بروتوكول تصوير ثلاثي الألوان عالي الدقة متعدد الألوان لتحويل الكولاجين إلى ألياف الكولاجين من النوع الأول المؤتلف ذاتيا

Summary

هنا، نقدم بروتوكولا لتمييز التمعدن داخل الألياف الليفية مقابل التمعدن خارج الألياف الليفية في ألياف الكولاجين المؤتلفة باستخدام STORM ثلاثي الألوان متعدد الألوان، مع دمج التصنيف الأمثل، والتصوير، والتحليل الكمي التزامن مع التمركز.

Abstract

يصف هذا البروتوكول طريقة مجهر إعادة بناء بصري ثلاثي الأبعاد ثلاثي الألوان (3D-STORM) لتصوير تمعدن الكولاجين على نطاق نانوي في نموذج ليفي من النوع الأول من الكولاجين المجمع ذاتيا. تتيح هذه الطريقة التصوير المتزامن للكولاجين، والبروتينات غير الكولاجينية (مثل كبريتات الكوندرويتين)، وأطوار معادن فوسفات الكالسيوم. يتضمن تحضير العينة التجميع السيلاني الأميني وتجميع الكولاجين ذاتيا، يليه التمعدن باستخدام وسط فوسفات الكالسيوم الذي يشكل فوسفات الكالسيوم غير المتبلور (ACP) في مرحلة مبكرة (30 دقيقة) وينضج إلى هيدروكسيا باتيت (HAP) بعد 6 ساعات. ثم يتم إجراء وسم الفلورة المناعية متعددة الإبريض، ويتم تقييم العينات أولا بواسطة المجهر الكونفوكالي قبل التقاط صورة 3D-STORM باستخدام مخزن تصوير لجمع الأكسجين. يتم إجراء معالجة وتحليل البيانات باستخدام برامج متاحة للجمهور. مقارنة بالمجهر الإلكتروني أو الكونفوكال التقليدي، يجمع هذا البروتوكول بين الخصوصية الجزيئية والدقة النانوية (الدقة الجانبية النموذجية 20–30 نانومتر، والمحور 50–60 نانومتر)، مما يسمح برؤية ثلاثية الأبعاد لأنماط التمعدن داخل الألياف مقابل خارج الفيليف. تظهر النتائج التمثيلية تصورا واضحا لشبكات الكولاجين، والبروتينات غير الكولاجينية المرتبطة، والمراحل المعدنية داخل الفضاء ثلاثي الأبعاد. تم توفير مقاييس كمية تشمل معامل الارتباط لبيرسون (0.89 ± 0.04) ومعامل التداخل لماندرس (0.91 ± 0.03) في قسم النتائج. يوفر هذا البروتوكول أداة قوية للباحثين في علوم المواد الحيوية، والتمعدن الحيوي، وهندسة أنسجة العظام الذين يحتاجون إلى فهم نانوي لديناميكيات التمعدن.

Introduction

تمعدن الكولاجين هو عملية بيولوجية أساسية محورية في تكوين الأنسجة الصلبة مثل العظام والأسنان¹. البنية المعقدة لألياف الكولاجين، إلى جانب التنظيم الدقيق لترسيب المعادن، تمنح هذه الأنسجة قوة ميكانيكية ملحوظة وسلامة هيكلية ملحوظة.². الكولاجين لا يعمل فقط كهيكل سلبي، بل كمشارك نشط، ينسق ترسيب المعادن بدقة من خلال تفاعلات جزيئية وفيزيائية معقدة³. توضيح هذه الآليات أمر بالغ الأهمية لفهم الحالات المرضية مثل هشاشة العظام وتسوس الأسنان، ولتطوير مواد محاكاة حيوية للعلاجات التجديدية⁴.

يتراوح قطر ألياف الكولاجين في الأنسجة الصلبة بين حوالي 50 إلى 100 نانومتر، مع أن جزيئات الهيدروكسيا باتيت (HAP) أصغر حجما (عادة 2–5 نانومتر في السمك و20–30 نانومتر في الطول) ومتداخلة داخل الفجوات الليفية⁵. بينما يمكن أن تعمل مناطق الفجوات كمواقع نوى، إلا أن المعادن في الأنسجة الأصلية تتشكل في البداية في الفراغات بين الألياف ثم تتوسع لاحقا إلى أقسام داخل الألياف الليفي. تشمل طرق التوصيف التقليدية التلوين النسيجي، المجهر الماسح بالليزر الكونفوكالي ^6,7، والمجهر الإلكتروني ^8,9. يوفر التلوين النسيجي تقييما ماكروسكوبيا لكنه لا يستطيع تقييم حالات التمعدن على نطاق النانو. المجهر الكونفوكلي يتيح ملاحظة مكونات محددة لكنه محدود الحيود (~200 نانومتر جانبيا)، غير قادر على تحليل التمعدن داخل الألياف مقابل خارج الألياف¹⁰. المجهر الإلكتروني يقدم دقة عالية لكنه يفتقر إلى الخصوصية الجزيئية. على الرغم من أن وسم الذهب المناعي يمكن أن يوفر خصوصية جزيئية للمجهر الإلكتروني، إلا أنه يتطلب معالجة متخصصة وأقل قابلية للتصور ثلاثي الأبعاد متعدد للمكونات مقارنة ب STORM، ويتطلب دورات تجريبية طويلة وتكاليف عالية¹¹.

يتغلب المجهر البصري العشوائي (STORM) على حد الحيود من خلال تحديد مواقع الفلوروفورات الفردية بدقة عالية، محققا دقة جانبية ~20 نانومتر¹². بالمقارنة مع تقنيات الدقة الفائقة الأخرى مثل المجهر الاستنزاف الانبعاثي المحفز (STED)¹³والمجهر الإضاءة الهيكلي (SIM)¹⁴، يقدم STORM دقة تحديد موقعية أعلى (~20 نانومتر جانبيا و~50 نانومتر محوريا) ويتوافق مع نطاق أوسع من الفلوروفورات العضوية. على وجه الخصوص، يتطلب STED أصباغ متخصصة وقوى ليزر عالية يمكن أن تتلف العينات البيولوجية، بينما يقدم SIM دقة ~100 نانومتر فقط، وهي غير كافية لتحديد ميزات بمقياس الألياف (50–100 نانومتر). يوفر STORM توازنا عمليا بين الدقة، وقدرة التعدد، وتوافق العينات. وصفت الإرشادات المنشورة عينات اختبار موحدة لتسهيل تحسين معلمات تصوير STORM وتقييم الدقة¹⁵. عند دمجه مع قدرات التصوير ثلاثي الأبعاد، يتيح 3D-STORM التصور النانوي لعدة مكونات في آن^واحد. وقد وسعت التطورات الحديثة STORM ليشمل التصوير متعدد الألوان ومتعدد الصور، مما أتاح تصور عدة أهداف ضمن نفس العينة^17,18.

يستخدم هذا البروتوكول نموذج بيوميميتيكي في المختبر يعتمد على ألياف الكولاجين المؤتليفة من النوع الأول ذاتيا المجمعة، وهو مصمم صراحة لنماذج الألياف الكيميائية المجمعة ذاتيا للكولاجين من النوع الأول المؤتلف، لتمييز التمعدن داخل الألياف الليفية عن خارج الألياف على المستوى النانوي. ليست مناسبة لتصوير الخلايا الحية، حيث تتطلب STORM عينات ثابتة ومخازن لجمع الأكسجين. كما أنه غير مناسب للأنسجة الأصلية عالية المعادن (مثل العظم الناضج) بدون إزالة الكالسيف أو استرجاع المستضدات مسبقا. إذا كان التحليل فقط يتطلب الكثافة المعدنية العامة أو شكل المساحة الكبيرة، فإن المجهر الكونفوكالي أو الإلكتروني التقليدي يكون أكثر كفاءة.

الهدف العام لهذا البروتوكول هو توفير سير عمل موحد وتدريجي لاستخدام تقنية 3D-STORM متعددة الألوان لتصوير توزيع المعادن والبروتينات غير الكولاجينية على المستوى النانوي داخل ألياف الكولاجين الفردية، مع التركيز بشكل خاص على التمييز بين التمعدن داخل الألياف الليفية وخارج الألياف الليفية. يدمج هذا البروتوكول التصنيف المناعي المحسن مع مخزن تصوير مخصص لتمكين تتبع المكونات العضوية المتعددة (الكولاجين، البروتينات غير الكولاجينية) والمراحل غير العضوية (ACP، HAP) في ثلاثة أبعاد¹⁹. ابتكار رئيسي هو التقييم الكمي لأنماط التمعدن داخل الألياف الليفية مقابل أنماط التمعدن خارج الليف. يتم تحقيق القياس من خلال معيارين مستقلين: (1) حساب معامل التموضعي المشترك لبيرسون بين قنوات المعدن (صبغة مؤشر الكالسيوم (مثل كالسيين)) والكولاجين (صبغة فلورية حمراء بعيدة) باستخدام وحدة التداخل في برامج تحليل الصور (المعامل >0.8 يشير إلى ارتباط قوي)؛ (2) تحليل استمرار إشارة المعادن عبر شرائح Z للألياف الفردية: إذا كانت إشارة المعدن موجودة في الشرائح المركزية (Z = 0 إلى ±120 نانومتر من مركز الألياف الرأسية) عند شدة ≥50٪ من الحد الأقصى)، تصنف كإشارة داخل الألياف الليفي. على عكس المجهر الإلكتروني أو الكونفوكال التقليدي، يجمع هذا البروتوكول بين الخصوصية الجزيئية والدقة النانوية، مما يتيح توزيعا مكانيا ثلاثي الأبعاد للتمعدن داخل الفيليف.

تم تصميم هذا البروتوكول للباحثين في علوم المواد الحيوية، والتمعدن الحيوي، وهندسة أنسجة العظام الذين يحتاجون إلى فهم نانوي لديناميكيات التمعدن. يمكن أيضا تعديل الإجراء الموحد لدراسة أنظمة الكولاجين المعدنية الأخرى، مثل شرائح العاج المنزوعة المعادن أو الهيدروجيلز القائمة على الكولاجين، من خلال تعديل خطوات تحضير العينة الأولية وفقا لذلك.

Protocol

أجريت جميع التجارب التي شملت عينات بيولوجية وفقا للإرشادات واللوائح الخاصة بالمرافق الأساسية في كلية الطب بجامعة تشجيانغ، وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة السلامة الحيوية المؤسسية (شهادة الموافقة رقم: BSL20235710079). يستخدم البروتوكول التجريبي الموضح هنا كواشف مصدرها تجاري وأنظمة محاكاة حيوية في المختبر. لا يشمل المشاركين البشر، أو الحيوانات، أو عينات الأنسجة البشرية، وبالتالي لا يتطلب موافقة أخلاقية من لجنة مراجعة مؤسسية.

تحذير: يجب تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالمواد الكيميائية الخطرة باستخدام غطاء بخاري مع معدات الحماية الشخصية المناسبة (معطف المختبر، القفازات، نظارات السلامة). التخلص من النفايات الكيميائية وفقا للوائح المؤسسات. بالنسبة ل NaN₃، اجمع النفايات في حاوية مخصصة تحمل علامة "نفايات الأزيد" ولا تخلط مع الأحماض (خطر الغازات المتفجرة). بالنسبة للجلوتارالديهايد، قم بإيقاف نشاطه بزيادة 10٪ من ثنائي كبريتات الصوديوم قبل التخلص منه. بالنسبة ل β-ميركابتوإيثانول، أكسد بالمبيض (1:10 فولت/فولت) لمدة ساعة قبل التخلص من التصريف.

ملاحظة: يجب إجراء وسم الفلورة المناعية قبل التمعدن لتجنب تغطية الحواتم بواسطة الرواسب المعدنية. في التطبيقات التي تتطلب وضع علامات بعد التمعدن، قد تكون هناك حاجة لاسترجاع المستضدات.

1. تحضير وسط التمعدن

1. تحضير وسط التمعدن لألياف الكولاجين المعاد تشكيلها
   1. تحضير محلول مخزون الكالسيوم بإضافة 100 ميكرولتر من حمض البولي أسبارتيك بقوة 5 ملغ/مل (p-Asp، Mw 9-11 كيلو دالتون) بشكل إسقاطي إلى 5 مل من محلول CaCl₂ بقوة 3.44 ملليمتر في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل.
   2. خلط الدوامة في الأنبوب لمدة 30 ثانية حتى يصبح متجانسا.
   3. أضف p-Asp ببطء وامزج جيدا لتثبيت فوسفات الكالسيوم غير المتبلور (ACP).
   4. أضف 5 مل من محلول الفوسفات (19 ملليموتر Na₂HPO₄ + 300 ملليمولار NaCl) إلى محلول مخزون الكالسيوم.
   5. خلط دوامة لمدة دقيقة واحدة.
      ملاحظة: التركيزات النهائية بعد الخلط: 1.67 ملليموغل CaCl₂، 9.5 ملليمولاوات Na₂HPO₄، 150 ملليمولار NaCl، و50 ميكروغرام/ملليتر p-Asp.
   6. جهز وسط التمعدن مباشرة قبل الاستخدام. لا تخزن؛ استخدم مقدمة ACP غير المستقرة فورا لتحقيق نتائج متسقة.
      ملاحظة: يؤدي التخزين إلى التبلور المبكر.
2. تحضير وسط التمعدن لجل الكولاجين/العاج منزول المعادن
   1. تحضير محلول يحتوي على الكالسيوم عن طريق إذابة 8.77 جرام NaCl، 0.01 جرام NaN₃، 6.06 جرام Tris، و1.11 جرام CaCl₂ في مياه منزوعة الأيونات بسعة 800 مل.
   2. ارفع الحجم إلى 1 لتر باستخدام ماء منزوع الأيون.
   3. أضف 350 ميكروغرام/مل حمض البولي أكريليك (PAA، ميغاوات ~1800) إلى المحلول المحتوي على الكالسيوم.
   4. دوامة لمدة دقيقة واحدة.
      ملاحظة: استخدم PAA بدلا من p-Asp لتحسين الاستقرار عند تركيزات الكالسيوم الأعلى.
   5. تحضير محلول الفوسفات عن طريق إذابة 0.85 جرام Na₂HPO₄ في 1 لتر ماء منزوع الأيونات للحصول على 6 مللي مولار Na₂HPO₄.
   6. تعقيم محلول الفوسفات بالفلتر باستخدام غشاء بحجم 0.22 ميكرومتر.
   7. اجمع أحجام متساوية (مثل 500 مل لكل منهما) من محاليل الكالسيوم والفوسفات مع التحريك المغناطيسي عند 300 دورة في الدقيقة.
   8. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.4 باستخدام 1 M HCl أو NaOH أثناء المراقبة باستخدام جهاز قياس الرقم الهيدروجيني.
      ملاحظة: حافظ على الرقم الهيدروجيني عند 7.4 ± 0.1. لا تسمح بانحرافات الرقم الهيدروجيني >0.2، التي تسبب التبلور المبكر.

2. تحضير ألياف الكولاجين المؤتلفة

1. تقويم الأمينو-سيلان للأطباق ذات القاع الزجاجي
   ملاحظة: يستخدم هذا المعالجة (3-أمينوبروبيل) ترايثوكسيسيلان (APTES) لإدخال مجموعات أمينية موجبة الشحنة (-NH₂) على سطح الزجاج، مما يعزز الامتصاص الكهروستاتيكي وتثبيت مونومرات الكولاجين سالبة الشحنة.
   1. أضف 200 ميكرولتر من محلول APTES (5٪ v/v في الإيثانول المطلق) إلى كل طبق زراعة ذو قاع زجاجي (35 مم، سمك #1.5H، 0.17 مم ± 0.005 مم).
   2. تأكد من تغطية سطح الطبق بالكامل بمحلول APTES.
   3. الحضانة في الظلام لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية).
   4. اشطف الصحون ثلاث مرات بالإيثانول المطلق (2 مل في كل غسلة).
   5. استخدم الموجات فوق الصوتية في ماء منزوع الأيونات لمدة 10 دقائق عند 40 كيلوهرتز. قم بإزالة بقايا APTES تماما لمنع الارتباط غير المحدد.
   6. يمكن تخزين الصحون المملحة جافة عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد.
   7. (اختياري) اخبز لتحسين الاستقرار: ضع الصحون المغسولة والمجففة في فرن عند درجة حرارة 100–120 درجة مئوية لمدة 30–60 دقيقة.
   8. اتركه ليبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل المتابعة.
      ملاحظة: إذا استخدمت أطباق بلاستيكية، خفض درجة الحرارة إلى أقل من 80 درجة مئوية لمنع التشوه. اقتباس طريقة السيلان من Bitter وMuir²⁰.
2. التجميع الذاتي للكولاجين والربط المتقاطع
   1. محلول الكولاجين-I بمقدار 100 ميكرولتر (50 ميكروغرام/مل في حمض الخليك بقوة 0.1 مل) على كل طبق سيلان.
   2. حضن عند حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 ساعات في غرفة رطوبة (> 90٪ رطوبة نسبية). حافظ على رطوبة مستقرة لمنع تبخر المحلول.
   3. التحقق من تكوين الألياف باستخدام المجهر التباين الطور أو المجهر الكونفوكلي؛ التحضير الناجح يظهر شبكة ألياف دقيقة تشبه الويب.
   4. للتحقق من تكوين الألياف بشكل صحيح على المستوى فوق البنيوي، جهز عينة منفصلة على شبكة TEM مطلية بالكربون من البوليفينيل الرسمي / مطلية بالكربون وفقا لنفس ظروف التجميع الذاتي (الكولاجين-I 50 ميكروغرام/مل، 37 درجة مئوية، 10 ساعات، الرطوبة > 90٪).
   5. صبغ بحمض الفوسفوتونجستيك بنسبة 1٪ (درجة حموضة 7.0) لمدة 10 دقائق.
   6. اغسله بالماء منزوع الأيون.
   7. افحص تحت مجهر إلكتروني ناقل. يشير النجاح إلى تكوين التليف بنمط الشريط الدوري D المميز 67 نانومتر (انظر الشكل 3).
   8. استنشق بعناية محلول الكولاجين المتبقي من الصحون ذات القاع الزجاجي.
   9. أضف 2 مل من محلول كبريتات الكوندرويتين (CS) (50 ملغ/مل في PBS، رقم الهيدروجينة 5.5) إلى كل طبق.
   10. حضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 12 ساعة للسماح بامتصاص كهروستاتيكي للألياف الكولاجينية.
   11. حضر محلول الربط المتقاطع EDC/NHS²¹: إذابة 0.2 M EDC (1-إيثيل-3-(3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل) كربوديميد) و0.05 M NHS (N-هيدروكسي سوكسنيميد) في مخزن MES (0.1 M MES، pH 5.5).
       ملاحظة: يمكن تحضير مخزن MES عن طريق إذابة حمض MES الحر في ماء منزوع الأيونات وضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.5 باستخدام NaOH.
   12. أزل محلول CS وأضف 2 مل من محلول الربط المتقاطع EDC/NHS.
   13. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين لتثبيت CS على الكولاجين بشكل تساهمي.
   14. اغسل الصحون ثلاث مرات باستخدام PBS (5 مل لكل منها، 5 دقائق لكل منها) لإزالة المواد غير المتفاعلة.
   15. تخزين ألياف الكولاجين المعالجة في PBS على درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل التمعدن.

3. وضع العلامات على الفلورة المناعية (يتم قبل التمعدن)

1. تحضير العينة
   1. اشطف ألياف الكولاجين ثلاث مرات بمحلول NaCl بسعة 500 ملليمول (10 مل لكل غسلة، 5 دقائق لكل غسلة).
   2. اغسل ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات (10 مل لكل غسلة، 5 دقائق لكل غسلة).
   3. قم بغسل الألواح على منصة هزاز أفقية تدور بسرعة 50 دورة في الدقيقة لضمان غسل شامل مع تقليل قوى القص التي قد تفك الألياف المجمعة.
2. الحجب وحضانة الأجسام المضادة الأولية
   1. حضن باستخدام محلول حاجز (ألبومين مصل بقري بنسبة 5٪ في PBS) عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في غرفة رطبة.
   2. تحضير كوكتيل الأجسام المضادة في حاجز حاجز: مضاد الكولاجين-I للأرنب (تخفيف 1:100) وكبريتات مضاد للغضروف للفأر (تخفيف 1:100).
   3. أضف 200 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة لكل عينة.
   4. غط العينات بفيلم ختم مختبري.
   5. الحضانة عند 4 درجات مئوية طوال الليل (12–16 ساعة).
   6. احم من الضوء باستخدام ورق الألمنيوم. بعد حضانة الأجسام المضادة الأولية، يمكن تخزين العينات في PBS عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.
3. صبغة الأجسام المضادة الثانوية
   1. أزل الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة بغسل الصحون ثلاث مرات باستخدام محلول غسيل (0.1٪ Tween-20 في PBS)، لمدة 10 دقائق لكل غسلة.
   2. حضر خليط الأجسام المضادة الثانوية الفلورية في محلول حجب (200 ميكرولتر لكل طبق 35 مم) الذي يحتوي: IgG مضاد للأرانب الماعز مرتبط بصبغة فلورية حمراء بعيدة (1:100) وIgM مضاد للفأر الماعز مقترق بصبغة فلورية حمراء (1:100).
      ملاحظة: من هذه الخطوة فصاعدا، احمي العينات من الضوء لمنع التبييض الضوئي للفلوروفور.
   3. حضن العينات في درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية) لمدة ساعة واحدة في الظلام.
   4. اغسل الصحون ثلاث مرات باستخدام محلول غسيل (10 دقائق لكل مرة) لإزالة الأجسام المضادة الثانوية غير المربوطة.
      ملاحظة: تخزين العينات الموسومة بنظام PBS عند 4 درجات مئوية (محمية من الضوء) لمدة تصل إلى 48 ساعة قبل التصوير. تتضمن ضوابط عدم وجود أجسام مضادة أولية لفحص التألق الذاتي.

4. تمعدن ألياف الكولاجين (يتم بعد وضع العلامات)

1. عملية التمعدن
   1. أضف 2 مل من وسط التمعدن الطازج المحضر لكل طبق.
   2. الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (قصيرة الأمد) لتكون المعادن في المرحلة المبكرة (ACP).
   3. بدلا من ذلك، الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات (طويلة الأمد) لتبلور المعادن الناضجة (HAP).
      ملاحظة: حافظ على درجة حرارة دقيقة عند 37 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية باستخدام حاضنة معايرة.
   4. سحب وسط معدني بلطف إلى الداخل.
   5. اشطف ثلاث مرات بماء منزوع الأيونات (5 مل لكل غسلة، بفاصل دقيقة واحدة).
2. وسم فوسفات الكالسيوم
   1. أضف 4 ميكرومولار من صبغة مؤشر الكالسيوم (مثل الكالسيين) في PBS (200 ميكرولتر لكل طبق).
   2. حضن في درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية) لمدة 30 دقيقة في الظلام.
      ملاحظة: صبغة مؤشر الكالسيوم (مثل الكالسيين) ترتبط بأيونات الكالسيوم ولا تميز بين الأطوار غير المتبلورة والبلورات؛ يعتمد تعيين الطور على زمن التمعدن (30 دقيقة = ACP، 6 ساعات = HAP). يجب حمايتها من الضوء باستخدام أنابيب كهرمانية أو تغليف بورق الألمنيوم.
   3. اشطف خمس مرات: ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات وغسلتان بإيثانول 70٪ (دقيقة لكل منهما)، بالتناوب بين الاثنين.
3. تحضير العينة للتصوير
   1. غمر عينات في مخزن التصوير: 10٪ (بدون ضخامة) جليسرول في PBS. يمكنك إضافة كاشف مضاد للتلاشي حسب تعليمات الشركة المصنعة.
   2. تطبيق حجم كاف (20–50 ميكرولتر) من مخزن التصوير لتغطية العينة.
   3. ضع غطاء فوق العينة.
   4. خزن العينات عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى 72 ساعة.

5. الملاحظة تحت مجهر ليزري كونفوكلي

1. نقل العينات من تخزين بدرجة 4 درجات مئوية إلى درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية).
2. اترك 10 دقائق من التوازن لمنع التكثف.
3. حافظ على الحماية الضوئية باستخدام عبوات كهرمانية أو ورق ألمنيوم.
4. تحقق من أن مخزن التصوير يغطي العينة بالكامل.
5. قم بضبط المجهر الكونفوكالي مع الإعدادات التالية:
   1. لتصوير الكولاجين (صبغة فلورية حمراء بعيدة): ليزر 647 نانومتر، مرشح انبعاث 650-710 نانومتر.
   2. لتصوير فوسفات الكالسيوم (صبغة مؤشر الكالسيوم (مثل الكالسيين)): ليزر 488 نانومتر، مرشح انبعاث 500-550 نانومتر.
   3. الهدف: غمر الزيت 100× (NA 1.4).
   4. قطر الثقب: وحدة إيري واحدة (AU).
   5. زمن البكسل في التخزين: 1-2 ميكروثانية.
      ملاحظة: قم بمحاذاة الليزر ومعايرة الثقب قبل التصوير.
6. إجراء المسح التسلسلي: أول فحص بإثارة 647 نانومتر (كولاجين).
7. قم بإجراء المسح الثاني مع إثارة 488 نانومتر (معدني).
   ملاحظة: اجمع القنوات بشكل متسلسل لتجنب التسرب.
8. لإعادة البناء ثلاثية الأبعاد، اضبط حجم خطوة المكدس Z إلى 0.5 ميكرومتر أو أقل لضمان أخذ عينات كافية.
9. احفظ الملفات مع حفظ البيانات الوصفية.
10. لتحليل التزاوج، استخدم برامج تحليل الصور القادرة على حساب معامل الارتباط الخاص ببيرسون (مثل البرامج المتاحة للجمهور مع الإضافات المناسبة).

6. التصوير بواسطة مجهر إعادة بناء بصري ثلاثي الأبعاد عشوائي (3D-STORM)

1. تحضير مخزن تصوير STORM²²
   ملاحظة: يضاف أكسيداز الجلوكوز والكتالاز إلى مخزن التصوير لجمع الأكسجين، مما يقلل من التبييض الضوئي ويطيل وميض الفلورفورات، وهو أمر ضروري لتحديد موقع جزيء واحد في STORM.
   1. حضر محلول مخزون لوكوز أكسيداز (GOx) بدرجة 8 ملغ/مل في محلول أسيتات الصوديوم 50 ملليمول (pH 5.1).
   2. جهز محلول مخزن كاتالاز عند 160 ميكروغرام/مل في 1× PBS.
      ملاحظة: قم بتخزين الإنزيمات في Aliquot، ثم تجميده باستخدام النيتروجين السائل أو حمام الثلج الجاف/الإيثانول، وتخزينه عند -20 °م أو -80 °م. تجنب تكرار دورات التجمد والذوبان.
   3. جهز جهاز تصوير STORM جديد على الجليد، محمي من الضوء.
   4. اجمع المكونات التالية بالترتيب المدرج إلى حجم نهائي 1 مل: H₂O خالي من النوكلياز المعقم (إلى 1 مل)، 1 M NaCl (10 ميكرولتر، 10 ملليمولار نهائي)، 1 M Tris-HCl pH 8.0 (50 ميكرولتر، 50 ملليمولار نهائيا)، 1 ميلار سيستيمين (MEA) المعدل حديثا مع الرقم الهيدروجيني ~7.0 (50 ميكرولتر، 50 ملليمول نهائي)، 50٪ (مع الفولت) الجلوكوز (200 ميكرولتر، 10٪ مع الجهد النهائي)، مخزون GOx (200 ميكرولتر، 1.6 ملغ/مل نهائي)، مخزون الكالازي (200 ميكرولتر، 32 ميكروغرام/مل نهائي).
   5. اخلط بلطف عن طريق التوصيل بالماصة أو العكس. لا تدع دوامة.
      ملاحظة: يجب تحضير المخزن المؤقت طازجا وحفظه على الثلج محميا من الضوء. استخدم خلال 30 دقيقة من التحضير. للحصول على تحسين مفصل لظروف تصوير STORM، يرجى الرجوع إلى البروتوكولات المعتمدة باستخدام عينات الاختبار¹⁵.
   6. أضف 200 ميكرولتر من مخزن تصوير STORM المحضر حديثا لتغطية العينة بالكامل.
2. تكوين نظام 3D-STORM
   1. تأكد من توجيه مسار التصوير إلى كاميرا CCD مضاعفة الإلكترون (EMCCD).
   2. شغل وحدة العدسة الأسطوانية للتصوير ثلاثي الأبعاد.
   3. اضبط البرنامج على وضع اكتساب 3D STORM.
   4. قم بتكوين مرشحات المسار البصري للأصباغ المستخدمة.
   5. شغل ليزر 647 نانومتر واضبط القدرة على مستوى منخفض (1-5 مللي واط).
   6. باستخدام هدف غمر الزيت بحجم 100× (NA ≥1.4)، حدد موقع منطقة الاهتمام في وضع المعاينة الحية للحقل الواسع أو TIRF.
   7. احصل على صورة فلورية واسعة المجال تقليدية لمقارنتها لاحقا.
   8. انتقل إلى وضع إضاءة TIRF.
   9. قم بمعايرة زاوية TIRF لتحقيق مجال إضاءة رقيق (~100-200 نانومتر) لتقليل الفلورة الخلفية.
   10. ضبط زمن التعريض بالكاميرا (10-30 مللي ثانية) بناء على شدة الإشارة الأولية.
   11. اضبط قدرة ليزر التصوير بناء على شدة الإشارة الأولية.
   12. قم بإجراء اختبار قصير للاكتساب (Quest Acquisition).
   13. تحقق من أن المعايير مضبوطة بشكل صحيح دون التسبب في تبييض ضوئي سريع.
       ملاحظة: تأكد من محاذاة دقيقة لمحور العدسة الأسطوانية مع مستوى العينة. معظم الأنظمة الحديثة تحتوي على معايرة تلقائية. للمعايرة اليدوية، استخدم خرز فلورسنت بطول 100 نانومتر للتحقق من دوال الانتشار النقطي المستديرة المتماثلة (PSFs).
   14. ابدأ بتعريض 10–30 مللي ثانية عند قدرة ليزر 647 نانومتر بقوة 1–2 كيلوواط/سم^مربع.
   15. تحقق من أن كثافة الوميض هي 0.1–1 جزيء/ميكرومتر^مربع.
   16. إذا كانت الكثافة منخفضة جدا أو مرتفعة جدا، قم بضبط قوة الليزر أو وقت التعريض وفقا لذلك.
   17. كرر عملية التحقق والتعديل حتى يتم تحقيق الكثافة المثالية.
3. جمع بيانات 3D-STORM
   1. اضبط برنامج الاستحواذ على وضع "التفعيل المستمر".
   2. اضبط ليزر التصوير (647 نانومتر) على طاقة عالية (100-500 ميلي واط مدخل لياف) لتحويل معظم الفلوروفورات إلى الحالة المظلمة.
   3. اضبط ليزر التفعيل (405 نانومتر) على طاقة منخفضة (0.1–5 ميلي واط).
   4. قم بتحسين قدرة 405 نانومتر تجريبيا للحفاظ على 100–200 جزيء محلي في كل إطار في منطقة 256×256 بكسل.
   5. اضبط العدد الإجمالي للإطارات بين 10,000–20,000.
   6. استخدم إطارا واحدا من ضوء التنشيط (405 نانومتر) يليه 5 إطارات من ضوء التصوير (647 نانومتر) في كل دورة.
   7. ابدأ بالاقتناء.
   8. تشغيل EMCCD بأقصى حساسية (تطبيق كسب EM)
   9. استخدم تعريض 10–30 مللي ثانية لكل إطار.
   10. أثناء الاستحواذ، راقب كثافة الجزيئات النشطة.
   11. ضبط قدرة ليزر 405 نانومتر للحفاظ على تدفق ثابت من الأحداث الفردية.
       ملاحظة: يمكن تخزين بيانات الأفلام الخام على قرص صلب عادي للأرشفة طويلة الأمد قبل إعادة البناء.
4. تحليل بيانات تمعدن الكولاجين (باستخدام برنامج تحليل الصور مع وحدة STORM)
   1. في برنامج التحليل، اختر برنامج تشغيل الكاميرا المناسب (وحدة STORM).
   2. انقر على [واجهة التحليل الرسومية] في لوحة STORM. نافذة التحليل تفتح.
   3. انقر على [فتح الملف]. اختر ملف صورة المجهر الخام ليتم تحليله. انقر على الفتح.
   4. تحديد الحد الأدنى لقيمة الفلورة (الحد الأدنى للارتفاع) للإشارات الصالحة.
   5. ابحث عن أظلم بقعة لا تزال معروفة كإشارة جزيء واحد.
   6. حرك الفأرة إلى مركزها.
   7. اقرأ قيمة الارتفاع القصوى.
   8. سجل هذه القيمة.
   9. انقر على [إعدادات التعريف]. في الحوار، قم بتعيين المعلمات التالية: الحد الأدنى للارتفاع (أدخل القيمة المسجلة في الخطوة 6.4.8)، الحد الأقصى للارتفاع (20000)، CCD Baseline (100)، وللبيانات 3D-STORM تحقق "3D" (إلغاء الاختيار ل2D).
   10. انقر >> لتوسيع المزيد من المعايير. التعيين: الحد الأدنى للعرض (نانومتر) إلى 200، الحد الأقصى للعرض (نانومتر) إلى 700 (400 للثنائي الأبعاد)، عرض التركيب الأولي (نانومتر) إلى 300، أقصى نسبة محورية إلى 2.5 (1.3 للثنائي الأبعاد)، وأقصى إزاحة (صور) إلى 1.
   11. انقر على موافق لإغلاق الحوار.
   12. قم بإجراء تحليل اختبار للتحقق من صحة المعلمات. إلغاء تحديد تصحيح الانجراف.
   13. اضبط الفترات الشهرية إلى 1.
   14. انقر على [اختبار].
   15. بعد التحليل، اضغط على موافق في الحوار المنبثق.
   16. تحقق من تحديد نقاط الإشارة بشكل صحيح. يجب عدم اختيار الضوضاء الخلفية بشكل خاطئ. لا ينبغي تفويت النقاط الحقيقية.
   17. إذا لم تكن مرضية، كرر الخطوات 6.4.9–6.4.16 لتعديل المعاملات حتى تصحيح.
   18. بعد اجتياز تحليل الاختبار، قم بإجراء التحليل الكامل. تحقق من تصحيح الانحراف (Deft Correction).
       ملاحظة: يقوم برنامج التحليل بتصحيح الانحرافات باستخدام خوارزمية تكرار الارتباط المتقاطع (RCC) التي تعزز الارتباط بين مقاطع الزمن من التموضع الجزيئي. لا حاجة للخرزات الائتمانية²³.
   19. الفترات الثابتة = 1.
   20. انقر على [ابدأ] (أو انقر على [اختبار] مرة أخرى، ثم [ابدأ]).
   21. انتظر حتى يكتمل التحليل. انقر على موافق في الحوار المنبثق.
   22. بعد التحليل، يتم إنشاء ملفي نتائج (.bin و.txt) في نفس المجلد الذي يحتوي عليه ملف .nd2.
   23. لتحليل التداخل (قنوات 647 نانومتر و488 نانومتر)، عرض القناتين في نفس الوقت في قائمة القنوات الخاصة بنافذة التحليل.
   24. اختر منطقة اهتمام مناسبة (عائد استثمار).
   25. استخدم وحدة التنقل المشترك لحساب معامل الارتباط لبيرسون. إذا لم يتم توفيرها تلقائيا، قم بتصدير بيانات سحابة النقاط يدويا إلى إضافة تجمع المواقع في برنامج تحليل الصور المتاح للجمهور. سجل القيمة.
   26. إجراء تحليل شريحة Z لتأكيد التمعدن داخل الألياف الليفية. في القائمة الرئيسية، اختر عرض > خطوة Z > Slice.
   27. استخرج المستويات الفردية بفواصل 60 نانومتر.
   28. راقب إشارة المعدن (باللون الأخضر، قناة 488 نانومتر). تحقق مما إذا كانت الإشارة تبقى في الشرائح المركزية (Z = 0 نانومتر ±120 نانومتر). الاستمرار يؤكد التمعدن داخل الألياف الليفية.
   29. اختياري: إجراء ترشيح الكثافة لتقليل العد الزائد من الباعثات المكتظة. افتح صورة STORM المعاد بناؤها في برنامج تحليل الصور المتاح للجمهور باستخدام إضافة لتحليل تحديد الموقع للجزيء الواحد²⁴.
   30. لتقليل العد الزائد من الباعثات المكتظة بكثافة، تطبيق ترشيح الكثافة (مثل مرشح الوسيط أو عتبة الكثافة المحلية) بناء على كثافة الإشارة.
   31. إذا لم يتم تفعيل تصحيح الانحرافات في الخطوة 6.4.18 أو إذا كان هناك حاجة لتصحيح إضافي، قم بإجراء تصحيح الانحراف. صحيح بناء على PSF للعلامات الائتمانية. بدلا من ذلك، استخدم خوارزميات الارتباط المتقاطع (مثل تصحيح الانحرافات المنفذ في نفس الإضافة).
   32. قم بإجراء فك مزج طيفي لإزالة التداخل بين القناة. في نافذة تحليل STORM، انقر على أداة إزالة التداخل (عادة في الزاوية اليمنى السفلية).
   33. اضبط نصف القطر على 25.0 نانومتر (موصى به). اختر القناة المصدرية. اختر طريقة الإزالة: ينصح بالإحصائي.
   34. لإزالة التنشيط المتقاطع الناتج عن ليزر الإثارة، اختر الطرح بالإضافة إلى NSA > التفعيل المتبادل. اضغط موافق. يتم توليد قناة جديدة، وهي التفعيل غير المحدد-Xt، تلقائيا.
   35. التحقق من مستويات التألق الذاتي والإشارات الخلفية باستخدام عينات تحكم غير مصبوغة. تأكد من أن جميع الإشارات معلمة بشكل محدد.
   36. قم بتصوير ثلاثي الأبعاد. اختر منطقة اهتمام (ROI) في نافذة التحليل.
   37. انقر على زر [3D] (أو [Show 3D]). قم بإنشاء عرض ثلاثي الأبعاد أو عرض للصوت.
   38. انقر بزر الفأرة الأيمن لتعديل معايير العرض. تصدير الفيديوهات بصيغ شائعة (مثل .avi أو .mp4).
   39. لتصنيف إشارة معدنية كإشارة داخل الألياف الليافية، قم بتحليل شريحة Z كما في 6.4.26–6.4.28. ملفات شدة التصدير.
   40. عرف مركز الألياف كمستوى Z حيث تكون إشارة الكولاجين هي الأقصى.
   41. تعتبر إشارة المعدن داخل الألياف إذا كانت شدتها عند Z = 0 (المركز) وعند Z = ±60 نانومتر هي ≥50٪ من أقصى كثافة معدنية في ذلك الفيبل. إذا انخفضت الإشارة إلى أقل من 30٪ عند Z = 0، صنفها كإكستراليفيلار.
   42. سجل التصنيف لما لا يقل عن 50 ليفا لكل حالة لحساب نسبة التمعدن داخل اللياف.
       ملاحظة: تتوفر أيضا إضافات بديلة متاحة للجمهور لتصفية الكثافة، وتصحيح الانحراف، وفصل الخلط الطيفي.

Results

يؤدي التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول إلى تصور ثلاثي الأبعاد عالي الدقة لألياف الكولاجين المعدنية باستخدام STORM ثلاثي الألوان متعدد الألوان. توضح النتائج التالية النتائج النموذجية، وضوابط الجودة، والتقييمات الكمية.

يظهر الشكل 1 إعادة بناء ثلاثية الألوان ثلاثية الألوان لشبكة كولاجين معدنية بفوسفات الكالسيوم غير المتبلور (ACP). يظهر الكولاجين (الموسوم بصبغة فلورية حمراء بعيدة) كشبكة ليفية محددة جيدا. كبريتات الكوندرويتين (GAG، الموسوم بصبغة حمراء) مرتبطة ارتباطا وثيقا بألياف الكولاجين، وتظهر مناطق التداخل الموضعي باللون السماوي في الصورة المدمجة. ومن المهم أن جسيمات ACP (خضراء، موسومة بصبغة مؤشر الكالسيوم) تلاحظ ضمن حدود ألياف الكولاجين، مما يظهر تمعدنا داخل الألياف الليفية في المرحلة المبكرة (30 دقيقة). يبرز هذا الشكل قدرة البروتوكول على تحليل ثلاثة مكونات مميزة في الوقت نفسه (الكولاجين، GAG، المعدن) على المستوى النانوي، وهو إنجاز لا يمكن تحقيقه باستخدام المجهر الكونفوكالي التقليدي (انظر الشكل 5 لمقارنة دقة التصوير). يؤكد التداخل النانوي لمادة ACP داخل الألياف أن السلف غير المتبلور يمكنه التسلل إلى داخل الألياف قبل التحول البلوري.

يوفر الشكل 2 دليلا كميا على اختراق الهيدروكسيا باتيت الناضج (HAP) داخل الألياف بعد 6 ساعات من التمعدن. يعرض الشكل 2A صور 2D STORM تظهر توازنا واسع النطاق بين الكولاجين (الأحمر) وHAP (الأخضر)، مع ظهور القنوات المدمجة باللون الأصفر. الشكل 2B هو إعادة بناء ثلاثية الأبعاد توضح العمارة المتكاملة. يوضح الشكل 2C تحليل شرائح محور Z بفواصل 60 نانومتر من الأعلى (Z = −120 نانومتر) إلى المركز (Z = 0) وإلى المقاطع الأعمق (Z = +120 نانومتر). تستمر إشارة HAP في الشرائح المركزية (Z = 0 إلى ±120 نانومتر) عند شدة ≥50٪ من الحد الأقصى، والتي تفي بمعايير التصنيف للتمعدن داخل الألياف المحددة في خطوات البروتوكول 6.4.39–6.4.41. أسفر التحليل الكمي للتداخل من ثلاث تجارب مستقلة (n = 3 تكرارات، كل منها يحتوي على 5 مناطق ذات اهتمام) عن معامل ارتباط بيرسون 0.89 ± 0.04 ومعامل تداخل ماندرز 0.91 ± 0.03 (متوسط ± SD). تشير هذه القيم إلى ارتباط قوي ومحدد بين الكولاجين وHAP داخل الألياف، مما يؤكد أن الطور البلوري الناضج موجود أيضا داخل الألياف.

الشكل 3 يؤكد السلامة الهيكلية لسقالة الكولاجين المجمعة ذاتيا باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل. تظهر ألياف الكولاجين الملونة بحمض الفوسفوتونغستيك بنسبة 1٪ (درجة الحموضة 7.0) نمط التداخل الدوري المميز 67 نانومتر في D، وهو تشخيص لتكون ليفي شبيه بالسكان الأصليين. تعد خطوة مراقبة الجودة هذه ضرورية قبل المضي قدما في تجارب التمعدن، لأنها تؤكد أن السقالة سليمة هيكليا وقادرة على دعم ترسيب المعادن داخل الألياف الليفية. بدون هذا النمط التنظيمي، قد يكون الكولاجين متغير أو مركب بشكل غير صحيح، مما يؤدي إلى أنماط معدنية اصطناعية.

يوضح الشكل 4 نتيجة سلبية تمثيلية يتم الحصول عليها عندما لا يتم التحكم في ظروف التمعدن بشكل صحيح (مثل غياب حمض البولي أسبارتيك أو درجة الحموضة > 7.6). في هذه الظروف غير المثالية، تلاحظ ترسبات HAP (الخضراء) حصريا على الركيزة الزجاجية خارج ألياف الكولاجين (الحمراء)، دون غزو داخل الليفي. تعمل هذه النتيجة كعنصر تحكم مهم: فهي تظهر أن التمعدن داخل الألياف المرصود في الشكلين 1 و2 ليس بسبب ترسيب غير محدد أو غسيل غير كامل، بل يتطلب تحكما دقيقا في البيئة الكيميائية (درجة الحموضة 7.4 ± 0.1، وجود حمض البولي أسبارتيك، والاستخدام الفوري لوسط التمعدن الطازج). يجب على الباحثين تضمين مثل هذه الضوابط السلبية للتحقق من صحة نظامهم الخاص.

يظهر الشكل 5 صور المجهر الكونفوكالي التمثيلية التي تم الحصول عليها قبل الحصول على STORM لفحص العينات الأولي. تكشف قناة الكولاجين (الشكل 5A) عن شبكة ليفية واضحة، وقناة HAP (الشكل 5B) تظهر المعادن المرتبطة بالألياف. تؤكد الصورة المدمجة (الشكل 5C) التنقل المشترك عند المستوى المحدود للحيود (~200 نانومتر). تخدم هذه الصور غرضين: (1) تتحقق من جودة العينة (وضع وسم كاف، تجميع أدنى، وارتباط معدني محدد) قبل الانتقال إلى تصوير STORM الذي يستغرق وقتا طويلا؛ و(2) توجه اختيار المناطق ذات الاهتمام للحصول على 3D-STORM. ومن المهم أن الصور الكونفوكلية تفتقر إلى الدقة اللازمة للتمييز بين التمعدن داخل الألياف والخارج الليفية. لاحظ أن إشارة المعدن تبدو مستمرة على طول الألياف دون أن تكشف ما إذا كانت داخلها أو خارجها. هذا القيد يؤكد الحاجة إلى نهج الدقة الفائقة الموضح هنا.

يعرض الشكل 6 تجربتين ضابطتين. الشكل 6A (عدم وجود أجسام مضادة أولية) لا يظهر إشارة محددة عند تطبيق الجسم المضاد الثانوي فقط، مما يؤكد أن الإشارات الملحوظة في العينات الموسومة ليست بسبب ارتباط الأجسام المضادة الثانوية غير المحددة. الشكل 6B (التحكم غير المصبوغ) لا يظهر إشارة فلورية (سوداء تماما)، مما يستبعد وجود تألق ذاتي كبير من العينة أو الركيزة. تعد هذه الضوابط ضرورية للتحقق من خصوصية تصنيف الفلورة المناعية. أي إشارة يمكن اكتشافها في هذه الأزرار تشير إلى الحاجة إلى تعديل خطوات الحجب أو الغسيل.

تحت ظروف التصوير المثلى لدينا، حقق نظام 3D-STORM دقة تحديد نموذجية تتراوح بين 20–30 نانومتر جانبيا و50–60 نانومتر محوريا، بما يتوافق مع الأدبيات الأصلية ل 3D-STORM^{رقم 25}. تم إجراء تصحيح الانجراف أثناء المعالجة اللاحقة باستخدام خوارزمية الارتباط المتقاطع المتكرر المدمجة (RCC)، التي تلغي الحاجة إلى علامات الودية الخارجية²³. في التوزيع الطوري، تم تعيين ACP عند 30 دقيقة من التمعدن وHAP عند 6 ساعات، بناء على حركيات النضج المعتمدة. تتيح القدرة على التمييز بين هذين المرحلتين زمنيا، إلى جانب تحديد الموقع على نطاق النانو، للباحثين دراسة ديناميكيات التحول المعدني داخل الألياف الليفية.

باختصار، تظهر النتائج الممثلة أن هذا البروتوكول يتيح التمييز على المستوى النانوي بين التمعدن داخل الألياف والخارج الليفي في نموذج كولاجين مؤتلف، مع مقاييس التنقل الكمية وضوابط سلبية مناسبة. تعد هذه الطريقة ذات قيمة خاصة للباحثين الذين يدرسون آليات التمعدن الحيوي، والمواد المحاكاة الحيوية، وهندسة أنسجة العظام.

يلخص الجدول التكميلي 1 المشكلات الشائعة التي تواجهها أثناء إجراءات التصوير التمعدني وتصوير العاصفة، إلى جانب أسبابها المحتملة وحلولها الموصى بها. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل 1: إعادة بناء ثلاثية الألوان ثلاثية الألوان لألياف الكولاجين المعدنية المختلفة. يتم تصوير الكولاجين (صبغة فلورية حمراء بعيدة) وكبريتات الكوندرويتين (صبغة فلورية زرقاء حمراء) في نفس الوقت. يظهر التداخل المشترك بين الكولاجين وGAG كأرجواني في القناة المدمجة، وتظهر المناطق التي تتداخل فيها جميع الأنواع الثلاثة باللون الأبيض. كما يظهر فوسفات الكالسيوم غير المتبلور (ACP، صبغة مؤشر الكالسيوم الأخضر). يلاحظ ACP داخل حدود ألياف الكولاجين، مما يشير إلى وجود توطين داخل الألياف الليفية. شريط المقياس: 1 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: تصوير ثلاثي الأبعاد لعملية العاصفة الثلاثية لتمعدن الهيدروكسيا باتيت داخل الألياف (HAP). (أ) صور STORM ثنائية الأبعاد للكولاجين (صبغة فلورية حمراء بعيدة)، HAP (صبغة مؤشر الكالسيوم الخضراء)، وقناة مدمجة. (ب) إعادة بناء الحجم ثلاثي الأبعاد. (ج) تحليل شرائح المحور Z بفواصل 60 نانومتر (Z = −120، −60، 0، +60، +120 نانومتر). تفي إشارة HAP الدائمة في الشرائح المركزية (Z = 0 إلى ±120 نانومتر) بمعايير التصنيف للتمعدن داخل الألياف (شدة ≥50٪ من الحد الأقصى). تم حساب التداخل الكمي من هذا الشكل: r بيرسون = 0.89 ± 0.04، تداخل ماندر = 0.91 ± 0.03. أشرطة المقياس: 0.1 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: التحقق من المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) لألياف الكولاجين المجمعة ذاتيا. تم صبغ ألياف الكولاجين بحمض الفوسفوتونغستيك بنسبة 1٪ (درجة حموضة 7.0). يؤكد نمط التقسيم التشخيصي D-الدوري 67 نانومتر نجاحا في تكوين الألياف والسلامة الهيكلية. شريط المقياس: 200 نانومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: النتيجة السلبية التمثيلية: التمعدن خارج الليفي. الكولاجين (صبغة فلورية حمراء بعيدة) وHAP (صبغة خضراء لمؤشر الكالسيوم). يترسب HAP حصريا على الركيزة الزجاجية خارج ألياف الكولاجين، دون غزو داخل الألياف الليفية. يتم تضمين هذه النتيجة غير المثالية كأداة تحكم سلبية لتوضيح نطاق النتائج المحتملة. شريط المقياس: 0.1 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 5: صور كونفوكال ممثلة تستخدم للفحص الأولي. (أ) قناة الكولاجين (صبغة فلورية حمراء بعيدة) تظهر شبكة ليفية واضحة. (B) قناة HAP (صبغة مؤشر الكالسيوم الخضراء) تظهر ارتباطا بالمعدن. (ج) تظهر الصورة المدمجة التزامن بين الكولاجين وHAP. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 6: تجارب التحكم. (أ) عدم وجود أجسام مضادة أولية: تم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية فقط؛ لا يوجد إشارة محددة. (ب) السيطرة غير المصبوغة: لا يوجد فلوروفور أو أجسام مضادة مطبقة؛ لا يوجد إشارة فلورية (أسود تماما). شريط المقياس = 1 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول الإضافي 1: دليل استكشاف المشكلات. المشكلات الشائعة التي تواجهها أثناء التمعدن واكتساب/تحليل 3D-STORM، إلى جانب أسبابها المحتملة وحلولها الموصى بها. راجع النص لأرقام الخطوات التفصيلية. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

يوفر هذا البروتوكول سير عمل شامل لتصوير تمعدن الكولاجين على المستوى النانوي باستخدام تقنية 3D-STORM متعددة الألوان. تتطلب عدة خطوات حاسمة اهتماما خاصا لضمان نتائج ناجحة.

أولا، يعد تحضير العينات أمرا أساسيا لتصوير STORM عالي الجودة. يجب أن يكون العزل الأميني للأطباق ذات القاع الزجاجي دقيقا لضمان تثبيت ألياف الكولاجين بشكل مستقر خلال خطوات الغسل ووضع العلامات لاحقا. يمكن أن يسبب APTES المتبقي ارتباطا غير محدد وخلفية عالية، بينما قد يؤدي عدم اكتمال السيلانية إلى انفصال الألياف. خطوة الموجات فوق الصوتية الموصى بها (10 دقائق عند 40 كيلوهرتز) تزيل السيلان غير المرتبط بفعالية مع الحفاظ على وظيفية السطح. بالنسبة لألياف الكولاجين المتقاطعة، يوصى باستخدام EDC/NHS²¹ لخصوصية عالية. بدلا من ذلك، يمكن استخدام غلوتارالديهيد بنسبة 0.1٪ (حضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، ثم غسلها جيدا)، لكنها أقل تحديدا. والأهم من ذلك، نوصي بالتحقق من التكوين الليفي السليم بواسطة TEM قبل الانتقال إلى التمعدن. كما هو موضح في الشكل 3، يؤكد وجود نمط الشريط الدوري المميز 67 نانومتر أن عملية التجميع الذاتي أنتجت ألياف كولاجينية طبيعية²⁶ سليمة هيكليا. تمنع هذه الخطوة في مراقبة الجودة تفسير خاطئ للنتائج الناتجة عن سقالات الكولاجين السيئة التكوين أو المشوهة.

ثانيا، يجب تجهيز وسط التمعدن بتحكم دقيق في درجة الحموضة (7.4 ± 0.1) واستخدامه فورا. السلف غير المتبلور لفوسفات الكالسيوم (ACP) حساس جدا للرقم الهيدروجيني والقوة الأيونية؛ يمكن أن تسبب الانحرافات الصغيرة التبلور المبكر. لذلك، يجب استخدام وسط التمعدن فور التحضير. بالنسبة للدراسات التي تتطلب مقارنات عبر عدة نقاط زمنية، حضر وسطا جديدا لكل تجربة بدلا من استخدام المحاليل المخزنة. عندما لا يتم التحكم في ظروف التمعدن بشكل صحيح (مثل عدم كفاية حمض البولي أسبارتيك أو الرقم الهيدروجيني غير الصحيح)، يسود التمعدن خارج الألياف الليفية كما هو موضح في الشكل 4. في هذا الضبط السلبي، يترسب HAP حصريا على الركيزة الزجاجية خارج ألياف الكولاجين، دون أي غزو داخل الألياف الليفية. إدراج مثل هذه النتائج السلبية ضروري للتحقق من أن الإشارة داخل الألياف التي لوحظت في الشكل 1 والشكل 2 ناتجة بالفعل عن تمعدن داخل الألياف المسيطر عليها وليس بسبب هطول غير محدد أو غسيل غير مكتمل. علاوة على ذلك، أكدت الدراسات السابقة أن التمييز بين التمعدن داخل الألياف والألياف خارج الألياف يتطلب تحكما دقيقا في البيئة الكيميائية المحلية ووجود إضافات مثبتة مثل حمض البولي أسبارتيك²⁷.

ثالثا، يتطلب وضع العلامات على الفلورة المناعية تحسينا دقيقا. تركيز الأجسام المضادة (1:100) المقدم يعمل جيدا لنظام الكولاجين وكبريتات الكوندرويتين الموصوف لكنه قد يحتاج إلى تعديل معايرة للأجسام المضادة أو أنواع العينات المختلفة. دائما يجب تضمين ضوابط عدم وجود أجسام مضادة أولية لتقييم التألق الذاتي والارتباط غير النوعي. من مرحلة الأجسام المضادة الثانوية فصاعدا، تعتبر الحماية الصارمة من الضوء ضرورية لمنع التبييض الضوئي بالفلوروفور.

رابعا، يجب تجهيز مخزن تصوير STORM طازجا واستخدامه خلال 30 دقيقة. يفقد نظام الأكسجين (الجلوكوز أوكسيداز/كاتالاز) نشاطه مع مرور الوقت، والسيستامين حساس للضوء وحساس للأكسجين. التحليل المسبق لمخزون الإنزيمات وتخزينها عند -80 درجة مئوية يضمن أداء متسقا عبر التجارب. يجب مراقبة كثافة الوميض في الوقت الحقيقي وتعديلها عن طريق تعديل قدرة الليزر 405 نانومتر؛ عدد الجزيئات القليل جدا يطيل وقت الاكتساب، بينما تسبب كثرة الجزيئات تداخلا في PSFs وتقليل دقة التحديد. لتحسين مفصل لمعلمات تصوير STORM، نحيل القراء إلى بروتوكولات عينات الاختبار^{المعتمدة 15}.

خامسا، تتطلب معالجة البيانات معلمات موحدة للمقارنات ذات المعنى عبر العينات. الحد الأدنى لعداد الفوتونات (عادة 500-1000 فوتون) يستبعد التموضعات منخفضة الثقة. إذا كانت إشارات العينة ضعيفة، فقد يتم تقليلها بشكل مناسب إلى 300 فوتون، لكن لا ينصح بالنزول إلى أقل من 200 فوتون. يعد تصحيح الانجراف باستخدام العلامات الخفية أو خوارزميات الارتباط المتقاطع ضروريا للحفاظ على الدقة، خاصة في إعادة البناء ثلاثية الأبعاد²⁸. يساعد فك الخلط الطيفي في القضاء على التداخل بين القنوات، وهو أمر حاسم لتحليل التداخل الدقيق مع التواجد. تم توضيح حل المشكلات الشائعة في الجدول التكميلي 1.

للبروتوكول عدة قيود. تم تحسينه للنماذج الحية المحاكاة الحيوية في المختبر؛ قد يتطلب التطبيق على الأنسجة الأصلية عالية المعادن (مثل العظم الناضج) خطوات إضافية مثل إزالة الكالسية أو استخراج المستضدات بشكل أكثر عدوانية، مما قد يؤثر على البنية الفائقة. الاعتماد على الأجسام المضادة المحددة قد يسبب مشاكل في كثافة العلامات أو عائقا في الفراغ، خاصة في الهياكل المكتظة بكثافة الجسم. التقنية تتطلب الكثير من المعدات، وتتطلب الوصول إلى مجهر STORM عالي الجودة مع خطوط ليزر مناسبة وكاميرا EMCCD. بالإضافة إلى ذلك، قد يحد الوقت الإجمالي المطلوب (~53 ساعة من تحضير العينة إلى تحليل البيانات) من معدل النقل لبعض التطبيقات.

على الرغم من هذه القيود، يقدم هذا البروتوكول مزايا كبيرة مقارنة بالطرق البديلة. مقارنة بالمجهر الإلكتروني، يوفر تخصصا جزيئيا من خلال وضع العلامات على التألق المناعي، مما يتيح الرؤية المتزامنة لعدة مكونات عضوية وغير عضوية. مقارنة بالمجهر الكونفوكلي، يحقق دقة مكانية أعلى ~10 مرات، مما يتيح التمييز بين أنماط التمعدن داخل الألياف الليفية وخارج الليف. توفر القدرة ثلاثية الأبعاد معلومات حجمية ضرورية لفهم توزيع المعادن داخل مصفوفة الكولاجين.

للطريقة تطبيق واسع في أبحاث التمعدن الحيوي. تشمل التطبيقات المحتملة دراسة دور البروتينات غير الكولاجينية في تكوين النواة المعدنية، وتقييم المواد البيوميمتيكية لتجديد العظام، والتحقيق في التمعدن المرضي في أمراض مثل هشاشة العظام وتسوس الأسنان، وتقييم تأثير التدخلات العلاجية على توزيع المعادن. مع التعديلات المناسبة، يمكن تكييف البروتوكول لدراسة واجهات عضوية-غير عضوية أخرى في الأنسجة أو المواد الحيوية.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
حمض البولي أسبارتيك (p-Asp)	سيغما-ألدرتش	P9903	مثبت لفوسفات الكالسيوم غير المتبلور
كلوريد الكالسيوم (CaCl2)	سيغما-ألدرتش	C1016	مصدر الكالسيوم
فوسفات الصوديوم ثنائي البازي (Na2HPO4)	سيغما-ألدرتش	S0876	مصدر الفوسفات
كلوريد الصوديوم (NaCl)	سيغما-ألدرتش	S9888	معدلة القوة الأيونية
حمض البولي أكريليك (PAA)	سيغما-ألدرتش	323667	مثبت الكالسيوم عالي التركيز
قاعدة تريس	سيغما-ألدرتش	T1503	مكون المخزن المؤقت
أزيد الصوديوم (NaN3)	سيغما-ألدرتش	S2002	عامل مضاد للميكروبات
(3-أمينوبروبيل) ترايثوكسيسيلان (APTES)	سيغما-ألدرتش	440140	عامل وظيفية سطح الزجاج
الإيثانول المطلق	سيغما-ألدرتش	459836	المذيب
محلول كولاجين من النوع الأول (50 & mu؛ g/mL بحمض الخليك 0.1 M)	كورنينغ	354249	سقالة ذاتية التجميع
كبريتات الكوندرويتين (CS)	سيغما-ألدرتش	C9819	محاكي البروتين غير الكولاجيني
EDC (1-إيثيل-3-(3-ثنائي ميثيل أمينوبروبيل)كاربوديميد)	سيغما-ألدرتش	E7750	رابط متقاطع
NHS (N-هيدروكسيسوكسنيميد)	سيغما-ألدرتش	130672	مفعل الرابط المتقاطع
حمض MES الحر	سيغما-ألدرتش	M5287	مخزن مؤقت للربط المتقاطع
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)	جيبكو	10010023	مخزن الغسيل والتخفيف
ألبومين مصل البقر (BSA)	سيغما-ألدرتش	A3059	عامل الحظر
الأجسام المضادة المضادة للكولاجين-I من الأرنب	أبكام	ab34710	الجسم المضاد الأساسي للكولاجين
الجسم المضاد لكبريتات الكوندرويتين المضاد للفأر	سيغما-ألدرتش	C8035	الجسم المضاد الأساسي للعثور على الألياف الكيميائية
مضاد للأرانب IgG مترافق مع صبغة فلورية حمراء بعيدة (Alexa Fluor 647)	ثيرمو فيشر العلمي	A-21244	الجسم المضاد الثانوي للكولاجين
مضاد للفئران IgM من الماعز مقترق بصبغة فلورية حمراء (Alexa Fluor 568)	ثيرمو فيشر العلمي	A-11031	الأجسام المضادة الثانوية للعشائر الكيميائية
كالسيين (صبغة مؤشر الكالسيوم)	سيغما-ألدرتش	C0875	ملصق فوسفات الكالسيوم
توين-20	سيغما-ألدرتش	P1379	منظف لعزل العزل
الجلسرول	سيغما-ألدرتش	G5516	مكون مخزن التصوير
أكسيداز الجلوكوز (GOx)	سيغما-ألدرتش	G7141	جامع الأكسجين
الكاتالاز	سيغما-ألدرتش	C1345	جامع الأكسجين
سيستيمين (MEA)	سيغما-ألدرتش	M6500	ثيول لميض الفلوروفور
دي-جلوكوز	سيغما-ألدرتش	G6152	الركيزة لجلوكوز أكسيداز
أسيتات الصوديوم	سيغما-ألدرتش	S2889	المخزن المؤقت لمخزون GOx
حمض الهيدروكلوريك (HCl)	سيغما-ألدرتش	320331	تعديل الرقم الهيدروجيني
هيدروكسيد الصوديوم (NaOH)	سيغما-ألدرتش	71690	تعديل الرقم الهيدروجيني
حمض الفوسفوتونغستيك	سيغما-ألدرتش	P4006	صبغة سلبية ل TEM
أطباق زراعة القاع الزجاجي (35 مم، #1.5H)	ماتيك	P35G-1.5-14-C	عينة من الركيزة؛ السماكة: 0.17 مم
منظف الموجات فوق الصوتية (40 كيلوهرتز)	برانسون	B200	جهاز التنظيف
غرفة الرطوبة	ثيرمو فيشر العلمي	11-432-10	للتجميع الذاتي للكولاجين
المجهر الإلكتروني الناقل	هيتاشي	HT7800	تصوير TEM
شبكات TEM مطلية ب Formvar/الكربون (200 شبكة)	سيغما-ألدرتش	FCF200-Cu	دعم عينات TEM
منصة هزة أفقية	لابنت	S2030-RC	غسل لطيف
مجهر الليزر الكونفوكال الماسح	نيكون	A1	الفحص التمهيدي
نظام المجهر ثلاثي الأبعاد STORM (مع ليزر 405/488/647 نانومتر، عدسة أسطوانية، EMCCD)	نيكون	ن-ستورم	التصوير عالي الدقة
100&00 مرة؛ هدف الغمر بالزيت (NA 1.49)	نيكون	MRD01991	تصوير عالي الدقة
مقياس الرقم الهيدروجيني	ميتلر توليدو	فايفجو F2	التحكم في الرقم الهيدروجيني
برنامج اكتساب وتحليل STORM	نيكون	عناصر NIS (وحدة STORM)	جمع ومعالجة بيانات STORM
تنسيق ملف .nd2 (ملف صورة مجهر خام)	نيكون	لا يوجد	تنسيق ملف صورة خام يتم إنشاؤه بواسطة مجاهر نيكون.
برنامج تحليل الصور المتاح للجمهور	المصدر المفتوح	لا يوجد	على سبيل المثال، ImageJ مع إضافة ThunderSTORM لتحليل تحديد موقع جزيء واحد (التوازن، تصحيح الانحراف)
بارافيلم	بيميس	PM996	تغطية العينة أثناء الحضانة
رقائق الألمنيوم	أي مورد مختبر	لا يوجد	للحماية من الضوء (مثل تغليف العينات)
أنابيب الطرد المركزي الدقيق الكهرماني	فيشر ساينتيفك	05-669-21	لحماية الفلوروفورات من الضوء
كوفرسليب (رقم 1.5)	كورنينغ	2855-18	تركيب عينات