مقالة منهجية

تقدير كمية الفلوريد في المصل والعظام والأسنان في نموذج فئران باستخدام الانتشار المُيسَّر بواسطة هيكساميثيل دي سيلوكسان وقياسات القطب الانتقائي للأيونات

81 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71488

⸱

أغسطس 28, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تحضير أطباق الانتشار المسهلة بواسطة الهكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS)، يليه قياسات القطب الانتقائي للأيونات لتقدير كتلة أيونات الفلوريد في مصل الدم والعظام والأسنان للفئران. توفر هذه الطريقة نهجاً حساساً قائماً على المعايرة لتقييم تراكم الفلوريد في العينات البيولوجية.

الملخص

يعد تقدير مستويات الفلورايد في الأنسجة البيولوجية أمراً أساسياً لفهم التعرض للفلورايد وعمليات استقلابه وسميته. يصف هذا البروتوكول طريقة حساسة وقابلة للتكرار لقياس كتلة أيونات الفلورايد في المصل والعظام والأسنان باستخدام الانتشار المُيسّر بواسطة الهيكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS) متبوعاً بالتحليل باستخدام القطب الانتقائي للأيونات (ISE). يتم جمع العينات البيولوجية، بما في ذلك المصل وعظم الفخذ والقواطع الفكية، من فئران تعرضت لمعالجات محكومة من الفلورايد. يتم تحويل عينات العظام والأسنان إلى رماد، ثم طحنها وترطيبها، بينما يتم معالجة المصل مباشرة. تُنقل كل عينة إلى طبق انتشار يحتوي على ماء فائق النقاء ويُغلق بغطاء مبطن بالبترولاتوم يحتوي على قطرات من هيدروكسيد الصوديوم التي تعمل كمصائد للفلورايد. يؤدي حقن حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS إلى بدء تحرر الفلورايد وانتشاره، مما يسمح بالتقاط أيونات الفلورايد المتحررة كمياً في المصائد. بعد عملية الانتشار التي تستمر طوال الليل، تُجمع قطرات مصيدة الفلورايد في عينة واحدة، وتُحمض لتصل إلى نطاق pH المطلوب، وتُضبط إلى حجم محدد لقياسها بواسطة ISE. وتعمل أطباق انتشار المعايرة المُحضرة بكتل معروفة من الفلورايد على إنشاء منحنى قياسي للتقدير الكمي، بينما تتحقق عينات مراقبة الجودة من استقرار القطب. تظهر النتائج التمثيلية للفئران في مرحلتي المراهقة والنضج التي تعرضت لـ 0 أو 125 ppm من الفلورايد قدرة هذه الطريقة على اكتشاف الاختلافات المعتمدة على العمر والجرعة في مستويات الفلورايد عبر المصل والعظام والأسنان. يوفر هذا البروتوكول نهجاً قوياً قائماً على المعايرة لتقدير كمية الفلورايد في مصفوفات بيولوجية متنوعة، وهو مناسب جداً للدراسات التي تبحث في التعرض للفلورايد، وترسبه في الأنسجة، والنتائج السمية في النماذج الفأرية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في قدرتها على تقدير كمية الفلورايد بدقة في العينات الصغيرة جداً، بما في ذلك 3–5 mg من الرماد المستخلص من القواطع الفردية للفئران، لأن عملية الانتشار تركّز كل الفلورايد المتحرر في حجم عينة قابل للقياس يقل عن 100 µL.

المقدمة

يعد الفلوريد أنيوناً يوجد بشكل طبيعي، ويعمل المستوى الأمثل منه بفعالية في الوقاية من تسوس الأسنان1,2,3,4,5. وفي الولايات المتحدة (U.S.)، تم تطبيق فلورة مياه المجتمع بتركيز 0.7 ppm كاستراتيجية للصحة العامة لتقليل معدلات الإصابة بالتسوس وتعزيز صحة الفم6. ومع ذلك، فإن تناول كميات مفرطة من الفلوريد لفترات طويلة يمكن أن يؤثر سلباً على أنسجة متعددة؛ حيث يؤدي التعرض العالي للفلوريد إلى اضطراب تكوين المينا7,8,9، وتغيير تكوين العظام10، والإضرار بسلامة الهيكل العظمي11.

على المستوى الخلوي، يؤدي التعرض للفلووريد إلى حدوث عدة اضطرابات أيضية، بما في ذلك الإجهاد التأكسدي12، وإجهاد الشبكة الإندوبلازمية13، وتعديلات فوق جينية تغير التعبير الجيني14، والموت الخلوي المبرمج في الخلايا المينائية15,16,17,18. وعلى الصعيد العالمي، تشكل التركيزات المرتفعة من الفلووريد في المياه الجوفية (>1.5 ppm) مصدر قلق صحي كبير. وقد قدرت دراسة حديثة للنمذجة التنبؤية أن ما يقرب من 180 مليون شخص حول العالم قد يتأثرون بالتعرض المفرط للفلووريد، مع تركز العبء الأكبر في آسيا وأفريقيا1. وبالإضافة إلى مياه الشرب، يحدث التعرض للفلووريد أيضاً من خلال الأطعمة (مثل المأكولات البحرية؛ ~1.9 ppm)، والمشروبات (مثل الشاي؛ 0.5–6 ppm19)، ومنتجات العناية بالأسنان مثل معجون الأسنان20 (1,000–1,500 ppm).

لذلك، يعد فهم التعرض للفلوريد واستقلابه وترسبه في الأنسجة أمرًا ضروريًا لتقييم كل من فوائده العلاجية وآثاره السمية المحتملة. ويعد التقدير الكمي الدقيق للفلوريد في العينات البيولوجية — بما في ذلك البول والمصل والعظام والأسنان — مكونًا حيويًا في هذا العمل. ومع ذلك، فإن القياس يمثل تحديًا تحليليًا نظرًا للسلوك الكيميائي للفلوريد وألفته القوية للمصفوفات الغنية بالكالسيوم. ويستقر ما يقرب من 99% من فلوريد الجسم في الأنسجة المعدنية مثل العظام والأسنان21. ولمواجهة هذه التحديات، تم تطوير مجموعة متنوعة من التقنيات التحليلية، بما في ذلك قياس الجهد باستخدام القطب الانتقائي للأيونات (ISE)، والكروماتوغرافيا الأيونية، والمقاييس اللونية، وإجراءات المعايرة، والطرق النووية أو القائمة على التنشيط22. ومن بين هذه التقنيات، برزت تقنية الانتشار المسهل بواسطة الهكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS) مقترنة بالقياس باستخدام القطب الانتقائي للفلوريد كواحد من أكثر النهج موثوقية واستخدامًا للمصفوفات البيولوجية نظرًا لحساسيتها وقابلية تكرار نتائجها وتوافقها مع أنواع العينات المتنوعة23,24,25,26,27,28,29.

على الرغم من توفر طرق تحليلية متعددة، إلا أن كل نهج يعاني من قيود قد تحد من استخدامه في الأبحاث التجريبية أو السريرية. يوفر الكروماتوغرافيا الأيونية حساسية وانتقائية عاليتين، ولكنه يتطلب أجهزة متخصصة وتحضيراً مكثفاً للعينات30,31. أما المقاييس اللونية، مثل طريقة SPADNS (sodium 2‑(parasulfophenylazo)‑1,8-dihydroxynaphthalene-3,6‑disulfonate)، فهي بسيطة وغير مكلفة، ولكنها عرضة للتداخل من العكارة والكروموفورات الداخلية، مما يحد من موثوقيتها في العينات البيولوجية المعقدة22,32,33. وتعد طرق المعايرة ذات تكلفة منخفضة ومباشرة، ولكنها تفتقر إلى الحساسية المطلوبة للكشف عن آثار الفلوريد في معظم العينات البيولوجية34. وتوفر التقنيات النووية أو القائمة على التنشيط حساسية استثنائية، ولكنها تتطلب الوصول إلى مفاعلات أو مصادر نيوترونية قائمة على المسرعات، مما يجعلها غير عملية للاستخدام المختبري الروتيني35. وفي المقابل، يوفر الانتشار المسهل بواسطة HMDS متبوعاً بقياس ISE توازناً عملياً بين الحساسية والتكلفة وسهولة الوصول، مع ضمان التحرير الكامل للفلوريد من الأنسجة الرخوة والمعدنية على حد سواء. وهذا مفيد بشكل خاص للدراسات التي تشمل الحيوانات الصغيرة، حيث تكون كمية الأنسجة المتاحة محدودة، وتنتج الهياكل المعدنية مثل القواطع في الفئران ما بين 3–5 mg فقط من الرماد لكل سن.

تتيح قدرة طريقة الانتشار–ISE على تركيز كل الفلوريد المتحرر في حجم صغير ومحدد إجراء تقدير كمي دقيق حتى في العينات الصغيرة للغاية. وهذا يجعل هذه الطريقة مناسبة تماماً لدراسات الحركية السمية، وتجارب الاستجابة للجرعة، وأبحاث استقلاب الفلوريد عبر المراحل النمائية. وقد استُخدمت القوارض الصغيرة، وبخاصة فئران C57BL/6J، على نطاق واسع كنماذج حيوانية لدراسة تأثيرات الفلوريد7,9,12,29,36 .

في هذا البروتوكول، يطبق المؤلفون تقنية الانتشار المُسهل بواسطة HMDS متبوعة بقياس القطب الانتقائي للفلوريد لتقدير كمية الفلوريد في المصل والعظام والأسنان التي جُمعت من فئران تعرضت لجرعة عالية من الفلوريد (125 ppm) مقارنة بمجموعات ضابطة غير معالجة. كما يقارن المؤلفون تراكم الفلوريد في الفئران المراهقة (6 أسابيع عند بدء العلاج) والفئران البالغة (18 أسبوعاً عند بدء العلاج) لتقييم الاختلافات المعتمدة على العمر في استقلاب الفلوريد وترسبه في الأنسجة. وقد تم اختيار القواطع السفلية كنسيج سني ممثل لأن القواطع لدى القوارض تبزغ باستمرار وتصل إلى حالة توازن مستقر بين البزوغ والتآكل الإطباقي بحلول الأسبوع السابع تقريباً من العمر. يوفر نمط النمو المستمر هذا تدرجاً ثابتاً ومتاحاً لتطور المينا، مما يجعل القواطع الفأرية نموذجاً واسع الاستخدام ومعتمداً للبحث في تكوين المينا وتفلور الأسنان.

البروتوكول

نُفذت جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وفقاً للإرشادات واللوائح الخاصة باستخدام الحيوانات الفقارية والمعتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (IACUC) في جامعة نوفا ساوث إيسترن (بروتوكول رقم 2023.02.MSuz1)، المعتمدة من قبل الجمعية الدولية لتقييم واعتماد رعاية الحيوانات المختبرية (AAALAC). وقد التزم جميع العمل على الحيوانات بدليل رعاية واستخدام حيوانات المختبر وإرشادات الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية (AVMA) لقتل الحيوانات رحمةً. جميع المواد المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. الحيوانات و تحضير وإعطاء فلوريد الصوديوم في نموذج فئران

  1. الحيوانات: يتم توزيع ذكور فئران من سلالة C57BL/6J على فئتين عمريتين: فئة المراهقة، 6 أسابيع عند بدء العلاج، وفئة البلوغ، 18 أسبوعاً عند بدء العلاج.
    1. زود كل مجموعة إما بماء منزوع الأيونات وخالٍ من الفلوريد (0 جزء في المليون F⁻) أو بمياه شرب مدعمة بفلوريد الصوديوم (125 جزء في المليون F⁻) لمدة تعرض استمرت 6 أسابيع.
    2. تضمين خمسة حيوانات في كل فئة عمرية وحالة علاجية (العدد = 5 لكل مجموعة).
    3. في نهاية فترة التعرض، يتم جمع المصل وعظام الفخذ والقواطع الفكية السفلية، وتحضير جميع العينات التي تم جمعها للتحليلات اللاحقة.
      ملاحظة: العينة: مادة معالجة مثل العظام المرمّدة، والأسنان المرمّدة، والمصل.
  2. إيواء الحيوانات ونظامها الغذائي: تُربى الفئران في ظروف مختبرية قياسية مع حسب الرغبة الوصول إلى الغذاء والماء.
    1. قدم نظاماً غذائياً خالياً من الفلوريد بدءاً من أسبوع واحد قبل جمع عينات الأسنان والعظام والمصل لتقليل مستويات الفلوريد الخلفية.
  3. فلوريد الصوديوم في مياه الشرب
    1. لتحضير مياه شرب مدعمة بالفلوريد، أذب فلوريد الصوديوم (NaF) في ماء منزوع الأيونات للوصول إلى تركيز الفلوريد المطلوب (على سبيل المثال، 125 جزء في المليون من F⁻).
    2. قم بترشيح المحلول عبر 0.2 µm يُفلتر المحلول باستخدام مرشح فراغي في زجاجة معقمة بجهاز الموصدة (autoclave). ويُحضر محلول جديد كل يومين.
      تنبيه: مادة NaF سامة في حال بلعها، وقد تسبب تهيجاً للجلد والعينين. يجب التعامل معها داخل خزانة استخلاص الأدخنة مع ارتداء معطف المختبر، وقفازات النيتريل، ونظارات السلامة.
  4. للحصول على مياه تحكم خالية من الفلوريد، قم بترشيح المياه منزوعة الأيونات عبر 0.2 µm يُرسّب السائل عبر مرشح تفريغ في زجاجة معقمة بجهاز التعقيم البخاري. يُحضّر ماء نقي كل يومين.
  5. توفير مياه شرب مدعمة بالفلوريد أو خالية من الفلوريد بقدر ما يشاء للمدة المطلوبة لمعالجة الفلورايد. راقب مستويات المياه يومياً واستبدل الزجاجات كل يومين.
  6. في نهاية فترة التعرض، يتم قتل الحيوانات رحمةً عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO₂) متبوعاً بفصل الرأس. وقد نُفذت إجراءات القتل الرحيم وفقاً لإرشادات الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية (AVMA) الخاصة بالقتل الرحيم للحيوانات، وتم اعتمادها كجزء من بروتوكول اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات (IACUC).
    تنبيه: أول أكسيد الكربون (CO)2 مادة مسببة للاختناق. تُنفذ الإجراءات في منطقة جيدة التهوية مع التأكد من عمل الغرفة بشكل صحيح. تجنب التعرض المباشر عن طريق الاستنشاق.

2. تحضير العينات لقياس الفلوريد

  1. جمع الدم
    1. يتم القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق CO₂ وجمع الدم فوراً عبر ثقب قلبي نهائي باستخدام سرنجة توبيركولين سعة 1 mL. يُنقل الدم إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL. يتم التخلص من جميع الإبر والسرنجات المستخدمة في حاوية معتمدة للتخلص من الأدوات الحادة في المؤسسة.
      تنبيه: إبر السرنجات حادة وقد تسبب إصابات وخز؛ لذا يجب التعامل معها بحذر.
    2. يُحفظ الدم لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة، ثم يُوضع في جهاز الطرد المركزي لمدة 10 min عند 2,000 × g.
    3. يُنقل السائل الطافي (المصل) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ويُحفظ في درجة حرارة −80 °C.
      تنبيه: تشكل المجمدات فائقة البرودة مخاطر الإصابة بقضمة الصقيع. يجب ارتداء قفازات عازلة عند التعامل مع الأنابيب وتجنب ملامسة الجلد لفترات طويلة للأسطح الباردة.
  2. العظام
    1. استخراج عظام الفخذ: بعد القتل الرحيم، يتم تشريح الأرجل الخلفية عند مفاصل الورك.
    2. تُزال جميع الأنسجة الرخوة بعناية من عظام الفخذ. تُغسل الأنسجة ثلاث مرات في ماء منزوع الأيونات. تُحفظ العظام في درجة حرارة -80 °C حتى يتم معالجتها لاحقاً. يتم التخلص من الأنسجة الرخوة المزالة وأي مواد ملوثة في مسار النفايات البيولوجية في المؤسسة.
      ملاحظة: يمكن تثبيت الأنسجة في 4% بارافورمالديهيد مع 2% سكروز لمدة 12–16 h للتخزين طويل الأمد في 70% إيثانول. إجراء التثبيت هذا لا يؤثر على دقة تقدير كمية الفلوريد اللاحقة.
    3. تُشطف العظام جيداً بالماء منزوع الأيونات. تُجفف الرطوبة الزائدة باستخدام مناديل ورقية خالية من الوبر.
    4. تُنقل العظام إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL مع ترك الأغطية مفتوحة للسماح بالتبخر، وتوضع في فرن تجفيف عند 60 °C لمدة 12–16 h.
      تنبيه: قد يسبب فرن التجفيف حروقاً. استخدم قفازات مقاومة للحرارة عند التعامل مع العينات.
    5. ترميد العظام: تُنقل العظام المجففة إلى بوتقات ألومينا. توضع البوتقات في فرن مفل (muffle furnace) وتُسخن إلى 600 °C بمعدل 150 °C/h، ثم تُترك لمدة 6 h. يُترك الفرن ليبرد إلى أقل من 200 °C قبل إخراج البوتقات. يتم التخلص من أي شظايا عظمية متبقية أو مستهلكات ملوثة في مسار النفايات البيولوجية في المؤسسة.
      تنبيه: يصل فرن المفل والبوتقات إلى درجات حرارة قصوى، مما يشكل خطراً شديداً بحدوث حروق. يجب دائماً ترك الفرن يبرد قبل التعامل مع البوتقات. عند إخراج البوتقات، يجب ارتداء معطف المختبر، ونظارات السلامة، وقفازات مقاومة للحرارة، واستخدام ملاقط طويلة لتجنب التلامس المباشر مع الأسطح الساخنة.
      خطوة حرجة: الترميد غير المكتمل سيؤثر سلباً على التحاليل اللاحقة. تأكد من وصول المادة العظمية إلى حالة أكسدة كاملة قبل المتابعة؛ حيث أن أي كربون متبقٍ سيتداخل مع القياسات اللاحقة.
      ملاحظة: يجب أن تظهر العظام المرمّدة بشكل صحيح بلون رمادي فاتح موحد إلى الأبيض. تشير الجزيئات الداكنة- خاصة الرواسب السوداء أو الشبيهة بالفحم- إلى احتراق غير مكتمل. في حالة وجود تغير في اللون، يتم تمديد مدة الترميد للسماح بالإزالة الكاملة للمواد العضوية.
    6. تخزين العظام المرمّدة: فور الانتهاء من الترميد، تُنقل العظام إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL. تُغلق الأنابيب بـ Parafilm وتُحفظ في مجفف فراغي حتى الاستخدام.
  3. الأسنان
    1. استخراج القواطع الفكية السفلية: يتم إجراء قطع أفقي عند مستوى المفصل الفكي الصدغي لفصل الفك السفلي عن الفك العلوي.
    2. يتم إجراء قطوع سهمية وسطية لتقسيم كل من الفك العلوي والسفلي إلى نصفين أيمن وأيسر.
    3. تُغسل الأنسجة ثلاث مرات في ماء منزوع الأيونات وتُستخرج القواطع الفكية السفلية بعناية. تُحفظ القواطع المستخرجة في درجة حرارة -80 °C حتى الاستخدام اللاحق. يتم التخلص من الأنسجة الرخوة المستخرجة وأي مستهلكات ملوثة في مسار النفايات البيولوجية في المؤسسة.
      تنبيه: استخدم أدوات التشريح الحادة بحذر عند إجراء القطوع عند المفصل الفكي الصدغي والمستوى السهمي الوسطي لتجنب الإصابات الشخصية. ارتدِ معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر ونظارات السلامة.
      ملاحظة: يمكن تثبيت الأنسجة في 4% بارافورمالديهيد مع 2% سكروز لمدة 12–16 h للتخزين طويل الأمد في 70% إيثانول. إجراء التثبيت هذا لا يؤثر على دقة تقدير كمية الفلوريد اللاحقة.
    4. تحضير الأسنان للترميد: تُشطف الأسنان جيداً بالماء منزوع الأيونات وتوضع في 1% بيروكسيد الهيدروجين (H₂O₂) لمدة 12–16 h. يتم التخلص من محاليل بيروكسيد الهيدروجين المستهلكة كنفايات كيميائية خطرة.
    5. تُشطف الأسنان مجدداً بالماء منزوع الأيونات، وتُجفف لفترة وجيزة باستخدام منديل خالٍ من الوبر، ثم تُنقل إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL مع ترك الأغطية مفتوحة. توضع الأنابيب في فرن تجفيف عند 60 °C لمدة 12–16 h.
      تنبيه: بيروكسيد الهيدروجين مادة مؤكسدة وقد يسبب تهيجاً للجلد والعينين. يجب التعامل معه في خزانة استخلاص الأبخرة مع ارتداء معطف المختبر وقفازات النيتريل ونظارات السلامة. تجنب ملامسته للمواد القابلة للاشتعال.
    6. ترميد الأسنان: تُنقل الأسنان المجففة إلى بوتقات ألومينا وتُرمّد في فرن مفل عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 600 °C لمدة 20 h، باستخدام معدل رفع حراري قدره 150 °C/h.
    7. لا يتم إخراج البوتقات إلا بعد أن يبرد الفرن إلى أقل من 200 °C.
      تنبيه: يصل فرن المفل والبوتقات إلى درجات حرارة قصوى، مما يشكل خطراً شديداً بحدوث حروق. اترك الفرن يبرد إلى أقل من 200 °C قبل التعامل مع البوتقات. عند إخراج البوتقات، ارتدِ معطف المختبر ونظارات السلامة وقفازات مقاومة للحرارة، واستخدم ملاقط طويلة لتجنب التلامس المباشر مع الأسطح الساخنة.
      خطوة حرجة: تأكد من الأكسدة الكاملة؛ حيث سيتداخل الكربون المتبقٍ مع التحاليل اللاحقة.
      ملاحظة: يجب أن تظهر مادة السن المرمّدة بلون رمادي فاتح موحد إلى الأبيض. أعد الترميد إذا ظلت هناك رواسب سوداء.
    8. تخزين عينات الأسنان المرمّدة: فور الانتهاء من الترميد، تُنقل الأسنان إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات قاع مستدير سعة 2 mL.
    9. تُغلق الأنابيب بـ Parafilm وتُحفظ في مجفف فراغي حتى الاستخدام.

3. تحضير أطباق الانتشار الميسرة بواسطة HMDS

  1. الكواشف والمواد
    1. حمض الكبريتيك بتركيز 6 عياري: قبل يومين على الأقل من تحضير أطباق الانتشار، قم بتحضير محلول مخزون من حمض الكبريتيك بتركيز 6 عياري.
      ملاحظة: طبق الانتشار: وعاء محكم الإغلاق مصمم لإنشاء بيئة مغلقة ومنضبطة يمكن من خلالها التقاط المكونات المنبعثة من مادة بيولوجية معالجة بواسطة مصيدة كيميائية مثبتة في الغطاء. ويمنع التصميم المحكم التبادل مع الهواء الخارجي، ويضمن توجيه المواد التحليلية المنبعثة نحو المصيدة لقياسها لاحقاً.
    2. ضع دورقاً بلاستيكياً سعة 1 لتر مع قضيب تحريك مغناطيسي على جهاز خلط مغناطيسي، وأضف 416 مل من الماء فائق النقاء.
    3. باستخدام ماصة سيرولوجية سعة 50 مل، أضف 84 مل من حمض H₂SO₄ بتركيز 36 عياريًا ببطء إلى الماء مع التقليب المستمر. سيصبح المحلول ساخنًا؛ لذا اتركه ليبرد حتى يصل إلى درجة حرارة الغرفة.. تخلص من أي محلول حمض كبريتيك غير مستخدم أو مستنفد باعتباره نفايات كيميائية خطرة ضمن مسار النفايات الكيميائية في المؤسسة.
      تنبيه: حمض الكبريتيك مادة أكالة للغاية. يجب التعامل معه داخل خزانة استخلاص الأدخنة مع ارتداء قفازات مقاومة للأحماض، ومعطف مختبر، ونظارات واقية. وفي حال ملامسته، يُشطف المكان فوراً بكميات وفيرة من الماء.
    4. حمض الكبريتيك بتركيز 6 عياري المشبع بـ HMDS: يُنقل حمض الكبريتيك بتركيز 6 عياري إلى قمع فصل سعة 2 لتر، ويُضاف إليه 15 مل من الهكساميثيل دي سيلوكسان (HMDS).
    5. تأكد من إغلاق السدادة والصنبور بإحكام، وأمسك قمع الفصل بشكل أفقي، ورجّه بقوة حتى تظهر قطيرات صغيرة من HMDS.
    6. افتح السدادة لتحرير غاز التفاعل، وكرر هذه العملية مرتين إضافيتين.
    7. اترك السدادة مفتوحة قليلاً لعدة ساعات. احفظ القمع الفاصل الذي يحتوي على حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS بتركيز 6 عياري في حامل داخل خزانة استرداد الغازات الكيميائية. تخلص من حمض الكبريتيك المحتوي على HMDS والمواد الملوثة كنفايات كيميائية خطرة.
      تنبيه: مادة HMDS قابلة للاشتعال وسامة عند الاستنشاق. يجب التعامل معها داخل خزانة استخراج الأبخرة (fume hood) مع ارتداء معطف المختبر والقفازات ونظارات السلامة. تُحفظ بعيداً عن مصادر الاشتعال.
    8. هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.05 عياري: أذِب 1 جم من حبيبات NaOH في 25 مل من الماء عالي النقاء لتحضير محلول مخزون بتركيز 1 عياري.
    9. امزج 2 مل من محلول NaOH المخزون بتركيز 1 عياري مع 38 مل من الماء عالي النقاوة للحصول على محلول NaOH بتركيز 0.05 عياري.
    10. وزّع محلول هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بتركيز 0.05 عياري إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل لاستخدام مرة واحدة، وأحكم إغلاق الأغطية باستخدام Parafilm، ثم احفظ الأنابيب في مجفف تفريغ لتقليل امتصاص ثاني أكسيد الكربون (CO₂). تخلص من محلول هيدروكسيد الصوديوم غير المستخدم أو المستنفد كنفايات كيميائية خطرة.
      تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم مادة كاوية للغاية ويمكن أن تسبب حروقاً شديدة. يجب ارتداء معطف المختبر، والقفازات، ونظارات السلامة. تعامل مع المحاليل بحذر لتجنب الرذاذ.
    11. حمض الخليك بتركيز 0.2 عياري: أضف 575 µL يُضاف حمض الخليك الثلجي إلى الماء فائق النقاء، ثم يُضبط الحجم النهائي ليصل إلى 50 مل لتحضير حمض الخليك بتركيز 0.2 عياري. تخلص من محاليل حمض الخليك كنفايات كيميائية خطرة.
      تنبيه: حمض الأسيتيك مادة مآكلة وقد يسبب تهيج الجلد والعينين والجهاز التنفسي. يجب التعامل معه داخل خزانة استخلاص كيميائية مع ارتداء معطف المختبر والقفازات ونظارات السلامة.
    12. الفازلين: يُصهر حوالي 100 جم من الفازلين عند 60 °C في فرن. اسحب الفازلين السائل في محاقن سعة 10 مل واتركه ليبرد ويتصلب. يمكن تخزين المحاقن المملوءة بالفازلين في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع.
    13. أطباق بتري: استخدم أطباق بتري غير معالجة بمقاس 60 × 15 ملم لتحضير أطباق الانتشار.
    14. اصنع ثقباً صغيراً في غطاء طبق بتري باستخدام إبرة حقنة قياس 18-G مسخنة.
    15. قم بطلاء الحافة الداخلية للغطاء بطبقة مستمرة من سدادة الفازلين (petrolatum) باستخدام سرنجة سعة 10 مل مزودة بإبرة غير مدببة قياس 14 G. تخلص من جميع الإبر المستخدمة في حاوية نفايات الأدوات الحادة المعتمدة في المؤسسة.
      تنبيه: إبر المحاقن حادة وقد تسبب إصابات وخزية. تعامل معها بحذر وتخلص منها في حاويات الأدوات الحادة المعتمدة. عند تسخين الإبر، ارتدِ قفازات مقاومة للحرارة وواقيًا للعينين لمنع الحروق.
    16. محاليل NaF المخزنة لمعايرة أطباق الانتشار. أذب 4.19 جم من NaF في 1 لتر من الماء فائق النقاء لتحضير محلول مخزن بتركيز 100 ميليمولار. حضّر تركيز 10 ميليمولار، 100 µMو، 10 µM المحاليل المخزنة عن طريق تخفيفات متسلسلة بنسبة 1:10 للمحلول ذو التركيز 100 ميلي مولار.
      ملاحظة: يوفر مول واحد من NaF مقدار 19 جم من F⁻؛ وبناءً على ذلك، 1 µL من 10 µM يحتوي NaF على 0.19 نانوغرام من F⁻ و 1 µL يحتوي كل 1 مل من محلول NaF بتركيز 10 ملي مولار على 190 نانوغرام من F⁻.
      ملاحظة: أطباق الانتشار الخاصة بالمعايرة: أطباق انتشار تُستخدم خصيصاً للمعايرة بكتلة معروفة من أيونات الفلوريد (F¯).
  2. تحضيرات أطباق الانتشار الخاصة بكل عينة
    1. طبق انتشار المصل: يتم نقل 3 مل من الماء فائق النقاء بواسطة الماصة إلى قاع طبق بتري ثم يُضاف 75 µL مصل. تخلص من أي مواد ملوثة بالمصل في مجرى النفايات البيولوجية الخاصة بالمؤسسة. انتقل إلى الخطوة 3.4.
    2. طبق انتشار العظام
      1. سحق رماد العظام: استخدم ملعقة دقيقة (micro spatula) لسحق العظام المرمّدة داخل أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل حتى تتحول إلى مسحوق ناعم. ابدأ في معالجة رماد العظام المسحوق على الفور. تخلص من المستهلكات الملوثة برماد العظام في مجرى النفايات الكيميائية المؤسسي.
      2. وزن وترطيب رماد العظام
        1. ضع الجزء السفلي الفارغ من طبق بتري على كفة ميزان تحليلي بدقة قراءة لا تقل عن 0.1 مجم.
        2. انقل رماد العظام المطحون من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل إلى طبق بورسلين صغير لتقليل الشحنة الساكنة ومنع تشتت المسحوق.
        3. باستخدام ملعقة دقيقة (micro spatula)، أضف حوالي 5 ملجم من رماد العظام إلى الطبق، وقم بتغطية المسحوق فوراً بـ 3 مل من الماء عالي النقاء قبل رفع الطبق من الميزان التحليلي لتجنب تشتت الرماد.
        4. سجل الوزن الدقيق لكل عينة من رماد العظام. انتقل إلى الخطوة 3.4.
    3. طبق انتشار الأسنان
      1. طحن الأسنان المرمدة
        1. انقل القواطع التي تم تحويلها إلى رماد إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات قاع مستدير سعة 2 مل، وأضف خرزة من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 5 مم إلى كل أنبوب. أغلق الأنابيب وثبّت الأغطية باستخدام Parafilm.
        2. اطحن القواطع التي تم ترميدها باستخدام جهاز طحن بالخرز (bead beater) بسرعة 2,500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوانٍ. باشر بمعالجة الأسنان المطحونة على الفور.
      2. وزن وترطيب الأسنان المرمّدة
        1. صُبَّ كامل محتويات الأنبوب، بما في ذلك الخرزة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ، في قاع طبق الانتشار الموضوع على كفة ميزان تحليلي. تخلص من المستهلكات الملوثة التي تحتوي على رماد الأسنان في مجرى النفايات الكيميائية الخاص بالمؤسسة.
        2. أخرج الخرزة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ من الطبق، وسجّل الوزن الدقيق لرماد السن (عادةً ما يتراوح بين 3 إلى 4 ملجم لكل قاطع سفلي).
        3. أضف على الفور 3 مل من الماء عالي النقاء لتغطية رماد السن قبل إزالة الطبق من الميزان لمنع تشتت الرماد الناتج عن التفريغ الساكن. تابع الخطوة 3.4.
  3. معايرة وضبط جودة أطباق الانتشار
    1. بالتوازي مع أطباق انتشار العينات، قم بتحضير مجموعتين من أطباق انتشار المعايرة لإجراء معايرة من 5-6 نقاط، ومجموعة واحدة مطابقة من أطباق انتشار ضبط الجودة، بما في ذلك عينة فارغة.
      ملاحظة: أطباق الانتشار الخاصة بضبط الجودة: يتم تحضيرها بنفس طريقة تحضير أطباق انتشار المعايرة، ولكن تُستخدم بشكل دوري للتحقق من استقرار القطب الكهربائي وضمان اتساق أداء القياس.
    2. انقل بواسطة الماصة 3 مل من الماء فائق النقاء إلى كل من 11 أو 13 طبق بتري، وأضف محلول NaF المركز لتغطية نطاق كتلة F¯ المتوقع في عينات العينات. استمر في الخطوة 3.4 لإكمال تجميع طبق الانتشار.37.
  4. إتمام تجميع طبق الانتشار
    1. لبناء ترسب مصيدة الفلوريد، 50 µl تُضاف ثلاث قطرات من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بتركيز 0.05 عياري على السطح الداخلي لغطاء طبق بتري، بعيداً عن حافة الغطاء.
      ملاحظة: مصيدة الفلوريد (F¯ Trap): أحد مكونات أطباق الانتشار التي تعمل على احتجاز أيونات الفلوريد (F¯)، وتحديداً هيدروكسيد الصوديوم (NaOH).
    2. اقلب الغطاء دون تعريض قطرات NaOH للاضطراب، وأحكم غلقه على الجزء السفلي من الطبق باستخدام البترولاتوم.
    3. لتحضير محلول حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS بتركيز 3 عياري، اخلط أحجاماً متساوية من حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS بتركيز 6 عياري ومياه فائقة النقاء. يُحضّر المحلول حديثاً قبل الاستخدام مباشرةً، حيث لا يمكن تخزينه.
    4. احقن 3 مل من حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS بتركيز 3 عياري (3 N) المُحضّر عبر الفتحة الموجودة في الغطاء إلى الماء الموجود في قاع طبق الانتشار، وذلك باستخدام محقنة سعة 10 مل مزودة بإبرة مقاس 20 G. توخَّ الحذر لتجنب تطاير الحمض على السطح الداخلي للغطاء عند إدخال إبرة المحقنة أو سحبها.
    5. انتشار الفلوريد بمساعدة HMDS: قم بسد ثقب الحقن فوراً بقطرة من الفازلين تغطي الفتحة بالكامل، وضع أطباق الانتشار على هزاز متغير السرعة مضبوط على سرعة بطيئة. تُحضن العينات طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1).

مخطط لطبق بتري؛ مصيدة الفلوريد (F-Trap)، ختم بترولاتوم، رماد العظام، وعملية حمض الكبريتيك المشبع بـ HDMS.
الشكل 1: مخطط لطبق انتشار العظام لاستخلاص وحجز الفلوريد. يوضح الشكل 1 تصميم طبق انتشار العظام الذي تم تجميعه في طبق بتري غير معالج بمقاس 60 × 15 mm. يحتوي الغطاء على ثقب حقن صغير محكم الإغلاق بخرزة من البترولاتوم. وعلى السطح الداخلي للغطاء، توضع ثلاث قطرات من NaOH كمصائد لأيون الفلوريد (F⁻)، بحيث تكون معلقة من الغطاء أثناء عملية الانتشار. يتم إغلاق الغطاء بإحكام لمنع تسرب الهواء إلى قاعدة الطبق باستخدام البترولاتوم. ويحتوي قاع طبق بتري على ماء فائق النقاء، وحمض كبريتيك مشبع بـ hexamethyldisiloxane (HMDS)، ورماد العظام، والتي تشكل معاً بيئة التفاعل لتحرير الفلوريد وحجزه لاحقاً. تم إنشاء هذا الشكل من قبل المؤلفين باستخدام Biorender، والشكل مرخص بموجب رخصة CC BY. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. قياس الفلوريد باستخدام القطب الانتقائي للأيونات (ISE)

  1. إعداد القطب الانتقائي للأيونات (ISE)
    1. املأ القطب الانتقائي للفلوريد ثنائي القناة بمحلول الملء المناسب، وقم بتوصيله بجهاز مقياس الجهد، وثبّت القطب في حامل الأقطاب.
    2. ضع طبق بتري غير معالج على رافعة مقصية تحت سطح الاستشعار الخاص بالقطب، مع التأكد من أن سطح الاستشعار موازٍ لقاع طبق بتري، ثم ارفع طاولة الرافعة المقصية بحيث يكون طبق بتري ملامساً تقريباً للقطب (الشكل 2).
  2. تحضير العينات للقياس
    ملاحظة: العينات: يُشار في هذا البروتوكول باسم "العينات" فقط إلى المنتجات النهائية التي يتم قياسها باستخدام القطب الانتقائي للأيونات (ISE)، والتي تتكون من مصيدة F¯ بعد عملية الانتشار، والتي دُمجت لاحقاً مع حمض الأسيتيك والماء.
    1. لضبط الرقم الهيدروجيني (pH) للعينة إلى 5، أخرج طبق الانتشار من الهزاز وارفع الغطاء بعناية عن طريق كسر ختم الفازلين بعد فترة الحضانة. اقلب الغطاء على سطح مستوٍ، مع التأكد من عدم تحريك قطرات مصيدة F¯ الثلاث.
    2. أضف 15–20 µL من حمض الأسيتيك بتركيز 0.2 N إلى قطرة واحدة باستخدام ماصة P20، ثم ادمج القطرات الثلاث جميعاً في قطرة واحدة دون تغيير طرف الماصة.
      ملاحظة: تميل العينات ذات تركيزات F¯ العالية إلى أن يكون لها رقم هيدروجيني (pH) ابتدائي أقل، وبالتالي تتطلب كمية أقل من حمض الأسيتيك 0.2 N لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5 مقارنة بالعينات التي تحتوي على كمية أقل من F¯. ونظراً لأن حجم العينة المتبقي بعد تسجيل جهد القطب (الخطوة 5.3) يكون ضئيلاً، استخدم أي كمية متبقية من العينة للتحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام ورق كاشف.
    3. لضبط حجم العينة، اضبط ماصة P100 على 75 µL، واسحب الحجم الكامل لمصيدة F¯ دون إدخال هواء، واضبط العينة لتصبح 75 µL بالضبط باستخدام ماء فائق النقاء.
    4. قم بتنفيذ هذه الخطوة بعناية لضمان دقة الحجم اللازم لحسابات تركيز الفلوريد. احتفظ بالعينة في طرف الماصة وانتقل فوراً إلى الخطوة 4.3.
  3. قياس العينات، وعينات المعايرة، وعينات ضبط الجودة
    1. لقياس جهد القطب للعينة، قم بتوزيعها بين سطح الاستشعار للقطب الانتقائي للفلوريد وطبق بتري. تأكد من أن كامل سطح الاستشعار للقطب مغمور تماماً في السائل، دون ملامسة طبق بتري مباشرة. انتظر حتى يستقر جهاز مقياس الجهد وسجل الجهد (mV) الذي يظهره الـ ISE.
    2. حدد منحنى المعايرة القياسي عن طريق قياس المجموعة الأولى من معايير المعايرة بالتتابع، بدءاً من أدنى تركيز لـ F¯ وصولاً إلى التركيز الأعلى.
      1. ارسم جهد القطب (mV) مقابل لوغاريتم F¯ (ng) لإنشاء منحنى المعايرة (الشكل 3). طبق الانحدار الأسي للحصول على معادلة المنحنى القياسي ومعامل التحديد (R2). تقبل منحنيات المعايرة فقط عندما تكون قيمة R2 ≥ 0.99.
    3. قس كل عينة من العينات وسجل جهد القطب (mV).
    4. لمراقبة استقرار القطب والكشف عن أي انحراف محتمل في المقايسة، قس عينات ضبط الجودة على فترات متقطعة طوال كل تشغيلة تحليلية.
      1. قارن قيم عينة ضبط الجودة مباشرة مع عينات المعايرة المقابلة وتأكد من التطابق في حدود 5% تقريباً للتحقق من استقرار أداء القطب بمرور الوقت.
      2. قس دورياً طبق انتشار فارغاً (Blank) للتأكد من عدم وجود تلوث بالفلوريد أثناء التعامل مع العينات والانتشار.
  4. لحساب كتلة F¯ (ng) في كل عينة، استخدم معادلة المنحنى القياسي. ثم اقسم هذه الكتلة على الحجم (µL) للمصل، أو الكتلة (mg) لرماد العظم أو السن المضاف إلى طبق الانتشار.
    1. مثال لحساب تركيز F¯ في رماد العظم (ng/mg)
      1. كتلة رماد العظم المضافة إلى طبق الانتشار: 5.1 mg؛ جهد القطب لعينة حجمها 75 µL: –31.6 mV
      2. الخطوة 1: حساب كتلة الفلوريد باستخدام معادلة المعايرة
        1. F⁻ mass (ng) = 3505.4 x e(-0.043x-31.6)
        2. F⁻ mass (ng) = 13,641 ng
      3. الخطوة 2: حساب تركيز الفلوريد في رماد العظم
        1. F⁻ concentration =  13,641 ng  /  5.1  mg
        2. F⁻ concentration =  2,675 ng / mg (ppm)

مخطط التحليل الجهدِي: القطب الانتقائي للأيونات مع مقياس الجهد يقيس العينة على رافعة مقصية للكشف عن الأيونات.
الشكل 2: مخطط لإعداد قياس ISE. يوضح الشكل 2 التكوين المستخدم لقياسات أيونات الفلورايد باستخدام قطب انتقائي للأيونات (ISE) ثنائي القناة. يوضع طبق بتري على رافعة مقصية للسماح بضبط دقيق لارتفاعه بالنسبة للقطب. يتصل الـ ISE بمقياس جهد ويوجه بحيث يكون سطح الاستشعار موازياً لمستوى طبق بتري، مع الحفاظ على مسافة تبلغ حوالي 1–2 mm. بعد تحديد المسافة، يتم سحب حجم صغير من العينة (75 µL) بالماصة ووضعه في الفجوة بين سطح الاستشعار وطبق بتري، مما يضمن تغطية العينة لمنطقة استشعار القطب بالكامل أثناء القياس. تم إنشاء هذا الشكل من قبل المؤلفين باستخدام Biorender، والشكل مرخص بموجب رخصة CC BY. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

رسم بياني لمعايرة أيونات الفلوريد؛ انحدار خطي؛ جهد القطب مقابل التركيز بـ mV/نانوجرام.
الشكل 3: منحنى المعايرة وجدول المعايرة المقابل لتقدير كمية كتلة أيون الفلوريد في عينات من أنسجة الأسنان. اللوحة العلوية: مثال لمنحنى معايرة مستخدم لتحديد كتلة أيون الفلوريد في عينات من أنسجة الأسنان. يوضح المحور السيني جهد القطب (mV، مقياس خطي)، ويوضح المحور الصادي كتلة أيون الفلوريد المقابلة (ng F⁻، مقياس لوغاريتمي). تُمثل نقاط المعايرة المقاسة بخط متصل، ويظهر الانحدار الأسي المجهز بخط منقط. يعرض مربع مدرج معادلة المنحنى القياسي ومعامل التحديد (R2 = 0.99). اللوحة السفلية: جدول يحتوي على القيم العددية المستخدمة لإنشاء منحنى المعايرة. يسرد الصف الأول جهود القطب الخمسة (mV) المسجلة لعينات المعايرة. ويوفر الصف الثاني كتل أيون الفلوريد المقابلة (ng F⁻) لكل عينة معايرة. ويسرد الصف الثالث الأحجام (µL) من محلول NaF المخزون بتركيز 10 mM المضافة إلى أطباق انتشار المعايرة؛ وتكافئ كتلة أيونات الفلوريد المضافة هذه الكتلة المحتجزة في كل عينة معايرة بعد الانتشار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

لإثبات تطبيق هذا البروتوكول في قياس تركيزات الفلوريد (F-) في المواد البيولوجية، تم إعداد عينات من مصل الدم، والعظام، والقواطع الفكية التي جُمعت من فئران تعرضت لمعالجات فلوريد محكومة. تم تقسيم ذكور الفئران من سلالة C57BL/6J إلى فئتين عمريتين، المراهقة (6 أسابيع) والناضجة (18 أسبوعًا)، ووُفر لها إما ماء منزوع الأيونات خالٍ من الفلوريد (0 ppm F⁻) أو ماء شرب مضاف إليه فلوريد الصوديوم (125 ppm F⁻) لمدة تعرض بلغت 6 أسابيع. شملت كل حالة عمرية وعلاجية خمسة حيوانات. وفي نهاية فترة التعرض، تم جمع مصل الدم وعظام الفخذ والقواطع الفكية، ثم جُهزت عينات المواد وحُللت وفقًا للبروتوكول. وفيما يلي ملخص لتركيزات الفلوريد التمثيلية المقاسة في مصل الدم والعظام والأسنان.

مخطط شريطي لتركيز الفلوريد؛ المصل، وعظم الفخذ، والقاطع؛ تحليل مقارن بين المراهقين والبالغين.
الشكل 4تركيزات الفلورايد المقاسة في المصل، وعظم الفخذ، والقواطع الفكية السفلية. تم تقسيم ذكور فئران من سلالة C57BL/6J إلى فئتين عمريتين، فئة المراهقين (6 أسابيع، عمود مفتوح) وفئة البالغين (18 أسبوعاً، عمود ممتلئ)، وتم تزويدهم إما بمياه منزوعة الأيونات خالية من الفلوريد (0 جزء في المليون من F⁻) أو مياه شرب مدعمة بفلوريد الصوديوم (125 جزء في المليون من F⁻) لمدة تعرض بلغت 6 أسابيع. وفي نهاية فترة التعرض، تم قياس مستويات الفلوريد في (أ) المصل، و(ب) عظم الفخذ، و(ج) القواطع الفكية السفلية من مجموعات العلاج نفسها. أما قيم المصل التي كانت أقل من حد الكشف (<(0.02 جزء في المليون) لغرض التصور المرئي، ولكن استُبعدت من التحليل الإحصائي. عُبر عن البيانات كمتوسطات ± الانحراف المعياري. أُجريت المقارنات بين مجموعات المراهقين والمجموعات البالغة باستخدام اختبار مان-ويتني (Mann–Whitney U test) مع تطبيق تصحيح بونفيروني-دن (Bonferroni–Dunn correction) للمقارنات المتعددة. *p < 0.05, **p < 0.01 (العدد = 5/مجموعة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تركيزات الفلوريد في المصل
في كل من مجموعتي المراهقين والبالغين اللتين عولجتا بـ 0 ppm من الفلوريد، كانت تركيزات الفلوريد في المصل أقل من حد الكشف للقطب الكهربائي الانتقائي للأيونات (<0.02 ppm). وفي مجموعات العلاج بـ 125 ppm، ارتفع الفلوريد في المصل إلى 0.3 ± 0.2 ppm في مجموعة المراهقين وإلى 0.7 ± 0.2 ppm في مجموعة البالغين (p = 0.06). وأُجريت المقارنة بين مجموعة المراهقين ومجموعة البالغين المعالجتين بـ 125 ppm باستخدام اختبار Mann–Whitney U مع تصحيح Bonferroni–Dunn للمقارنات المتعددة. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). وقد استُبعدت مجموعات العلاج بـ 0 ppm من التحليل الإحصائي. (الشكل 4A، الجدول 1).

تركيزات الفلوريد في عظم الفخذ
في مجموعات العلاج بـ 0 جزء في المليون، كانت تركيزات الفلوريد في عظم الفخذ أقل بشكل ملحوظ لدى المراهقين (292 ± 39 جزء في المليون) مقارنة بالحيوانات البالغة (896 ± 55 جزء في المليون) (p < 0.01). وفي المقابل، كانت تركيزات الفلورايد في مجموعات 125 جزء في المليون لدى المراهقين (4,108 ± 482 جزء في المليون) أعلى بكثير منها لدى الحيوانات البالغة (2,966 ± 612 جزء في المليون) (p = 0.04). أُجريت المقارنات بين المجموعتين المراهقة والبالغة باستخدام اختبار مان-ويتني يو (Mann–Whitney U test) مع تطبيق تصحيح بونفروني-دن (Bonferroni–Dunn correction) للمقارنات المتعددة. *p < 0.05, **p < 0.01 (العدد = 5/مجموعة). (الشكل 4B, جدول 1). الشكل 5-أ يوضح التغير النسبي (fold-change) في مستويات الفلوريد في عظم الفخذ بين مجموعتي المعالجة بـ 0 جزء في المليون و125 جزء في المليون لكل مجموعة عمرية. أظهر المراهقون زيادة بمقدار 14 ضعفاً في مستويات الفلوريد عند 125 جزء في المليون، بينما أظهرت الفئران البالغة زيادة بمقدار 3 أضعاف.

تركيزات الفلوريد في القواطع السفلية
في مجموعات 0 ppm، كانت تركيزات الفلوريد في القواطع السفلية أقل بكثير لدى المراهقين (35 ± 4 ppm) مقارنة بالحيوانات البالغة (123 ± 23 ppm) (p = 0.03). وفي مجموعات العلاج بـ 125 ppm، ارتفعت تركيزات الفلوريد في القواطع إلى 5641 ± 955 ppm لدى المراهقين و4392 ± 1694 ppm لدى الحيوانات البالغة. أُجريت المقارنات بين مجموعات المراهقين والبالغين باستخدام اختبار Mann–Whitney U مع تصحيح Bonferroni–Dunn للمقارنات المتعددة. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). (الشكل 4C، الجدول 1). وعلى الرغم من أن تركيزات الفلوريد المطلقة عند 125 ppm لم تختلف بشكل ملحوظ بين الفئات العمرية، إلا أن التغير المضاعف من 0 ppm إلى 125 ppm كان أكبر بكثير لدى الفئران المراهقة (زيادة بمقدار 161 ضعفاً) مقارنة بالفئران البالغة (زيادة بمقدار 36 ضعفاً) (الشكل 5B).

رسم بياني شريطي يوضح تأثير الفلورايد على التغير في التضاعف في أنسجة عظم الفخذ والقاطع، بين المراهقين والبالغين.
الشكل 5: يُظهر المراهقون زيادة في التضاعف في تراكم الفلورايد في العظام والقواطع بشكل أكبر من الفئران البالغة. التغير في التضاعف في تركيزات الفلورايد من معاملة بـ 0 ppm إلى 125 ppm من الفلورايد في الفئران المراهقة (الشريط المفتوح) والبالغة (الشريط الممتلئ). (A) عظم الفخذ و(B) القاطع الفكي السفلي من مجموعات المعاملة نفسها. يتم التعبير عن البيانات كمتوسطات ± SD. أُجريت المقارنات بين مجموعات المراهقين والبالغين باستخدام اختبار t غير المزدوج. * p < 0.05، (N = 5/group). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

العينةالمصلعظم الفخذالقاطع السفلي
الفئة العمريةيافعبالغيافعبالغيافعبالغ
مجموعة العلاج0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192N/A72711114909
المتوسط< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
الانحراف المعياريNA0.2NA0.239482556123955231694

الجدول 1: قياسات الفلوريد الفردية في المصل، وعظم الفخذ، والقواطع الفكية. يدرج الجدول 1 تركيزات الفلوريد الفردية (ppm F⁻) التي تم قياسها في عينات المصل، وعظم الفخذ، والقواطع الفكية من الفئران المراهقة والبالغة التي تعرضت إما لـ 0 ppm أو 125 ppm من الفلوريد. وبالنسبة لكل نوع من الأنسجة، تُعرض البيانات في أعمدة مقابلة لمجموعات العلاج الأربع: المراهقة 0 ppm، والمراهقة 125 ppm، والبالغة 0 ppm، والبالغة 125 ppm. يتضمن كل عمود القيم الفردية الخمس المسجلة (N = 5)، تليها المتوسط الحسابي والانحراف المعياري (SD) المحسوبين. وفي مجموعة المصل للفئران المراهقة بتركيز 0 ppm، كانت جميع القيم المسجلة أقل من حد الكشف للقطب الكهربائي الانتقائي للأيونات (<0.02 ppm). يوفر الجدول البيانات العددية الخام التي تستند إليها قيم الملخص والمقارنات الإحصائية الموضحة في الشكل 4.

المناقشة

تم الحصول على قياسات الفلوريد باستخدام قطب انتقائي للأيونات (ISE) متخصص في الفلوريد يشتمل على غشاء بلوري من فلوريد اللانثانوم (LaF₃)38,39. يشكل هذا الغشاء روابط La–F مستقرة للغاية، مما يؤدي إلى تفضيل قوي لأيونات الفلوريد على الهاليدات الأخرى. ووفقاً للأدبيات الكهروكيميائية المعتمدة ومواصفات الشركة المصنعة، يظهر غشاء LaF₃ معاملات انتقائية منخفضة جداً للكلوريد، مما يشير إلى أن أيونات الكلوريد لا تسبب تداخلاً قابلاً للقياس في ظل الظروف المستخدمة في هذا البروتوكول. وعلى الرغم من وجود الكلوريد بشكل طبيعي في الأسنان والعظام، إلا أن نشاطه لا يؤثر على جهد القطب، وتكون الإشارة المسجلة انعكاساً لنشاط الفلوريد تحديداً. يتوافق حد الكشف الأدنى البالغ 0.02 ppm مع أدنى تركيز قابل للقياس الكمي والمثبت من قبل الشركة المصنعة لقطب Orion الانتقائي للفلوريد. ويعكس هذا الحد أدنى تركيز للفلوريد يحافظ عنده القطب على استجابة نيرنستية مستقرة وعلاقة خطية مع منحنى المعايرة. وبما أن حد الكشف محدد بخصائص غشاء القطب ومثبت من قبل الشركة المصنعة، لم تكن هناك حاجة إلى تحديد تجريبي إضافي لهذا البروتوكول؛ ومع ذلك، وفيما يتعلق بنطاق الكشف العلوي، لاحظ المؤلفون أن كتل الفلوريد التي تتجاوز 38,000 ng تقريباً في مصيدة NaOH بحجم 50 µL أدت إلى استجابة غير خطية للقطب، مما يشير إلى أن منحنى المعايرة لم يعد موثوقاً عند أحمال الفلوريد العالية جداً. ومن المرجح أن تعود هذه اللاخطية إلى تجاوز القوة الأيونية المثلى ونطاق النشاط للقطب في ظل الظروف التجريبية المحددة، بدلاً من أن تعكس حداً علوياً متأصلاً في الـ ISE نفسه. وبالنسبة للعينات المتوقع أن تحتوي على كتل من الفلوريد فوق هذه العتبة، يُنصح بزيادة حجم مصيدة NaOH للحفاظ على القياسات ضمن النطاق الديناميكي الخطي للقطب.

يجب مراعاة هذا الاعتبار عند تطبيق البروتوكول على العينات التي تحتوي على محتوى فلوريد مرتفع بشكل غير عادي. ونظراً لأن خطوة الانتشار تستهلك كامل حجم العينة، تعذر إجراء قياسات مكررة وتجارب الاسترداد بعد الإضافة (spike‑and‑recovery) على العينات البيولوجية. ولضمان الدقة التحليلية والضبط، تم إدراج معايير ضبط الجودة (QC) التي تحتوي على تركيزات معروفة من الفلوريد في كل سلسلة قياس. وقد تمت معالجة معايير ضبط الجودة هذه وقياسها بنفس طريقة العينات التجريبية. وفي جميع عمليات التشغيل، كانت تركيزات الفلوريد المقاسة لمعايير ضبط الجودة ضمن نطاق 5% باستمرار من قيمها المتوقعة. لكل سلسلة مكونة من 10–20 عينة من العينات المدروسة، تم تحضير مجموعتين مستقلتين من 5–6 عينات معايرة بالتوازي مع العينات المدروسة، وتم تسجيل منحنى معايرة قبل كل جلسة قياس. وتم ضبط نطاق المعايرة لكل عملية تشغيل لتقريب كتل الفلوريد المتوقعة في العينات المدروسة، والتي اعتمدت على نوع العينة، وكتلة المادة المضافة إلى طبق الانتشار، ومجموعة العلاج وعمر الحيوان. بالنسبة لقياسات المصل، كانت معايير المعايرة تقابل تركيزات فلوريد تبلغ حوالي 0.06–1.20 ppm في العينة. أما بالنسبة لقياسات العظام والأسنان، فقد كانت معايير المعايرة تقابل تركيزات فلوريد تبلغ حوالي 19–7,600 ppm في العينة.

يوفر هذا البروتوكول نهجاً حساساً وقابلاً للتكرار لتقدير كمية أيونات الفلوريد في المصل والعظام والأسنان باستخدام الانتشار المُيسّر بواسطة hexamethyldisiloxane متبوعاً بالتحليل باستخدام القطب الانتقائي للأيونات (ISE). وتعمل هذه الطريقة على التقاط الفلوريد المنطلق من مصفوفات بيولوجية متنوعة بشكل موثوق، وتسمح بالتقييم الكمي لتراكم الفلوريد بعد التعرض الخاضع للرقابة. وتظهر النتائج التمثيلية للفئران المراهقة والبالغة فروقاً واضحة تعتمد على العمر والجرعة في ترسب الفلوريد عبر الأنسجة، مما يؤكد فائدة هذا النهج لدراسة استقلاب الفلوريد والحركية السمية in vivo.

تكمن إحدى نقاط القوة الرئيسية في هذا البروتوكول في استخدام أطباق الانتشار التي تفصل مادياً بين تفاعل إطلاق الفلوريد والبيئة التي يتم فيها احتجاز الفلوريد. ويقلل التصميم المختوم بالفازلين (petrolatum) من التبادل الجوي ويضمن الالتقاط الفعال لأيونات الفلوريد المتحررة بواسطة قطرات هيدروكسيد الصوديوم الموجودة على الغطاء. ويوفر حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS قوة دفع قوية ومتسقة لإطلاق الفلوريد من الأنسجة المعدنية، بما في ذلك الهياكل عالية التكلس مثل العظام والأسنان. يتيح قياس ISE اللاحق، والمعاير بمعايير مطابقة للانتشار، تحديداً كمياً دقيقاً عبر نطاق ديناميكي واسع. وميزة أخرى لهذا النهج هي قدرته على تحديد كمية الفلوريد في العينات البيولوجية الصغيرة للغاية؛ حيث تنتج الأنسجة المعدنية من الفئران، وخاصة القواطع السفلية، ما يتراوح بين 3–5 mg فقط من الرماد لكل سن. وغالباً ما تتطلب الطرق التحليلية التقليدية كتل عينات أكبر أو محتوى فلوريد أعلى لتحقيق كشف موثوق. وفي المقابل، يعمل التصميم القائم على الانتشار على تركيز كل الفلوريد المتحرر من العينة بأكملها في حجم صغير ومحدد، مما يسمح بتحديد كمي دقيق حتى في العينات الضئيلة ذات الكتلة المطلقة المنخفضة من الفلوريد. وتعد هذه الميزة قيمة بشكل خاص للدراسات التي تشمل حيوانات صغيرة، أو توفر محدود للأنسجة، أو هياكل معدنية مستأصلة مجهرياً.

تتمثل إحدى القيود الأساسية لهذه الطريقة في حد الكشف الخاص بالقطب الانتقائي للأيونات (ISE) المستخدم في هذه الدراسة (0.02 ppm). فغالباً ما كانت عينات المصل المأخوذة من حيوانات التحكم الخالية من الفلوريد تقل عن هذا الحد، مما حال دون قياس التركيزات المنخفضة للغاية من الفلوريد. قد يتطلب الأمر زيادة كتلة أو حجم العينة المضافة إلى طبق الانتشار، في حال توفرها، أو استخدام تقنيات تحليلية بديلة عند قياس التركيزات الزهيدة القريبة من حد الكشف أو التي تقل عنه. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب هذه الطريقة عملية انتشار تستمر طوال الليل وتعاملاً دقيقاً مع الكواشف المسببة للتآكل، مما قد يحد من الإنتاجية في الدراسات ذات الأحجام الكبيرة. ورغم أن تقنية ISE توفر قياساً كمياً حساساً للفلوريد الكلي، إلا أنها لا تستطيع تقييم التوزيع المكاني داخل الأنسجة. لذا، يمكن دمج مناهج تكميلية، مثل المجهر الإلكتروني الماسح المقترن بمطيافية الأشعة السينية المشتتة للطاقة (SEM-EDX) أو انبعاث أشعة غاما المستحث بالجسيمات (PIGE)، لتصور ورسم خرائط توزيع الفلوريد على المقياسين المجهري والعياني. وتسمح هذه الأنماط القائمة على التصوير بتقييم تراكم الفلوريد الموضعي في الأنسجة المعدنية أو الرخوة، وبذلك تكمل قياسات ISE وتوفر تقييماً أكثر شمولاً لمحتوى الفلوريد في الأنسجة.

يمكن لعدة عوامل تقنية متكررة أن تؤثر على دقة وموثوقية انتشار الفلوريد وقياسه في هذا البروتوكول، وتبرز ملاحظاتنا كيف يساهم تحضير المعايرة، وإحكام إغلاق طبق الانتشار، والتحكم في pH، وأداء القطب الكهربائي، والتعامل مع العينات مجتمعة في تحديد جودة البيانات. تشمل الأسباب المحتملة لمنحنى معايرة غير خطي (R2 < 0.99) أو قراءات عينات الأنسجة خارج النطاق المتوقع، أخطاء في حساب حجم محلول NaF المخزون المضاف إلى طبق الانتشار أو أخطاء في الماصة أثناء تحضير معايير المعايرة. الإجراء الموصى به: تحضير مجموعتين مستقلتين على الأقل من عينات المعايرة لكل تشغيلة بحيث تتوفر مجموعة احتياطية في حال وقع منحنى معايرة واحد خارج النطاق المتوقع. قد يتسبب عدم إحكام إغلاق طبق الانتشار أيضاً في فقدان الفلوريد أثناء الانتشار، مما يؤدي إلى قراءات منخفضة بشكل زائف. يحدث هذا عادةً عند وضع كمية غير كافية من الفازلين على حافة غطاء طبق الانتشار. الإجراء الموصى به: وضع كمية وفيرة من هلام الفازلين حول حافة غطاء طبق الانتشار والضغط بقوة لضمان الإغلاق التام. يمكن أن تؤدي أخطاء الماصة عند إضافة محلول حمض الخليك إلى مصيدة NaOH إلى إزاحة pH العينة خارج النطاق الأمثل pH 5.0، مما يؤدي إلى استرداد غير دقيق للفلوريد. الإجراء الموصى به: فحص pH كل عينة باستخدام ورق pH والتخلص من أي عينة تقع خارج pH 5. قد تقع عينات المعايرة أيضاً خارج حدود التسجيل الصالحة للقطب الكهربائي الانتقائي للفلوريد؛ حيث تعتبر التركيزات الأقل من 0.02 ppm أدنى من حد كشف القطب الكهربائي. الإجراء الموصى به: عدم استخدام عينات معايرة تحتوي على أقل من 0.02 ppm من الفلوريد. وعلى العكس من ذلك، يمكن لعينات المعايرة ذات تركيزات الفلوريد العالية جداً أن تغير القوة الأيونية للمحلول وتنتج استجابات غير خطية للقطب الكهربائي. الإجراء الموصى به: في بداية المشروع، يتم تحضير محاليل معايرة تغطي نطاقاً واسعاً من تركيزات الفلوريد لتحديد نطاق العمل الخطي للقطب الكهربائي المحدد المستخدم. إذا تجاوزت عينات الأنسجة هذا النطاق الخطي، يتم تقليل كتلة الأنسجة أو زيادة حجم مصيدة NaOH وتعديل حجم حمض الخليك وفقاً لذلك للحفاظ على pH 5. في حال صعوبة الحصول على منحنيات معايرة خطية في نطاق 0.02–1 ppm: يكون السبب الشائع هو تقادم القطب الكهربائي، حيث تفقد الأقطاب الكهربائية الانتقائية للفلوريد القديمة حساسيتها عند تركيزات الفلوريد المنخفضة جداً. الإجراء الموصى به: استبدال القطب الكهربائي الانتقائي للفلوريد. تحدث قراءات مقياس الجهد غير المستقرة (انجراف أو قفز الإشارة) عادةً عندما لا يكون سطح الاستشعار في القطب الكهربائي مغموراً بالكامل في محلول العينة. الإجراء الموصى به: خفض القطب الكهربائي بحيث يكون سطح الاستشعار مغطى بالكامل بالعينة السائلة.

بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول نهجاً قوياً قائماً على المعايرة لتقدير كمية الفلوريد في مصفوفات بيولوجية متنوعة، وهو مناسب جداً للدراسات التي تبحث في التعرض للفلوريد، وترسبه في الأنسجة، والنتائج السمية في النماذج الفأرية.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عن عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم؛ زمالات JSPS للبحوث الخارجية 202560528 (S.Y.)، ومؤسسة دعم الأبحاث في ولاية ساو باولو (FAPESP)؛ 2024/07452-9 (J.S.T.)، والمعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه والجمجمة التابع للمعاهد الوطنية للصحة؛ R01DE027648 (M.S.) و K02DE029531 (M.S.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الأسيتيك، جليديSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
بوتقات الألوميناأدفاليو تكنولوجي (Advalue Technology)قطر خارجي 12 مم × 25 مم ارتفاع، AL-6212AL-6212
ميزان تحليليVWRVWR 124B2، د = 0.1 ملغم—
جهاز طحن العينات بالخرزالمعيار المرجعيBeadBug 6—
إبرة محقنة ذات طرف غير مدببأمازونإبرة ذات سن غير مدبب للأغراض الصناعية، 14 G × 0.5 بوصةX001TT8KX1
ثاني أكسيد الكربونإير غاز (AirGas)——
خزانة استخلاص الغازات الكيميائيةMott Manufacturingنموذج 7421040—
سكروز (+D)Thermo Scientific99.7% في الكيمياء الحيوية177142500
محلول ملء القطب الكهربائيThermo Scientificمحلول ملء Orion IonPlus900061
محلول الكحول الإيثيليKoptec140 درجة إثبات2401
مجمّد، −80 °CThermo Scientificسلسلة Revco RDE—
قفازات مقاومة للحرارةFisher Scientificقفازات Bel-Art Clavies للتعقيم بالبخار والمواد الخطرة بيولوجياًH13201
هيكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
بيروكسيد الهيدروجينVWRJ.T. Baker، بنسبة 30%2204-01
قطب انتقائي للأيوناتThermo Scientificقطب انتقائي للأيونات من Orion للفلووريد، ثنائي القناة9609BNWP
خلاط مغناطيسيVWRجهاز تحريك 360—
ملعقة مسطحة دقيقةأمازونملعقة نحت الشمع رقم 7A، من الفولاذ المقاوم للصدأ—
جهاز طرد مركزي دقيقEppendorf5427R5404000131
فرن التخميدThermo Scientificفرن مَفْلَة صغير لسطح المختبر من Thermolyne، سعة 1.3 لتر، طراز FB1315MFB1315M
فرنBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
محلول البارافورمالدهيد في المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS)Thermo Scientific4% بارافورمالدهيد في المحلول الملحي الملحّ بالـ PBSJ19943-K2
طبق بتريVWR60 × 15 مم، غير معالج25384-092
فازلين (Petrolatum)Thermo Scientificفازلين، أبيض، نقي417090010
ورق كاشف الأس الهيدروجيني (pH)Fisher ScientificpH-Fix 4.5–10.092120.3
طبق بورسلينFisher Scientificبوطقة Fisherbrand، سعة 5 مل، ارتفاع 20 مم، شكل مرتفعFB-965-B
مقياس الجهد الكهربائيThermo Scientificمقياس Orion Dual Star لدرجة الحموضة والأقطاب الانتقائية للأيونات (pH/ISE)2115102
حامل حلقي مع ماسكVWRمشبك حلقي، 15 سم470104-526
نظام غذائي للقوارضBio-ServF1515, AIN-76A, ½ الرواسبF1515
رافعة مقصيةأمازونرافعة المقص المختبرية—
قمع فصلFisher ScientificEisco، زجاج بوروسيليكات، 2 لترS89285
كلوريد الصوديومFisher Scientificمعتمد من الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS)، بلوريS271-1
فلوريد الصوديومFisher Scientificمعتمد من الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS)، مسحوقS299-100
هيدروكسيد الصوديومFisher Scientificكبيبات بيضاءBP359-500
خرز الفولاذ المقاوم للصدأFisher ScientificScientific Industries، 5 مم، 100 قطعةSI-CS05
حمض الكبريتيكFisher Scientificدرجة الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS Grade)A300-500
TISAB IIThermo Scientificمحلول تطبيق Orion IonPlus940909
مجفف بالتفريغFisher Scientificمجفف فراغي موفر للمساحة من Bel-Art، مقاس 10 بوصاتF42010-0000
مرشح تفريغFisher Scientificمرشح علوي للقارورة من نوع Flow، بولي إيثر سلفون (PES)، 90 مم، 0.2 µm597-4520
هزاز متغير السرعةميدساي (MidSci)LabDoctor / Benchmark Scientific—

المراجع

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
  2. Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O'Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2
  3. Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885
  4. Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273
  5. Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279
  6. Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038
  7. Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302
  8. Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629
  9. Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.
  10. Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948
  11. Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.
  12. Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.
  13. Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200
  14. Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600
  15. Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.
  16. Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436
  17. Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495
  18. Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2
  19. Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.
  20. Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486
  21. Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.
  22. Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.
  23. Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.
  24. Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2
  25. Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.
  26. Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339
  27. Martínez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657
  28. Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.
  29. Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.
  30. Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.
  31. Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.
  32. Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.
  33. Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.
  34. Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.
  35. Kučera J, Štefánik, M. & Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.
  36. Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583
  37. Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.
  38. Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.
  39. Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تقدير كمية الفلوريدالانتشار بمساعدة HMDSفلوريد المصلفلوريد العظامفلوريد الأسنانالعينات البيولوجيةالمنحنى القياسيالترسيب النسيجي

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.