستقبل البروجسترون (PR) — والتعبير عن الجين الورمي لمستقبل عامل نمو البشرة البشري 2 (HER2)2. تعبر أورام Luminal A عن ER و/أو PR دون وجود تعبير مفرط لـ HER2 (ER/PR+ و HER2−)؛ بينما تعبر أورام luminal B عن ER/PR و HER2 معاً (ER/PR+ و HER2+)؛ وتتميز أورام HER2+ بتعبير عالٍ عن HER2 بغض النظر عن حالة مستقبلات الهرمونات؛ أما سرطان الثدي ثلاثي السلبية (TNBC) فيفتقر إلى التعبير عن جميع هذه العلامات الثلاث (ER−، PR−، و HER2−)2,3. ومن بين هذه الأنماط الفرعية، يمثل سرطان الثدي ثلاثي السلبية (TNBC) الشكل الأكثر تحدياً من الناحية السريرية ويشكل ما يقرب من 15%–20% من جميع حالات سرطان الثدي. ويظهر المرضى المصابون بـ TNBC مساراً مرضياً هو الأكثر عدوانية، مع أسوأ إنذار وأقصر معدل بقاء إجمالي لمدة 5 سنوات، وذلك بسبب الاستجابات الضعيفة للعلاج الكيميائي التقليدي وغياب العلاجات الموجهة الفعالة3,4. علاوة على ذلك، يظهر TNBC ميلاً مرتفعاً بشكل ملحوظ للنقائل الحشوية، خاصة إلى الرئتين في غضون 5 سنوات من التشخيص، كما أن المرضى المصابين بـ TNBC المتقدم أو النقيلي (mTNBC) لديهم متوسط بقاء نادراً ما يتجاوز سنتين5,6. وتؤكد هذه الإحصائيات على الحاجة الماسة والملحة لاستراتيجيات علاجية جديدة لسرطان الثدي ثلاثي السلبية.

تلعب البيئة الدقيقة للورم (TME) دوراً محورياً في تطور سرطان الثدي والهروب المناعي. وتُصنف البلاعم المرتبطة بالورم كواحدة من أكثر الخلايا المناعية وفرةً داخل البيئة الدقيقة للورم، وقد تم الاعتراف بها مؤخراً كوسيطات حاسمة في المناعة الفطرية المضادة للأورام7,8,9. وبينما كانت البلاعم المرتبطة بالورم تُقسم تاريخياً إلى حالات "M1" المحفزة للالتهابات وحالات "M2" المحفزة للأورام، فإن هذا النموذج الثنائي يفشل في استيعاب المدى الحقيقي لتباين البلاعم. وبدلاً من ذلك، تشغل البلاعم المرتبطة بالورم طيفاً وظيفياً ديناميكياً، يتطور استجابةً للإشارات البيوكيميائية المتنوعة داخل البيئة الدقيقة للورم. وفي هذا المشهد المعقد، تعمل الخلايا السرطانية بنشاط على تخريب نشاط البلاعم من خلال استراتيجيات هروب مناعي مختلفة، لا سيما الإفراط في التعبير عن إشارات "لا تأكلني". وكان محور CD47/SIRPα هو أول نقطة تفتيش مناعية فطرية يتم تحديدها في هذا السياق6,10، ومؤخراً، ظهر CD24 كإشارة قوية وجديدة مضادة للبلعمة11,12. يُعد CD24 بروتيناً سكرياً صغيراً من نوع الميوسين عالي الارتباط بالسكريات، ويكون راسيةً في غشاء الخلية عبر رابطة glycosylphosphatidylinositol13. ويتم التعبير عنه في سلالات مختلفة من الخلايا المناعية في الظروف الفسيولوجية، ولكنه غالباً ما يظهر بتعبير مفرط في الأورام الصلبة، بما في ذلك سرطانات الثدي والمبيض والبنكرياس والقولون والمستقيم14. وفي الخلايا الورمية، يرتبط CD24 بالمستقبل المثبط sialic acid–binding immunoglobulin-like lectin 10 (Siglec-10) الذي تعبر عنه البلاعم. ويؤدي هذا التفاعل إلى تحفيز فسفرة نطاقات immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif في الذيل السيتوبلازمي لـ Siglec-10، مما ينشط فوسفاتازات SHP-1 و SHP-2 التي تثبط إشارات البلعمة النهائية11. وقد ثبت أن حصر التفاعل بين CD24/Siglec-10 باستخدام أجسام مضادة أحادية النسيلة يعزز بقوة عملية بلعمة الأورام البشرية التي تعبر عن CD24 بواسطة البلاعم. كما أظهرت دراستنا الأخيرة أن تعطيل جين CD24a في خلايا سرطان الثدي يزيد من قابليتها للبلعمة بواسطة البلاعم في نموذج فأر مصاب بسرطان الثدي ثلاثي السلبية9.

يعد البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCP) آلية محورية تقوم من خلالها الأجسام المضادة بتوجيه الخلايا البلعمية لبلعمة الخلايا الورمية15,16. وعند الارتباط بالمستضدات التي تعبر عنها الأورام، تتفاعل منطقة Fc للجسم المضاد مع مستقبلات Fcγ (FcγRs) الموجودة على الخلايا البلعمية، مما يحفز شلالات إشارات داخل خلوية تبلغ ذروتها في إعادة ترتيب الهيكل الخلوي، وتكوين الكأس البلعمي، وابتلاع الخلية المستهدفة17.

في هذه الدراسة، قمنا بتطوير والتحقق من صحة بروتوكول تصوير حي للخلايا بفاصل زمني (time-lapse) لقياس عملية البلعمة التي تقوم بها البلاعم (macrophages) لخلايا سرطان الثدي بتوجيه من الأجسام المضادة. تعتمد هذه الطريقة على البلاعم المشتقة من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) من متبرعين بشريين أصحاء، والتي تم تمايزها باستخدام عامل تحفيز مستعمرات البلاعم (M-CSF) ثم تحفيزها لاحقاً باستخدام عديد السكاريد الشحمي (LPS) وإنترفيرون غاما (IFN-γ). وأكد تحليل قياس التدفق الخلوي (Flow cytometry) زيادة تنظيم CD80 ضمن مجموعة CD11b⁺ بعد التحفيز (الشكل 1)، مما يدعم النمط الظاهري المنشط كلاسيكياً. تمنح حالة التنشيط هذه قدرة بلعمية قوية بوساطة الأجسام المضادة، مما يجعلها مناسبة جداً لتقييم البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCP). وتعمل خلايا سرطان الثدي الموجبة لـ CD24 والموسومة ببروتين GFP كخلايا مستهدفة، حيث يتم طلاؤها (opsonized) بجسم مضاد أحادي النسيلة علاجي مضاد لـ CD24 قبل الزراعة المشتركة. يتم تسجيل أحداث البلعمة على مدار فترة زمنية مدتها 16 h باستخدام مجهر آلي تحت ظروف بيئية محكومة. ولتمكين التقييم الكمي بالتوازي مع التصوير الديناميكي، يتم إجراء مقايسة نقطة نهاية (endpoint assay) منفصلة تحت ظروف زراعة مشتركة متطابقة، مما يسمح بقياس دقيق للبلعمة بعد إزالة الخلايا المستهدفة التي لم يتم استيعابها داخلياً. يوفر هذا البروتوكول منصة قياسية وقابلة للتكرار وغنية بالمعلومات المرئية لتقييم ADCP بوساطة جسم مضاد مضاد لـ CD24. ومن المهم أن دمج التصوير بفاصل زمني مع استراتيجية كمية تكميلية قائمة على نقطة النهاية يتيح التقييم المتزامن لحركية البلعمة ومقدارها. يمكن تكييف هذه الطريقة لاستقصاء أهداف علاجية مناعية أخرى موجهة نحو البلاعم. ويعد هذا البروتوكول الأكثر ملاءمة لتقييم ADCP بوساطة الأجسام المضادة أحادية النسيلة العلاجية ضد المستضدات السطحية على الخلايا السرطانية. كما أنه مناسب جداً للفحص المقارن للأجسام المضادة المرشحة، وتوصيف الاستجابة للجرعة، والدراسات الميكانيكية لارتباط Fc–FcγR، بما في ذلك تأثيرات حظر إشارات "لا تأكلني" (مثل CD47–SIRPα). وبما أن المقايسة تستخدم بلاعم بشرية أولية، فإنها مناسبة أيضاً للدراسات الانتقالية التي تتطلب تقييم التباين بين المتبرعين قبل التطوير السريري.

مخطط لعزل الخلايا أحادية النواة من الدم المحيطي مع قياس التدفق الخلوي لتحليل الخلايا البلعمية.
الشكل 1. توليد والتحقق من صحة الخلايا البلعمية المحفزة بـ IFN-γ/LPS والمشتقة من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي باستخدام قياس التدفق الخلوي. اللوحة العلوية: يتم عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) من متبرعين أصحاء عن طريق طرد مركزي بتدرج الكثافة باستخدام محلول Ficoll عند 400 × g لمدة 30 min عند 20°C، مع موازنة جميع الكواشف مسبقاً عند 20°C ± 2°C. يتم استزراع PBMCs المعزولة في وسط ImmunoCult-SF مكمل بـ 100 ng/mL من عامل تحفيز مستعمرات الخلايا البلعمية (M-CSF) لمدة 7 أيام لتحفيز تمايز الخلايا البلعمية (اليوم 0-7)، مع تزويد الوسط بالمكملات في اليوم 5. في اليوم 8، يتم تحفيز الخلايا البلعمية المتمايزة بـ 100 ng/mL من IFN-γ و 1 µg/mL من LPS لمدة 48 h (اليوم 8-10). بعد ذلك تخضع الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي. اللوحة السفلية: تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا البلعمية. صبغت الخلايا بلوحة سطحية تتكون من CD11b-FITC و CD80-PE و CD206-PerCP-Cy5.5، متبوعة بإضافة DAPI قبل عملية الاستحواذ لاستبعاد الخلايا الميتة. استراتيجية تحديد البوابات (Gating): تم تحديد بوابات الخلايا الحية أولاً (DAPI⁻)، تلاها تحديد CD11b⁺ على مخطط CD11b-FITC مقابل FSC-A لتأكيد هوية الخلايا البلعمية. ثم تم تحليل أحداث CD11b⁺ الحية على مخطط نقطي لـ CD80 مقابل CD206 لتأكيد مجتمع CD80⁺CD206⁻ المستحث بواسطة تحفيز IFN-γ/LPS. اليمين: مخطط نقطي تمثيلي لـ CD11b-FITC مقابل FSC-A يظهر أن 99.8% من الخلايا المحددة كانت CD11b⁺، مما يؤكد هوية الخلايا البلعمية. اليسار: تقع غالبية خلايا CD11b⁺ ضمن بوابة CD80⁺CD206⁻ (Q1: 95.2%)، مما يشير إلى النمط الظاهري المسبب للالتهابات المتوقع في ظل ظروف التحفيز المطبقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ينبغي على المستخدمين مراعاة عدة قيود عند تطبيق هذه التقنية. أولاً، يمكن أن يؤدي التباين بين المانحين في البالعات المشتقة من الخلايا الوحيدة في الدم المحيطي (PBMC) إلى إحداث تباين كبير في نتاج البلعمة، لذا نوصي باستخدام عدة مانحين (n ≥ 3) مع تقديم بيانات كل مانح على حدة إلى جانب النتائج المجمعة. ثانياً، لا يجسد تنسيق الزراعة المشتركة ثنائية الأبعاد (2D) البيئة الدقيقة للورم، لذا يجب التحقق من النتائج في نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) أو نماذج حية (in vivo) قبل الاستنتاج السريري. ثالثاً، تلتقط نافذة التصوير التي تستمر 16 ساعة أحداث البلعمة المبكرة ولكنها لا تعكس العمليات طويلة المدى مثل عرض المستضد أو التنشيط المناعي الثانوي. وبناءً على ذلك، فإن الاستخدام المشترك للتصوير في الوقت الفعلي والقياس الكمي النهائي يوفر إطاراً تكميلياً يعزز كلاً من قابلية التفسير وإمكانية تكرار قياسات ADCP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتضمن هذا البروتوكول استخدام بلاعم أولية مشتقة من عينات دم لمتبرعين أصحاء. وقد تم جمع العينات ومعالجتها وفقاً للإرشادات الصادرة عن مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) في جامعة الصين الطبية.

1. تحضير الخلايا البلعمية المشتقة من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات التي تتضمن دماء بشرية بموجب موافقة مجلس المراجعة المؤسسية (مثل CMUH IRB). كما يجب الحصول على موافقة مستنيرة من المتبرعين الأصحاء قبل جمع الدم.

تنبيه: يجب التعامل مع جميع منتجات الدم البشري وفقاً لشروط المستوى الثاني من السلامة البيولوجية (Biosafety Level 2) وباستخدام الاحتياطات العامة.

  1. جمع الدم
    1. يتم جمع دم كامل من متبرع سليم في أنابيب سحب مفرغة (vacutainer) سعة 10 مل مغلفة بحمض إيثيلين ثنائي أمين رباعي الخليك (EDTA).
  2. تخفيف الدم
    1. قم بتخفيف الدم الكامل بنسبة 1:1 باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS؛ Ca) مبرد بالثلج2⁺-/Mg2(خالٍ من ⁺) (على سبيل المثال، 10 مل من الدم + 10 مل من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات PBS).
    2. امزج عن طريق القلب من ثلاث إلى خمس مرات.
      ملاحظة: يجب الاحتفاظ بالمحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) على الثلج قبل الاستخدام؛ إذ تساعد درجة الحرارة المنخفضة في الحفاظ على حيوية الخلايا أثناء المعالجة.
  3. تكوين طبقات تدرج الكثافة
    1. ضع الدم المخفف بعناية في طبقة فوق Ficoll–Paque PLUS بنسبة حجمية تبلغ 2:1 (حجم/حجم) في أنبوب مخروطي (على سبيل المثال، 8 مل من الدم فوق 4 مل من Ficoll في أنبوب سعة 15 مل، أو 30 مل فوق 15 مل في أنبوب سعة 50 مل).
    2. يتم موازنة كل من الدم المخفف ومحلول Ficoll–Paque PLUS حرارياً لـ 20°C ± 2°C قبل وضع الطبقات.
    3. أزل Ficoll–Paque PLUS من 4°C تُحفظ لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام، أو تُدفأ لفترة وجيزة في 20°C ± 2°C حمام مائي.
    4. لا تستخدم كواشف باردة، لأن كثافة Ficoll معايرة لـ 20°C ± 2°C، وأي انحرافات ستؤدي إلى تدهور كفاءة الفصل وإنتاجية الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC).
      ملاحظة: قم بإمالة الأنبوب بزاوية 45° قم بإمالة الأنبوب وإضافة الدم ببطء عبر الماصة على طول الجدار للحفاظ على واجهة فصل حادة. تجنب تحريك طبقة الـ Ficoll.
  4. الطرد المركزي
    1. طرد مركزي بقوة 400 × g لمدة 30 دقيقة عند 20°C مع تحرير المكبح (الشكل 1).
      ملاحظة: يؤدي الكبح إلى تعطيل تدرج الكثافة وتقليل حصيلة الخلايا الوحيدة والليمفاوية الدموية الطرفية (PBMC).
  5. جمع الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)
    1. اسحب بعناية طبقة الغشاء الكريمي فقط (الطبقة البينية المبيضة بين طبقتي البلازما والفيكول)، دون تحريك البلازما في الأعلى أو طبقة الفيكول في الأسفل، باستخدام ماصة سيرولوجية.
    2. انقل الطبقة التي تم تجميعها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
  6. غسل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)
    1. أضف المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) حتى يصل الحجم الإجمالي إلى 25 مل في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
    2. استخدم أنبوباً سعة 50 مل لضمان إجراء عملية الطرد المركزي والموازنة بشكل صحيح.
    3. يُوضع في جهاز الطرد المركزي عند 300 × g لمدة 10 دقائق.
  7. تحلل كريات الدم الحمراء
    1. تخلص من الراشح.
    2. أعد تعليق الراسب في 5 مل من محلول تحلل كرات الدم الحمراء (RBC lysis buffer) عن طريق السحب والطرد اللطيف باستخدام ماصة سيرولوجية حتى يتشتت الراسب تماماً ولا تبقى أي تكتلات مرئية.
    3. تُحضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      تنبيه: يلزم التشتيت الكامل لضمان تحلل متجانس؛ ومع ذلك، يجب تجنب السحب والضخ القوي بالماصة أو استخدام جهاز الرج الميكانيكي (vortexing)، لأن ذلك قد يؤدي إلى تلف الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs). لا تتجاوز مدة الحضن مع محلول تحلل كرات الدم الحمراء 5 دقائق، حيث إن التعرض لفترات طويلة قد يؤثر سلباً على حيوية الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC).
  8. ترسيب خلايا PBMC
    1. قم بإجراء الطرد المركزي عند 500 × g لمدة 5 دقائق لترسيب الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) وإزالة حطام خلايا الدم الحمراء المتحللة.
  9. إعادة التعليق النهائية
    1. تخلص من الطافي.
    2. أعد تعليق الراسب في 5 مل من وسط ImmunoCult-SF المخصص للخلايا البلعمية.
      ملاحظة: في الظروف القياسية، ينتج عادةً عن 10 مل من الدم الكامل 1.5-2.0 × 107 الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي.

2. تمايز الخلايا البلعمية (الأيام 0–7)

ملاحظة: استخدم أطباق بتري غير المعالجة لزراعة الأنسجة (TC) لاختيار الخلايا البلعمية المتمايزة المشتقة من الخلايا الوحيدة عن طريق الالتصاق. حيث سيتم غسل الخلايا اللمفاوية غير الملتصقة أثناء عملية الزراعة اللاحقة.

  1. اليوم 0: استزراع الخلايا
    1. قم بعد الخلايا واستزرع 1 × 107 من خلايا PBMC في طبق بتري بقطر 10 cm غير معالج بـ TC.
    2. أكمل الحجم الإجمالي إلى 10 mL باستخدام وسط ImmunoCult-SF الخاص بالبلعميات والمكمل بـ 100 ng/mL من M-CSF (يُحضّر بإضافة مخزون M-CSF مباشرة إلى الوسط الكامل قبل الاستخدام مباشرة والخلط عن طريق القلب اللطيف).
      ملاحظة: يمكن توسيع نطاق البروتوكول تناسبيًا لاستيعاب الاختلافات في إنتاج PBMC من المتبرع، باستخدام كثافة استزراع تبدأ من 1 × 106 خلية/mL كقاعدة أساسية.
  2. الحضن والمراقبة
    1. يُحضن عند 37°C مع 5% CO₂ في حاضنة رطبة.
    2. راقب تكوّن تجمعات الخلايا الوحيدة العائمة وظهور الخلايا الملتصقة يوميًا.
      ملاحظة: ستزداد الخلايا الوحيدة تدريجيًا في الحجم وتُشكل تجمعات مع تقدم التمايز. ستبدأ بعض الخلايا الوحيدة في الالتصاق بالطبق. لا يتطلب الأمر أي تدخل في هذه الخطوة.
  3. اليوم 5: تدعيم الوسط الغذائي
    1. أضف بلطف 5 mL من وسط ImmunoCult-SF الطازج الخاص بالبلعميات والمكمل بـ 100 ng/mL من M-CSF إلى الطبق، مع الحرص على عدم زعزعة استقرار البلعميات الملتصقة.
    2. استمر في استزراع الخلايا لمدة يومين إضافيين (حتى اليوم 7).
      تنبيه: أضف الوسط الطازج بلطف على طول جانب الطبق لتجنب زعزعة استقرار البلعميات الملتصقة، حيث قد يؤثر التمزق الميكانيكي على كفاءة التمايز وإنتاجية الخلايا.
      ملاحظة: تجنب استبدال الوسط للحفاظ على العوامل ذات الإفراز الذاتي أو المجاورة (autocrine/paracrine factors) التي تدعم تمايز البلعميات.
  4. اليوم 7: التقييم المورفولوجي
    1. افحص كفاءة تمايز البلعميات تحت مجهر مقلوب.
    2. تظهر الخلايا الملتصقة مورفولوجيا مميزة للبلعميات: كبيرة، ومسطحة، وغير منتظمة الشكل، مع وجود أقدام كاذبة مرئية.
    3. في اليوم 7، يجب أن تكون البلعميات المتمايزة جيدًا مرئية.
      تنبيه: يعد التقييم المورفولوجي في اليوم 7 شرطًا أساسيًا حاسمًا للتحقق اللاحق عن طريق قياس التدفق الخلوي. يجب أن تكون البلعميات المتمايزة جيدًا مرئية بوضوح تحت المجهر، وتعكس النسبة الأعلى من الخلايا الملتصقة ذات مورفولوجيا البلعميات كفاءة تمايز أكبر (تعتبر نسبة التلاقي 70% تقريبًا من البلعميات الملتصقة ذات المورفولوجيا المميزة مؤشرًا على نجاح التمايز). المزارع التي تظهر التصاقًا ضئيلًا، أو خلايا مستديرة في الغالب، أو تمايزًا مورفولوجيًا ضعيفًا بشكل عام، من غير المرجح أن تعطي نتائج موثوقة في قياس التدفق الخلوي، ولا ينبغي أن تنتقل إلى مرحلتي التحفيز والصبغ.

3. استقطاب الخلايا البلعمية (الأيام 8–10)

  1. جمع وتنقية الوسط الشرطي
    1. في اليوم الثامن، اسحب بعناية 15 mL من الوسط من طبق الزرع دون تحريك البلاعم الملتصقة وانقلها إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 mL.
    2. قم بطرد مركزي للوسط المجموع عند 400 × g لمدة 5 min لترسيب حطام الخلايا.
    3. احتفظ بالسائل الطافي المصفى للخطوة التالية.
  2. التحفيز باستخدام إنترفيرون غاما (IFN-γ) والعديد السكري (LPS)
    1. انقل 15 mL من السائل الطافي المصفى إلى أنبوب معقم جديد وأضف إليه 100 ng/mL من IFN-γ و 1 µg/mL من LPS.
    2. امزج المكونات جيداً عن طريق السحب والدفع اللطيف باستخدام الماصة (5-10 مرات) لضمان توزيع السيتوكينات بشكل متجانس دون إدخال فقاعات.
    3. أعد كامل كمية الوسط المكمل بالسيتوكينات (15 mL) إلى طبق الزرع الأصلي، مع السحب والضخ بلطف على طول الجدار الداخلي لتجنب تحريك البلاعم الملتصقة.
    4. حضّن العينات عند 37°C مع 5% CO₂ لمدة 48 h (من اليوم الثامن إلى اليوم العاشر).
      ملحوظة: استخدم الوسط الشرطي (القديم) للحفاظ على العوامل ذات الإفراز الذاتي أو المجاوزة. يُستخدم هذا المزيج من IFN-γ و LPS لاستقطاب البلاعم إلى نمط ظاهري محفز للالتهاب. تحت ظروف التحفيز بـ IFN-γ (100 ng/mL) و LPS (1 µg/mL) المستخدمة في هذا البروتوكول، تظهر البلاعم تغيرات شكلية مميزة، بما في ذلك الأقدام الكاذبة (lamellipodia) المستطيلة المتوافقة مع حالة تنشيط محفزة للالتهاب، بالإضافة إلى تعبير CD11b و CD80.
      تحذير: تعامل مع LPS وفقاً لإجراءات السلامة المختبرية المناسبة، حيث إنه ذيفان داخلي نشط بيولوجياً قد يسبب استجابات التهابية عند التعرض له.

4. تأكيد علامات النمط الظاهري الالتهابي للبلاعم المحفزة بـ IFN-γ و LPS عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. حصاد الخلايا
    1. احصد مجموعة فرعية من البلاعم المستقطبة في اليوم 10 لإجراء التوصيف المظهري.
    2. أضف 10 mM من EDTA في PBS وحضنها لمدة 10–15 min عند 37°C.
    3. افصل الخلايا عن طريق الماصة برفق.
      ملاحظة: مدد فترة تحضين EDTA لمدة 30 min إضافية عند 37°C إذا ظلت الخلايا ملتصقة، ثم كرر عملية الماصة برفق. تجنب استخدام الماصة بقوة أو الكشط الميكانيكي للحفاظ على حيوية الخلايا وسلامة المؤشرات السطحية.
  2. إعداد صبغ الأجسام المضادة
    1. اصبغ الخلايا باستخدام أجسام مضادة مقترنة بفلوروكوم لـ CD11b (مؤشر سلالة البلاعم الشامل)، وCD80 (مؤشر التهابي)، وCD206 (مؤشر مضاد للالتهاب يستخدم كمؤشر استبعاد سلبي لتحديد النمط المظهري الالتهابي).
  3. إجراء الصبغ
    1. انقل 5 × 105 من البلاعم المفصولة إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي يحتوي على 100 µL من PBS البارد.
    2. أضف الأجسام المضادة CD11b-FITC وCD80-PE وCD206-PerCP-Cy5.5 بتركيز نهائي قدره 1 µg/mL لكل منها.
    3. امزج معلق الخلايا بواسطة الماصة برفق.
    4. حضن العينات على الثلج لمدة 1 h، مع حمايتها من الضوء.
    5. أدر العينات في جهاز الطرد المركزي بسرعة 300 × g لمدة 1 min عند 4°C.
    6. اشفط السائل الطافي بعناية.
    7. أضف 0.5 mL من PBS البارد لغسل كتلة الخلايا.
    8. أدر العينات في جهاز الطرد المركزي بسرعة 300 × g لمدة 1 min عند 4°C.
    9. تخلص من السائل الطافي.
    10. أعد تعليق كتلة الخلايا في 200 µL من PBS البارد.
    11. أضف DAPI بتركيز نهائي قدره 1 µg/mL.
      ملاحظة: قم بتضمين ضوابط النمط الإيزوتوبي المناسبة وصبغة حيوية (على سبيل المثال، DAPI أو صبغة Viobility 405/452 القابلة للتثبيت).
  4. تحليل قياس التدفق الخلوي
    1. اجمع العينات المصبوغة باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
    2. أكد تعبير CD11b وCD80 في مجموعة البلاعم.
    3. انتقل إلى مقايسة البلعمة فقط بعد تأكيد تعبير المؤشرات بما يتوافق مع النمط المظهري الالتهابي.
  5. جمع وبيانات قياس التدفق الخلوي
    1. إعداد الجهاز
      1. قم بتكوين مقياس التدفق الخلوي باستخدام القنوات التالية: Pacific Blue/V450 (DAPI)، وFITC (CD11b)، وPE (CD80)، وPerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. اضبط معيار الجمع لجمع 10,000 حدث لكل عينة ضمن البوابة الرئيسية المحددة.
    2. معايرة العتبة والكسب
      1. افتح أربعة مخططات نقطية تعرض FSC على المحور السيني وقناة فلوروفور واحدة على المحور الصادي.
      2. جهز خلايا مصبوغة بالأجسام المضادة لضابط النمط الإيزوتوبي المقابل لكل فلوروفور.
      3. اجمع عينات ضابط النمط الإيزوتوبي.
      4. اضبط الكسب لكل قناة لوضع مجموعة ضابط النمط الإيزوتوبي تحت 101 على المقياس اللوغاريتمي.
      5. استخدم هذه العتبة لتحديد مستويات إشارة الخلفية.
        ملاحظة: استخدم نطاق مقياس لوغاريتمي من 101 إلى 101·5 لإيجاد فصل موثوق بين الخلفية والإشارة المحددة.
    3. التعويض
      1. أضف قطرة واحدة من خرزات التعويض في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL.
      2. أضف الجسم المضاد المقترن بالفلوروفور المقابل بتركيز نهائي قدره 1 µg/mL.
      3. حضن لمدة 30 min على الثلج، مع حمايتها من الضوء.
      4. أدر في جهاز الطرد المركزي بسرعة 400 × g لمدة 1 min.
      5. تخلص من السائل الطافي.
      6. أعد تعليق الخرزات في 200 µL من PBS البارد.
      7. اجمع ضوابط اللون الواحد.
      8. طبق التعويض الطيفي لتصحيح تداخل الفلوروفورات.
    4. استراتيجية تحديد البوابات
      1. اختيار الخلايا الحية
        1. اعرض Pacific Blue/V450 (DAPI) على المحور الصادي وFSC على المحور السيني.
        2. حدد البوابة على الأحداث السلبية لـ DAPI (أقل من 101) لاختيار الخلايا الحية.
      2. تحديد البلاعم
        1. اجعل مجموعة الخلايا الحية بمثابة البوابة الرئيسية.
        2. اعرض FITC (CD11b) على المحور الصادي وFSC على المحور السيني.
        3. حدد البوابة على أحداث CD11b⁺ (أعلى من 101).
      3. تحديد النمط المظهري الالتهابي
        1. اجعل مجموعة CD11b⁺ بمثابة البوابة الرئيسية.
        2. اعرض PE (CD80) على المحور الصادي وPerCP-Cy5.5 (CD206) على المحور السيني.
        3. طبق تحديد البوابات الربعية عند 101.5 على كلا المحورين.
        4. حدد الخلايا CD80⁺CD206⁻ في الربع العلوي الأيسر (Q1).
  6. معايير القبول
    1. تأكد من أن ≥90% من الخلايا ضمن البوابة الرئيسية CD11b⁺ هي CD80⁺CD206⁻.
    2. انتقل إلى مقايسة البلعمة فقط عند تحقيق هذه العتبة.
    3. كرر عزل PBMC، وتمايز M-CSF، وتحفيز IFN-γ/LPS إذا فشلت العينات في تلبية هذا المعيار.

5. مقايسة البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة

ملاحظة: تحقق من التعبير المستقر لـ GFP في الخلايا السرطانية قبل إعداد المقايسة. تأكد من تعبير CD24 على الخلايا المستهدفة قبل بدء المقايسة. استخدم خلايا سرطانية تتراوح نسبة إيجابية CD24 فيها بين 50%–100% لتحقيق أفضل أداء. وتظهر خلايا MDA-MB-468 المستخدمة في هذا البروتوكول إيجابية CD24 بنسبة 100%.

  1. استزراع البلاعم
    1. قم باستزراع البلاعم المحفزة بـ IFN-γ و LPS، والمدققة في الخطوة 4، بمعدل 2 × 105 خلية لكل بئر في طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئراً.
    2. حضّن الطبق عند 37°C في ظروف سكون مع 5% CO₂ لمدة 12–16 ساعة للسماح بالتصاق الخلايا (الشكل 2A).
      ملاحظة: تأكد من التصاق البلاعم بإحكام قبل المتابعة؛ إذ قد تنفصل البلاعم ضعيفة الالتصاق أثناء التصوير مما يؤدي إلى تضليل النتائج.
  2. تحضير الخلايا السرطانية
    1. قم بزراعة خلايا سرطان الثدي (MDA-MB-468) الموجبة لـ CD24 والموسومة بـ GFP حتى تصل نسبة الالتحام إلى 70%–80%.
    2. اشفط وسط الزراعة.
    3. اغسل الطبقة الخلوية الأحادية مرة واحدة باستخدام PBS.
  3. فصل الخلايا السرطانية
    1. أضف 10 mM EDTA في PBS إلى طبق الزراعة.
    2. حضّن الخلايا عند 37°C لمدة 5–10 دقائق.
    3. افصل الخلايا عن طريق السحب اللطيف بالماصة لتحقيق تحرر كامل للخلايا.
      ملاحظة: تجنب استخدام التريبسين لفصل الخلايا، فقد يؤدي الهضم الإنزيمي إلى قطع CD24 من سطح الخلية وإضعاف ارتباط الأجسام المضادة.
  4. جمع وعد الخلايا السرطانية
    1. اجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب طرد مركزي.
    2. قم بإجراء طرد مركزي للخلايا عند 300 × g لمدة 5 دقائق.
    3. تخلص من السائل الطافي.
    4. أعد تعليق الراسب الخلوي في وسط RPMI كامل.
    5. قم بعدّ الخلايا الحية.
  5. تغطية الخلايا السرطانية بالأجسام المضادة (Opsonization)
    1. أعد تعليق الخلايا السرطانية بكثافة 2 × 105 خلية/مل في 0.5 مل من وسط RPMI كامل.
    2. أضف الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد لـ CD24 ليصل إلى تركيز نهائي قدره 1 µg/mL.
    3. امزج المعلق الخلوي عن طريق السحب اللطيف بالماصة لضمان توزيع منتظم للأجسام المضادة.
    4. حضّن الخلايا عند 37°C لمدة 30 دقيقة في ظروف سكون.
      ملاحظة: قم بتضمين ضابط IgG مطابق للنمط الإشاري وبنفس التركيز كضابط سلبي للبلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة.
  6. التحضير للزراعة المشتركة
    1. لا تغسل الخلايا بعد عملية التغطية بالأجسام المضادة.
    2. انتقل مباشرة إلى الزراعة المشتركة للحفاظ على غطاء الأجسام المضادة على سطح الخلية.
  7. إعداد الزراعة المشتركة
    1. أضف 1 × 105 من خلايا سرطان الثدي الموسومة بـ GFP والمغطاة بالأجسام المضادة إلى كل بئر يحتوي على البلاعم.
    2. حافظ على نسبة الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة بمعدل 2:1.
      ملاحظة: اضبط نسبة الخلايا المؤثرة إلى المستهدفة بناءً على التصميم التجريبي. استخدم نسباً أعلى من البلاعم إلى الخلايا السرطانية من النسبة الموصوفة 2:1 (مثلاً 3:1 أو 5:1) لزيادة تكرار التلامس بين الخلايا وتعزيز رصد أحداث البلعمة.

مخطط زمني لتفاعل الخلايا البلعمية والخلايا المحددة ببروتين GFP في تجربة التصوير.
الشكل 2. التصوير الزمني للبلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة. (A) نظرة عامة تخطيطية لنظام الزراعة المشتركة وإعداد التصوير الزمني. شملت معاملات التصوير فاصلًا زمنيًا قدره 10 min على مدار زمن استحواذ إجمالي قدره 16 h (97 إطارًا)، باستخدام عدسة شيئية 10× مع قنوات تباين الطور وGFP. (B) صور زمنية تمثيلية من 1 h إلى 16 h تظهر أحداث البلعمة التي تتميز باستيعاب الخلايا السرطانية الموجبة لـ GFP داخل الخلايا البلعمية بمرور الوقت. تبرز الدوائر الصفراء المتقطعة أحداث بلعمة تمثيلية. في قناة تباين الطور، تظهر الخلايا السرطانية المبتلعة كهياكل داخل خلوية ساطعة في طور التباين داخل سيتوبلازم الخلية البلعمية (الأسهم البيضاء). وفي قناة GFP، يؤكد الفلورة الموضعية داخل الخلايا البلعمية عملية الاستيعاب الداخلي. (C) مناظر مكبرة لأحداث بلعمة تمثيلية عند 0 و1 و4 و16 h، توضح العملية التسلسلية لابتلاع الخلايا السرطانية المحددة بـ GFP بوساطة الخلايا البلعمية. تم اختيار تسلسل الصور ليكون تمثيليًا بناءً على التصوير الواضح لأحداث البلعمة التي تتوسطها الخلايا البلعمية. تشير الأسهم البيضاء إلى الخلايا البلعمية التي تتفاعل مع الخلايا المستهدفة وتقوم باستيعابها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

6. التصوير بفاصل زمني (نظام آلي لتصوير الخلايا الحية)

ملاحظة: قم بتكوين بروتوكول التصوير باستخدام نظام Lionheart للتصوير الآلي للخلايا الحية وبرنامج Gen5 للتصوير الآلي للخلايا الحية قبل إجراء المقايسة. احصل على التدريب المناسب قبل تشغيل نظام التصوير لضمان الإعداد الدقيق، والأداء الأمثل، والاستخدام الآمن.

  1. تجهيز الجهاز
    1. قم بتشغيل نظام التصوير، ووحدة التحكم البيئية، ومصدر غاز CO₂ قبل ساعة واحدة على الأقل من بدء التصوير.
    2. افتح لوحة التحكم البيئية (Environment Control) في برنامج التصوير الآلي للخلايا الحية.
    3. اضبط درجة الحرارة على 37°C ونسبة CO₂ على 5%.
    4. تأكد من استقرار درجة حرارة الحجرة ضمن نطاق ± 0.2°C ونسبة CO₂ عند 5.0% ± 0.1% قبل وضع الطبق.
  2. إعداد الطبق
    1. ضع الطبق ذو الـ 24 بئراً في حجرة التصوير الخاصة بنظام التصوير.
  3. التكوين الأولي
    1. افتح مدير المهام (Task Manager) في برنامج التصوير الآلي للخلايا الحية.
    2. اختر [Imager manual mode].
    3. انقر على [Capture now] لتهيئة معاملات التصوير.
    4. اختر عدسة شيئية 10×.
    5. اختر microplate كإعداد للمرشح.
    6. اختر الطبق ذو الـ 24 بئراً من مكتبة الأطباق في برنامج التصوير الآلي للخلايا الحية.
  4. إعداد التركيز والتصوير
    1. اختر قناة تباين الطور (Phase Contrast).
    2. اختر بئراً تمثيلياً (على سبيل المثال، A1).
    3. قم بتفعيل التركيز التلقائي (autofocus) قبل البدء في التقاط الصور بفاصل زمني (time-lapse).
    4. التقط صورة باستخدام أيقونة الكاميرا.
    5. تأكد من مورفولوجيا الخلايا وجودة التركيز.
    6. انتقل إلى [Process/Analyze].
    7. اختر [Create experiment from an image set] لتهيئة التجربة.
  5. معاملات التقاط الصور بفاصل زمني
    1. افتح لوحة إعدادات [Procedure].
    2. اضبط درجة الحرارة على 37°C ونسبة CO₂ على 5%.
    3. ضمن [Start Kinetic]، اضبط وقت التشغيل على 16:00:00.
    4. اضبط الفاصل الزمني للتصوير على 0:10:00.
    5. اضبط إجمالي عدد القراءات على 97.
    6. استخدم فاصلاً زمنياً للتصوير يتراوح بين 10–15 min لتحقيق التوازن بين الدقة الزمنية والسمية الضوئية مع التقاط أحداث البلعمة المبكرة.
  6. تكوين قناة التصوير
    1. اضبط القناة 1 (Channel 1) على تباين الطور (Phase Contrast).
    2. اضبط القناة 2 (Channel 2) على GFP (Ex 469/35, Em 525/39).
    3. اختر عدسة شيئية 10× للحصول على أفضل مجال رؤية ودقة.
    4. اضبط الإضاءة، ووقت التكامل، والكسب (gain) على [Auto]، أو اضبطها يدوياً.
    5. استخدم وقت تعريض نموذجي لـ GFP يتراوح بين 100–300 ms لتجنب تشبع الإشارة.
    6. طبق إعدادات تصوير متطابقة عبر جميع الآبار.
  7. إعداد مواقع التصوير
    1. افتح قائمة [Define beacons].
    2. قم بتعطيل التقاط Z-stack.
    3. قم بتعطيل التقاط المونتاج (montage acquisition).
    4. قم بإجراء التصوير عند مستوى بؤري واحد.
    5. حدد مواقع التصوير يدوياً عن طريق اختيار مناطق تمثيلية غير متداخلة داخل كل بئر باستخدام أيقونة المجهر.
    6. حافظ على مواقع تصوير متطابقة عبر جميع النقاط الزمنية.
    7. اختر ما لا يقل عن 4–6 مجالات رؤية لكل بئر.
  8. التقاط الصور بفاصل زمني
    1. انقر على [Play] لبدء التصوير الآلي بفاصل زمني.
  9. تصدير البيانات وتصورها
    1. افتح ملف التجربة المحفوظ بعد الانتهاء من التقاط الصور.
    2. اختر مواقع التصوير.
    3. صدّر بيانات الفاصل الزمني بتنسيق MP4.
    4. افتح [Process Tool].
    5. طبق [Image Deconvolution] إذا لزم الأمر لتحسين التصور وتحديد أحداث البلعمة التمثيلية.
      ملاحظة: استخدم التصوير بفاصل زمني للتصور النوعي فقط. قد تتداخل الخلايا السرطانية الموجبة لـ GFP غير المبلعمة أو ترتبط عابراً بالبلعميات، مما يؤدي إلى إشارات إيجابية كاذبة. أجرِ التحليل الكمي باستخدام مقايسة نقطة نهاية منفصلة.

7. التكميم النهائي لعملية البلعمة

  1. إزالة الخلايا غير المبتلعة
    1. يُجرى المقايسة تحت ظروف استزراع مشترك متطابقة.
    2. تُنهى التجربة عند 4 h.
    3. يُزال وسط الاستزراع.
    4. يُضاف 10 mM EDTA في PBS.
    5. تُحضن العينات عند 37°C لمدة 5 min.
    6. تُغسل العينات برفق باستخدام PBS لإزالة خلايا GFP الموجبة غير المبتلعة.
    7. يُضاف وسط استزراع جديد للبلاعم.
  2. التقاط الصور للقياس الكمي
    1. تُلتقط الصور باستخدام قنوات تباين الطور وGFP.
    2. يتم تصوير ما لا يقل عن 4–6 حقول رؤية لكل بئر.
    3. تُحلل ثلاثة آبار على الأقل لكل حالة تجريبية.
  3. تعريف أحداث البلعمة
    1. تُحدد البلاعم التي تحتوي على إشارات GFP موجبة محاطة بالكامل ضمن الحدود الخلوية.
  4. تحليل الصور
    1. تُفتح الصور في برنامج ImageJ.
    2. تُستخدم إضافة Cell Counter.
    3. يُحسب العدد الإجمالي للبلاعم.
    4. تُحسب البلاعم التي تحتوي على خلايا GFP موجبة مبتلعة.
  5. حساب مؤشر البلعمة
    1. يُحسب: صيغة مؤشر البلعمة؛ نسبة خلايا GFP الموجبة المبتلعة إلى إجمالي البلاعم؛ معادلة.
    2. يُجرى التحليل بطريقة تعمية.
    3. تُكرر العملية في ثلاث تجارب مستقلة على الأقل.
  6. عرض البيانات
    1. تُعرض صور الفاصل الزمني التمثيلية بترتيب زمني (الشكل 2B والشكل 2C).
    2. تُعرض صور نقطة النهاية التمثيلية (الشكل 3A والشكل 3B).

تحليل البلعمة: الزراعة المشتركة للخلايا البلعمية، الجسم المضاد أحادي النسيلة anti-CD24؛ صور مجهرية، ومقارنة بمخطط البيانات.
الشكل 3. قياس البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة في الخلايا البلعمية عن طريق تحليل نقطة النهاية. (A) صور تمثيلية بتباين الطور وفلورية GFP للخلايا البلعمية التي تمت زراعتها بشكل مشترك مع خلايا سرطان الثدي الموصومة بـ GFP لمدة 4 h، متبوعة بإزالة الخلايا غير المبتلعة باستخدام معالجة EDTA. تم دمج قناتي تباين الطور وGFP لتحديد الخلايا البلعمية والأهداف الموجبة لـ GFP التي تم استيعابها داخلياً. تم تعداد الخلايا البلعمية (العداد 0) والخلايا البلعمية المبتلعة الموجبة لـ GFP (العداد 1) باستخدام إضافة Cell Counter في برنامج ImageJ. في حالة التحكم بـ IgG، لم تُلاحظ أي أحداث بلعمة، بينما أدت المعالجة بالجسم المضاد أحادي النسيلة anti-CD24 إلى ظهور إشارات GFP موجبة واضحة داخل الخلايا البلعمية، مما يشير إلى حدوث بلعمة نشطة. شريط المقياس = 200 µm. (B) قياس مؤشر البلعمة، والذي يُعرف بأنه النسبة المئوية للخلايا البلعمية التي تحتوي على خلايا موجبة لـ GFP مستوعبة داخلياً نسبة إلى إجمالي عدد الخلايا البلعمية. زاد الجسم المضاد أحادي النسيلة anti-CD24 بشكل ملحوظ من مؤشر البلعمة مقارنة بمجموعة التحكم IgG (0.00 ± 0.00% مقابل 18.76 ± 4.01%، المتوسط ± SD؛ n = 6 حقول لكل مجموعة؛ ***p < 0.001، اختبار Welch’s unpaired t-test). البيانات تمثيلية لثلاث تجارب مستقلة على الأقل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم التأكد من نجاح توليد واستقطاب الخلايا البلعمية من خلايا PBMC باستخدام التقييم المورفولوجي وتحليل قياس التدفق الخلوي (الشكل 1). حيث تم استزراع خلايا PBMC التي عُزلت عن طريق طرد مركزي بتدرج الكثافة في وسط مضاف إليه M-CSF، مما أدى إلى ظهور خلايا ملتصقة ذات مورفولوجيا مميزة للخلايا البلعمية بحلول اليوم السابع. وبعد التحفيز باستخدام IFN-γ و LPS، أظهرت الخلايا نمطًا ظاهريًا يتفق مع التنشيط في ظل الظروف المطبقة. وأظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن 99.8% من الخلايا المختارة كانت إيجابية لـ CD11b، م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعد عدة خطوات في هذا البروتوكول حاسمة للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. أولاً، تؤثر جودة ونقاء عزل خلايا PBMC بشكل مباشر على حصيلة الخلايا البلعمية وكفاءة تمايزها. ويعد الترسيب الدقيق للدم المخفف فوق تدرج Ficoll والطرد المركزي مع إيقاف تشغيل المكابح أمراً ضرورياً للحفاظ على واجهة الطبقة الكريمية (buffy coat). كما أن التحلل غير المكتمل لخلايا RBC أو فترة الحضانة المفرطة مع محلول التحلل سيؤدي إلى تضرر حيوية خلايا PBMC. ثانياً، يجب التحقق من استقطاب الخلايا البلعمية المحرضة للالتهاب عن طريق قياس التدفق الخلوي قبل إجرا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يفصح المؤلفون عن عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مركز بيولوجيا السرطان والعلاجات الدقيقة بجامعة الصين الطبية، من خلال برنامج مركز أبحاث المجالات المتميزة ضمن إطار مشروع براعم التعليم العالي التابع لوزارة التربية والتعليم (MOE) في تايوان (CBPTC-PROJ-5-2).

نتوجه بالشكر إلى مركز بيولوجيا السرطان والعلاجات الدقيقة لتوفير التمويل والدعم الأكاديمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول مخزون من حمض إيثيلين ثنائي الأمين رباعي حمض الخليك (EDTA) بتركيز 0.5 مولارSigma-Aldrich (أو ما يعادلها)E7889 (أو ما يعادله)تُستخدم لتحضير محلول عمل من EDTA بتركيز 10 ملي مولار في محلول PBS لفصل الخلايا
أطباق زراعة الأنسجة ذات ٢٤ بئراً (المعالجة لزراعة الأنسجة)Corning (أو ما يعادلها)3524تُستخدم للاستزراع المشترك للخلايا البلعمية والخلايا السرطانية أثناء مقايسة البلعمة
جسم مضاد مضاد لـ CD206 البشري (قياس التدفق الخلوي)BioLegend (أو ما يعادلها)321122 (أو ما يعادلها)مؤشر للنمط الظاهري البديل للبلاعم
جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ CD24 البشريThermo Fisher Scientific (أو ما يعادلها)MA1-91384 (أو ما يعادله)تُستخدم لعمل عملية الطلاء المناعي (opsonization) للخلايا السرطانية من أجل البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة
نظام تصوير آلي للخلايا الحية مزود بغرفة تحكم بيئي (مثل Lionheart FX)Agilent Technologies (أو ما يعادلها)المجهر الآلي BioTek Lionheart FXيتيح التصوير بالفاصل الزمني لفترات طويلة تحت درجة حرارة مضبوطة و 2 الظروف
برمجيات التصوير الخاص بالتصوير الآلي للخلايا الحية (على سبيل المثال Gen5)Agilent Technologies (أو ما يعادلها)لم يتم توفير نص للمراجعة والترجمة. يرجى تزويدي بالنص المصدر باللغة الإنجليزية للبدء في ترجمته وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.تُستخدم للحصول على بيانات التصوير بالفاصل الزمني وتحليلها
جهاز طرد مركزي (دوار ذو دلاء متأرجحة)Thermo Fisher Scientific (أو ما يعادلها)جهاز Multifuge X4R Pro مع دوّار TX-1000 (أو ما يعادله)تُستخدم لعزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) وخطوات غسل الخلايا
2 حضّانة (37°ج، 5% 2)Thermo Fisher Scientific (أو ما يعادلها)تسخين مباشر من Forma 2 حضّانة (أو ما يعادلها)يحافظ على الظروف الفسيولوجية للمستنبتات الخلوية
2 إمداد غاز مع منظم ضغطAgilent Technologies (أو ما يعادلها)لم يتوفر نص للترجمة. يرجى تزويد النص المصدر باللغة الإنجليزية للبدء في عملية الترجمة العلمية إلى اللغة العربية.المستلزمات 2 للتحكم البيئي في الحضانة ونظام التصوير
أنابيب مخروطية (15 مل و50 مل)Corning (أو ما يعادلها)352070 (أو ما يعادله)تُستخدم في خطوات عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)، وغسلها، وطردها المركزي.
أنابيب جمع الدم المطلية بـ EDTA (أنابيب مفرغة الهواء/vacutainers)BD Biosciences (أو ما يعادلها)367863 (أو ما يعادلها)تُستخدم لجمع عينات الدم الكامل من المتبرعين
Ficoll-Paque PLUSCytiva (أو ما يعادلها)17144003 (أو ما يعادله)وسط تدرج الكثافة لعزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs)
جهاز قياس التدفق الخلوي (على سبيل المثال: FACSCanto II)BD Biosciences (أو ما يعادلها)BD FACSCanto II تُستخدم للتحليل المظهري للخلايا البلعمية
خرزات التعويض (قياس التدفق الخلوي)Biolegend (أو ما يعادله)424602تُستخدم كعناصر تحكم للتعويض أحادي اللون
جسم مضاد CD11b المضاد للبشر الموّسم بـ FITC (قياس التدفق الخلوي)BioLegend (أو ما يعادلها)101205 (أو ما يعادله)مؤشر يُستخدم لتحديد الخلايا البلعمية
جسم مضاد PE مضاد لـ CD80 البشري (قياس التدفق الخلوي)BioLegend (أو ما يعادلها)375410 (أو ما يعادلها)علامة مرتبطة بالنمط الظاهري للبلاعم المنشطة
خط خلايا سرطان الثدي المعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (MDA-MB-468)ATCC (أو ما يعادلها)HTB-132 (أو ما يعادلها)الخلايا المستهدفة المستخدمة في مقايسة البلعمة؛ يتيح البروتين الفلوري الأخضر (GFP) التصوير المرئي
وسط ImmunoCult-SF لزراعة الخلايا البلعميةSTEMCELL Technologies (أو ما يعادلها)10961 (أو ما يعادلها)وسط خالي من المصل مستخدم لتمايز الخلايا البلعمية
دالبكو’وسط إيغل المعدل (DMEM)Thermo Fisher Scientific (أو ما يعادلها)12100046تستخدم لاستزراع الخلايا السرطانية وإعادة تعليقها
جسم مضاد ضابط من النمط الإسوي (IgG)Bio X Cell (أو ما يعادله)BE0297 (أو ما يعادلها)الضابط السلبي لمقايسة البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة
عديد السكاريد الدهني (LPS)Sigma-Aldrich (أو ما يعادلها)L2630 (أو ما يعادله)المحفز المستخدم لتنشيط الخلايا البلعمية بالاشتراك مع IFN-γγ
إنترفيرون غاما البشري المؤتلف (IFN-γ)STEMCELL Technologies (أو ما يعادلها)78020 (أو ما يعادله)السيتوكين المستخدم لتنشيط البلاعم
عامل تحفيز مستعمرات البلاعم البشري المؤتلف (M-CSF)STEMCELL Technologies (أو ما يعادلها)78057 (أو ما يعادلها)عامل النمو المستخدم لتمايز الخلايا البلعمية
ماصات باستور أو ماصات سيرولوجيةJetbiofil (أو ما يعادله)GSP010010 (أو ما يعادلها)تُستخدم لمناولة السوائل أثناء عزل الخلايا الوحيدة النوكليوية الدموية الطرفية (PBMC) واستزراع الخلايا.
محلول منظم من الفوسفات الملحي (PBS) (خالٍ من الكالسيوم)2+-/ملجم2+-خالٍ من)Thermo Fisher Scientific (أو ما يعادلها)BP399-500 (أو ما يعادله)المحلول المنظم المستخدم في غسل الخلايا وخطوات التخفيف
أطباق بتري (100 مم، غير مـ–(المعالج لزراعة الأنسجة)Corning (أو ما يعادلها)430591تُستخدم لتمايز الخلايا البلعمية عن طريق الاختيار بالالتصاق
محلول تحلل كريات الدم الحمراء (RBC)BioLegend (أو ما يعادلها)420301 (أو ما يعادلها)تُستخدم لإزالة خلايا الدم الحمراء أثناء عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)
صبغة Viobility 405/452 القابلة للتثبيتMiltenyi Biotec (أو ما يعادلها)130-130-404 (أو ما يعادله)تُستخدم لتقييم حيوية الخلايا أثناء تحليل قياس التدفق الخلوي
DAPISigma-Aldrich (أو ما يعادلها)D9542 (أو ما يعادله)تُستخدم لاستبعاد الخلايا الميتة في قياس التدفق الخلوي

المراجع

  1. Sung H, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.
  2. Perou CM, et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2000;406(6797):747-752.
  3. Foulkes WD, Smith IE, Reis-Filho JS. Triple-negative breast cancer. N Engl J Med. 363(20):1938-1948.
  4. Dent R, et al. Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 2007;13(15 Pt 1):4429-4434.
  5. Lin NU, et al. Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases. Cancer. 2008;113(10):2638-2645.
  6. Bianchini G, De Angelis C, Licata L, Gianni L. Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs. Nat Rev Clin Oncol. 2022;19(2):91-113.
  7. Lecoultre M, Dutoit V, Walker PR. Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review. J Immunother Cancer. 2020;8(2).
  8. Mantovani A, Allavena P, Marchesi F, Garlanda C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(11):799-820.
  9. Chan SH, Lin CY, Tseng HJ, Wang LH. Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8⁺ t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model. J Biomed Sci. 2025;32(1):73.
  10. Majeti R, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 2009;138(2):286-299.
  11. Barkal AA, et al. CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy. Nature. 2019;572(7769):392-396.
  12. Wang X, et al. CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder. Cell Metab. 2022;34(8):1088-1103.e1086.
  13. Chan SH, et al. Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 2019;18(1):147-161.
  14. Huang S, Zhang X, Wei Y, Xiao Y. Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy. Front Immunol. 2024;15:1367959.
  15. Weiskopf K, Weissman IL. Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer. MAbs. 2015;7(2):303-310.
  16. Cao X, et al. Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy. Sci Adv. 2022;8(11):eabl9171.
  17. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev Immunol. 1999;17:593-623.
  18. Flannagan RS, Jaumouille V, Grinstein S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 2012;7:61-98.
  19. Denardo DG, Ruffell B. Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2019;19(6):369-382.
  20. Horsthemke M, Wilden J, Bachg AC, Hanley PJ. Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages. J Vis Exp. 2018;(140). doi:10.3791/57566.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD24

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.