بروتوكول لفصل نصف الكرة المخية من أجل الملاحظة المورفولوجية والاستخلاص المشترك للحمض النووي الريبوزي والبروتين في مناطق دماغ الفئران

Xinyu Zhu; Yukun Li; Lianjun Zhang; Yiyun Zou; Shanxiang Gao; Yuan Tian; Jing Xu; Chunqing Liu

doi:10.3791/71465

مقالة منهجية

بروتوكول لفصل نصف الكرة المخية من أجل الملاحظة المورفولوجية والاستخلاص المشترك للحمض النووي الريبوزي والبروتين في مناطق دماغ الفئران

2 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/71465

⸱

سبتمبر 1, 2026

Xinyu Zhu^*¹^,² , Yukun Li^*³ , Lianjun Zhang³ , Yiyun Zou³ , Shanxiang Gao³ , Yuan Tian³ , Jing Xu⁴ , Chunqing Liu¹

¹College of Medical Laboratory, Dalian Medical University, ²The Transvascular Implant Instrument Research Institute, ³The Second Affiliated Hospital of Dalian Medical University, ⁴College of Basic Medical Sciences of Dalian Medical University

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يتناول هذا البروتوكول كيفية تقسيم أدمغة الفئران إلى نصفين؛ حيث يُستخدم نصف كرة دماغي واحد للتلوين المورفولوجي، والنصف الآخر لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) والبروتينات. وتهدف هذه الاستراتيجية إلى تقليل عدد الحيوانات المستخدمة، والالتزام بمبادئ الـ 3Rs، وتقليل التباين بين الحيوانات.

الملخص

في أبحاث العلوم العصبية اليومية، تتطلب الصبغات المورفولوجية والمقاييس الجزيئية للأحماض النووية والبروتينات عادةً حيوانات تجارب منفصلة، مما يزيد من عدد الحيوانات المستخدمة ويتعارض مع مبدأ 3Rs لرفاهية الحيوان. يحدد هذا البروتوكول سير عمل لتخصيص الأنسجة في دماغ الفئران يتيح إجراء تحليلات مورفولوجية وجزيئية مقترنة من حيوان واحد. بعد التروية عبر القلب بمحلول ملحي 0.9%، يتم تقسيم الدماغ إلى نصفين كرويين. يتم تثبيت نصف كرة واحد في 4% بارافورمالدهيد من أجل الكيمياء النسيجية المناعية والفلورية المناعية؛ وتحافظ المقاطع المخزنة في محلول السكروز-إيثيلين جليكول-بولي فينيل بيروليدون (PVP) على جودة صبغ موثوقة لمدة تصل إلى سبع سنوات. أما نصف الكرة المقابل فيتم حفظه بالتجميد عند -80 °C لاستخلاص الحمض النووي الريبي (RNA) والبروتين معاً، وبإنتاجية كافية لإجراء تحاليل qPCR و Western Blot اللاحقة. عند اختبار هذه الطريقة على عينات من القشرة الشمية الداخلية (entorhinal cortex) بوزن 9–10 mg، تعطي هذه الطريقة إنتاجية من RNA والبروتين أقل مما ينتج عن استخلاص RNA أو البروتين بشكل منفرد، ومع ذلك تظل الجزيئات الحيوية المستعادة كافية للكشف الجزيئي. يقلل سير العمل هذا من استهلاك الحيوانات ويزيل الاختلافات الفردية بين التحليلات المورفولوجية والجزيئية المقترنة. كما يوفر طريقة مجدية لتحضير الأنسجة من أجل التوصيف متعدد الأبعاد لمناطق فرعية محددة في دماغ الفئران.

المقدمة

توسعت أبحاث العلوم العصبية بشكل كبير على مدى العقود الأخيرة، مما كشف عن الآليات الرئيسية التي تحكم فسيولوجيا الدماغ البشري، وبداية الأمراض العصبية، وتطوير العلاجات. ولا تزال النماذج الحيوانية لا غنى عنها في الاستقصاءات العصبية، حيث توفر منصات قابلة للضبط والتكرار لاستكشاف التطور العصبي، والوظيفة الفسيولوجية، والعمليات المرضية. وتسمح التلاعبات التجريبية والملاحظات النسيجية في الفئران للباحثين بتوصيف الإشارات العصبية، وتكوين الدوائر العصبية، والارتباطات العصبية السلوكية. وبالتوازي مع التقدم التقني، أصبحت أخلاقيات التجارب الحيوانية شاغلاً مركزياً؛ إذ تُعد مبادئ 3Rs (الاستبدال Reduction، والتقليل Replacement، والتحسين Refinement) حالياً معايير مقبولة عالمياً لجميع الدراسات الحيوانية¹^,²، وهي تتطلب من الباحثين تقليل استخدام الحيوانات مع الحفاظ على نتائج تجريبية موثوقة.

تسمح الأدوات المبتكرة، مثل أنظمة التعطيل الجيني الشرطي، بإجراء تلاعب جيني دقيق ضمن مناطق فرعية محددة من دماغ الفئران³. وقد غذّت هذه التطورات أبحاثاً مكثفة حول أقسام الدماغ ذات النطاق المجهري، مثل مناطق CA1 وCA3 والتلافيف المسننة (DG) في الحصين، والتي تنظم التعلم والذاكرة والمزاج⁴. ويتطلب فك رموز الوظائف العليا لهذه المناطق الدماغية الصغيرة قياسات منسقة على المستويات المورفولوجية والنسخية والبروتينية. ولسوء الحظ، فإن حجم أنسجتها الضئيل يخلق عقبات تقنية رئيسية أمام الكشف المتوازي متعدد المؤشرات.

تعد الصبغ المورفولوجي، وتقدير كمية RNA، والكشف المناعي عن البروتين ثلاثة من القراءات الأساسية الروتينية في علوم الأعصاب. تتطلب تصميمات الأبحاث التقليدية ثلاث مجموعات منفصلة من الحيوانات الفئرانية لإتمام هذه الأنواع الثلاثة من الاختبارات. وتؤدي هذه الممارسة إلى زيادة كبيرة في استهلاك الحيوانات وتسبب تباينًا بيولوجيًا ملحوظًا بين الحيوانات، مما يضعف إمكانية المقارنة بين مجموعات البيانات النسيجية والجزيئية. ومن شأن وجود سير عمل موحد يتيح الحصول على إشارات مورفولوجية وجزيئية متطابقة من حيوان واحد أن يعالج هذين القيدين الحرجين بشكل كبير، ويحقق امتثالاً أفضل لمبدأ التقليل (Reduction) ضمن القواعد الثلاث (3Rs).

نقدم هنا بروتوكولاً قابلاً للتكرار للفصل نصف الكروي لأنسجة دماغ الفئران. فبعد إجراء تروية ملحية جهازية، يتم تقسيم الدماغ بالكامل إلى نصفين كرويين: يُثبّت أحدهما لإجراء الفحوصات المورفولوجية، بينما يتم حفظ النصف المقابل بالتجميد لاستخلاص مشترك ومتزامن للـ RNA والبروتين. وتحافظ الأنسجة المثبتة والمخزنة في محلول منظم واقٍ مكون من السكروز والإيثيلين جليكول والبولي فينيل بيروليدون (PVP) على إشارات صبغية مستقرة وعالية الجودة لتقنيات الكيمياء النسيجية المناعية والفلورة المناعية لمدة تصل إلى سبع سنوات. وقد تحققنا من صحة هذه الطريقة باستخدام عينات مقتطعة صغيرة تزن 9–10 mg من القشرة الشمية الداخلية، وهي أنسجة أخف وزناً من المناطق التي تُدرس عادةً مثل الحصين والقشرة الجبهية الأمامية. ويشير الكشف الناجح عن هذه العينة النسيجية الضئيلة إلى أن المناطق الفرعية الأصغر في الدماغ، مثل تحت المهاد واللوزة الدماغية، تتوافق أيضاً مع سير العمل هذا. ورغم أن هذا البروتوكول ينتج تركيزات من الـ RNA والبروتين أقل من تلك التي تنتجها أطقم الاستخلاص المتخصصة أحادية الغرض، إلا أن الجزيئات الحيوية المعزولة تمتلك جودة كافية لدعم تحليلات qPCR وWestern blot القياسية اللاحقة. ويقلل سير العمل هذا من استهلاك الحيوانات ويزيل الفروق الفردية بين التحليلات المورفولوجية والجزيئية المقترنة. كما يوفر طريقة عملية لتحضير الأنسجة من أجل التوصيف متعدد الأبعاد للمناطق الفرعية المنفصلة في دماغ الفئران.

البروتوكول

بيان الأخلاقيات

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية التي أجريت في هذه الدراسة من قبل لجنة الرعاية المؤسسية والاستخدام الحيواني بجامعة داليان الطبية (رقم الموافقة AEE18026 لتجارب الجرذان ورقم AEE24261 لتجارب الفئران)، جمهورية الصين الشعبية. نُفذت جميع البروتوكولات التجريبية وفقاً للمبادئ التوجيهية الأخلاقية لحيوانات المختبر، مع الامتثال الكامل لمبادئ الـ 3Rs (التقليل، والاستبدال، والتحسين) الخاصة بالتجارب الحيوانية. وطوال العملية التجريبية بأكملها، تم اتخاذ تدابير صارمة للتخفيف من معاناة الحيوانات وضيقها بشكل فعال. وفي الوقت نفسه، تم حصر عدد الحيوانات التجريبية في الحد الأدنى المطلوب لضمان موثوقية وصحة نتائج التحليل الإحصائي. راجع جدول المواد للحصول على قائمة كاملة بالكواشف والمواد الاستهلاكية والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تحضير الحيوانات التجريبية وجراحة التروية عبر القلب

التخدير والتحضير قبل الجراحة
1. استخدم جرذان Sprague-Dawley البالغة من الذكور أو فئران C57BL/6 الخالية من مسببات الأمراض المحددة (SPF) في هذا البروتوكول. يتم إيواء الحيوانات في بيئة خاضعة للتحكم في درجة الحرارة (22 ± 2 °C) مع دورة ضوء/ظلام مدتها 12 ساعة. وفر للحيوانات إمكانية الوصول غير المحدود إلى الطعام والماء المعقمين.
2. احقن الحيوانات بصوديوم بنتو-باربيتال عبر الحقن داخل الصفاق بجرعة 80 mg/kg للجرذان أو 50 mg/kg للفئران لاستحثاث التخدير (انظر الشكل 1).
إجراء التروية عبر القلب
1. ثبت الحيوانات المخدرة في وضع الاستلقاء الظهري على لوح جراحي.
2. افتح جدار البطن على طول الخط الناصف من الناتئ الخنجري إلى الارتفاق العاني باستخدام مقصات مستقيمة. قص جدار الصدر الجانبي من الجهتين لكشف القلب بالكامل.
3. قم بتروية الحيوان بمحلول ملحي عادي 0.9% بارد جداً بمعدل تدفق ثابت: 100–150 mL خلال 10–15 دقيقة للجرذان و 20–30 mL خلال 5–8 دقائق للفئران.
استخلاص الدماغ وفصل نصفي الكرة المخية
1. اقطع رؤوس الحيوانات باستخدام مقصات جراحية كبيرة بعد اكتمال التروية. قص فروة الرأس على طول الخط الناصف لكشف الجمجمة.
2. استخدم ملعقة جراحية معقمة لرفع الدماغ برفق من التجويف القحفي. انقل الدماغ كاملاً بسرعة إلى طبق بتري معقم موضوع على الثلج.
3. استخدم شفرة حلاقة معقمة وخالية من RNase لتقسيم الدماغ بشكل متماثل إلى نصفين أيمن وأيسر على طول الدرز السهمي.
4. انقل نصف الكرة المخية الأيسر فوراً إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL يحتوي على 10 mL من محلول بارافورمالدهيد 4% البارد جداً للتثبيت. انقل نصف الكرة المخية الأيمن إلى أنبوب حفظ بالتجميد مُسمى وخالٍ من RNase، وقم بتجميده سريعاً في نيتروجين سائل، وخزنه عند -80 °C حتى يتم استخلاص RNA والبروتين.

2. تثبيت أنسجة الدماغ، وتقطيعها، وتخزينها لفترات طويلة

التثبيت وإزالة المياه
1. اغمر النصف الأيسر من الدماغ بالكامل في محلول بارافورمالدهيد بتركيز 4%، وثبت النسيج عند درجة حرارة 4 °C لمدة 24 ساعة. بعد اكتمال عملية التثبيت، انقل نصف الدماغ إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL يحتوي على محلول سكروز بتركيز 30%، وقم بإزالة المياه من النسيج عند درجة حرارة 4 °C.
2. استبدل محلول السكروز بتركيز 30% كل 24 ساعة حتى يغوص نسيج الدماغ إلى قاع الأنبوب.
تحضير المقاطع التجميدية
1. أخرج نصف الدماغ منزوع الماء من محلول السكروز، وجفف السوائل الزائدة برفق باستخدام ورق ترشيح معقم.
2. ثبت نصف الدماغ على منصة العينات في جهاز الميكروتوم التجميدي (cryostat) باستخدام وسط التضمين المخصص لدرجة حرارة القطع المثالية (OCT).
3. اقطع مقاطع إكليلية متسلسلة للدماغ بسماكة 30 µm باستخدام جهاز الميكروتوم التجميدي. اجمع المقاطع المتتالية في طبق يحتوي على 24 بئراً ومملوء بمحلول PBS معقم بتركيز 0.01 M.
التخزين طويل الأمد لمقاطع الدماغ
1. قم بتحضير محلول حفظ مقاطع الدماغ الواقي من التجمد مسبقاً: أضف 2 g من PVP400 و60 g من السكروز و60 mL من إيثيلين جلايكول إلى 100 mL من محلول PBS بتركيز 0.01 M. حرك المحلول في درجة حرارة الغرفة حتى تذوب جميع المكونات تماماً، واحفظه عند درجة حرارة 4 °C حتى وقت الاستخدام.

3. استخلاص RNA باستخدام TRIzol

تجانس الأنسجة وفصل الأطوار
1. قم بتجانس أنسجة القشرة الشمية الداخلية في 1 mL من كاشف TRIzol باستخدام جهاز تجانس فائق الدقة، ثم حضن المزيج المتجانس على الثلج لمدة 15 min. قم بالطرد المركزي عند 8,000 × g لمدة 5 min عند 4 °C.
2. أضف 200 µL من الكلوروفورم وقم بالخلط باستخدام جهاز vortex لمدة 10 s. قم بالطرد المركزي عند 5,600 × g لمدة 15 min عند 4 °C. بعد ذلك، انقل الطور المائي العلوي إلى أنبوب خالٍ من RNase. أضف 500 µL من الإيزوبروبانول وحضنه عند -20 °C طوال الليل لترسيب RNA. قم بالطرد المركزي مرة أخرى.
ترسيب RNA وغسله وتقييم جودته
1. تخلص من السائل الطافي واغسل كتلة RNA بـ 1 mL من الإيثانول بتركيز 75%. قم بالطرد المركزي عند 5,600 × g لمدة 5 min عند 4 °C. أزل السائل الطافي، وجفف الكتلة بالهواء لمدة 10 min، ثم أذب RNA في 20 µL من الماء المعالج بـ DEPC لمدة 10 min.
2. قس تركيز ونقاء RNA (A₂₆₀/A₂₈₀) باستخدام جهاز المطياف الضوئي. خزن RNA عند -80 °C لحين إجراء التحليلات اللاحقة.

4. استخلاص البروتين الكلي باستخدام طقم Minute

تحلل الأنسجة وتجانسها
1. يُبرد عمود الطرد المركزي وأنبوب الجمع مسبقاً على الثلج. يتم تجانس النسيج في 100 µL من محلول تحلل الخلايا باستخدام مجانس فائق الدقة. يُشطف المجانس بـ 100 µL إضافية من محلول تحلل الخلايا ثم تُمزج النواتج المتحللة.
استخلاص البروتين وتحديده كمياً
1. يُنقل المتجانس إلى عمود الطرد المركزي ويُحضن لمدة 2 min في درجة حرارة الغرفة.
2. يُجرى الطرد المركزي عند 11,000–14,300 × g لمدة 2 min.
3. يُوضع أنبوب الجمع على الثلج فوراً بعد الطرد المركزي ويتم التخلص من عمود الطرد المركزي. يُحدد تركيز البروتين باستخدام مقايسة BCA.

5. الاستخلاص المتزامن للحمض النووي الريبوزي (RNA) والبروتين من القشرة الشمية الداخلية (9-10 ملجم)

التحضير المسبق للتجربة وتحضير الكواشف
1. استخدم مجموعة استخلاص DNA/RNA/protein لجميع خطوات الاستخلاص. استخدم فقط المستهلكات المعتمدة الخالية من RNase وDNase (انظر الشكل 2).
2. حضّر محلول التحلل (lysis buffer) مباشرة قبل الاستخدام: أضف مزيج مثبط البروتياز (protease inhibitor cocktail) إلى محلول التحلل المرفق مع المجموعة بتخفيف 1:100.
تحلل الأنسجة وفصل الطور
1. أخرج نصف الكرة الدماغية اليمنى المجمد من التخزين في درجة حرارة -80 °C وضعه على الثلج. استخدم خرامة (punch) معقمة وخالية من RNase لجمع 9–10 mg من النسيج من منطقة الدماغ المستهدفة.
2. قم بتجنيس النسيج تماماً على الثلج باستخدام مجنس أنسجة كهربائي حتى لا تبقى أي شظايا نسيجية مرئية. حضّن المادة المتجانسة على الثلج لمدة 10 min لضمان التحلل الكامل.
3. أضف 200 µL من كاشف الفصل المرفق مع المجموعة إلى المادة المتجانسة. قم برج الأنبوب بقوة باستخدام جهاز الـ Vortex لمدة 30 s وحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 min. قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 8,000 × g لمدة 15 min عند 4 °C لتحقيق فصل تام للأطوار.
تنقية RNA واستخلاصه
1. اجمع الطور المائي العلوي بعناية باستخدام طرف ماصة خالٍ من RNase. انقل الطور المائي المجموع إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL خالٍ من RNase. أضف حجماً مساوياً من الإيثانول بتركيز 100% إلى الطور المائي المجموع وامزجهما.
2. انقل 700 µL من المزيج إلى عمود تنقية RNA المرفق مع المجموعة. قم بطرد العمود مركزياً عند 5,600 × g لمدة 1 min في درجة حرارة الغرفة.
3. أضف 500 µL من محلول غسيل RNA 1 المرفق مع المجموعة إلى العمود. قم بطرد العمود مركزياً عند 5,600 × g لمدة 1 min في درجة حرارة الغرفة.
4. أضف 500 µL من محلول غسيل RNA 2 المرفق مع المجموعة إلى العمود، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى. قم بطرد العمود الفارغ مركزياً عند 8,000 × g لمدة 2 min في درجة حرارة الغرفة لإزالة الإيثانول المتبقي تماماً من غشاء العمود.
5. انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي دقيق (microcentrifuge tube) جديد سعة 1.5 mL خالٍ من RNase. أضف 30–50 µL من الماء الخالي من RNase (المسخن مسبقاً إلى 60 °C) مباشرة في مركز غشاء العمود. حضّن العمود في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 min. قم بطرد العمود مركزياً عند 8,000 × g لمدة 1 min في درجة حرارة الغرفة لاستخلاص RNA.
ترسيب البروتين وإذابته
1. أضف 750 µL من الإيزوبروبانول إلى الطور العضوي المتبقي والطور البيني في الأنبوب الأصلي بعد إزالة الطور المائي لاستخلاص RNA. حضّن المزيج عند -20 °C لمدة 30 min لترسيب البروتينات.
2. قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 8,000 × g لمدة 10 min عند 4 °C. تخلص من السائل الطافي وحافظ على كتلة البروتين المترسبة سليمة في قاع الأنبوب.
3. أضف 1 mL من الإيثانول بتركيز 95% إلى كتلة البروتين. رج الأنبوب لفترة وجيزة باستخدام الـ Vortex لغسل الكتلة المترسبة. قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 8,000 × g لمدة 5 min عند 4 °C وتخلص من السائل الطافي. كرر خطوة الغسل هذه مرتين إضافيتين.
4. جفف كتلة البروتين في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 5–10 min حتى تصبح الكتلة شفافة ولا يظهر أي إيثانول متبقٍ.
5. أضف 50–100 µL من محلول SDS بتركيز 5–10% إلى الكتلة المجففة. رج الأنبوب بقوة باستخدام الـ Vortex لمدة 1 min وحضنه على الثلج لمدة 10 min لإذابة البروتين تماماً. قم بطرد الأنبوب مركزياً عند 8,000 × g لمدة 5 min عند 4 °C. اجمع السائل الطافي كخلاصة بروتين نهائية.

6. صبغ الكيمياء النسيجية المناعية (IHC)

المعالجة المسبقة للمقاطع وتعطيل الإنزيمات الداخلية
1. إخراج مقاطع الدماغ من وحدة تخزين الحماية من التجمد عند -20 °C. استخدم إبرة زجاجية لنقل المقاطع إلى طبق يحتوي على 24 بئرًا ومملوء بمحلول 0.01 M PBS (pH 7.4).
2. غسل المقاطع ثلاث مرات باستخدام 0.01 M PBS، لمدة 5 min لكل غسلة، في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز.
3. تحضين المقاطع مع حاجب بيروكسيديز بتركيز 3% من بيروكسيد الهيدروجين في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 min لتعطيل نشاط البيروكسيديز الداخلي. كرر خطوات الغسل بعد عملية الحجب.
النفاذية والحجب غير النوعي
1. تحضين المقاطع في 0.5% Triton X-100 لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز لتحقيق نفاذية الغشاء الخلوي. كرر خطوات الغسل.
2. تحضين المقاطع في 4% bovine serum albumin لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة، يليه التحضين مع مثبط صبغ غير نوعي لمدة 30 min إضافية في درجة حرارة الغرفة.
تحضين الأجسام المضادة الأولية والثانوية
1. تخفيف الأجسام المضادة الأولية في محلول 1% BSA وفق التخفيفات المثالية التالية: doublecortin (DCX, 1:4000)، وneuronal nuclear antigen (NeuN, 1:3000)، وionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1, 1:2000)، وglial fibrillary acidic protein (GFAP, 1:2000).
2. إضافة 200 µL من محلول الجسم المضاد الأولي المخفف إلى كل بئر، مع ضمان غمر المقاطع بالكامل.
3. إضافة 200 µL من الجسم المضاد الثانوي المسمى بالبيوتين إلى كل بئر. تحضين المقاطع في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 min.
4. غسل المقاطع ثلاث مرات باستخدام 0.01 M PBS، لمدة 5 min لكل غسلة. إضافة 300 µL من مقترن streptavidin-peroxidase إلى كل بئر. تحضين المقاطع في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 min. كرر خطوات الغسل بعد التحضين.
التظهير اللوني باستخدام 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) والتغطية
1. إضافة 200 µL من محلول DAB العامل إلى كل بئر. مراقبة التفاعل اللوني تحت المجهر الضوئي.
2. تثبيت المقاطع على شرائح زجاجية مطلية بالجيلاتين باستخدام إبرة زجاجية. تجفيف الشرائح بالهواء تمامًا في درجة حرارة الغرفة.
3. نزع الماء من الشرائح عبر سلسلة إيثانول متدرجة (50%, 70%, 90%, 95%, 100%, 100% ethanol، لمدة 5 min لكل منها)، يليه الترويق باستخدام الزيلين مرتين، لمدة 5 min لكل مرة.

7. صبغ التألق المناعي (IF)

المعالجة المسبقة للمقاطع والنفاذية
1. إخراج مقاطع الدماغ من وحدة التخزين المبرد عند -20 °C. نقل المقاطع إلى طبق مكون من 24 بئراً يحتوي على 0.01 M PBS (pH 7.4).
2. غسل المقاطع ثلاث مرات باستخدام 0.01 M PBS، لمدة 5 min لكل غسلة، في درجة حرارة الغرفة على هزاز.
3. تحضين المقاطع في 0.5% Triton X-100 لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة على هزاز.
4. غسل المقاطع ثلاث مرات باستخدام 0.01 M PBS، لمدة 10 min لكل غسلة، بعد عملية النفاذية.
الحجب وتحضين الأجسام المضادة الأولية
1. تحضين المقاطع في محلول حجب يحتوي على 4% BSA ومثبط للتلوين غير النوعي لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة داخل غرفة رطبة.
2. سحب محلول الحجب. تخفيف الأجسام المضادة الأولية في محلول 1% BSA بتركيزات محسنة، وإضافة 300 µL من محلول الأجسام المضادة الأولية المخفف إلى كل بئر. تحضين المقاطع طوال الليل عند 4 °C في غرفة رطبة ومحمية من الضوء.
تحضين الأجسام المضادة الثانوية
1. إعادة تدفئة المقاطع في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 h في الظلام في اليوم التالي. استعادة محلول الأجسام المضادة الأولية وغسل المقاطع ثلاث مرات باستخدام 0.01 M PBS، لمدة 10 min لكل غسلة، على هزاز في الظلام.
2. تخفيف الأجسام المضادة الثانوية المقترنة بفلوروفور في محلول 1% BSA وفقاً للتخفيف الموصى به من قبل الشركة المصنعة. إضافة 300 µL من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى كل بئر. تحضين المقاطع في درجة حرارة الغرفة لمدة 1–2 h في الظلام.
3. غسل المقاطع خمس مرات باستخدام 0.01 M PBS، لمدة 5 min لكل غسلة، في الظلام.

8. تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR)

إزالة الـ gDNA من الـ RNA والنسخ العكسي
1. إجراء النسخ العكسي لتخليق الـ cDNA باستخدام طقم نسخ عكسي، مع استخدام 1 µg من الـ RNA الكلي لكل نظام تفاعل بحجم 20 µL. اتبع برنامج الدورات الحرارية الموصى به من قبل الشركة المصنعة: 25 °C لمدة 5 min، و50 °C لمدة 15 min، و85 °C لمدة 5 min، ثم الحفظ عند 4 °C.
2. تخفيف الـ cDNA المُخلق بنسبة 1:5 باستخدام ماء خالٍ من الـ RNase. يُخزن الـ cDNA عند -20 °C حتى مرحلة تضخيم الـ qPCR.
تحضير نظام الـ qPCR والتضخيم
1. تحضير نظام تفاعل الـ qPCR على الثلج داخل غطاء PCR مخصص وخالٍ من الـ RNase. يتكون نظام التفاعل بحجم 20 µL من: 10 µL من الـ qPCR Master Mix، و0.4 µL من البادئ الأمامي (10 µM)، و0.4 µL من البادئ العكسي (10 µM)، و2 µL من قالب الـ cDNA المُخفف، و7.2 µL من الماء الخالي من الـ RNase.
2. إجراء تضخيم الـ qPCR باستخدام البرنامج التالي: 95 °C لمدة 30 s للمسخ الأولي؛ 40 دورة تتكون من 95 °C لمدة 10 s و60 °C لمدة 30 s؛ يتبع ذلك تحليل منحنى التفكك من 60 °C إلى 95 °C، بزيادات قدرها 0.5 °C كل 5 s.

9. لطخة ويسترن

تقدير كمية البروتين وتحضير العينات
1. خفف مستخلصات البروتين لتصبح بتركيزات متساوية باستخدام محلول SDS بتركيز 5–10%، وذلك بناءً على نتائج مقايسة BCA.
الفصل الكهربائي باستخدام SDS-PAGE ونقل البروتين
1. حضّر هلام فصل SDS-PAGE بتركيز 10% وهلام تجميع بتركيز 5% وفقاً لبروتوكولات البيولوجيا الجزيئية القياسية.
2. حمّل 20 µg من البروتين الكلي في كل بئر من آبار الهلام. بالنسبة لتجارب التحميل المتدرج، حمّل 15 µg و 30 µg و 45 µg من البروتين في كل بئر.
3. أجرِ الفصل الكهربائي عند 80 V لمدة 30 min حتى يدخل مؤشر البروتين في هلام الفصل، ثم زد الجهد إلى 120 V لمدة 60–90 min حتى يصل صبغ البروموفينول الأزرق إلى أسفل الهلام.
4. قم بتجميع "ساندوتش" النقل بالترتيب التالي (من الكاثود إلى الأنود): الإسفنج، وورق الترشيح، والهلام، وغشاء PVDF، وورق الترشيح، ثم الإسفنج. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء بين الهلام والغشاء.
5. أجرِ عملية النقل الرطب عند تيار ثابت قدره 300 mA لمدة 90 min في حمام ثلجي.
غلق الغشاء وحضن الأجسام المضادة
1. اشطف غشاء PVDF لفترة وجيزة باستخدام محلول TBST المنظم بعد اكتمال عملية النقل. احضن الغشاء في BSA بتركيز 5% لمدة 2 h في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز لغلق مواقع الارتباط غير النوعية.
2. خفف الأجسام المضادة الأولية في محلول BSA بتركيز 5% بتركيزات مُحسّنة. احضن الغشاء مع محلول الجسم المضاد الأولي طوال الليل عند 4 °C على جهاز هزاز.
3. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام محلول TBST المنظم، لمدة 10 min لكل غسلة، على جهاز هزاز في اليوم التالي.
4. خفف الجسم المضاد الثانوي المرتبط ببيروكسيداز الفجل (HRP) في محلول حليب خالٍ من الدسم بتركيز 5% وفقاً للتخفيف الموصى به من قِبل الشركة المصنعة. احضن الغشاء مع محلول الجسم المضاد الثانوي لمدة 2 h في درجة حرارة الغرفة على جهاز هزاز.
5. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام محلول TBST المنظم، لمدة 10 min لكل غسلة، بعد حضن الجسم المضاد الثانوي. احضن الغشاء مع محلول ركيزة ECL لمدة 1–2 min في الظلام.

النتائج

تقدير تركيز RNA، والترحيل الكهربائي بهلام الأجاروز، وqPCR

كما هو موضح، تم استخلاص RNA البروتين الكلي معاً من عينات مأخوذة من القشرة الشمية الداخلية (9–10 mg) باستخدام طقم استخلاص DNA/RNA/protein. استُخدمت عينات موازية تمت معالجتها بواسطة TRIzol (لـ RNA) أو طقم استخلاص البروتين كعينات ضابطة. أسفر البروتوكول عن الحصول على 235 ± 12 ng µL⁻¹ من RNA، وهو أقل بنسبة 36 % مقارنة بـ TRIzol (p < 0.05) (الشكل 3A). ومع ذلك، أظهرت هلامات الأجاروز حزم 28S و 18S rRNA حادة وإشارات 5S، مما يشير إلى سلامة RNA (الشكل 3B). أنتج اختبار qPCR لكل من CD86 و IL-1β و TNF-α و IL-6 منحنيات تفكك مفردة ومتماثلة (الشكل 3C)، ولوحظت قيم Ct أقل في هذه المجموعة (الشكل 3D)؛ ومع ذلك، يلزم إجراء المزيد من الدراسات بما في ذلك تحليلات سلامة RNA لتحديد ما إذا كانت هذه الاختلافات تعكس تحسناً في جودة RNA أو كفاءة الاستخلاص. ورغم أن عائد RNA كان أقل من ذلك الذي تم الحصول عليه باستخلاص TRIzol، إلا أن حزم 28S و 18S rRNA المتميزة ومنحنيات تضخيم qPCR النوعية أشارت إلى أن RNA المستخلص كان بجودة كافية لتحليلات qPCR اللاحقة.

تقييم تركيز البروتين، وتحليل SDS-PAGE، وتحليل Western blot

بالاتساق مع بيانات RNA، أسفر بروتوكول الاستخلاص المزدوج عن تركيزات بروتين كلية أقل من تلك التي أسفرت عنها مجموعة استخلاص البروتين (p < 0.05). ومع ذلك، كشفت لطخات ويسترن عن حزم تفاعلية مناعية أقوى بشكل ملحوظ لكل هدف تم فحصه (الشكل 4A). وبالاتساق مع نتائج تقدير كمية RNA، يسترجع بروتوكول الاستخلاص المشترك لـ RNA والبروتين كمية أقل من البروتين الكلي مقارنة بمجموعة استخلاص البروتين المخصصة لغرض واحد، وهو ما يمكن ملاحظته عبر صبغ البروتين الكلي بصبغة CBB (الشكل 4B–C). وأظهر بروتين التدبير المنزلي β-Tubulin حزماً واضحة ومستقرة تحت كلا طريقتي الاستخلاص، مع كثافة إشارة متقاربة. كما تم الكشف بنجاح عن بروتين ULK منخفض الوفرة في العينات المستخلصة بشكل مشترك. والجدير بالذكر أن إشارات الحزم الخاصة بـ PSD-95 وp-ERK وp-NFκB p65 كانت أقوى بشكل ملحوظ في مجموعة الاستخلاص المشترك مقارنة بمجموعة استخلاص البروتين الفردية. وأدى تحميل البروتين المتسلسل من 15 µg إلى 45 µg إلى توليد تدرجات حزم تعتمد على الجرعة لجميع الأهداف المكتشفة في كلتا المجموعتين. وإجمالاً، على الرغم من أن عائد البروتين الكلي في سير عمل الاستخلاص المزدوج أقل، إلا أن جودة البروتين كافية لتحليل لطخة ويسترن القياسي، كما أن أداء الكشف العام ليس أدنى من مجموعات استخلاص البروتين الفردية التقليدية.

الكيمياء النسيجية المناعية والتألق المناعي

كشف الفحص الكيميائي النسيجي المناعي لمقاطع الدماغ المخزنة لمدة تتراوح بين 0.5 و7 سنوات عن وسم قوي للخلايا العصبية حديثة الولادة DCX⁺، والخلايا الإفرازية AVP⁺، والخلايا العصبية MAP2/NeuN⁺ مع الحفاظ على سلامة المورفولوجيا والألياف (الشكل 5A). كما أظهر الفحص المناعي الفلوري لمقاطع مخزنة لمدة 5 إلى 7 سنوات وجود خلايا نجمية GFAP⁺ واضحة، وخلايا دبقية صغيرة Iba-1⁺، وخلايا عصبية منشطة FosB⁺ (الشكل 5B). وقد احتفظت المقاطع التمثيلية المخزنة لمدة تتراوح بين 0.5 و7 سنوات بإشارات كيميائية نسيجية مناعية ومناعية فلورية يمكن الكشف عنها تحت الظروف التي تم اختبارها. وبناءً على ذلك، يحافظ محلول الحفظ على سلامة الأنسجة والمستضدات، مما يتيح إمكانية التخزين الموثوق على المدى الطويل.

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل المتكامل لفصل نصفي الكرة المخية للكشف المورفولوجي والجزيئي للدماغ. يوضح هذا المخطط المسار التجريبي الكامل، بما في ذلك التروية الملحية عبر القلب للقوارض، والتقسيم الناصف للدماغ الكامل المعزول، والتثبيت وتحضير المقاطع المجمدة لنصف الكرة المخية الأيسر لصبغ IHC/IF، والحفظ بالتجميد لنصف الكرة المخية المقابل للاستخلاص المشترك المتزامن لـ RNA والبروتين، وتحليل qPCR، وتحليل Western blot. جميع رسوم الفئران التوضيحية تم إنتاجها في الأصل بواسطة Jimeng AI. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: سير العمل للاستخلاص المشترك والمتزامن لـ RNA والبروتين من أنسجة دماغ القوارض المجمدة. يوضح المخطط الخطوات المتسلسلة التي تشمل أخذ عينات من الأنسجة المستهدفة عن طريق الثقب من النصفين الكرويين المجمدين، وتحلل الأنسجة والفصل ثلاثي المراحل، وتنقية RNA واستخلاصه لـ qPCR، بالإضافة إلى ترسيب البروتين وغسله وإذابته لتحضير العينات للكشف بواسطة لطخة ويسترن (Western blot). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تقييم عائد RNA، وسلامة RNA، وتوافق qPCR باستخدام عينات مجهرية من القشرة الشمية الداخلية للجرذ. (A) تركيزات RNA المحددة كمياً التي تم الحصول عليها عبر طقم الاستخلاص المشترك مقابل طريقة TRIzol (المتوسط ± SEM). (B) الرحلان الكهربائي لهلام الأجاروز يظهر حزم rRNA 28S و 18S سليمة من كلتا مجموعتي الاستخلاص. (C) تؤكد منحنيات الانصهار المفردة التضخيم النوعي للجينات الالتهابية المستهدفة وجين GAPDH كجين مرجعي. (D) قيم Ct للجينات الالتهابية المكتشفة تحت مدخلات RNA متطابقة عبر طريقتي الاستخلاص. *p < 0.05، **p < 0.01 مقابل مجموعة TRIzol. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4تقييم لطخة ويسترن للبروتينات المستخلصة بواسطة بروتوكول الاستخلاص المشترك للحمض النووي الريبي والبروتين. (A) تحميل البروتين بالتدرج (15/30/45 µg) يوضح إشارات النطاقات المعتمدة على الجرعة للبروتينات المشبكية وبروتينات الإشارة. (Bالكشف عن بروتين ULK1 ذو الوزن الجزيئي المرتفع باستخدام صبغ البروتين الكلي بصبغة CBB كمرجع لتحميل العينات.كربونمقارنة بطريقة لطخة ويسترن (Western blot) متساوية التحميل للبروتينات المستهدفة بين سيرتي عمل لاستخلاص البروتينات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5التلوين الكيميائي النسيجي المناعي والتلوين المناعي الفلوري لقطاعات الدماغ الحرة الطافية والمحفوظة لمدة تتراوح بين 0.5 و7 سنوات. (A) صور مجهرية لصبغة كيميائية نسيجية مناعية باستخدام المجهر الضوئي (Brightfield) تم التقاطها بتكبير 200× و ٤٠٠× تكبير. أُجري صبغ DCX وAVP على عينات أنسجة الفئران، بينما أُجري صبغ MAP2 وNeuN على عينات أنسجة الجرذان. (Bصور تمثيلية للوميض المناعي تم الحصول عليها من عينات أنسجة جرذان. يحدد GFAP الخلايا النجمية، ويحدد IBA-1 الخلايا الدبقية الصغيرة، بينما يشير FOSB إلى النشاط العصبي. أُجريت جميع تجارب صبغ التألق المناعي الموضحة في هذا اللوح باستخدام عينات من الجرذان لتقييم تعبير الوسمات العصبية والتمركز الخلوي، صور مجهرية بتكبير 200× التكبير. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

في الأبحاث التي تُجرى على الفئران، غالبًا ما تتطلب التحليلات المورفولوجية ومقايسات الأحماض النووية/البروتينات عينات حيوانية منفصلة بسبب اختلاف إجراءات التحضير الخاصة بكل منها. يؤدي ذلك إلى زيادة عدد الحيوانات المستخدمة وإحداث تباين بيولوجي بين الحيوانات، مما قد يقلل من إمكانية المقارنة بين مجموعات البيانات النسيجية والجزيئية. ولمعالجة هذه القيود، قمنا بتطوير سير عمل يتيح الحصول على البيانات النسيجية والجزيئية من الحيوان نفسه.

يعتمد التصميم المركزي لسير العمل هذا على التوزيع نصف الكروي لأنسجة الدماغ بعد التروية عبر القلب بمحلول ملحي بتركيز 0.9%⁵^,⁶. حيث يتم تثبيت أحد النصفين الكرويين في بارافورمالدهيد بتركيز 4% لإجراء الكيمياء النسيجية المناعية والتفلور المناعي، بينما يُحفظ النصف الكروي المقابل عند درجة حرارة −80 °C من أجل الاستخلاص المشترك للـ RNA والبروتين، وqPCR، وبصمة ويسترن (Western blotting) لاحقاً. ومع ذلك، قد لا تكون القراءات المختارة قابلة للمقارنة بشكل كامل بين نصفي الكرة المخية. لقد تم توثيق وجود جانبية هيكلية ووظيفية في أدمغة القوارض، وقد تؤدي هذه الاختلافات بين نصفي الكرة إلى إدخال تباين عند إجراء التحليلات على الجانبين المتقابلين⁷^,⁸. لذلك، يجب على الباحثين اختيار الأنسجة باستمرار من نفس النصف الكروي المخي وفقاً لأهداف بحثهم.

تتمثل إحدى المزايا البارزة لهذه الطريقة في الحفظ طويل الأمد للمقاطع الدماغية العائمة والمثبتة. فبعد عملية التجفيف باستخدام السكروز بتركيز 30%، تُحفظ المقاطع التاجية بسماكة 30 µm في محلول حفظ مكون من السكروز والإيثيلين جليكول وPVP. وقد أظهرت الدراسات السابقة أن محاليل الحماية من التجمد المكونة من السكروز والإيثيلين جليكول وPVP تساعد في الحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة والقدرة المستضدية أثناء التخزين طويل الأمد⁹^,¹⁰. ومع ذلك، قامت دراسات قليلة فقط بتقييم فترات تخزين تمتد لعدة سنوات. وتوسع البيانات المختبرية الخاصة بنا هذه النتائج: حيث احتفظت المقاطع التمثيلية المخزنة لمدة تصل إلى سبع سنوات بإشارات كيميائية نسيجية مناعية وتألق مناعي يمكن اكتشافها في ظل الظروف المختبرة. وتدعم هذه الملاحظات جدوى تخزين المقاطع الدماغية العائمة لعدة سنوات من أجل التحليلات الاسترجاعية وتجارب المتابعة.

ومن الجدير بالذكر أن سير العمل هذا يوفر ميزة رئيسية أخرى من خلال الاستخلاص المشترك المزدوج لـ RNA والبروتين من نصف كرة مخية واحدة مجمدة. ورغم أن بروتوكول الاستخلاص المشترك هذا ينتج كميات من RNA والبروتين أقل قليلاً مقارنة بطرق استخلاص الهدف الواحد التقليدية، إلا أن المواد الحيوية التي يتم الحصول عليها تظل كافية للكشف القوي باستخدام qPCR وWestern blot. ومن الناحية الجوهرية، يتيح الاستخلاص المشترك قياس وفرة النسخ والبروتينات من عينات نسيجية متطابقة، مما يلغي التباين البيولوجي الناتج عن معالجة العينات بشكل منفصل، ويسمح بإجراء توصيف جزيئي متكامل ومتسق للغاية¹¹^,¹². علاوة على ذلك، لا يتطلب هذا النهج سوى كتلة نسيجية صغيرة تبلغ حوالي 9–10 mg، مما يجعله مناسباً تماماً لتحليلات المجموعات الفرعية الدقيقة والمحددة في مناطق الدماغ التي تتسم بمحدودية توفر العينات.

على الرغم من هذه المزايا الكبيرة، فإن هذه الطريقة تعاني أيضاً من بعض القيود التي تستوجب الإشارة إليها. أولاً، قد تحد المردودات المنخفضة نسبياً من الحمض النووي الريبوزي (RNA) والبروتينات من إمكانية تطبيق هذه الطريقة في التجارب التي تتطلب كميات كبيرة من الأحماض النووية أو البروتينات، مثل تنقية البروتينات على نطاق واسع أو تسلسل RNA عالي العمق. ثانياً، بينما يعد تخزين المقاطع لفترات طويلة فعالاً لمدة تصل إلى سبع سنوات، إلا أن التحلل التدريجي لبعض المستضدات أو الأحماض النووية غير المستقرة قد يحدث مع مرور فترات زمنية ممتدة، مما قد يؤثر على كثافة الصبغ أو حساسية الكشف الجزيئي. ثالثاً، تم تحسين هذه الطريقة حالياً لأنسجة دماغ الفئران وقد تتطلب تعديلاً عند تطبيقها على أنسجة أخرى أو نماذج حيوانية بديلة، نظراً لاختلاف تكوين الأنسجة والخصائص التركيبية بين الأنواع والأعضاء. أخيراً، قد يتداخل تركيز 5–10% من SDS مع مطيافية الكتلة، ومقايسات نشاط الإنزيمات، ودراسات التفاعل بين البروتينات والبروتينات¹³^,¹⁴، وغيرها من التطبيقات الحساسة لـ SDS. ولذلك، قد تكون هناك حاجة إلى إجراءات إضافية لإزالة المنظفات أو تبديل المحلول المنظم.

وفي الختام، يتيح سير عمل التخصيص نصف الكروي هذا إجراء تحليلات مورفولوجية وجزيئية مزدوجة من نفس الحيوان، مع تقليل عدد الحيوانات المستخدمة والتباين بين الحيوانات. سيكون سير العمل هذا مفيداً في الدراسات التي تتطلب تحليلات نسيجية وجزيئية مزدوجة، لا سيما عندما تكون الأنسجة المتاحة محدودة. كما أن قدرته على تخزين المقاطع لفترات طويلة قد تسهل التحليلات الاسترجاعية وأرشفة العينات الموحدة، بينما يدعم استخدام عينات صغيرة من مناطق الدماغ الاستقصاءات الخاصة بكل منطقة. وتتمثل قيوده الرئيسية في انخفاض حصيلة الـ RNA والبروتين، واحتمالية وجود عدم تماثل نصف كروي، واقتصاره على أنسجة دماغ الفئران، ومحدودية التوافق مع التطبيقات الحساسة لـ SDS. وينبغي أن تعمل الدراسات المستقبلية على تحسين استعادة الجزيئات الحيوية، والتحقق من صحة سير العمل في أنسجة وأنواع أخرى، وتقييم الاستقرار طويل الأمد لأهداف جزيئية إضافية.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بأنه ليس لديهم أي مصالح مالية متنافسة معروفة أو علاقات شخصية من شأنها أن تؤثر على العمل الوارد في هذه الورقة.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح مقدمة من إدارة التعليم بمقاطعة Liaoning (مشروع البحث العام JYTMS20230571) ومبادرة جامعة Dalian الطبية لعام 2023 "تكامل الطب الصيني التقليدي والغربي من أجل الصحة والعافية" (H0.2XY2023KY10)، وكلاهما مُنح للأستاذ CQ Liu؛ ومن خلال برنامج ابتكار طلاب المرحلة الجامعية بمقاطعة Liaoning لعام 2025. &؛ برنامج تدريب ريادة الأعمال (S202510161061) وصندوق تدريب المواهب المبتكرة للطلاب الجامعيين وإصلاح التدريس بجامعة داليان الطبية (112307010209)، وكلاهما مُنِح لـ YK Li.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل خالية من إنزيم RNase	Axygen	MCT-150-C-S	جمع عينات خزعات نسيجية وأجزاء استخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) والبروتين.
أنابيب طرد مركزي مخروطية سعة 15 ملل	الغشاء الحيوي الرقيق (Biofilm)	CFT010150	التثبيت، وإزالة الماء باستخدام السكروز، وتخزين المحلول.
أطباق زراعة الخلايا ذات 24 بئراً	NEST	702001	جمع صبغات وتخزين المقاطع الدماغية عائمة الحرّة لفترات طويلة.
محلول سكروز بتركيز 30%	أُعدَّ في المختبر	نظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدي بالمحتوى العلمي المراد ترجمته من اللغة الإنجليزية إلى اللغة العربية، وسأقوم بتنفيذه وفقًا للمعايير المهنية والأكاديمية المحددة.	الحماية من التجميد لنصاف كرتي الدماغ المثبتة قبل التقطيع بالتجميد.
محلول بارافورمالدهيد بتركيز 4%	بيوشارب (Biosharp)	BL539A	تثبيت بالغمر لنصف كرة الدماغ المخصص لدراسة المورفولوجيا.
5× محلول تحميل البروتين	Beyotime Biotechnology	DL101	تحضير عينات البروتين للفصل الكهربائي للهلام باستخدام SDS (SDS-PAGE).
أجاروز	Solarbio	الفئة: A8201	تقييم سلامة الحمض النووي الريبوزي (RNA) عن طريق الفصل الكهربائي للهلامات الأجاروزية.
جسم مضاد لبروتين الدوبلكورتين	Abcam	ab18723	الأجسام المضادة الأولية للكيمياء النسيجية المناعية لبروتين الدوبلكورتين.
جسم مضاد لـ ERK	Beyotime	AB2014	الجسم المضاد الأولي للكشف عن إجمالي ERK بواسطة لطخة ويسترن.
جسم مضاد مضاد لبروتين GFAP	Abcam	ab10062	الأجسام المضادة الأولية للتألق المناعي للبروتين الحمضي الليفي الدبقي.
جسم مضاد لـ Iba1	واكو	NCNP24	الأجسام المضادة الأولية لتقنية التألق المناعي للجزيء الموائم الرابط للكالسيوم المتأين 1.
الأجسام المضادة لـ NeuN	Millipore	A60	الأجسام المضادة الأولية لصبغ المستضد النووي العصبي.
مضادات العامل النخرِي-κجسم مضاد p65	HUABIO	ET1603-12	الأجسام المضادة الأولية لـ NF-κتحليل لطخة ويسترن لبروتين p65.
جسم مضاد لـ ERK المفسفر	Beyotime	ET1610-13	الأجسام المضادة الأولية لتقنية لطخة ويسترن الخاصة بـ ERK المفسفر.
جسم مضاد لـ PSD95	HUABIO	ET1602-20	الأجسام المضادة الأولية لتحليل PSD95 بطريقة لطخة ويسترن.
جسم مضاد لـ ULK1	HUABIO	ET1704-63	الأجسام المضادة الأولية لتحليل ULK1 بطريقة لطخة ويسترن.
مضاد-β-جسم مضاد للتوبولين	ABclonal	AC021	جسم مضاد أولي للتحكم في التحميل لتقنية اللطخة الغربية.
وسط تثبيت فلوري مانع للبهتان	Beyotime	P0126-5	وسط التثبيت للمقاطع المصبوغة بتقنية التألق المناعي.
طقم الكشف عن البيروكسيداز باستخدام البيوتين والستريبتاديفيدين	شركة فوتشو مايكسين للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.)	KIT-9720	نظام الكشف الثانوي للكيمياء النسيجية المناعية باستخدام DAB.
ألبومين المصل البقري	شركة Qiansheng Biotech Co., Ltd.	QO3000	محلول الحجب للتلوين المناعي واللطخة الغربية.
فئران من سلالة C57BL/6	شركة Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	فئران من سلالة C57BL/6 بعمر 4 أسابيع	الحيوانات التجريبية لجمع أنسجة دماغ الفئران، في حال إدراجها.
نظام التصوير بالتألق الكيميائي	شركة كلينكس للأجهزة العلمية المحدودة (Clinx Science Instruments Co., Ltd.)	ChemiScope 6200 Touch	كشف إشارات التألق الكيميائي في لطخة ويسترن.
المجهر البؤري الماسح بالليزر	Leica Microsystems CMS GmbH	الرقم التسلسلي: 591974	التقاط الصور لمقاطع التألق المناعي.
محلول حفظ واقٍ من التجميد	جُهِّز في المختبر	غير متوفر	التخزين طويل الأمد لمقاطع الدماغ الطافية في −20 °C.
جهاز التجميد المقطعي (Cryostat)	Leica	CM1950	تحضير 30 μm مقاطع إكليلية للدماغ.
طقم ركيزة DAB الملونة	سيجما	SLBP7387V	التظهير الكروموجيني للكيمياء النسيجية المناعية.
محلول صبغ النواة بـ DAPI	كولابر (Coolaber)	SL7100	صبغة نووية مضادة للتفلور المناعي.
مجهر ضوئي رقمي	شركة نينغبو يونغشين للبصريات المحدودة (Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd.)	طراز NE910+FL-900	مراقبة تطور تفاعل DAB وتصوير المقاطع المصبوغة بالحقل المضيء.
دي إن ايس 1 (DNase I)	Vazyme	R223-01	إزالة الحمض النووي الجينومي المتبقي قبل النسخ العكسي.
جسم مضاد من الحمير ضد IgG الأرنب، مقترن بـ 488	Thermo Fisher Scientific	A21206	جسم مضاد ثانوي فلوري للتألق المناعي.
جسم مضاد من الحمير مضاد لـ IgG الأرنب، مقترن بـ 594	Abcam	ab150076	جسم مضاد ثانوي فلوري للتألق المناعي.
طقم E.Z.N.A. لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين والحمض النووي الريبوزي والبروتين	Omega Bio-Tek	D3892-01
جهاز إمداد الطاقة للترحيل الكهربائي	Bio-Rad	1645050	وحدة تزويد الطاقة للفصل الكهربائي للهلام الأغاروزي وفصل البروتينات بواسطة الفصل الكهربائي للهلام بوجود دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE).
إيثيلين جليكول	شركة سينوفارم للكواشف الكيميائية المحدودة (Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.)	10009828	مكونات محلول الحفظ الواقي من التجميد.
نظام تصوير الهلام	شركة كلينكس للأدوات العلمية المحدودة (Clinx Science Instruments Co., Ltd.)	ChemiScope 6200 Touch	تصوير هلامات الأجاروز لتقييم جودة الحمض الريبي النووي (RNA).
شرائح زجاجية مطلية بالجيلاتين	شركة سيتوتست لتصنيع الأدوات المختبرية المحدودة (CITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTD)	المرجع: 10127105P رقم القطعة: 80312-2101	تثبيت مقاطع الدماغ الحرة العائمة المصبوغة بـ DAB.
برمجيات تحليل الصور	المعاهد الوطنية للصحة	ImageJ/Fiji	التحليل densitometric لنطاقات لطخة ويسترن ومعالجة الصور.
أيزوبروبانول	شركة Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	80109218	ترسيب البروتين من الجزء العضوي/البيني.
جهاز طرد مركزي دقيق، مبرد	شركة يانتشنغ كايت للأجهزة المختبرية المحدودة (Yancheng Kaite Laboratory Instrument Co., Ltd.)	TGL16M	الطرد المركزي أثناء خطوات استخلاص وغسل الحمض النووي الريبوزي (RNA)/البروتين.
طقم استخلاص البروتين السريع (Minute Protein Extraction Kit)	ابتكر	MS-026
وسط تثبيت بلسمي متعادل	شركة شنغهاي يواني للتكنولوجيا الحيوية المحدودة، شنغهاي، الصين	رقم الكتالوج S30509، رقم CAS 96949-21-2	تغطية المقاطع المصبوغة بـ DAB والمجففة بشرائح غطائية.
وسط التضمين OCT	ساكورا	4583	وسط التضمين لعمل مقاطع تجميدية لأنصاف كرات الدماغ المثبتة.
أطباق أو أنابيب qPCR البصرية	Axygen	PCR-0208-C	أوعية التفاعل لعملية تضخيم qPCR.
بارافيلم (Parafilm)	أمنكور (Amcor)	PM996	إحكام إغلاق الأطباق متعددة الآبار لتخزين المقاطع لفترات طويلة.
بنتوباربيتال الصوديوم	Hualan Bio	57-33-0	عامل تخدير قبل التروية عبر القلب.
أطباق بتري	Biosharp	BS-90-D	التعامل مع الدماغ على الثلج وفصل نصف الكرتين.
كاشف استخلاص الحمض الريبي النووي (RNA) بالفينول/الغوانيدينيوم	سباركليد (Sparklade)	AC0101-B	كاشف مقارن لتجارب ضبط استخلاص الحمض الريبي النووي (RNA).
مزيج مثبطات الفوسفاتاز	APExBIO	K1015-100	الحفاظ على الفسفرة أثناء استخلاص البروتين.
محلول ملحي منظم بالفوسفات	Biosharp	BL601A	محلول الغسل المنظم، ومذيب محلول السكروز، ومذيب مادة الحماية من التجمد.
غشاء بولي فينيليدين فلورايد	Millipore	IPVH08100	غشاء لنقل لطخة ويسترن.
بولي فينيل بيروليدون K40	سيجما	9003-39-8	مكون محلول الحفظ الواقي من التجميد.
مزيج مثبطات البروتياز	Beyotime	P1045	منع تحلل البروتينات أثناء تحلل الأنسجة.
طقم استخلاص البروتين	ابتكر	MS-026	طقم مقارنة لتجارب ضبط استخلاص البروتين الكلي.
نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (Real-time PCR)	Amolarray	MA6000	تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وتحليل منحنى الانصهار.
دوديسيل كبريتات الصوديوم	BioFroxx	3250GR500	إذابة راسب البروتين وتحضير عينات الفصل الكهربائي للهلام باستخدام SDS-PAGE.
شفرات حلاقة معقمة	Biosharp	BS-RB-11	فصل نصفي الكرة المخية وتشذيب الأنسجة على الثلج.
مقترن الستربتافيدين وبيروكسيديز	شركة فوتشو مايكسين للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.)	KIT-9720	كاشف تضخيم/كشف الإشارة لصبغ الكيمياء النسيجية المناعية باستخدام DAB.
السكروز	هوشي	57-50-1	محلول الحماية من التجميد ومحلول الحفظ الواقٍ من التجميد.
المزيج الرئيسي لـ qPCR بصبغة SYBR	Vazyme	Q711-02	تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.
جهاز النقل	Bio-Rad	1703930	النقل الرطب للبروتينات من هلام الفصل الكهربائي للهلام بوجود دوديسلفات الصوديوم (SDS-PAGE) إلى الغشاء.
محلول ملحي مُنظّم بـ Tris مع Tween 20	جُهز في المختبر	يرجى تقديم النص المراد ترجمته.	محلول غسيل غشاء لطخة ويسترن.
Triton X-100	سينوفارم (Sinopharm)	9002-93-1	نفاذية مقاطع الدماغ للتلوين المناعي.
تريزول (Trizol)	سباركليد (Sparklade)	AC0101-B
طقم كشف الكيمياء النسيجية المناعية SP فائق الحساسية (للأجسام المضادة الأولية للفئران/الأرانب)	شركة Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	جسم مضاد ثانوي/كاشف تحديد لصبغة DAB في الكيمياء النسيجية المناعية.
جرذ ويستار	شركة Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	٢٨٠-٣٢٠ جم، ذكر	الحيوانات التجريبية لجمع أنسجة دماغ الجرذ، في حال إدراجها.
زايلين	شركة Sinopharm للكواشف الكيميائية المحدودة (Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.)	10023418	تنقية الشرائح المصبوغة بـ DAB قبل التغطية.
وسط تثبيت بلسم محايد	شركة شنغهاي يواني بيو-تكنولوج المحدودة، شنغهاي، الصين	رقم الكتالوج S30509، رقم CAS 96949-21-2	تغطية المقاطع المجففة والمصبوغة بـ DAB بشرائح التغطية.
مرافق الستريبتوفيدين والبيروكسيداز	شركة Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	كاشف تضخيم/كشف الإشارة لصبغة DAB في الكيمياء النسيجية المناعية.
تريتون إكس-100 (Triton X-100)	سينوفارم (Sinopharm)	9002-93-1	نفاذية المقاطع الدماغية من أجل الصبغ المناعي.
طقم كشف الكيمياء النسيجية المناعية SP فائق الحساسية (للأجسام المضادة الأولية للفئران/الأرانب)	شركة فوزو مايكسين للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.)	KIT-9720	الأجسام المضادة الثانوية/كاشف الكشف لتقنية الكيمياء النسيجية المناعية باستخدام DAB.
زايلين	شركة سينوفارم للكواشف الكيميائية المحدودة (Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.)	10023418	تصفية الشرائح المصبوغة بـ DAB قبل عملية التغطية.

المراجع

Lauwereyns J, et al. Toward a common interpretation of the 3Rs principles in animal research. Lab Anim. 2024;53(12):347-50.
Hubrecht RC, Carter E. The 3Rs and humane experimental technique: implementing change. Animals (Basel). 2019;9(10):754.
Gavériaux-Ruff C, Kieffer BL. Conditional gene targeting in the mouse nervous system: Insights into brain function and diseases. Pharmacol Ther. 2007;113(3):619-34.
Basu J, Siegelbaum SA. The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(11):a021733.
Wu J, et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 2021;11(5):e3988.
Taves MD, et al. Steroid concentrations in plasma, whole blood and brain: Effects of saline perfusion to remove blood contamination from brain. PLoS One. 2010;5(12):e15727.
Jordan JT. The rodent hippocampus as a bilateral structure: A review of hemispheric lateralization. Hippocampus. 2020;30(3):278-92.
Mundorf A, Ocklenburg S. Looking at both sides: Integrating data from both hemispheres is crucial in rodent neuroscience. Eur J Neurosci. 2025;62(5):e70249.
Watson RE, et al. Use of cryoprotectant to maintain long-term peptide immunoreactivity and tissue morphology. Peptides. 1986;7(1):155-9.
Hoffman GE, Le WW. Just cool it! Cryoprotectant anti-freeze in immunocytochemistry and in situ hybridization. Peptides. 2004;25(3):425-31.
Rajput SK, et al. A column-based rapid method for the simultaneous isolation of DNA, RNA, miRNA and proteins. Cell Biol Int. 2012;36(9):779-83.
Morse SMJ, Shaw G, Larner SF. Concurrent mRNA and protein extraction from the same experimental sample using a commercially available column-based RNA preparation kit. Biotechniques. 2006;40(1):54-8.
Puchades M, Westman A, Blennow K, Davidsson P. Removal of sodium dodecyl sulfate from protein samples prior to matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 1999;13(5):344-9.
Kachuk C, Stephen K, Doucette A. Comparison of sodium dodecyl sulfate depletion techniques for proteome analysis by mass spectrometry. J Chromatogr A. 2015;1418:158-66.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

qPCR