يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

توليد خلايا CAR-T المتخصصة لـ Claudin18.2 في الموقع عبر توصيل mRNA بوساطة الجسيمات النانوية الدهنية

352 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71482

⸱

أغسطس 14, 2026

 ,  ,  , 
1School of Medicine, Shanghai University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يحد التصنيع المعقد ex vivo والمخاوف المتعلقة بالسلامة من تطبيق خلايا CAR T على الأورام الصلبة. يصف هذا البروتوكول طريقة للتوليد in situ لخلايا CAR-T عابرة عن طريق توصيل mRNA المشفر لـ CAR بوساطة LNP، مما يوفر منصة قابلة للتكرار وقابلة للتكيف مع تطبيقات هندسة الخلايا المناعية الأخرى القائمة على mRNA.

الملخص

حققت العلاجات القائمة على الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضد الخيمرية (CAR T-cell therapy) نجاحاً سريرياً ملحوظاً في علاج الأورام الخبيثة الدموية؛ ومع ذلك، فإن تطبيقها على نطاق أوسع يظل محدوداً بسبب تكاليف التصنيع العالية وعدم كفاية الفعالية ضد الأورام الصلبة. وللتغلب على هذه التحديات، تم تطوير استراتيجية لتوليد خلايا CAR-T in situ تعتمد على إيصال mRNA الخاص بمستقبل CAR الذي يستهدف Claudin18.2 بواسطة الجسيمات النانوية الدهنية (LNP)، مما يسمح بإنتاج مؤقت لخلايا CAR-T مباشرة داخل أنسجة الورم. وبعد عملية ترانسفكشن LNP، أظهرت الخلايا التائية المنشطة تعبيراً سطحياً فعالاً لمستقبلات CAR. وأظهرت خلايا CAR-T المؤقتة هذه نشاطاً سمياً خلوياً قوياً ضد خطوط خلايا سرطان المعدة الإيجابية لـ Claudin18.2، بما في ذلك NUGC4 وNCI-N87، وحققت فعالية كبيرة مضادة للأورام في نماذج الفئران الحاملة للأورام. يصف هذا البروتوكول الإجراءات التفصيلية لعملية النسخ in vitro لـ mRNA الخاص بـ CAR، وصياغة LNP، وتنشيط الخلايا التائية وعملية الترانسفكشن، وتحليل تعبير CAR، والتقييم الوظيفي للسمية الخلوية بوساطة CAR-T in vitro وin vivo. وبشكل عام، توفر هذه الاستراتيجية منصة فعالة من حيث التكلفة ومتعددة الاستخدامات لتوليد خلايا CAR-T مؤقتة، وتقدم نهجاً واعداً لعلاج الأورام الصلبة.

المقدمة

يتزايد معدل الإصابة بالسرطان والوفيات الناجمة عنه بشكل سريع في جميع أنحاء العالم، مما يشكل تهديداً لبقاء الإنسان والتنمية المجتمعية. ويعد سرطان المعدة ثالث سبب رئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان عالمياً وينتشر بشكل كبير1. ونظراً لانخفاض معدلات التشخيص المبكر، يتم تشخيص نسبة كبيرة من المرضى في مراحل متقدمة. وتشمل العلاجات التقليدية الجراحة، والعلاج الإشعاعي، والعلاج الكيميائي. وقد يكون الاستئصال الجراحي للمرضى الذين يعانون من سرطان المعدة في مراحله المتوسطة إلى المتأخرة أو الحالات المعقدة غير مكتمل. علاوة على ذلك، فإن الصدمة الجراحية الكبيرة وفترة التعافي الطويلة بعد الجراحة يمكن أن تؤثر سلباً على جودة حياة المرضى وقد تؤدي إلى حدوث مضاعفات. كما يؤدي العلاج الإشعاعي والكيميائي إلى إتلاف الأنسجة الطبيعية بشكل شديد، مما يسبب العديد من الآثار الجانبية أثناء العلاج. في المقابل، توفر العلاجات الموجهة والخلوية الدقة والفعالية؛ حيث برزت هذه العلاجات كأنماط رعاية معاصرة وحاسمة، وتمثل التوجه السائد في اختيار الاستراتيجيات العلاجية المستقبلية.

لقد دفع ظهور علاج الخلايا التائية ذات المستقبلات المستضدية الوهمية (CAR-T) العلاج الخلوي نحو طفرة فارقة، حيث أظهر فعالية قوية في علاج الأورام الدموية الخبيثة2,3. يعتمد علاج CAR-T على استخدام الخلايا التائية الخاصة بالمريض، والتي يتم تعديلها وراثياً in vitro عن طريق إدخال مستقبل مستضدي وهمي (CAR) محدد. يتعرف هذا المستقبل على مستضدات معينة على أسطح الخلايا الورمية ويعمل على تنشيط الخلايا التائية لمهاجمة الخلايا السرطانية. وفي السنوات الأخيرة، تطورت أيضاً أبحاث علاج CAR-T لسرطان المعدة. ويعد اختيار الأهداف العلاجية أمراً بالغ الأهمية لأنه يحدد دقة استهداف الخلايا التائية (CAR-T) وفعاليتها. فبعد HER2، ظهر Claudin18.2 كهدف علاجي بارز آخر في سرطان المعدة، حيث تتراوح معدلات التعبير عنه بين 40% و87% لدى المرضى. وعادة ما يكون Claudin18.2 مدفوناً داخل مخاطية المعدة، ولكن عندما تقوم الأورام الخبيثة بتخريب الوصلات المحكمة المسؤولة عن التبادل الجزيئي بين الخلايا، يصبح Claudin18.2 مكشوفاً على سطح الخلايا الورمية، مما يجعله هدفاً علاجياً محدداً لهذه الأورام4.

تتضمن عملية التصنيع القياسية لخلايا CAR-T عادةً جمع الخلايا، واختيار الخلايا التائية وإثراءها، وتنشيط الخلايا التائية، وبناء جين CAR، ونقل الجين، والتوسيع، ومراقبة الجودة، والتخزين والنقل، متبوعةً بحقن المريض. وتعد عملية تحضير خلايا CAR-T بالكامل معقدة للغاية، حيث تتطلب ظروفاً معقمة ومواصفات بيئية وأجهزة صارمة. ويؤدي ذلك إلى ارتفاع تكلفة علاج CAR-T، مما يحد من تطبيقه السريري. ولمعالجة تعقيدات إنتاج CAR-T خارج الجسم (ex vivo)، تم اقتراح مفهوم تحضير CAR-T داخل الجسم (in vivo). ويتضمن هذا النهج برمجة خلايا CAR-T مباشرة داخل جسم المريض، مما يلغي الحاجة إلى جمع الخلايا وتعديلها وتوسيعها خارج الجسم (ex vivo). تهدف هذه الاستراتيجية إلى تقليل التكاليف، وتعزيز السلامة وإمكانية الوصول، وتمكين تطبيقات أوسع في علاج الأمراض5.

يكمن المفتاح لتحضير خلايا CAR-T in vivo في اختيار ناقل توصيل مثالي. وتُصنف الناقلات حالياً إلى ناقلات فيروسية وغير فيروسية. ومن بين الخيارات الفيروسية، تُستخدم الناقلات الفيروسية البطيئة (LV) والناقلات الفيروسية المرتبطة بالأدينو (AAV) بشكل أساسي. ومع ذلك، فإن المخاطر الكبيرة وسعة الحمولة المحدودة المرتبطة بالناقلات الفيروسية تشكل عقبات رئيسية أمام الأبحاث السريرية6. ومن العيوب الرئيسية للناقلات الفيروسية في التوصيل in vivo قدرتها على الاندماج الجينومي، مما قد يؤدي إلى سمية جينية وطفرات إقحامية. وقد وثقت حالات سابقة حدوث استجابات مناعية قاتلة أو إصابة بالسرطان لدى جزء صغير من المرضى بعد العلاج. علاوة على ذلك، فإن السمية والقدرة المناعية المتأصلة في الفيروسات تقيد بشدة استخدامها في الإدارة المتكررة in vivo. ويتمثل تحدٍ آخر في سعة الحمولة المحدودة للناقلات الفيروسية، مما يمنع التوصيل المتزامن لجينات متعددة.

تعالج أنظمة توصيل mRNA غير الفيروسية هذه القصور بفعالية؛ فهي تتجنب الاندماج في جينوم المضيف، وبالتالي تتفادى العديد من المخاطر. ويمنع تأثيرها المؤقت حدوث تسمم خارج الهدف، مما يسمح بتعبير قصير المدى وقابل للتحكم لخلايا CAR-T، وهو ما يقلل من الآثار الجانبية ومخاطر السلامة. ومن بين الأنظمة غير الفيروسية، توفر الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) نهجاً أكثر أماناً، حيث تتغلب على قيود الحجم التي تفرضها النواقل الفيروسية. كما تعالج الجسيمات النانوية الدهنية مشكلات طفرات الإدخال والاستجابة المناعية، مما يجعلها مرشحة واعدة في علاج خلايا CAR-T، مع إمكانية تقليل السمية وتعزيز السلامة وخفض التكاليف7.

تركز الأبحاث الحالية حول العلاج المناعي للأورام الصلبة بشكل أساسي على تحسين تركيبات الجسيمات النانوية الدهنية (LNP)، والتعديل المستهدف، وهندسة تسلسلات الـ mRNA عبر نماذج سرطانية متنوعة، بما في ذلك الميلانوما8، وسرطان الثدي، وسرطان القولون والمستقيم9. كما وُجهت الجهود نحو إنشاء بلعميات ذات مستقبلات مستضد خيمرية (CAR-M)10 وخلايا شجرية (CAR-DC)11 via أنظمة توصيل الـ LNP لاختراق الحواجز الفيزيائية المعقدة والبيئة الدقيقة المثبطة للمناعة في الأورام الصلبة (TME). توفر المنصة المعروضة هنا نظاماً متعدد الاستخدامات وغير فيروسي لتوصيل الـ mRNA يتميز بدرجة عالية من التركيبية. ومن خلال استبدال تسلسل الـ mRNA ببساطة، يمكن تكييف هذه المنصة بسرعة لتناسب نماذج الأورام الصلبة التي تستهدف مستضدات أخرى، أو توسيع نطاقها ليشمل مجالات علاجية غير متعلقة بالأورام، مثل الأمراض المناعية الذاتية، وأمراض القلب والأوعية الدموية، والأمراض التليفية.

ومع ذلك، لا تزال هناك فجوة تقنية في علاجات سرطان المعدة التي تستخدم هذه المنصات: فقد ركزت الدراسات السابقة بشكل أساسي على تحرير الخلايا النخاعية، بينما ظلت استراتيجيات إعادة برمجة الخلايا التائية in vivo عالية الكفاءة استكشافية إلى حد كبير. ولمعالجة هذه الفجوة، يوضح هذا البروتوكول طريقة لتوليد خلايا CAR-T عابرة via إيصال mRNA بوساطة الجسيمات النانوية الدهنية (LNP). يهدف هذا النهج إلى التغلب على القيود المتأصلة في علاجات خلايا CAR-T التقليدية، بما في ذلك التكاليف الباهظة، وعمليات التصنيع المعقدة، والسمية الجهازية، مما يوفر بديلًا علاجيًا أكثر فعالية وسهولة في الوصول للمرضى. وقد تم إثبات أن ترانسفكشن الخلايا التائية بتسلسل mRNA محسن يشفر CAR محدد يستهدف Claudin18.2 يسمح بتعبير قوي لـ CAR على سطح الخلية، مما يوجه الخلايا التائية المعدلة لممارسة نشاط سام للخلايا وموجه ضد خلايا ورمية محددة. يتكون هذا البروتوكول من خمسة أقسام متميزة: النسخ in vitro لـ CAR mRNA، وتحضير وتوصيف LNP، وتنشيط وترانسفكشن الخلايا التائية، والكشف عن تعبير CAR، وتقييم الفعالية التحليلية للخلايا CAR-T in vitro و in vivo.

بالمقارنة مع تقنيات توصيل mRNA-LNP الحالية، يكمن الابتكار المنهجي الجوهري في هذا البروتوكول في التحسين الحركي للتعبير العابر. وقد تم إجراء تحسين تآزري لكل من المنطقة غير المترجمة 5' UTR، والمنطقة غير المترجمة 3' UTR، والقبعة 5' Cap، وذيل poly(A) بطول 120-bp. ويعمل هذا التصميم المخصص على تعديل نصف عمر mRNA ضمن البيئة المجهرية للورم، مما يحقق ترجمة عالية الكفاءة ضمن نافذة علاجية محددة يتبعها تحلل آمن. وبفضل ما تتميز به هذه المنصة من توليد سريع وعابر لمستقبلات CAR، فإنها تعمل كتركيبة "جاهزة للاستخدام" للاستعمال الفوري، مما يمنع تطور المرض خلال فترة التصنيع الطويلة المطلوبة للعلاجات التقليدية. علاوة على ذلك، يوفر ملف التعبير العابر هذا ميزة أمان قابلة للتحكم عند استهداف المستضدات التي تنطوي على سميات محتملة من نوع "على الهدف، خارج الورم"، أو للمرضى غير القادرين على تحمل متلازمة إفراز السيتوكين (CRS) الشديدة المرتبطة بعلاجات CAR-T التقليدية.

على الرغم من المزايا الجلية لتوليد خلايا CAR-T in vivo in situ، والمتمثلة في إلغاء عمليات التصنيع المعقدة ex vivo وتقليل الأعباء الاقتصادية، لا تزال هناك بعض القيود قائمة. ففي الدورة الدموية الجهازية، تكون الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) عرضة للتراكم غير النوعي في الكبد والابتلاع السريع بواسطة الخلايا البلعمية والخلايا التغصنية. وبدون وجود جزيئات استهداف محددة موجهة نحو الخلايا التائية، تتأثر كفاءة عفن الخلايا التائية المستهدفة حتمًا. علاوة على ذلك، عند دخول أنسجة الورم، تتعرض خلايا CAR-T المولدة in situ لبيئة ورمية (TME) عدائية؛ ففي ظل الظروف التي تتسم بنقص الأكسجين والحمضية والكبت المناعي، تصبح هذه الخلايا التائية عرضة بشكل كبير للإجهاد المناعي، مما يحد من قدرتها السامة للخلايا. بالإضافة إلى ذلك، وبينما تعزز الطبيعة العابرة للتعبير عن mRNA مستويات السلامة، فإنها تقيد مدة النافذة العلاجية. ولتحقيق فعالية مستدامة مضادة للأورام، غالبًا ما يتطلب الأمر إعطاء جرعات متقطعة ومتكررة. وبناءً على ذلك، ستتركز الأبحاث المستقبلية على معالجة هذه القيود من خلال تحسين كفاءة توصيل LNPs لتحقيق استهداف دقيق ونوعي للسلالات الخلوية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع التجارب الحيوانية من قبل لجنة أخلاقيات حيوانات المختبر في مستشفى شنغهاي العاشر الشعبي (رقم الموافقة: SHDSYY-2025-P085؛ تاريخ الموافقة: 1 يناير 2025). وتلتزم هذه الدراسة بالقوانين واللوائح والمتطلبات المؤسسية المحلية. استُخدمت إناث الفئران من سلالة NSG التي تتراوح أعمارها بين 6-8 أسابيع. تم الحصول على الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) المستخدمة في هذه الدراسة من مصدر تجاري. وتظهر الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. تحضير mRNA الخاص بمستقبلات CAR

  1. تحضير قوالب DNA الخطيّة
    ملاحظة: تم تخطيط البلازميد الذي يحتوي على تسلسل CAR باستخدام إنزيم التقييد BspQI. يجب أن يقوم إنزيم التقييد المختار بإدراج قطعة DNA في اتجاه المصب من منطقة المحفز (promoter region) على الجانب الأيمن، وألا يحتوي على مواقع تعرف داخل قطعة DNA المدرجة.
    1. أضف الماء المقطر المزدوج (ddH2O)، والمحلول المنظم 10× buffer، وقالب DNA، وإنزيم BspQI بالترتيب المحدد في الجدول 1. يتم الحضانة عند 50 °C لمدة 2 h، ثم يتم تثبيط الإنزيم عند 80 °C لمدة 20 min. يمكن تخزين البلازميد الخطي عند 4 °C.
      1. قم بإعداد تفاعل الهضم بالتقييد في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم. أضف الماء المقطر المزدوج، والمحلول المنظم لإنزيم التقييد، وقالب DNA البلازميدي، وإنزيم التقييد BspQI بالترتيب والأحجام المحددة في الجدول 1.
      2. امزج خليط التفاعل برفق عن طريق السحب والطرد بالماصة، ثم قم بتدويره لفترة وجيزة في جهاز الطرد المركزي الدقيق. حضن الخليط عند 50 °C لمدة 2 h في جهاز التدوير الحراري (thermal cycler) للسماح بالهضم الكامل. قم بتثبيط إنزيم التقييد عن طريق حضن الخليط عند 80 °C لمدة 20 min.
        ملاحظة: اختياري - يتم تخزين البلازميد الخطي عند 4 °C للاستخدام قصير المدى أو الانتقال فوراً إلى خطوة مراقبة الجودة.
    2. حضر هلام أغاروز بتركيز 1% عن طريق وزن 0.25 g من الأغاروز وإذابته في 25 mL من المحلول المنظم 1× Tris–Acetate–EDTA (TAE). أضف 2.5 µL من Gel Green وامزجهما جيداً. ارفع الخليط إلى درجة الغليان، ثم رجه بقوة. كرر هذه العملية ثلاث مرات قبل صب الخليط في صينية صب الهلام. قم بالتشغيل الكهربائي عند 10 V لمدة 10 min، يليه 130 V لمدة 20 min.
      1. قم بإجراء التصوير بالأشعة فوق البنفسجية (UV) للتحقق من الهضم الكامل. ومن خلال مقارنة مواقع الحزم مع علامات DNA والبلازميد غير المقطوع، أظهر البلازميد الخطي حزمتين متمايزتين فقط تتوافقان مع أوزانهما الجزيئية المتوقعة: كانت التسلسل المستهدف حوالي 1,791 bp، والقطعة المتبقية حوالي 2,535 bp.
    3. قم بتنقية نواتج الهضم باستخدام حبيبات عزل DNA.
      1. استخدم جهاز Vortex لرج الحبيبات المغناطيسية لضمان الخلط التام. انقل الحجم المحدد من الحبيبات المغناطيسية إلى عينة DNA وامزجها برفق. حضن العينة في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 min للسماح بارتباط DNA بالحبيبات.
      2. ضع العينة على حامل مغناطيسي لمدة 5 min. قم بإزالة السائل الطافي بعناية. أضف 20 µL من الإيثانول بتركيز 80% المحضر حديثاً للغسيل. حضن العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 s وأزل السائل الطافي بعناية. كرر هذه الخطوة مرتين.
      3. اترك العينة على الحامل المغناطيسي في درجة حرارة الغرفة مع فتح الغطاء لمدة 5 min للتجفيف. أخرج العينة من الحامل المغناطيسي. أضف 1 µL من ddH2O الخالي من النوكلياز. امزج جيداً عن طريق السحب والطرد بالماصة. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 min. اترك المحلول يستقر على الحامل المغناطيسي لمدة 5 min حتى يصبح صافياً.
      4. انقل السائل الطافي بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد خالٍ من النوكلياز. استخدم مقياس الطيف الضوئي لقياس تركيز DNA؛ يجب استخدام DNA الناتج فوراً في عملية النسخ in vitro. احسب معدل الاسترداد بناءً على كمية DNA المنقاة مقسومة على كمية DNA الأولية المضافة.
  2. النسخ In Vitro (IVT)
    1. قم بإذابة جميع مكونات طقم النسخ in vitro وإضافة القبعة لـ RNA القائم على T7 RNA polymerase على الثلج (باستثناء T7 RNA Polymerase Mix، الذي يجب حفظه عند -20 °C حتى الاستخدام). رج المحاليل المنظمة بـ Vortex لفترة وجيزة ثم قم بتدويرها.
    2. قم بتجميع خليط تفاعل IVT في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم وخالٍ من النوكلياز في درجة حرارة الغرفة وفقاً للأحجام المحددة في الجدول 2. أضف المكونات بالترتيب المذكور، وختاماً مزيج إنزيم T7.
    3. امزج خليط التفاعل جيداً ولكن برفق عن طريق نقر الأنبوب أو السحب والطرد بالماصة. قم بتدويره لفترة وجيزة لتجميع السائل في القاع. حضن الخليط عند 37 °C لمدة 2 h في جهاز التدوير الحراري.
    4. أضف 2 µL من إنزيم DNase I مباشرة إلى تفاعل IVT لتفكيك قالب DNA المتبقي. امزج برفق وحضن عند 37 °C لمدة 15 min إضافية. انتقل فوراً إلى خطوة التنقية.
  3. قم بتنقية منتج RNA الناتج باستخدام حبيبات عزل RNA باتباع نفس إجراء تنقية نواتج هضم DNA.
    1. أذب الناتج في 20 µL من الماء الخالي من الإنزيمات. استخدم مقياس الطيف الضوئي NanoDrop لقياس تركيز mRNA ونسبة الامتصاص (OD). استخدم 1 µL من الماء الخالي من النوكلياز كعينة ضابطة (blank). يجب أن تكون نسبة OD260/280 بين 1.8 و 2.1، ونسبة OD260/230 بين 2.0 و 2.4.
      ملاحظة: إذا وقعت النسب خارج هذه النطاقات، فإن ذلك يشير إلى وجود تلوث، ويجب تنقية العينة مرة أخرى.
    2. استخدم نظام الفصل الكهربائي الشعري الآلي لتحليل الأحماض النووية والبروتينات لتحليل طول وسلامة CAR mRNA المصنع. يجب أن يظهر ملف الفصل الكهربائي ذروة واحدة حادة تتوافق مع حجم CAR mRNA الكامل المتوقع (حوالي 180 nt)، دون وجود ذيول ومع خط أساس مسطح ونظيف. لا ينبغي وجود حزم منتشرة ذات وزن جزيئي منخفض أو ذوات متعددة؛ وإلا فإن ذلك يشير إلى تحلل RNA.
    3. قم بتقسيم CAR mRNA المعتمد إلى حصص (aliquots) لتجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة، وخزنه عند -80 °C للحفظ طويل المدى.

2. تحضير الجسيمات النانوية الشحمية (LNP) وتوصيفها

  1. أذِب SM102، والكوليسترول، و1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)، وDMG-PEG20 في إيثانول لامائي لتحضير محلول مخزون بتركيز 10 ملجم/ملل. ثم حضّر الطور العضوي باستخدام نسبة 1:50:38.5:10:1.5.
    1. احسب كمية الـ mRNA المطلوبة بناءً على نسبة 8:1 بين مجموعات الأمين N موجبة الشحنة ومجموعات الفوسفات P سالبة الشحنة. أذِب الـ mRNA في محلول سترات الصوديوم لتحضير الطور المائي. حافظ على نسبة 1:3 بين الطور العضوي والطور المائي بمعدلات تدفق تبلغ 1.5 مل/دقيقة لكل منهما. حضر الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) باستخدام جهاز مائعات دقيقة مزود بخلاط على شكل عظم السمكة.
  2. أولاً، يتم شطف الأنابيب والشريحة الموائعية الدقيقة (خلاط عظم السمكة) مرة واحدة باستخدام الإيثانول اللامائي ومحلول سترات الصوديوم. بعد خلط الأطوار العضوية والمائية المحضرة عن طريق التطهير، يتم سحبها باستخدام محقنة سعة 1 مل؛ على أن تكون نسبة الطور العضوي إلى الطور المائي 1:3. ثم يتم تحميلهما في قناتي مضخة المحقنة على التوالي.
    1. اضبط معدلات التدفق للأطوار العضوية والمائية. أضف 5 مل من محلول منظم سترات الصوديوم (50 ملي مولار) إلى أنبوب الطرد المركزي المتصل بالمخرج. بعد شطف أي محلول غسيل متبقٍ من الأنابيب، ابدأ تشغيل الجهاز واجمع المادة المستخلصة.
    2. انقل الجسيمات النانوية الدهنية (LNPs) المشتتة في محلول سترات الصوديوم إلى أنبوب ترشيح فائق بمسامية 100 كيلو دالتون، ثم قم بالطرد المركزي عند 400 × ج لمدة 5-10 دقائق، ثم أضف 2.5 مل من محلول سترات الصوديوم و2.5 مل من محلول TBS بتركيز 1× لإعادة توزيعها، وكرر عملية الطرد المركزي مرة واحدة.
    3. أضف 1 مل من محلول سترات الصوديوم و 4 مل من محلول TBS بتركيز 1× لإعادة توزيع الجسيمات، ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى. تُحفظ جسيمات LNPs المركزة في 1 مل من محلول TBS عند 4 °C لفترة قصيرة.
  3. استخدم طقم قياس كمية الـ RNA القائم على الفلورة لقياس محتوى الـ mRNA في الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) قبل وبعد عملية إزالة الاستحلاب؛ ويمثل الفرق بين القيمتين كفاءة التغليف للجسيمات النانوية الدهنية.
    1. قم بتحضير محلول TE المنظم بتركيز 1×، والمحلول العامل للمسبار، وTriton X-10 بتركيز 2%. قم بتخفيف المعيار الخاص بـ mRNA (100 µg/mLإلى 2 µg/mL باستخدام منظم TE بتركيز 1×، وقم بإعداد منحنى قياسي بتركيزات: عينة فارغة، و10، و20، و10، و50، و10 نانوجرام/ملل. قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس (Vortex). 4 µL من محلول الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) مع 16 µL من محلول Triton X-10 بتركيز 2%، ثم يُترك لمدة 10 دقائق.
    2. أضف 5 µL من محلول الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) التي تمت إزالة الاستحلاب منها إلى 95 µL من محلول TE المنظم بتركيز 1×. أضف 100 µL أضف محلول العمل الخاص بالمسبار إلى آبار المنحنى القياسي وآبار العينات، واخلط جيداً، واحمه من الضوء، ثم انقله إلى لوحة ذات 96 بئراً ذات قاع أسود.
    3. بعد الحضانة، قم بقياس شدة الفلورة (Ex480/Em520) باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة. اطرح قيم الامتصاصية الخاصة بآبار العينة الفارغة (البلانك) من قيم آبار المنحنى القياسي وآبار العينات، على التوالي، لرسم المنحنى القياسي.
    4. استخدم المنحنى القياسي لحساب تركيزات mRNA في محلول الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) قبل وبعد إزالة الاستحلاب، ثم اضرب هذه القيم في 20 للحصول على التركيزات قبل التخفيف، وعوض بها في صيغة الحساب:
      صيغة معدل التغليف؛ عملية كيميائية، حساب الكفاءة، طريقة إزالة الاستحلاب.
  4. خذ 10 µL من جسيمات LNP، ثم خفها في 1 مل من محلول TBS. حدد حجم الجسيمات، وجهد زيتا، وقيمة مؤشر تشتت الحجم (PDI) باستخدام محلل حجم الجسيمات Malvern.

3. تنشيط الخلايا التائية ونقل الجينات

  1. فرز الخلايا التائية
    1. خذ الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي (PBMCs) بتركيز 1 × 107/مل، وأعد تعليقها عند 37 °C، ثم أضف 10 مل من محلول منظم لفصل الخلايا مناعيًا مغناطيسيًا، وامزجه جيدًا، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 50 × ج لمدة 8 دقائق، ثم قم بالعد.
    2. أعد تعليق الخلايا واضبط الكثافة لتصبح 5 × 107 خلية/مل، أضف 50 µL من كوكتيل العزل (Isolation Cocktail) لكل ملليلتر من معلق الخلايا، والتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق؛ ثم أضف 40 µL من الجسيمات المغناطيسية لعزل الخلايا مناعياً مغناطيسياً لكل ملليمتر من معلق الخلايا واخلط؛ ثم ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي واحضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
      1. انقل معلق الخلايا المُثرى بعناية إلى أنبوب طرد مركزي جديد باستخدام ماصة. ارفع الأنبوب عن المغناطيس، وأضف 4 مل من محلول فصل الخلايا المناعي المغناطيسي الطازج، ثم قم بالتحضين لمدة 5 دقائق إضافية لإجراء جولة فصل ثانية.
    3. اغسل الخلايا باستخدام وسط زراعة الخلايا التائية (RPMI 1640 GlutaMAX + 10% مصل جنيني بقري + 1% بنسيلين/ستريبتومايسين + 10 وحدة دولية/مل rhIL-2 + 5 نانوجرام/مل rhIL-7 + 5 نانوجرام/مل rhIL-15)، ثم قم بالطرد المركزي والعد. أضف وسط زراعة الخلايا التائية لضبط كثافة الخلايا لتصبح 1 × 106/مل وأضف 12.5 µL خرزات مغناطيسية منشطة للخلايا التائية البشرية CD3/CD28. تُحضن في 37 °C في حضانة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO₂) لمدة 48 ساعة لتنشيط الخلايا.
  2. كشف معايير تنشيط الخلايا التائية
    1. نقل 200 µL من الخلايا التائية (T cells) المنشطة لمدة 48 ساعة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. أزل خرزات التنشيط المغناطيسية CD3/CD28، وأضف 1 مل من محلول FACS المنظم للغسل، ثم امزج بلطف باستخدام الماصة، ثم قم بالطرد المركزي عند 50 × ج, 4 °C لمدة 5 دقائق. يُزال الطافي بعناية وتُكرر العملية من 2 إلى 3 مرات.
    2. أعد تعليق الخلايا في 100 µL محلول FACS المنظم. أضف 1 µL كل من الأجسام المضادة لـ CD3 البشري، وCD25 البشري، وCD69 البشري. اخلط العينات برفق واتركها في درجة حرارة الجليد في الظلام لمدة 30 دقيقة.
      1. أضف 1 مل من منظم FACS لغسل الخلايا، ثم قم بالطرد المركزي، وبعد ذلك أزل الراشح بعناية، ثم أضف 100 µL من محلول FACS المنظم و 0.1 µL من صبغة LIVE/DEAD لتثبيت الخلايا الميتة، ثم تُحضن على الجليد في الظلام لمدة 10 دقائق.
    3. أعد تعليق الخلايا في 1 مل من منظم FACS، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 500 x جـ, 4 °C لمدة 5 دقائق، ثم أزل السائل الطافي بعناية. كرر العملية من 2 إلى 3 مرات. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 200 µL محلول FACS المنظم. تحليل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي.
    4. حدد الخلايا المستهدفة باستخدام FSC-A وSSC-A، وافصل الخلايا المفردة باستخدام FSC-A وFSC-H، وحدد الخلايا الحية باستخدام صبغة تمييز الخلايا الحية والميتة (LIVE/DEAD). قارن نسب CD25 وCD69 بين الخلايا التائية غير النشطة والخلايا التائية المنشطة.
  3. عدوى الخلايا التائية باستخدام الجسيمات النانوية الدهنية (LNP)
    1. بناءً على حساب كفاءة التغليف، خذ الحجم المطلوب من الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) وفقاً لكمية الحمض الريبوزي المرسال (mRNA). أولاً، قم بطرد الجسيمات النانوية الدهنية المشتتة في محلول TBS مركزياً لفصلها، ثم انقلها إلى وسط RPMI 1640.
    2. بعد مرور 48 ساعة، استخدم حاملًا مغناطيسيًا لإزالة خرزات التنشيط المغناطيسية CD3/CD28. قم بالطرد المركزي عند 50 × ج لمدة 8 دقائق، ثم قم بالعد وإضافة وسط استنبات الخلايا التائية (T-cell) لضبط الكثافة لتصبح 2 × 106 خلية/مل. أضف 1 µg من جسيمات LNP-mRNA لكل 1 × 105 الخلايا. اخلط بلطف عن طريق السحب والضخ بالماصة، ثم حضّن في 37 °C في حاضنة تحتوي على 5% من ثاني أكسيد الكربون (CO₂) لمدة تتراوح بين 4 و6 ساعات.

4. الكشف عن تعبير CAR

  1. بعد 4–6 ساعات من عملية التعداء (transfection)، تُخلط خلايا CAR-T بلطف باستخدام الماصة لضمان التجانس. يُنقل ما لا يقل عن 2 × 105 من الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 mL.
  2. يُضاف 1 mL من منظم FACS (FACS buffer) إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 mL. تُخلط العينة بالماصة، ثم تُوضع في جهاز الطرد المركزي بسرعة 500 x g لمدة 5 min عند درجة حرارة 4 °C. يُزال السائل الطافي بعناية. تُكرر هذه الخطوة 2–3 مرات.
  3. تُعلق كتلة الخلايا المترسبة في 10 µL من منظم FACS، وتُقسم العينة إلى مجموعة ضابطة ومجموعة تجريبية، بحيث تحتوي كل منهما على 50 µL. يُضاف 1 µL من الجسم المضاد الكاشف لـ CAR من نوع G4S-linker إلى معلق الخلايا في المجموعة التجريبية، وتُخلط العينة بلطف، ثم تُحضن على الثلج في الظلام لمدة 30 min. أما بالنسبة للمجموعة الضابطة، فلا يُضاف الجسم المضاد، وتُحضن على الثلج.
  4. تُسحب 0.2 µL من صبغة الخلايا الميتة القابلة للتثبيت LIVE/DEAD (بتركيز 10×) وتُخف في 10 µL من منظم FACS؛ ثم يُضاف 50 µL من هذا المزيج إلى كل من المجموعتين الضابطة والتجريبية، وتُخلط العينة بلطف، ثم تُحضن على الثلج في الظلام لمدة 10 min.
  5. تُغسل الخلايا باستخدام 1 mL من منظم FACS. تُوضع في جهاز الطرد المركزي بسرعة 50 x g لمدة 5 min عند درجة حرارة 4 °C. يُزال السائل الطافي بعناية. تُكرر العملية 2–3 مرات.
  6. يُتخلص من السائل الطافي وتُعلق الخلايا في 20 µL من منظم FACS. تُحلل الخلايا باستخدام قياس التدفق الخلوي (flow cytometry).
  7. يُقيم تعبير CAR باستخدام استراتيجية تحديد البوابات (gating strategy) التالية: تحديد الخلايا المستهدفة باستخدام مخطط FSC-A و SSC-A، وتحديد الخلايا المفردة باستخدام مخطط FSC-A و FSC-H، وتحديد الخلايا الحية باستخدام صبغة الخلايا القابلة للتثبيت LIVE/DEAD.
    ملاحظة: بناءً على اختيار الخلايا المصبوغة إيجابياً بجسم G4S-linker المضاد في العمود الأقصى جهة اليمين من مجتمع الخلايا الحية في المجموعة الضابطة، فإن النسبة المئوية الموضحة للمجموعة التجريبية تمثل معدل إيجابية CAR.

5. تحليل السمية الخلوية لـخلايا CAR-T In vitro

  1. هضم خلايا الورم NUGC4 و NCl-N87 التي تعبر عن اللوسيفيريز باستخدام التريبسين. يتم الطرد المركزي عند 300 x g لمدة 5 min. أضف 1 mL من وسط RPMI 1640، ثم قم بعدّ الخلايا وضبط كثافتها لتكون 5 × 104 cells/mL. وزع 10 µL في كل بئر من طبق 96-well plate. أضف حجماً مساوياً من المحلول الملحي الملحق بالفوسفات (PBS) في الآبار المتبقية لمنع التبخر. تُحضن الخلايا في حضانة عند 37 °C مع 5% CO₂ لمدة 24 h.
  2. احسب معدل إيجابية CAR بناءً على نتائج قياس التدفق الخلوي. أضف خلايا CAR-T أو T خلايا بنسب مؤثر إلى هدف تبلغ 10:1، 5:1، 3:1، 1:1، 1:3، و 1:5 إلى الآبار التي تحتوي على خلايا الورم (10 µL/well). تُحضن عند 37 °C مع 5% CO₂ لمدة 24 h.
  3. باستخدام طقم مقايسة الجين المراسل للوسيفيريز الخاص بـ firefly، يتم الكشف عن إشارة اللوسيفيريز من خلايا الورم المتبقية وفقاً لدليل المنتج، ثم يتم حساب معدل القتل: (1 - (قيمة RLU للخلية المؤثرة/قيمة RLU للخلية الهدف)) × 10%.

6. التحقق الوظيفي In vivo لخلايا CAR-T

  1. بعد فترة تأقلم لمدة أسبوع واحد قبل التلقيح، يُحقن كل فأر تحت الجلد في منطقة الإبط بـ 5 × 106 خلايا NUGC4. قم بقياس حجم الورم يومياً، واحسب حجم الورم باستخدام الصيغة التالية: V (ملم3) = L × و2/2 (حيث تمثل L القطر الأطول للورم وW القطر الأقصر) حتى وصل الورم إلى 10 ملم3.
  2. قسّم الفئران عشوائياً إلى أربع مجموعات: ثلاث مجموعات علاجية تتلقى جرعات مختلفة، ومجموعة ضابطة تتلقى محلول PBS، بحيث تضم كل مجموعة ثلاثة فئران.
    ملاحظة: لم يتم تنفيذ قانون العمى.
  3. بعد التحضين 10 µg من الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) بتركيز 1 × 106 خلايا T المنشطة لمدة 4 ساعات، وتحضير جرعات مقدارها 5 × 105 خلية/فأر، 1 × 106 خلية/فأر، و2 × 106 خلية/فأر. يتم حقن الخليط المكون من الجسيمات النانوية الدهنية (LNP) والخلايا التائية (T cells) في الفئران. عبر حقن في الوريد الذيلي، بحيث يتلقى كل فأر 100 µL حجم من الخلايا أو المحلول الملحي المُنَظِّم للفوسفات (PBS). تم إعطاء الجرعات في الأيام 1 و4 و7 و10، بمجموع أربع جرعات.
  4. قم بقياس حجم الورم لدى الفئران في الأيام 0 و2 و4 و6 و8 و10 و12 و14، واحسب حجم الورم، ثم ارسم منحنى النمو. عبّر عن البيانات في صورة المتوسط ± الانحراف المعياري (SD). حلل الفروق بين المجموعات باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (ANOVA) عبر برنامج للتحليل الإحصائي والرسم البياني، مقترناً باختبار توكي للمقارنات المتعددة. ns: غير دال إحصائياً؛ *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم استخدام تسلسل CAR يستهدف Claudin18.2، يتكون من الجزء المتغير أحادي السلسلة (scFv) من جسم مضاد أحادي النسيلة بشري لمنع Claudin18.2، ومنطقة مفصلة CD8، ومنطقة عبر غشائية CD28، والنطاق التحفيزي المشترك، ونطاق التنشيط CD3ζ. تم بناء قالب DNA يحتوي على محفز T7 وذيل poly A بناءً على هذا التسلسل لنسخ mRNA الخاص بـ CAR in vitro (الشكل 1A). بلغ طول mRNA الخاص بـ CAR حوالي 180 bp، كما تم التحقق من ذلك عن طريق الفصل الكهربائي الشعري (الشكل 1B). يشير وجود حزمة واح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول نظاماً غير فيروسي لإيصال mRNA يتجنب الاندماج في جينوم المضيف، مما يؤدي إلى تفادي مخاطر عديدة، بما في ذلك الرفض المناعي. كما تمنع وظيفته العابرة حدوث السمية خارج الهدف، مما يتيح تعبيراً قصير المدى وقابلاً للتحكم في خلايا CAR-T لتقليل الآثار الجانبية ومخاطر السلامة.

تم إجراء تحسين لتصميم تسلسل CAR mRNA من أجل تنظيم كفاءة ترجمته ومدة تعبيره. تعمل كل من المنطقة غير المترجمة 5'UTR، والمنطقة غير المترجمة 3'UTR، والقبعة 5'-Cap، وذيل poly(A) لجزيء mRNA بشكل تآزري على تنظيم ترجمة mR...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يقر المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح

شكر وتقدير

نود أن نعرب عن امتناننا لجامعة شنغهاي والمختبر المركزي في مستشفى شنغهاي العاشر للأشخاص لتوفيرهما منصة بحثية لهذه الدراسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
إيثانول مطلقSigma-Aldrich459836طور عضوي
أجاروزBeyotimeST004Lرحلان كهربائي هلامي
الأجسام المضادة أحادية النسيلة PE لـ anti-G4S linker (B02H1) mAb PE HycellsGS-ARPE100كشف CAR
إنزيم القطع BspQINEBR0712خطية البلازميد
BV421 Mouse Anti-Human CD25BD Biosciences564033علامة التنشيط
خرز تنشيط CD3/CD28Thermo Fisher Scientific11161Dتنشيط الخلايا التائية
كوليسترولSigma-AldrichC8667ليبيد هيكلي
حضانة زراعة الخلايا بـ CO2Thermo Fisher / ما يعادلها250iلزراعة الخلايا التائية والخلايا الورمية
DMG-PEG2000Avanti Polar Lipids880151ليبيد مبيجلي (PEGylated)
خرز مغناطيسي لعزل DNASYNTHGENE10501-005تنقية DNA
DNase I (خالٍ من RNase)NEBM0303Lإزالة قالب DNA
DSPCAvanti Polar Lipids850365فوسفوليبيد
محلل تشتت الضوء الديناميكيMalvern Panalytical         Zetasizer    لقياس حجم LNP، ومؤشر التشتت المتعدد PDI، وجهد زيتا 
منظم EasySepSTEMCELL Technologies20144فصل مغناطيسي
مصل جنين البقر (FBS)Gibco10099-141مكمل زراعة
FITC Mouse Anti-Human CD3BD Biosciences555332تحديد الخلايا التائية
مقياس التدفق الخلوي      BD Biosciences / ما يعادلهاFACSCelesta / LSRFortessa لكشف CAR وعلامة التنشيط
صبغة GelGreen للأحماض النوويةBiotium41005تصوير DNA
صبغة LIVE/DEAD القابلة للتثبيتInvitrogenL34955صبغ الحيوية
طقم مقايسة اللوسيفيريزPromegaE1500قراءة السُميّة الخلوية
حامل فصل مغناطيسي   STEMCELL Technologies / ما يعادلها18000لعزل PBMC والخلايا التائية
مقياس الطيف الضوئي Nanodrop  Thermo Fisher Scientific  NanoDrop 2000            لتقدير كمية DNA/RNA     
فئران NSG إناث (6–8 أسابيع)Jackson Laboratory5557نموذج في الجسم الحي (In vivo)
PBMCsShanghai Saili Biotechnology Company
جهاز الدورة الحرارية لـ PCRBio-Rad / ما يعادله  T100لتضخيم DNA
PE Mouse Anti-Human CD69BD Biosciences557050التنشيط المبكر
بنسلين-ستربتومايسينGibco15140-122مضادات حيوية
محلل Qsep للأحماض النووية    BiOptic Inc.  Qsep100      لتحليل حجم/سلامة mRNA
طقم Quant-iT RiboGreen RNAInvitrogenR11490كفاءة التغليف
RapidSpheresSTEMCELL Technologies15061وسم مغناطيسي
إنترلوكين-15 البشري المؤتلف Recombinant Human IL-15PeproTech200-15دعم النمط الظاهري للذاكرة
إنترلوكين-2 البشري المؤتلف Recombinant Human IL-2PeproTech200-02توسيع الخلايا التائية
إنترلوكين-7 البشري المؤتلف Recombinant Human IL-7PeproTech200-07بقاء الخلايا التائية
جهاز طرد مركزي مبردEppendorf / ما يعادله 5425Rلتركيز LNP ومعالجة الخلايا 
RNA 6000 LadderThermo Fisher ScientificAM7152توصيف RNA
طقم خرطوشة RNA (قطعة واحدة)BiopticC105110ضبط جودة RNA
خرز مغناطيسي لعزل RNASYNTHGENE10511-005تنقية mRNA
ماء خالٍ من RNaseThermo Fisher ScientificAM9937النسخ في المختبر (IVT) والتعامل مع RNA
RPMI 1640 GlutaMAXGibco61870-036زراعة الخلايا التائية
SM-102MedChemExpress / ما يعادلهاHY-112563ليبيد قابل للتأين
مزيج عزل الخلايا التائيةSTEMCELL Technologies15061عزل الخلايا التائية CD3+
طقم T7 للنسخ المشترك وإضافة القبعة (Cap-Addition)SYNTHGENE10111-3011تخليق mRNA في المختبر (IVT)
منظم TBSGibco3005تخزين LNP
تريبسين-EDTAGibco25200-056فصل الخلايا
نظام تصوير الهلام بالأشعة فوق البنفسجية  Syngene / ما يعادلها  NuGenius/NuGenius+للتحقق من هضم DNA

المراجع

  1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2018;68(6):394-424.
  2. Saez-Ibañez AR, Upadhaya S, Partridge T, Shah M, Correa D, Campbell J. Landscape of cancer cell therapies: trends and real-world data. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(9):631-632.
  3. Dunbar CE, High KA, Joung JK, Kohn DB, Ozawa K, Sadelain M. Gene therapy comes of age. Science. 2018;359(6372):eaan4672.
  4. Jiang H, Shi Z, Wang P, Li X, Hou W, Zhang H, et al. Claudin18.2-specific chimeric antigen receptor engineered T cells for the treatment of gastric cancer. J Natl Cancer Inst. 2019;111(4):409-418.
  5. Baker DJ, Arany Z, Baur JA, Epstein JA, June CH. CAR T therapy beyond cancer: the evolution of a living drug. Nature. 2023;619(7971):707-715.
  6. Raguram A, Banskota S, Liu DR. Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents. Cell. 2022;185(15):2806-2827.
  7. Khawar MB, Afzal A, Si Y, Sun H. Steering the course of CAR T cell therapy with lipid nanoparticles. J Nanobiotechnology. 2024;22(1):380.
  8. Hamilton AG, Thatte AS, Xu J, Mai D, Billingsley MM, Mitchell MJ, et al. High-throughput in vivo screening using barcoded mRNA identifies lipid nanoparticles with extrahepatic tropism for in situ immunoengineering. Adv Mater. 2026;38(13):e14370.
  9. Żak MM, Yoo J, Utrero-Rico A, Kim J, Smith R, Wang L, et al. A tumor-selective mRNA system enables precision cancer treatment. Mol Ther. 2026;34(2):1066-1083.
  10. Han JH, Fagan E, Yeom K, Park JH. In situ chimeric antigen receptor macrophage therapy via co-delivery of mRNA and immunostimulant. ACS Nano. 2025;19(48):40798-40816.
  11. Chen X, Li X, Yan Y, Wang J, Liu Y, Zhang Q, et al. Splenic dendritic cell-targeting mRNA transfection of H-type ionizable lipid-based LNPs for enhancing tumor immunotherapy. Bioact Mater. 2026;61:429-447.
  12. Roundtree IA, Evans ME, Pan T, He C. Dynamic RNA modifications in gene expression regulation. Cell. 2017;169(7):1187-1200.
  13. Ikeda RA, Richardson CC. Interactions of the RNA polymerase of bacteriophage T7 with its promoter during binding and initiation of transcription. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83(11):3614-3618.
  14. Holtkamp S, Kreiter S, Selmi A, Simon P, Koslowski M, Huber C, et al. Modification of antigen-encoding RNA increases stability, translational efficacy, and T-cell stimulatory capacity of dendritic cells. Blood. 2006;108(13):4009-4017.
  15. Tada M, Abe N, Inagaki M, Sato K, Yamaguchi T, Tanaka H, et al. The effect of cap structure and poly(A) positioning on mRNA translation efficiency. Angew Chem Int Ed Engl. 2025;64(50):e202514124.
  16. Ye Z, Chen J, Zhao X, Li Y, Wang X, Zhang Y, et al. In vitro engineering chimeric antigen receptor macrophages and T cells by lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery. ACS Biomater Sci Eng. 2022;8(2):722-733.
  17. Billingsley MM, Singh N, Ravikumar P, Zhang R, June CH, Mitchell MJ. Ionizable lipid nanoparticle-mediated mRNA delivery for human CAR T cell engineering. Nano Lett. 2020;20(3):1578-1589.
  18. Billingsley MM, Hamilton AG, Mai D, Singh N, Zhang R, Lee Y, et al. Orthogonal design of experiments for optimization of lipid nanoparticles for mRNA engineering of CAR T cells. Nano Lett. 2022;22(1):533-542.
  19. Zong Y, Lin Y, Wei T, Cheng Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 2023;35(51):e2303261.
  20. Sun D, Lu ZR. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 2023;40(1):27-46.
  21. Su FY, Zhao QH, Dahotre SN, Li X, Wang Y, Zhang Z, et al. In vivo mRNA delivery to virus-specific T cells by light-induced ligand exchange of MHC class I antigen-presenting nanoparticles. Sci Adv. 2022;8(8):eabm7950.
  22. Herrera-Barrera M, Ryals RC, Gautam M, Patel A, Kim S, Wilson J, et al. Peptide-guided lipid nanoparticles deliver mRNA to the neural retina of rodents and nonhuman primates. Sci Adv. 2023;9(2):eadd4623.
  23. Kheirolomoom A, Kare AJ, Ingham ES, Mahakian LM, Tam SM, Silvestrini MT, et al. In situ T-cell transfection by anti-CD3-conjugated lipid nanoparticles leads to T-cell activation, migration, and phenotypic shift. Biomaterials. 2022;281:121339.
  24. Tombácz I, Laczkó D, Shahnawaz H, Muramatsu H, Natesan A, Yadegari A, et al. Highly efficient CD4+ T cell targeting and genetic recombination using engineered CD4+ cell-homing mRNA-LNPs. Mol Ther. 2021;29(11):3293-3304.
  25. Rurik JG, Tombácz I, Yadegari A, Méndez Fernández PO, Shewale SV, Li L, et al. CAR T cells produced in vivo to treat cardiac injury. Science. 2022;375(6576):91-96.
  26. Shi D, Toyonaga S, Anderson DG. In vivo RNA delivery to hematopoietic stem and progenitor cells via targeted lipid nanoparticles. Nano Lett. 2023;23(7):2938-2944.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

علاج الخلايا التائية ذات المستقبلات المستضدية الخيمريةتوصيل الجسيمات النانوية الليبيديةاستهداف كلودين 18.2ترانسفكشن الحمض الريبوزي المرسال للمستقبلات المستضدية الخيمريةتنشيط الخلايا التائيةتوليد الخلايا التائية ذات المستقبلات المستضدية الخيمرية في الموقعالعلاج المناعي للأورام الصلبةتحليل تعبير المستقبلات المستضدية الخيمريةالنسخ في المختبرالفعالية المضادة للأورام

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.