يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

التصوير الزمني لعملية بلعمة الخلايا البلعمية لخلايا سرطان الثدي ثلاثي السلبية الموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر والموجهة بالأجسام المضادة

219 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71461

⸱

أغسطس 14, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة للتصوير الحي للخلايا بنظام الفاصل الزمني (time-lapse) لتصور عملية البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة من قبل الخلايا البلعمية (macrophages) لخلايا سرطان الثدي ثلاثي السلبية المكتسية بالبروتين الفلوري الأخضر، وذلك باستخدام خلايا بلعمية مشتقة من الخلايا وحيدة النواة في الدم المحيطي ومجهر آلي.

الملخص

تعد البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة آلية رئيسية تقوم من خلالها البلاعم بابتلاع الخلايا السرطانية المغلّفة بالأجسام المضادة (opsonized). يصف هذا البروتوكول طريقة تصوير الخلايا الحية بفاصل زمني (time-lapse) لتصور عملية البلعمة التي تقوم بها البلاعم المعتمدة على الأجسام المضادة لخلايا سرطان الثدي ثلاثي السلبية التي تعبر عن CD24 والموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر. يتم اشتقاق البلاعم من خلايا الدم المحيطية وحيدة النواة البشرية، وتمايزها باستخدام عامل تحفيز مستعمرات البلاعم، وتوجيهها باستخدام إنترفيرون غاما والليبيد أ متعدد السكاريد لتوليد نمط ظاهري محفز للالتهاب. يتم تغليف الخلايا السرطانية بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ CD24 قبل الزرع المشترك مع البلاعم بنسبة محددة من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة. يتم تسجيل أحداث البلعمة على مدار فترة زمنية تبلغ 16 h باستخدام مجهر آلي مجهز بنظام تحكم بيئي للحفاظ على الظروف الفسيولوجية. يتم التصوير باستخدام قنوات الحقل المضيء والفلورية، مما يسمح بتحديد الخلايا السرطانية ومراقبة استيعابها داخلياً بواسطة البلاعم. وتظهر الصور الممثلة بفاصل زمني الابتلاع التدريجي للخلايا السرطانية الفلورية بمرور الوقت. ولتمكين التقييم الكمي، يتم إجراء اختبار نقطة نهاية موازٍ تحت ظروف زرع مشترك متطابقة، حيث تتم إزالة الخلايا السرطانية غير المستوعبة داخلياً قبل التصوير للسماح بالقياس الدقيق لأحداث البلعمة. توفر هذه الطريقة نهجاً معيارياً وقابلاً للتكرار لتصور البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة في المختبر (in vitro). والأهم من ذلك، أن دمج التصوير بفاصل زمني مع التكميم القائم على نقطة النهاية يتيح تقييماً تكميلياً لحركية ومقدار البلعمة. يدعم هذا البروتوكول تقييم الأجسام المضادة العلاجية والعلاجات المناعية للسرطان الموجهة نحو البلاعم في بيئة مختبرية محكومة.

المقدمة

يعد سرطان الثدي أكثر الأورام الخبيثة تشخيصاً بين النساء في جميع أنحاء العالم، حيث يسجل ما يقرب من 2.3 مليون حالة جديدة سنوياً1. ويتميز المرض بتغاير سريري ويُصنف إلى أربعة أنماط جزيئية رئيسية على الأقل بناءً على حالة المستقبلات الهرمونية — مستقبل الإستروجين (ER) ومستقبل البروجسترون (PR) — والتعبير عن الجين الورمي لمستقبل عامل نمو البشرة البشري 2 (HER2)2. تعبر أورام Luminal A عن ER و/أو PR دون فرط تعبير HER2 (ER/PR+ و HER2−)؛ بينما تعبر أورام Luminal B عن ER/PR و HER2 معاً (ER/PR+ و HER2+)؛ وتتميز أورام HER2+ بتعبير عالٍ عن HER2 بغض النظر عن حالة المستقبلات الهرمونية؛ أما سرطان الثدي ثلاثي السلبية (TNBC) فيفتقر إلى التعبير عن جميع العلامات الثلاث (ER− و PR− و HER2−)2,3. ومن بين هذه الأنماط، يمثل TNBC الشكل الأكثر تحدياً من الناحية السريرية ويشكل حوالي 15%–20% من جميع سرطانات الثدي. ويظهر المرضى المصابون بـ TNBC مساراً مرضياً هو الأكثر عدوانية، مع أسوأ التوقعات وأقصر معدل بقاء إجمالي لمدة 5 سنوات، وذلك بسبب الاستجابات الضعيفة للعلاج الكيميائي التقليدي وغياب العلاجات الموجهة الفعالة3,4. علاوة على ذلك، يظهر TNBC ميلاً مرتفعاً بشكل ملحوظ للنقائل الحشوية، خاصة إلى الرئتين خلال 5 سنوات من التشخيص، ويمتلك المرضى المصابون بـ TNBC المتقدم أو النقائلي (mTNBC) متوسط بقاء نادراً ما يتجاوز سنتين5,6. وتؤكد هذه الإحصائيات الحاجة الماسة والملحة لاستراتيجيات علاجية جديدة لـ TNBC.

تلعب البيئة الدقيقة للورم (TME) دوراً محورياً في تطور سرطان الثدي والهروب المناعي. وتُصنف البلعميات المرتبطة بالورم من بين أكثر الخلايا المناعية وفرة داخل البيئة الدقيقة للورم، وقد تم الاعتراف بها مؤخراً كوسطاء حاسمين للمناعة الفطرية المضادة للأورام7,8,9. وبينما كانت البلعميات المرتبطة بالورم تُقسم تاريخياً إلى حالات "M1" المحفزة للالتهابات وحالات "M2" المحفزة للأورام، فإن هذا النموذج الثنائي يفشل في استيعاب المدى الحقيقي لتباين البلعميات. بدلاً من ذلك، تشغل البلعميات المرتبطة بالورم طيفاً وظيفياً ديناميكياً، يتطور استجابةً للإشارات البيوكيميائية المتنوعة داخل البيئة الدقيقة للورم. وفي هذا المشهد المعقد، تعمل الخلايا السرطانية بنشاط على تحريف نشاط البلعميات من خلال استراتيجيات هروب مناعي مختلفة، لا سيما الإفراط في التعبير عن إشارات "لا تأكلني". وكان محور CD47/SIRPα هو أول نقطة تفتيش مناعية فطرية يتم تحديدها في هذا السياق6,10، ومؤخراً، ظهر CD24 كإشارة مضادة للبلعمة جديدة وقوية11,12. إن CD24 هو بروتين سكري من نوع الميوسين، صغير الحجم ومعالج بغليكوزيل مكثف، ومرتبط بغشاء الخلية عبر رابطة glycosylphosphatidylinositol13. ويتم التعبير عنه في سلالات مختلفة من الخلايا المناعية في الظروف الفسيولوجية، ولكنه غالباً ما يكون مفرط التعبير في الأورام الصلبة، بما في ذلك سرطانات الثدي والمبيض والبنكرياس والقولون والمستقيم14. وفي الخلايا الورمية، يرتبط CD24 بالمستقبل المثبط sialic acid–binding immunoglobulin-like lectin 10 (Siglec-10) الموجود على البلعميات. ويؤدي هذا التفاعل إلى تحفيز فسفرة نطاقات immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif في الذيل السيتوبلازمي لـ Siglec-10، مما ينشط فوسفاتازات SHP-1 و SHP-2 التي تثبط إشارات البلعمة اللاحقة11. وقد تبين أن حصر تفاعل CD24/Siglec-10 باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة يزيد بقوة من بلعمة الأورام البشرية التي تعبر عن CD24 بواسطة البلعميات. كما أظهرت دراستنا الأخيرة أن تعطيل CD24a في خلايا سرطان الثدي يزيد من قابليتها للبلعمة بواسطة البلعميات في نموذج فأري لسرطان الثدي ثلاثي السلبية9.

تعد البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCP) آلية محورية تقوم من خلالها الأجسام المضادة بتوجيه الخلايا البلعمية لبلعمة الخلايا الورمية15,16. فعند الارتباط بالمستضدات المعبر عنها في الورم، ترتبط منطقة Fc للجسم المضاد بمستقبلات Fcγ (FcγRs) الموجودة على الخلايا البلعمية، مما يحفز شلالات إشارات داخل خلوية تنتهي بإعادة ترتيب الهيكل الخلوي، وتشكيل الكأس البلعمي، واحتواء الخلية المستهدفة17.

في هذه الدراسة، قمنا بتطوير والتحقق من صحة بروتوكول تصوير حي للخلايا بنظام الفاصل الزمني (time-lapse) لقياس البلعمة التي تحفزها الأجسام المضادة بواسطة الخلايا البلعمية لخلايا سرطان الثدي. تعتمد هذه الطريقة على استخدام الخلايا البلعمية المشتقة من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) من متبرعين بشريين أصحاء، حيث يتم تمايزها باستخدام العامل المحفز لمستعمرات الخلايا البلعمية (M-CSF) ثم تحفيزها لاحقاً باستخدام عديد السكاريد الشحمي (LPS) وإنترفيرون غاما (IFN-γ). وقد أكد تحليل قياس التدفق الخلوي زيادة تنظيم CD80 ضمن مجموعة CD11b⁺ بعد التحفيز (الشكل 1)، مما يدعم النمط الظاهري المنشط كلاسيكياً. تمنح حالة التنشيط هذه قدرة بلعمية قوية بوساطة الأجسام المضادة، مما يجعلها مناسبة لتقييم البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة (ADCP). وتعمل خلايا سرطان الثدي الموجبة لـ CD24 والموسومة بـ GFP كخلايا مستهدفة، ويتم تغليفها (opsonized) باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة علاجي مضاد لـ CD24 قبل الزراعة المشتركة. يتم تسجيل أحداث البلعمة على مدار فترة زمنية مدتها 16 h باستخدام مجهر آلي تحت ظروف بيئية مضبوطة. ولتمكين التقييم الكمي بالتوازي مع التصوير الديناميكي، يتم إجراء مقايسة نهائية منفصلة تحت ظروف زراعة مشتركة متطابقة، مما يسمح بقياس دقيق للبلعمة بعد إزالة الخلايا المستهدفة التي لم يتم استيعابها داخلياً. يوفر هذا البروتوكول منصة قياسية وقابلة للتكرار ومعلوماتية بصرياً لتقييم ADCP بوساطة جسم مضاد مضاد لـ CD24. والأهم من ذلك أن دمج التصوير بنظام الفاصل الزمني مع استراتيجية كمية تكميلية قائمة على المقايسة النهائية يتيح التقييم المتزامن لحركية البلعمة ومقدارها. ويمكن تكييف هذه الطريقة للبحث في أهداف علاجية مناعية أخرى موجهة للخلايا البلعمية. ويعد هذا البروتوكول الأكثر ملاءمة لتقييم ADCP بوساطة الأجسام المضادة أحادية النسيلة العلاجية ضد المستضدات السطحية على الخلايا السرطانية. كما أنه مناسب للفحص المقارن للأجسام المضادة المرشحة، وتوصيف استجابة الجرعة، والدراسات الميكانيكية لارتباط Fc–FcγR، بما في ذلك آثار حصر إشارات "لا تأكلني" (على سبيل المثال، CD47–SIRPα). وبما أن المقايسة تستخدم خلايا بلعمية بشرية أولية، فهي مناسبة أيضاً للدراسات الانتقالية التي تتطلب تقييم التباين بين المتبرعين قبل التطوير السريري.

figure-introduction-1
الشكل 1. إنتاج والتحقق بواسطة قياس التدفق الخلوي من البلاعم المحفزة بـ IFN-γ/LPS والمشتقة من الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي. اللوحة العلوية: يتم عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) من متبرعين أصحاء عن طريق الطرد المركزي بالتدرج الكثافي باستخدام محلول Ficoll عند 400 × g لمدة 30 min عند 20°C، مع موازنة جميع الكواشف مسبقاً عند 20°C ± 2°C. تُزرع الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي المعزولة في وسط ImmunoCult-SF مضاف إليه 100 ng/mL من العامل المحفز لمستعمرات البلاعم (M-CSF) لمدة 7 أيام لتحفيز تمايز البلاعم (اليوم 0–7)، مع تزويد الوسط في اليوم 5. في اليوم 8، يتم تحفيز البلاعم المتمايزة بـ 100 ng/mL من IFN-γ و 1 µg/mL من LPS لمدة 48 h (اليوم 8–10). ثم تخضع الخلايا لتحليل قياس التدفق الخلوي. اللوحة السفلية: تحليل قياس التدفق الخلوي للبلاعم. صُبغت الخلايا بلوحة سطحية تتكون من CD11b-FITC و CD80-PE و CD206-PerCP-Cy5.5، متبوعة بإضافة DAPI قبل عملية الاستحواذ لاستبعاد الخلايا الميتة. استراتيجية تحديد البوابات: تم تحديد البوابات أولاً على الخلايا الحية (DAPI⁻)، متبوعة بتحديد CD11b⁺ في مخطط CD11b-FITC مقابل FSC-A لتأكيد هوية البلاعم. ثم حُللت أحداث CD11b⁺ الحية في مخطط نقطي لـ CD80 مقابل CD206 لتأكيد وجود جمهرة CD80⁺CD206⁻ الناتجة عن تحفيز IFN-γ/LPS. اليمين: مخطط نقطي تمثيلي لـ CD11b-FITC مقابل FSC-A يظهر أن 99.8% من الخلايا المحددة كانت CD11b⁺، مما يؤكد هوية البلاعم. اليسار: وقعت غالبية خلايا CD11b⁺ ضمن بوابة CD80⁺CD206⁻ (Q1: 95.2%)، مما يشير إلى النمط الظاهري المسبب للالتهاب المتوقع في ظل ظروف التحفيز المطبقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يجب على المستخدمين مراعاة عدة قيود عند تطبيق هذه التقنية. أولاً، يمكن أن يؤدي التباين بين المانحين في الخلايا البلعمية المشتقة من PBMC إلى إحداث تباين كبير في ناتج البلعمة، لذا نوصي باستخدام عدة مانحين (n ≥ 3) مع تقديم بيانات كل مانح بشكل فردي إلى جانب النتائج المجمعة. ثانياً، لا يحاكي تنسيق المزارع المشتركة ثنائية الأبعاد (2D co-culture) البيئة الدقيقة للورم، لذا ينبغي التحقق من النتائج في نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) أو نماذج حية (in vivo) قبل الاستنتاج السريري. ثالثاً، تلتقط نافذة التصوير التي تستمر لمدة 16 ساعة أحداث البلعمة المبكرة ولكنها لا تعكس العمليات طويلة المدى مثل تقديم المستضد أو التنشيط المناعي الثانوي. وبناءً على ذلك، فإن الاستخدام المشترك للتصوير في الوقت الفعلي والتقدير الكمي النهائي يوفر إطاراً تكميلياً يعزز كلاً من قابلية التفسير وإمكانية تكرار قياسات ADCP.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يتضمن هذا البروتوكول استخدام البلاعم الأولية المستمدة من عينات دم من متبرعين أصحاء. وقد تم جمع العينات ومعالجتها وفقاً لإرشادات مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) بجامعة الصين الطبية.

1. تحضير البالعات المشتقة من الخلايا الوحيدة الدموية الطرفية (PBMC)

ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الإجراءات التي تتضمن دماً بشرياً بموجب موافقة مجلس مراجعة المؤسسة (على سبيل المثال، CMUH IRB). كما يجب الحصول على موافقة مستنيرة من المتبرعين الأصحاء قبل عملية جمع الدم.

تنبيه: يجب التعامل مع جميع منتجات الدم البشرية وفقاً لشروط المستوى الثاني من السلامة البيولوجية (Biosafety Level 2) وباستخدام الاحتياطات العالمية.

  1. جمع الدم
    1. جمْع الدم الكامل من متبرع سليم في أنابيب vacutainer سعة 10 mL مطلية بحمض إيثيلين ثنائي أمين رباعي الخليك (EDTA).
  2. تخفيف الدم
    1. تخفيف الدم الكامل بنسبة 1:1 باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS; Ca2⁺-/Mg2⁺-free) مبرد بالثلج (على سبيل المثال، 10 mL من الدم + 10 mL من PBS).
    2. المزج عن طريق القلب من ثلاث إلى خمس مرات.
      ملاحظة: يُحفظ محلول PBS على الثلج قبل الاستخدام. تساعد درجة الحرارة المنخفضة في الحفاظ على حيوية الخلايا أثناء المعالجة.
  3. طبقات تدرج الكثافة
    1. وضع طبقة من الدم المخفف بعناية فوق Ficoll–Paque PLUS بنسبة حجمية 2:1 (v/v) في أنبوب مخروطي (على سبيل المثال، 8 mL من الدم فوق 4 mL من Ficoll في أنبوب 15 mL، أو 30 mL فوق 15 mL في أنبوب 50 mL).
    2. موازنة درجة حرارة كل من الدم المخفف وFicoll–Paque PLUS لتصل إلى 20°C ± 2°C قبل وضع الطبقات.
    3. إخراج Ficoll–Paque PLUS من التخزين عند 4°C قبل 30 دقيقة على الأقل من الاستخدام، أو تدفئته لفترة وجيزة في حمام مائي بدرجة حرارة 20°C ± 2°C.
    4. عدم استخدام الكواشف المبردة، حيث إن كثافة Ficoll معايرة لدرجة حرارة 20°C ± 2°C، وأي انحرافات ستؤثر سلباً على كفاءة الفصل وحصيلة الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC).
      ملاحظة: يتم إمالة الأنبوب بزاوية 45° وسحب الدم ببطء عبر الجدار للحفاظ على واجهة فاصلة حادة. يجب عدم تعكير طبقة Ficoll.
  4. الطرد المركزي
    1. الطرد المركزي بسرعة 400 × g لمدة 30 دقيقة عند 20°C مع إيقاف تشغيل المكبح (الشكل 1).
      ملاحظة: يؤدي استخدام المكبح إلى تعطيل تدرج الكثافة وتقليل حصيلة PBMC.
  5. جمع PBMC
    1. سحب طبقة الغشاء الكريمي (buffy coat) فقط بعناية (وهي الواجهة البيضاء الموجودة بين طبقتي البلازما وFicoll)، دون تعكير البلازما في الأعلى أو طبقة Ficoll في الأسفل، باستخدام ماصة سيرولوجية.
    2. نقل الطبقة التي تم جمعها إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 mL.
  6. غسل PBMC
    1. إضافة PBS لرفع الحجم الإجمالي إلى 25 mL في أنبوب مخروطي سعة 50 mL.
    2. استخدام أنبوب 50 mL لضمان إجراء الطرد المركزي والموازنة بشكل صحيح.
    3. الطرد المركزي بسرعة 300 × g لمدة 10 دقائق.
  7. تحلل كريات الدم الحمراء
    1. التخلص من السائل الطافي.
    2. إعادة تعليق الراسب في 5 mL من محلول تحلل كريات الدم الحمراء (RBC lysis buffer) عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام ماصة سيرولوجية حتى يتشتت الراسب تماماً ولا تتبقى أي تكتلات مرئية.
    3. التحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      تحذير: التشتت الكامل ضروري لضمان تحلل متجانس؛ ومع ذلك، يجب تجنب السحب والضخ القوي أو استخدام جهاز الرج (vortexing)، لأن ذلك قد يتلف PBMC. يجب عدم تجاوز 5 دقائق من التحضين مع محلول تحلل RBC، حيث إن التعرض المطول قد يؤثر على حيوية PBMC.
  8. ترسيب PBMC
    1. الطرد المركزي بسرعة 500 × g لمدة 5 دقائق لترسيب PBMC وإزالة حطام كريات الدم الحمراء المتحللة.
  9. إعادة التعليق النهائية
    1. التخلص من السائل الطافي.
    2. إعادة تعليق الراسب في 5 mL من وسط ImmunoCult-SF لزراعة البلاعم.
      ملاحظة: في الظروف القياسية، ينتج عادةً عن 10 mL من الدم الكامل ما يتراوح بين 1.5–2.0 × 107 من PBMC.

2. تمايز الخلايا البلعمية (الأيام 0-7)

ملاحظة: استخدم أطباق بتري غير المعالجة لزراعة الأنسجة (TC) لاختيار الخلايا البلعمية المتمايزة المشتقة من الخلايا الوحيدة عن طريق الالتصاق. سيتم غسل الخلايا اللمفاوية غير الملتصقة أثناء عملية الزراعة اللاحقة.

  1. اليوم 0: استزراع الخلايا
    1. إجراء عد الخلايا واستزراع 1 × 107 من خلايا PBMCs في طبق بتري بقطر 10 cm غير معالج بـ TC.
    2. رفع الحجم الإجمالي إلى 10 mL باستخدام وسط ImmunoCult-SF للخلايا البلعمية المدعم بـ 100 ng/mL من M-CSF (يتم تحضيره بإضافة مخزون M-CSF مباشرة إلى الوسط الكامل قبل الاستخدام مباشرة والخلط عن طريق القلب اللطيف).
      ملاحظة: يمكن تغيير مقياس البروتوكول بشكل تناسبي لاستيعاب الاختلافات في إنتاج PBMC من المتبرع، باستخدام كثافة استزراع تبدأ من 1 × 106 خلية/mL كقاعدة أساسية.
  2. التحضين والمراقبة
    1. التحضين عند 37°C مع 5% CO₂ في حاضنة رطبة.
    2. مراقبة تكون تجمعات الخلايا الوحيدة العائمة وظهور الخلايا الملتصقة يومياً.
      ملاحظة: ستزداد الخلايا الوحيدة تدريجياً في الحجم وتكون تجمعات مع تقدم التمايز. ستبدأ بعض الخلايا الوحيدة في الالتصاق بالطبق. لا يتطلب الأمر أي تدخل في هذه الخطوة.
  3. اليوم 5: تدعيم الوسط الغذائي
    1. إضافة 5 mL من وسط ImmunoCult-SF الطازج للخلايا البلعمية المدعم بـ 100 ng/mL من M-CSF بلطف إلى الطبق، مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا البلعمية الملتصقة.
    2. الاستمرار في الاستزراع لمدة يومين إضافيين (حتى اليوم 7).
      تنبيه: أضف الوسط الطازج بلطف على طول جانب الطبق لتجنب إزعاج الخلايا البلعمية الملتصقة، حيث إن الاضطراب الميكانيكي قد يؤثر على كفاءة التمايز وحصيلة الخلايا.
      ملاحظة: تجنب استبدال الوسط للحفاظ على العوامل ذات الإفراز الذاتي/جوار الخلايا التي تدعم تمايز الخلايا البلعمية.
  4. اليوم 7: التقييم المورفولوجي
    1. فحص كفاءة تمايز الخلايا البلعمية باستخدام مجهر مقلوب.
    2. تظهر الخلايا الملتصقة مورفولوجيا مميزة للخلايا البلعمية: كبيرة، ومسطحة، وغير منتظمة الشكل، مع وجود أقدام كاذبة مرئية.
    3. في اليوم 7، يجب أن تكون الخلايا البلعمية المتميزة جيداً مرئية.
      تنبيه: يعد التقييم المورفولوجي في اليوم 7 شرطاً أساسياً وحرجاً للتحقق اللاحق عن طريق قياس التدفق الخلوي. يجب أن تكون الخلايا البلعمية المتميزة جيداً مرئية بوضوح تحت المجهر، وتعكس النسبة الأعلى من الخلايا الملتصقة ذات المورفولوجيا البلعمية كفاءة تمايز أكبر (تعتبر نسبة تلاقي تبلغ 70% تقريباً من الخلايا البلعمية الملتصقة ذات المورفولوجيا المميزة مؤشراً على التمايز الناجح). من غير المرجح أن تعطي المزارع التي تظهر التصاقاً شحيحاً، أو خلايا مستديرة بشكل مهيمن، أو تمايزاً مورفولوجياً ضعيفاً نتائج موثوقة في قياس التدفق الخلوي، ولا ينبغي المضي بها إلى مرحلتي التحفيز والتلوين.

3. استقطاب الخلايا البلعمية (الأيام 8–10)

  1. جمع وتنقية الوسط المكيف
    1. في اليوم 8، اسحب بعناية 15 mL من الوسط من طبق الزرع دون تحريك البلاعم الملتصقة وانقله إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 50 mL.
    2. قم بطرد مركزي للوسط المجموع عند 400 × g لمدة 5 min لترسيب حطام الخلايا.
    3. احتفظ بالرائق المنقى للخطوة التالية.
  2. التحفيز باستخدام إنترفيرون غاما (IFN-γ) والعديد السكري الشحمي (LPS)
    1. انقل 15 mL من الرائق المنقى إلى أنبوب معقم جديد وأضف إليها 100 ng/mL من IFN-γ و 1 µg/mL من LPS.
    2. امزج المكونات جيداً عن طريق السحب والضخ اللطيف بالماصة (5–10 مرات) لضمان توزيع السيتوكينات بشكل متجانس دون إدخال فقاعات.
    3. أعد الـ 15 mL كاملة من الوسط المكمل بالسيتوكينات إلى طبق الزرع الأصلي، مع السحب والضخ بلطف على طول الجدار الداخلي لتجنب تحريك البلاعم الملتصقة.
    4. حضن العينات عند 37°C مع 5% CO₂ لمدة 48 h (من اليوم 8 إلى اليوم 10).
      ملاحظة: استخدم الوسط المكيف (القديم) للحفاظ على العوامل ذات الإفراز الذاتي/جوار الخلية. يُستخدم هذا المزيج من IFN-γ و LPS لاستقطاب البلاعم إلى نمط ظاهري محفز للالتهابات. في ظل ظروف التحفيز باستخدام IFN-γ (100 ng/mL) و LPS (1 µg/mL) المتبعة في هذا البروتوكول، تظهر البلاعم تغيرات مورفولوجية مميزة، بما في ذلك الأقدام الصفائحية المستطيلة التي تتوافق مع حالة التنشيط المحفزة للالتهابات، بالإضافة إلى تعبير CD11b و CD80.
      تنبيه: تعامل مع LPS وفقاً لإجراءات السلامة المختبرية المناسبة، حيث إنه ذيفان داخلي نشط بيولوجياً قد يسبب استجابات التهابية عند التعرض له.

4. تأكيد علامات النمط الظاهري الالتهابي للخلايا البلعمية المحفزة بـ IFN-γ و LPS بواسطة قياس التدفق الخلوي

  1. حصاد الخلايا
    1. اجمع مجموعة فرعية من البالعات الكبيرة المستقطبة في اليوم العاشر من أجل التنميط المظهري.
    2. أضف 10 مللي مولار من EDTA في محلول PBS، ثم احضن الخليط لمدة تتراوح بين 10 و15 دقيقة عند 37°C.
    3. افصل الخلايا عن طريق السحب اللطيف باستخدام الماصة.
      ملاحظة: قم بتمديد فترة الحضن بـ EDTA لمدة 30 دقيقة إضافية عند 37°C إذا ظلت الخلايا ملتصقة، فكرر عملية السحب والنفخ اللطيف بالماصة. تجنب السحب والنفخ العنيف أو الكشط الميكانيكي للحفاظ على حيوية الخلايا وسلامة المؤشرات السطحية.
  2. إعداد صبغ الأجسام المضادة
    1. قم بصبغ الخلايا باستخدام أجسام مضادة مقترنة بفلوروكوم ضد CD11b (علامة سلالة البلاعم العامة)، وCD80 (علامة التهابية)، وCD206 (علامة مضادة للالتهاب تُستخدم كعلامة استبعاد سلبية لتحديد النمط الظاهري الالتهابي).
  3. إجراء الصبغ
    1. نقل 5 × 105 نقل البلاعم المنفصلة إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي المحتوي على 100 µL من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) البارد.
    2. أضف الأجسام المضادة CD11b-FITC وCD80-PE وCD206-PerCP-Cy5.5 ليكون التركيز النهائي 1 µg/mL لكل منها.
    3. امزج معلق الخلايا عن طريق السحب والضخ اللطيف باستخدام الماصة.
    4. تُحضن العينات على الثلج لمدة ساعة واحدة، مع حمايتها من الضوء.
    5. طرد العينات مركزياً عند 300 × ج لمدة دقيقة واحدة عند 4°C.
    6. اشفط السائل الطافي بعناية.
    7. أضف 0.5 مل من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) البارد لغسل كتلة الخلايا المترسبة.
    8. قم بطرد العينات مركزياً عند 300 × جـ لمدة دقيقة واحدة عند 4°C.
    9. تخلص من الراشح.
    10. أعد تعليق ركازة الخلايا في 200 µL من محلول PBS البارد.
    11. أضف DAPI ليصل إلى تركيز نهائي قدره 1 µg/mL.
      ملحوظة: يجب تضمين ضوابط النمط الجزيئي (isotype controls) المناسبة وصبغة حيوية (مثل DAPI أو صبغة Viobility 405/452 Fixable Dye).
  4. تحليل قياس التدفق الخلوي
    1. اكتسب العينات المصبوغة باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي.
    2. تأكيد تعبير CD11b وCD80 في مجموعة الخلايا البلعمية.
    3. انتقل إلى اختبار البلعمة فقط بعد التأكد من أن تعبير العلامات يتوافق مع النمط الظاهري الالتهابي.
  5. تحصيل بيانات قياس التدفق الخلوي وإعداد الجهاز
    1. إعداد الجهاز
      1. قم بتكوين جهاز قياس التدفق الخلوي باستخدام القنوات التالية: Pacific Blue/V450 (DAPI)، وFITC (CD11b)، وPE (CD80)، وPerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. اضبط معالم الاستحواذ لجمع 10,000 حدث لكل عينة ضمن البوابة الأبوية المحددة.
    2. معايرة العتبة والكسب
      1. افتح أربعة مخططات نقطية (dot plots) تعرض التشتت الأمامي للخلية (FSC) على المحور السيني وقناة فلوروفور واحدة على المحور الصادي.
      2. قم بتحضير خلايا مصبوغة بالأجسام المضادة الضابطة من النوع المتماثل (isotype control) المقابلة لكل فلوروفور.
      3. الحصول على عينات ضابطة من النمط المناعي (isotype control).
      4. اضبط الكسب (gain) لكل قناة بحيث يتم وضع مجموعة التحكم من النمط المتماثل (isotype control) تحت القيمة 10.1 على المقياس اللوغاريتمي.
      5. استخدم هذه العتبة لتحديد مستويات إشارة الخلفية.
        ملاحظة: استخدم نطاق مقياس لوغاريتمي بمقدار 101 إلى 101·5 لإيجاد فصل موثوق بين الإشارة الخلفية والإشارة النوعية.
    3. التعويض
      1. أضف قطرة واحدة من خرزات التعويض إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
      2. أضف الجسم المضاد المقترن بالفلوروفور المناظر ليكون التركيز النهائي هو 1 µg/mL.
      3. تُحضن لمدة 30 دقيقة على الثلج، مع الحماية من الضوء.
      4. يُوضع في جهاز الطرد المركزي عند 400 دورة في الدقيقة × جاذبية (g) لمدة دقيقة واحدة.
      5. تخلص من الطافي.
      6. أعد تعليق الخرزات في 200 µL من المحلول الملحي الملحق بالفوسفات (PBS) البارد.
      7. الحصول على ضوابط اللون الواحد.
      8. تطبيق التعويض الطيفي لتصحيح تداخل الفلوروفورات.
    4. استراتيجية تحديد البوابات
      1. اختيار الخلايا الحية
        1. اعرض Pacific Blue/V450 (DAPI) على المحور الصادي (y-axis) وFSC على المحور السيني (x-axis).
        2. تحديد بوابة للأحداث السلبية لصبغة DAPI (أقل من 101لاختيار الخلايا الحية.
      2. تحديد الخلايا البلعمية
        1. حدد مجتمع الخلايا الحية كبوابة أصل.
        2. اعرض FITC (CD11b) على المحور الصادي وFSC على المحور السيني.
        3. تحديد البوابة على CD11b⁺ الأحداث (أعلى من 101).
      3. تحديد النمط الظاهري الالتهابي
        1. تحديد CD11b⁺ المجتمع كبوابة أب.
        2. اعرض PE (CD80) على المحور الصادي و PerCP-Cy5.5 (CD206) على المحور السيني.
        3. قم بتطبيق تقسيم المربعات (quadrant gating) عند 101.5 على كلا المحورين.
        4. تحديد CD80⁺CD206⁻ الخلايا في الربع العلوي الأيسر (Q1).
  6. معايير القبول
    1. تأكد من أن ≥90% من الخلايا ضمن نطاق CD11b⁺ بوابة الأصل هي CD80⁺CD206⁻.
    2. لا تنتقل إلى اختبار البلعمة إلا عند تحقيق هذه العتبة.
    3. كرر عملية عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)، والتمايز باستخدام عامل تحفيز مستعمرات البلاعم (M-CSF)، و... IFN-γتحفيز LPS إذا لم تستوفِ العينات هذا المعيار.

5. مقايسة البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة

ملاحظة: تحقق من التعبير المستقر لـ GFP في الخلايا السرطانية قبل إعداد المقايسة. تأكد من تعبير CD24 على الخلايا المستهدفة قبل إجراء المقايسة. استخدم الخلايا السرطانية التي تتراوح فيها نسبة إيجابية CD24 بين 50%–100% لتحقيق الأداء الأمثل. تظهر خلايا MDA-MB-468 المستخدمة في هذا البروتوكول إيجابية CD24 بنسبة 100%.

  1. استزراع الخلايا البلعمية
    1. قم باستزراع الخلايا البلعمية المحفزة بـ IFN-γ و LPS، كما تم التحقق منها في الخطوة 4، بكثافة 2 × 105 خلية لكل بئر في طبق زراعة أنسجة مكون من 24 بئرًا.
    2. حضّن الطبق عند درجة حرارة 37°C تحت ظروف سكون مع 5% CO₂ لمدة 12–16 ساعة للسماح بالتصاق الخلايا (الشكل 2A).
      ملاحظة: تأكد من التصاق الخلايا البلعمية بإحكام قبل المتابعة؛ حيث إن الخلايا ضعيفة الالتصاق قد تنفصل أثناء التصوير وتؤدي إلى نتائج مضللة.
  2. تحضير الخلايا السرطانية
    1. قم بزراعة خلايا سرطان الثدي (MDA-MB-468) الموجبة لـ CD24 والموسومة بـ GFP حتى تصل درجة التلاقي إلى 70%–80%.
    2. قم بشفط وسط الزراعة.
    3. اغسل الطبقة أحادية الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.
  3. فصل الخلايا السرطانية
    1. أضف 10 mM EDTA في PBS إلى طبق الزراعة.
    2. حضّن الخلايا عند درجة حرارة 37°C لمدة 5–10 دقائق.
    3. افصل الخلايا عن طريق السحب اللطيف بالممصّة لتحقيق تحرر كامل للخلايا.
      ملاحظة: تجنب استخدام التربسين لفصل الخلايا؛ إذ قد يؤدي الهضم الإنزيمي إلى شطر CD24 من سطح الخلية وإعاقة ارتباط الأجسام المضادة.
  4. جمع وعد الخلايا السرطانية
    1. اجمع الخلايا المنفصلة في أنبوب طرد مركزي.
    2. قم بطرد الخلايا مركزياً عند 300 × g لمدة 5 دقائق.
    3. تخلص من الراشح.
    4. أعد تعليق كتلة الخلايا في وسط RPMI كامل.
    5. قم بعدّ الخلايا الحية.
  5. طمس الخلايا السرطانية بالأجسام المضادة
    1. أعد تعليق الخلايا السرطانية بكثافة 2 × 105 خلية/مل في 0.5 مل من وسط RPMI كامل.
    2. أضف الجسم المضاد أحادي النسيلة anti-CD24 ليصل التركيز النهائي إلى 1 µg/mL.
    3. امزج معلق الخلايا بالسحب اللطيف بالممصّة لضمان توزيع متجانس للأجسام المضادة.
    4. حضّن الخلايا عند درجة حرارة 37°C لمدة 30 دقيقة تحت ظروف سكون.
      ملاحظة: استخدم تحكم IgG مطابق للنمط الجيني وبنفس التركيز كعنصر تحكم سلبي لعملية البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة.
  6. التحضير للزراعة المشتركة
    1. لا تغسل الخلايا بعد عملية الطمس.
    2. انتقل مباشرة إلى الزراعة المشتركة للحفاظ على تغطية الأجسام المضادة لسطح الخلية.
  7. إعداد الزراعة المشتركة
    1. أضف 1 × 105 خلية من خلايا سرطان الثدي الموسومة بـ GFP والمطمسة بالأجسام المضادة إلى كل بئر يحتوي على الخلايا البلعمية.
    2. حافظ على نسبة الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة بمقدار 2:1.
      ملاحظة: اضبط نسبة الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة بناءً على التصميم التجريبي. استخدم نسباً أعلى من الخلايا البلعمية إلى الخلايا السرطانية من النسبة المذكورة 2:1 (مثل 3:1 أو 5:1) لزيادة تكرار التلامس بين الخلايا وتعزيز اكتشاف أحداث البلعمة.

figure-protocol-1
الشكل 2. التصوير الزمني لعملية البلعمة الخلوية المعتمدة على الأجسام المضادة. (A) نظرة عامة تخطيطية لنظام الزراعة المشتركة وإعداد التصوير الزمني. تضمنت معايير التصوير فاصلًا زمنيًا قدره 10 min على مدار وقت استحواذ إجمالي قدره 16 h (97 إطارًا)، باستخدام عدسة شيئية 10× مع قنوات تباين الطور وGFP. (B) صور زمنية ممثلة من 1 h إلى 16 h تظهر أحداث البلعمة التي تتميز بدمج الخلايا السرطانية الموجبة لـ GFP داخل البلاعم بمرور الوقت. تبرز الدوائر الصفراء المتقطعة أحداث بلعمة ممثلة. في قناة تباين الطور، تظهر الخلايا السرطانية المبتلعة كهياكل داخل خلوية ساطعة في طور التباين ضمن سيتوبلازم البلاعم (الأسهم البيضاء). وفي قناة GFP، يؤكد الفلورسنت الموضع داخل البلاعم عملية الدمج الداخلي. (C) مناظر مكبرة لأحداث بلعمة ممثلة عند 0 و1 و4 و16 h، توضح العملية المتسلسلة للابتلاع الذي تتوسطه البلاعم للخلايا السرطانية الموسومة بـ GFP. تم اختيار تسلسل الصور كنموذج ممثل بناءً على التصور الواضح لأحداث البلعمة التي تتوسطها البلاعم. تشير الأسهم البيضاء إلى البلاعم التي تتفاعل مع الخلايا المستهدفة وتقوم بدمجها داخليًا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

6. التصوير بنظام الفاصل الزمني (نظام آلي لتصوير الخلايا الحية)

ملاحظة: قم بتكوين بروتوكول التصوير باستخدام نظام Lionheart للتصوير الآلي للخلايا الحية وبرنامج Gen5 للتصوير الآلي للخلايا الحية قبل إجراء المقايسة. احصل على التدريب المناسب قبل تشغيل نظام التصوير لضمان الإعداد الدقيق، والأداء الأمثل، والاستخدام الآمن.

  1. تجهيز الجهاز
    1. قم بتشغيل نظام التصوير، ووحدة التحكم البيئي، وإمدادات غاز CO₂ قبل التصوير بساعة واحدة على الأقل.
    2. افتح لوحة التحكم البيئي (Environment Control) في برنامج التصوير الآلي للخلايا الحية.
    3. اضبط درجة الحرارة على 37°C وCO₂ على 5%.
    4. تأكد من استقرار درجة حرارة الحجرة في حدود ± 0.2°C وCO₂ عند 5.0% ± 0.1% قبل تحميل الطبق.
  2. إعداد الطبق
    1. ضع الطبق ذو الـ 24 بئراً في حجرة التصوير الخاصة بنظام التصوير.
  3. التكوين الأولي
    1. افتح مدير المهام (Task Manager) في برنامج التصوير الآلي للخلايا الحية.
    2. اختر [وضع المصور اليدوي - Imager manual mode].
    3. انقر على [التقاط الآن - Capture now] لتهيئة معلمات التصوير.
    4. اختر عدسة شيئية بقوة 10×.
    5. اختر "microplate" كإعداد للمرشح.
    6. اختر طبقاً ذو 24 بئراً من مكتبة الأطباق في برنامج التصوير الآلي للخلايا الحية.
  4. ضبط التركيز وإعداد الصورة
    1. اختر قناة تباين الطور (Phase Contrast).
    2. اختر بئراً ممثلاً (على سبيل المثال، A1).
    3. قم بتنشيط التركيز التلقائي (autofocus) قبل بدء عملية التصوير المتقطع (time-lapse).
    4. التقط صورة باستخدام أيقونة الكاميرا.
    5. تأكد من مورفولوجيا الخلايا وجودة التركيز.
    6. انتقل إلى [المعالجة/التحليل - Process/Analyze].
    7. اختر [إنشاء تجربة من مجموعة صور - Create experiment from an image set] لتكوين التجربة.
  5. معلمات التصوير المتقطع (Time-lapse)
    1. افتح لوحة إعدادات [الإجراء - Procedure].
    2. اضبط درجة الحرارة على 37°C وCO₂ على 5%.
    3. ضمن [بدء الحركية - Start Kinetic]، اضبط وقت التشغيل على 16:00:00.
    4. اضبط الفاصل الزمني للتصوير على 0:10:00.
    5. اضبط إجمالي عدد القراءات على 97.
    6. استخدم فاصلاً زمنياً للتصوير يتراوح بين 10–15 دقيقة للموازنة بين الدقة الزمنية والسمية الضوئية مع التقاط أحداث البلعمة المبكرة.
  6. تكوين قناة التصوير
    1. اضبط القناة 1 على تباين الطور (Phase Contrast).
    2. اضبط القناة 2 على GFP (Ex 469/35, Em 525/39).
    3. اختر عدسة شيئية بقوة 10× للحصول على أفضل مجال رؤية ودقة.
    4. اضبط الإضاءة، ووقت التكامل، والكسب على [تلقائي - Auto]، أو قم بتعديلها يدوياً.
    5. استخدم وقت تعريض نموذجياً لـ GFP يتراوح بين 100–300 ms لتجنب تشبع الإشارة.
    6. طبق إعدادات التصوير ذاتها على جميع الآبار.
  7. إعداد موضع التصوير
    1. افتح قائمة [تحديد نقاط الاستدلال - Define beacons].
    2. قم بتعطيل التقاط مكدس Z (Z-stack).
    3. قم بتعطيل التقاط المونتاج (montage).
    4. أجرِ التصوير عند مستوى بؤري واحد.
    5. حدد مواضع التصوير يدوياً عن طريق اختيار مناطق ممثلة وغير متداخلة داخل كل بئر باستخدام أيقونة المجهر.
    6. حافظ على مواضع تصوير متطابقة عبر جميع النقاط الزمنية.
    7. اختر من 4 إلى 6 مجالات رؤية على الأقل لكل بئر.
  8. عملية التصوير المتقطع
    1. انقر على [تشغيل - Play] لبدء التصوير المتقطع الآلي.
  9. تصدير البيانات والتصور
    1. افتح ملف التجربة المحفوظ بعد عملية التصوير.
    2. اختر مواضع التصوير.
    3. صدر بيانات التصوير المتقطع بتنسيق MP4.
    4. افتح [أداة المعالجة - Process Tool].
    5. طبق [فك التلفيف الصوري - Image Deconvolution] إذا لزم الأمر لتحسين التصور وتحديد أحداث البلعمة الممثلة.
      ملاحظة: استخدم التصوير المتقطع للتصور النوعي فقط. قد تتداخل الخلايا السرطانية الموجبة لـ GFP غير المبتلعة مع البالعات أو ترتبط بها بشكل عابر، مما يؤدي إلى إشارات إيجابية خاطئة. أجرِ التحليل الكمي باستخدام مقايسة نقطة نهاية منفصلة.

7. التكميم النهائي لعملية البلعمة

  1. إزالة الخلايا غير الممتصة
    1. إجراء المقايسة تحت ظروف استزراع مشترك متطابقة.
    2. إنهاء التجربة عند 4 h.
    3. إزالة وسط الاستزراع.
    4. إضافة 10 mM EDTA في PBS.
    5. التحضين عند 37°C لمدة 5 min.
    6. الغسل بلطف باستخدام PBS لإزالة الخلايا الموجبة لـ GFP غير الممتصة.
    7. إضافة وسط بلعميات جديد.
  2. اكتساب الصور للتقدير الكمي
    1. اكتساب الصور باستخدام قنوات تباين الطور وGFP.
    2. التقاط ما لا يقل عن 4–6 حقول رؤية لكل بئر.
    3. تحليل ثلاثة آبار على الأقل لكل حالة.
  3. تعريف أحداث البلعمة
    1. تحديد البلعميات التي تحتوي على إشارات موجبة لـ GFP محاطة بالكامل داخل الحدود الخلوية.
  4. تحليل الصور
    1. فتح الصور في برنامج ImageJ.
    2. استخدام ملحق Cell Counter.
    3. عد إجمالي البلعميات.
    4. عد البلعميات التي تحتوي على خلايا ممتصة موجبة لـ GFP.
  5. حساب مؤشر البلعمة
    1. الحساب وفقاً لـ: figure-protocol-2
    2. إجراء التحليل بطريقة التعمية.
    3. التكرار عبر ثلاث تجارب مستقلة على الأقل.
  6. عرض البيانات
    1. عرض صور ممثلة للفواصل الزمنية بترتيب زمني (الشكل 2B و الشكل 2C).
    2. عرض صور ممثلة للنقطة النهائية (الشكل 3A و الشكل 3B).

figure-protocol-3
الشكل 3. التقدير الكمي لبلعمة الماكروفاج المعتمدة على الأجسام المضادة عن طريق تحليل النهاية. (A) صور تمثيلية لتباين الطور والفلورة البروتينية GFP لماكروفاج تمت زراعتها مع خلايا سرطان الثدي الموّسمة بـ GFP لمدة 4 h، تلتها إزالة الخلايا غير المبتلعة باستخدام معالجة EDTA. تم دمج قناتي تباين الطور وGFP لتحديد الماكروفاج والأهداف الموجبة لـ GFP التي تم ابتلاعها. تم عد الماكروفاج (العداد 0) والماكروفاج البالعة الموجبة لـ GFP (العداد 1) باستخدام إضافة Cell Counter في برنامج ImageJ. في حالة التحكم IgG، لم تُلاحظ أي عمليات بلعمة، بينما أدت المعالجة بالأجسام المضادة أحادية النسيلة anti-CD24 إلى ظهور إشارات GFP موجبة واضحة داخل الماكروفاج، مما يشير إلى عملية بلعمة نشطة. شريط المقياس = 200 µm. (B) التقدير الكمي لمؤشر البلعمة، والذي عُرِّف بأنه النسبة المئوية للماكروفاج التي تحتوي على خلايا موجبة لـ GFP مبتلعة بالنسبة لإجمالي تعداد الماكروفاج. زاد الجسم المضاد أحادي النسيلة anti-CD24 بشكل ملحوظ من مؤشر البلعمة مقارنة بالتحكم IgG (0.00 ± 0.00% مقابل 18.76 ± 4.01%، المتوسط ± SD؛ n = 6 حقول لكل مجموعة؛ ***p < 0.001، اختبار Welch’s unpaired t-test). البيانات تمثل ما لا يقل عن ثلاث تجارب مستقلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم التأكد من نجاح توليد واستقطاب الخلايا البلعمية من خلايا PBMC باستخدام التقييم المورفولوجي وتحليل قياس التدفق الخلوي (الشكل 1). حيث تم استزراع خلايا PBMC التي عُزلت عن طريق طرد مركزي بتدرج الكثافة في وسط مضاف إليه M-CSF، مما أدى إلى ظهور خلايا ملتصقة ذات مورفولوجيا مميزة للخلايا البلعمية بحلول اليوم السابع. وبعد التحفيز باستخدام IFN-γ و LPS، أظهرت الخلايا نمطًا ظاهريًا يتفق مع التنشيط في ظل الظروف المطبقة. وأظهر تحليل قياس التدفق الخلوي أن 99.8% من الخلايا المختارة كانت إيجابية لـ CD11b، م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعد عدة خطوات في هذا البروتوكول حاسمة للحصول على نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. أولاً، تؤثر جودة ونقاء عزل خلايا PBMC بشكل مباشر على حصيلة الخلايا البلعمية وكفاءة تمايزها. ويعد الترسيب الدقيق للدم المخفف فوق تدرج Ficoll والطرد المركزي مع إيقاف تشغيل المكابح أمراً ضرورياً للحفاظ على واجهة الطبقة الكريمية (buffy coat). كما أن التحلل غير المكتمل لخلايا RBC أو فترة الحضانة المفرطة مع محلول التحلل سيؤدي إلى تضرر حيوية خلايا PBMC. ثانياً، يجب التحقق من استقطاب الخلايا البلعمية المحرضة للالتهاب عن طريق قياس التدفق الخلوي قبل إجرا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يفصح المؤلفون عن عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل مركز بيولوجيا السرطان والعلاجات الدقيقة بجامعة الصين الطبية، من خلال برنامج مركز أبحاث المجالات المتميزة ضمن إطار مشروع براعم التعليم العالي التابع لوزارة التربية والتعليم (MOE) في تايوان (CBPTC-PROJ-5-2).

نتوجه بالشكر إلى مركز بيولوجيا السرطان والعلاجات الدقيقة لتوفير التمويل والدعم الأكاديمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول مخزون من حمض إيثيلين ثنائي الأمين رباعي حمض الخليك (EDTA) بتركيز 0.5 مولارSigma-Aldrich (أو ما يعادلها)E7889 (أو ما يعادله)تُستخدم لتحضير محلول عمل من EDTA بتركيز 10 ملي مولار في محلول PBS لفصل الخلايا
أطباق زراعة الأنسجة ذات ٢٤ بئراً (المعالجة لزراعة الأنسجة)Corning (أو ما يعادلها)3524تُستخدم للاستزراع المشترك للخلايا البلعمية والخلايا السرطانية أثناء مقايسة البلعمة
جسم مضاد مضاد لـ CD206 البشري (قياس التدفق الخلوي)BioLegend (أو ما يعادلها)321122 (أو ما يعادلها)مؤشر للنمط الظاهري البديل للبلاعم
جسم مضاد أحادي النسيلة مضاد لـ CD24 البشريThermo Fisher Scientific (أو ما يعادلها)MA1-91384 (أو ما يعادله)تُستخدم لعمل عملية الطلاء المناعي (opsonization) للخلايا السرطانية من أجل البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة
نظام تصوير آلي للخلايا الحية مزود بغرفة تحكم بيئي (مثل Lionheart FX)Agilent Technologies (أو ما يعادلها)المجهر الآلي BioTek Lionheart FXيتيح التصوير بالفاصل الزمني لفترات طويلة تحت درجة حرارة مضبوطة و 2 الظروف
برمجيات التصوير الخاص بالتصوير الآلي للخلايا الحية (على سبيل المثال Gen5)Agilent Technologies (أو ما يعادلها)لم يتم توفير نص للمراجعة والترجمة. يرجى تزويدي بالنص المصدر باللغة الإنجليزية للبدء في ترجمته وفقاً للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.تُستخدم للحصول على بيانات التصوير بالفاصل الزمني وتحليلها
جهاز طرد مركزي (دوار ذو دلاء متأرجحة)Thermo Fisher Scientific (أو ما يعادلها)جهاز Multifuge X4R Pro مع دوّار TX-1000 (أو ما يعادله)تُستخدم لعزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC) وخطوات غسل الخلايا
2 حضّانة (37°ج، 5% 2)Thermo Fisher Scientific (أو ما يعادلها)تسخين مباشر من Forma 2 حضّانة (أو ما يعادلها)يحافظ على الظروف الفسيولوجية للمستنبتات الخلوية
2 إمداد غاز مع منظم ضغطAgilent Technologies (أو ما يعادلها)لم يتوفر نص للترجمة. يرجى تزويد النص المصدر باللغة الإنجليزية للبدء في عملية الترجمة العلمية إلى اللغة العربية.المستلزمات 2 للتحكم البيئي في الحضانة ونظام التصوير
أنابيب مخروطية (15 مل و50 مل)Corning (أو ما يعادلها)352070 (أو ما يعادله)تُستخدم في خطوات عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)، وغسلها، وطردها المركزي.
أنابيب جمع الدم المطلية بـ EDTA (أنابيب مفرغة الهواء/vacutainers)BD Biosciences (أو ما يعادلها)367863 (أو ما يعادلها)تُستخدم لجمع عينات الدم الكامل من المتبرعين
Ficoll-Paque PLUSCytiva (أو ما يعادلها)17144003 (أو ما يعادله)وسط تدرج الكثافة لعزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs)
جهاز قياس التدفق الخلوي (على سبيل المثال: FACSCanto II)BD Biosciences (أو ما يعادلها)BD FACSCanto II تُستخدم للتحليل المظهري للخلايا البلعمية
خرزات التعويض (قياس التدفق الخلوي)Biolegend (أو ما يعادله)424602تُستخدم كعناصر تحكم للتعويض أحادي اللون
جسم مضاد CD11b المضاد للبشر الموّسم بـ FITC (قياس التدفق الخلوي)BioLegend (أو ما يعادلها)101205 (أو ما يعادله)مؤشر يُستخدم لتحديد الخلايا البلعمية
جسم مضاد PE مضاد لـ CD80 البشري (قياس التدفق الخلوي)BioLegend (أو ما يعادلها)375410 (أو ما يعادلها)علامة مرتبطة بالنمط الظاهري للبلاعم المنشطة
خط خلايا سرطان الثدي المعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (MDA-MB-468)ATCC (أو ما يعادلها)HTB-132 (أو ما يعادلها)الخلايا المستهدفة المستخدمة في مقايسة البلعمة؛ يتيح البروتين الفلوري الأخضر (GFP) التصوير المرئي
وسط ImmunoCult-SF لزراعة الخلايا البلعميةSTEMCELL Technologies (أو ما يعادلها)10961 (أو ما يعادلها)وسط خالي من المصل مستخدم لتمايز الخلايا البلعمية
دالبكو’وسط إيغل المعدل (DMEM)Thermo Fisher Scientific (أو ما يعادلها)12100046تستخدم لاستزراع الخلايا السرطانية وإعادة تعليقها
جسم مضاد ضابط من النمط الإسوي (IgG)Bio X Cell (أو ما يعادله)BE0297 (أو ما يعادلها)الضابط السلبي لمقايسة البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادة
عديد السكاريد الدهني (LPS)Sigma-Aldrich (أو ما يعادلها)L2630 (أو ما يعادله)المحفز المستخدم لتنشيط الخلايا البلعمية بالاشتراك مع IFN-γγ
إنترفيرون غاما البشري المؤتلف (IFN-γ)STEMCELL Technologies (أو ما يعادلها)78020 (أو ما يعادله)السيتوكين المستخدم لتنشيط البلاعم
عامل تحفيز مستعمرات البلاعم البشري المؤتلف (M-CSF)STEMCELL Technologies (أو ما يعادلها)78057 (أو ما يعادلها)عامل النمو المستخدم لتمايز الخلايا البلعمية
ماصات باستور أو ماصات سيرولوجيةJetbiofil (أو ما يعادله)GSP010010 (أو ما يعادلها)تُستخدم لمناولة السوائل أثناء عزل الخلايا الوحيدة النوكليوية الدموية الطرفية (PBMC) واستزراع الخلايا.
محلول منظم من الفوسفات الملحي (PBS) (خالٍ من الكالسيوم)2+-/ملجم2+-خالٍ من)Thermo Fisher Scientific (أو ما يعادلها)BP399-500 (أو ما يعادله)المحلول المنظم المستخدم في غسل الخلايا وخطوات التخفيف
أطباق بتري (100 مم، غير مـ–(المعالج لزراعة الأنسجة)Corning (أو ما يعادلها)430591تُستخدم لتمايز الخلايا البلعمية عن طريق الاختيار بالالتصاق
محلول تحلل كريات الدم الحمراء (RBC)BioLegend (أو ما يعادلها)420301 (أو ما يعادلها)تُستخدم لإزالة خلايا الدم الحمراء أثناء عزل الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMC)
صبغة Viobility 405/452 القابلة للتثبيتMiltenyi Biotec (أو ما يعادلها)130-130-404 (أو ما يعادله)تُستخدم لتقييم حيوية الخلايا أثناء تحليل قياس التدفق الخلوي
DAPISigma-Aldrich (أو ما يعادلها)D9542 (أو ما يعادله)تُستخدم لاستبعاد الخلايا الميتة في قياس التدفق الخلوي

المراجع

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Perou, C. M., et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 406 (6797), 747-752 (2000).
  3. Foulkes, W. D., Smith, I. E., Reis-Filho, J. S. Triple-negative breast cancer. N Engl J Med. 363 (20), 1938-1948 (2010).
  4. Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4429-4434 (2007).
  5. Lin, N. U., et al. Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases. Cancer. 113 (10), 2638-2645 (2008).
  6. Bianchini, G., De Angelis, C., Licata, L., Gianni, L. Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs. Nat Rev Clin Oncol. 19 (2), 91-113 (2022).
  7. Lecoultre, M., Dutoit, V., Walker, P. R. Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review. J Immunother Cancer. 8 (2), (2020).
  8. Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).
  9. Chan, S. H., Lin, C. Y., Tseng, H. J., Wang, L. H. Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8⁺ t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model. J Biomed Sci. 32 (1), 73 (2025).
  10. Majeti, R., et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 138 (2), 286-299 (2009).
  11. Barkal, A. A., et al. CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy. Nature. 572 (7769), 392-396 (2019).
  12. Wang, X., et al. CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder. Cell Metab. 34 (8), 1088-1103.e6 (2022).
  13. Chan, S. H., et al. Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 18 (1), 147-161 (2019).
  14. Huang, S., Zhang, X., Wei, Y., Xiao, Y. Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy. Front Immunol. 15, 1367959 (2024).
  15. Weiskopf, K., Weissman, I. L. Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer. MAbs. 7 (2), 303-310 (2015).
  16. Cao, X., et al. Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy. Sci Adv. 8 (11), eabl9171 (2022).
  17. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev Immunol. 17, 593-623 (1999).
  18. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  19. Denardo, D. G., Ruffell, B. Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol. 19 (6), 369-382 (2019).
  20. Horsthemke, M., Wilden, J., Bachg, A. C., Hanley, P. J. Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages. J Vis Exp. (140), e57566 (2018).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

البلعمة المعتمدة على الأجسام المضادةالبروتين الفلوري الأخضرالخلايا التي تعبر عن CD24تصوير الخلايا الحيةالطلاء البروتيني بالأجسام المضادة أحادية النسيلةمقايسة النقطة النهائيةالعلاج المناعي للسرطان
التصوير الزمني لعملية بلعمة الخلايا البلعمية لخلايا سرطان الثدي ثلاثي السلبية الموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر والموجهة بالأجسام المضادة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.