مقالة منهجية

تقدير كمية الفلوريد في المصل والعظام والأسنان في نموذج فئران باستخدام الانتشار المُيسَّر بواسطة هيكساميثيل دي سيلوكسان وقياسات القطب الانتقائي للأيونات

238 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71488

⸱

أغسطس 28, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تحضير أطباق الانتشار المسهلة بواسطة الهكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS)، يليه قياسات القطب الانتقائي للأيونات لتقدير كتلة أيونات الفلوريد في مصل الدم والعظام والأسنان للفئران. توفر هذه الطريقة نهجاً حساساً قائماً على المعايرة لتقييم تراكم الفلوريد في العينات البيولوجية.

الملخص

يعد تقدير مستويات الفلورايد في الأنسجة البيولوجية أمراً أساسياً لفهم التعرض للفلورايد وعمليات استقلابه وسميته. يصف هذا البروتوكول طريقة حساسة وقابلة للتكرار لقياس كتلة أيونات الفلورايد في المصل والعظام والأسنان باستخدام الانتشار المُيسّر بواسطة الهيكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS) متبوعاً بالتحليل باستخدام القطب الانتقائي للأيونات (ISE). يتم جمع العينات البيولوجية، بما في ذلك المصل وعظم الفخذ والقواطع الفكية، من فئران تعرضت لمعالجات محكومة من الفلورايد. يتم تحويل عينات العظام والأسنان إلى رماد، ثم طحنها وترطيبها، بينما يتم معالجة المصل مباشرة. تُنقل كل عينة إلى طبق انتشار يحتوي على ماء فائق النقاء ويُغلق بغطاء مبطن بالبترولاتوم يحتوي على قطرات من هيدروكسيد الصوديوم التي تعمل كمصائد للفلورايد. يؤدي حقن حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS إلى بدء تحرر الفلورايد وانتشاره، مما يسمح بالتقاط أيونات الفلورايد المتحررة كمياً في المصائد. بعد عملية الانتشار التي تستمر طوال الليل، تُجمع قطرات مصيدة الفلورايد في عينة واحدة، وتُحمض لتصل إلى نطاق pH المطلوب، وتُضبط إلى حجم محدد لقياسها بواسطة ISE. وتعمل أطباق انتشار المعايرة المُحضرة بكتل معروفة من الفلورايد على إنشاء منحنى قياسي للتقدير الكمي، بينما تتحقق عينات مراقبة الجودة من استقرار القطب. تظهر النتائج التمثيلية للفئران في مرحلتي المراهقة والنضج التي تعرضت لـ 0 أو 125 ppm من الفلورايد قدرة هذه الطريقة على اكتشاف الاختلافات المعتمدة على العمر والجرعة في مستويات الفلورايد عبر المصل والعظام والأسنان. يوفر هذا البروتوكول نهجاً قوياً قائماً على المعايرة لتقدير كمية الفلورايد في مصفوفات بيولوجية متنوعة، وهو مناسب جداً للدراسات التي تبحث في التعرض للفلورايد، وترسبه في الأنسجة، والنتائج السمية في النماذج الفأرية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في قدرتها على تقدير كمية الفلورايد بدقة في العينات الصغيرة جداً، بما في ذلك 3–5 mg من الرماد المستخلص من القواطع الفردية للفئران، لأن عملية الانتشار تركّز كل الفلورايد المتحرر في حجم عينة قابل للقياس يقل عن 100 µL.

المقدمة

يعد الفلوريد أنيوناً يوجد بشكل طبيعي، ويعمل المستوى الأمثل منه بفعالية في الوقاية من تسوس الأسنان1,2,3,4,5. وفي الولايات المتحدة (U.S.)، تم تطبيق فلورة مياه المجتمع بتركيز 0.7 ppm كاستراتيجية للصحة العامة لتقليل معدلات الإصابة بالتسوس وتعزيز صحة الفم6. ومع ذلك، فإن تناول كميات مفرطة من الفلوريد لفترات طويلة يمكن أن يؤثر سلباً على أنسجة متعددة؛ حيث يؤدي التعرض العالي للفلوريد إلى اضطراب تكوين المينا7,8,9، وتغيير تكوين العظام10، والإضرار بسلامة الهيكل العظمي11.

على المستوى الخلوي، يؤدي التعرض للفلووريد إلى حدوث عدة اضطرابات أيضية، بما في ذلك الإجهاد التأكسدي12، وإجهاد الشبكة الإندوبلازمية13، وتعديلات فوق جينية تغير التعبير الجيني14، والموت الخلوي المبرمج في الخلايا المينائية15,16,17,18. وعلى الصعيد العالمي، تشكل التركيزات المرتفعة من الفلووريد في المياه الجوفية (>1.5 ppm) مصدر قلق صحي كبير. وقد قدرت دراسة حديثة للنمذجة التنبؤية أن ما يقرب من 180 مليون شخص حول العالم قد يتأثرون بالتعرض المفرط للفلووريد، مع تركز العبء الأكبر في آسيا وأفريقيا1. وبالإضافة إلى مياه الشرب، يحدث التعرض للفلووريد أيضاً من خلال الأطعمة (مثل المأكولات البحرية؛ ~1.9 ppm)، والمشروبات (مثل الشاي؛ 0.5–6 ppm19)، ومنتجات العناية بالأسنان مثل معجون الأسنان20 (1,000–1,500 ppm).

لذلك، يعد فهم التعرض للفلوريد واستقلابه وترسبه في الأنسجة أمرًا ضروريًا لتقييم كل من فوائده العلاجية وآثاره السمية المحتملة. ويعد التقدير الكمي الدقيق للفلوريد في العينات البيولوجية — بما في ذلك البول والمصل والعظام والأسنان — مكونًا حيويًا في هذا العمل. ومع ذلك، فإن القياس يمثل تحديًا تحليليًا نظرًا للسلوك الكيميائي للفلوريد وألفته القوية للمصفوفات الغنية بالكالسيوم. ويستقر ما يقرب من 99% من فلوريد الجسم في الأنسجة المعدنية مثل العظام والأسنان21. ولمواجهة هذه التحديات، تم تطوير مجموعة متنوعة من التقنيات التحليلية، بما في ذلك قياس الجهد باستخدام القطب الانتقائي للأيونات (ISE)، والكروماتوغرافيا الأيونية، والمقاييس اللونية، وإجراءات المعايرة، والطرق النووية أو القائمة على التنشيط22. ومن بين هذه التقنيات، برزت تقنية الانتشار المسهل بواسطة الهكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS) مقترنة بالقياس باستخدام القطب الانتقائي للفلوريد كواحد من أكثر النهج موثوقية واستخدامًا للمصفوفات البيولوجية نظرًا لحساسيتها وقابلية تكرار نتائجها وتوافقها مع أنواع العينات المتنوعة23,24,25,26,27,28,29.

على الرغم من توفر طرق تحليلية متعددة، إلا أن كل نهج يعاني من قيود قد تحد من استخدامه في الأبحاث التجريبية أو السريرية. يوفر الكروماتوغرافيا الأيونية حساسية وانتقائية عاليتين، ولكنه يتطلب أجهزة متخصصة وتحضيراً مكثفاً للعينات30,31. أما المقاييس اللونية، مثل طريقة SPADNS (sodium 2‑(parasulfophenylazo)‑1,8-dihydroxynaphthalene-3,6‑disulfonate)، فهي بسيطة وغير مكلفة، ولكنها عرضة للتداخل من العكارة والكروموفورات الداخلية، مما يحد من موثوقيتها في العينات البيولوجية المعقدة22,32,33. وتعد طرق المعايرة ذات تكلفة منخفضة ومباشرة، ولكنها تفتقر إلى الحساسية المطلوبة للكشف عن آثار الفلوريد في معظم العينات البيولوجية34. وتوفر التقنيات النووية أو القائمة على التنشيط حساسية استثنائية، ولكنها تتطلب الوصول إلى مفاعلات أو مصادر نيوترونية قائمة على المسرعات، مما يجعلها غير عملية للاستخدام المختبري الروتيني35. وفي المقابل، يوفر الانتشار المسهل بواسطة HMDS متبوعاً بقياس ISE توازناً عملياً بين الحساسية والتكلفة وسهولة الوصول، مع ضمان التحرير الكامل للفلوريد من الأنسجة الرخوة والمعدنية على حد سواء. وهذا مفيد بشكل خاص للدراسات التي تشمل الحيوانات الصغيرة، حيث تكون كمية الأنسجة المتاحة محدودة، وتنتج الهياكل المعدنية مثل القواطع في الفئران ما بين 3–5 mg فقط من الرماد لكل سن.

تتيح قدرة طريقة الانتشار–ISE على تركيز كل الفلوريد المتحرر في حجم صغير ومحدد إجراء تقدير كمي دقيق حتى في العينات الصغيرة للغاية. وهذا يجعل هذه الطريقة مناسبة تماماً لدراسات الحركية السمية، وتجارب الاستجابة للجرعة، وأبحاث استقلاب الفلوريد عبر المراحل النمائية. وقد استُخدمت القوارض الصغيرة، وبخاصة فئران C57BL/6J، على نطاق واسع كنماذج حيوانية لدراسة تأثيرات الفلوريد7,9,12,29,36 .

في هذا البروتوكول، يطبق المؤلفون تقنية الانتشار المُسهل بواسطة HMDS متبوعة بقياس القطب الانتقائي للفلوريد لتقدير كمية الفلوريد في المصل والعظام والأسنان التي جُمعت من فئران تعرضت لجرعة عالية من الفلوريد (125 ppm) مقارنة بمجموعات ضابطة غير معالجة. كما يقارن المؤلفون تراكم الفلوريد في الفئران المراهقة (6 أسابيع عند بدء العلاج) والفئران البالغة (18 أسبوعاً عند بدء العلاج) لتقييم الاختلافات المعتمدة على العمر في استقلاب الفلوريد وترسبه في الأنسجة. وقد تم اختيار القواطع السفلية كنسيج سني ممثل لأن القواطع لدى القوارض تبزغ باستمرار وتصل إلى حالة توازن مستقر بين البزوغ والتآكل الإطباقي بحلول الأسبوع السابع تقريباً من العمر. يوفر نمط النمو المستمر هذا تدرجاً ثابتاً ومتاحاً لتطور المينا، مما يجعل القواطع الفأرية نموذجاً واسع الاستخدام ومعتمداً للبحث في تكوين المينا وتفلور الأسنان.

البروتوكول

لقد أُجريت جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وفقاً للإرشادات واللوائح الخاصة باستخدام الحيوانات الفقارية المعتمدة من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسي للحيوانات (IACUC) في جامعة نوفا جنوب شرقية (بروتوكول رقم 2023.02.MSuz1)، والمعتمدة من قبل الرابطة الدولية لتقييم واعتماد الرعاية الصحية للحيوانات المختبرية (AAALAC). كما التزم جميع العمل مع الحيوانات بدليل الرعاية والاستخدام للحيوانات المختبرية وإرشادات الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية (AVMA) بشأن القتل الرحيم للحيوانات. جميع المواد المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. الحيوانات و تحضير وإعطاء فلوريد الصوديوم في نموذج فأري

  1. الحيوانات: يتم توزيع ذكور الفئران من سلالة C57BL/6J على فئتين عمريتين: المراهقة، في عمر 6 أسابيع عند بدء العلاج، والبالغة، في عمر 18 أسبوعاً عند بدء العلاج.
    1. زود كل مجموعة إما بماء منزوع الأيونات وخالٍ من الفلوريد (0 جزء في المليون من F⁻) أو بماء شرب مدعم بفلوريد الصوديوم (125 جزء في المليون من F⁻) لمدة تعرض تبلغ 6 أسابيع.
    2. قم بتضمين خمس حيوانات في كل عمر وحالة علاجية (العدد = 5 لكل مجموعة).
    3. في نهاية فترة التعرض، يتم جمع المصل وعظام الفخذ والقواطع الفكية، وتجهيز جميع العينات التي تم جمعها للتحليلات اللاحقة.
      ملاحظة: العينة: مواد مُعالجة مثل العظام المرمّدة، والأسنان المرمّدة، والمصل.
  2. إيواء الحيوانات ونظامها الغذائي: يتم إيواء الفئران في ظروف مختبرية قياسية مع إلى حد التشبع الوصول إلى الغذاء والماء.
    1. يجب اتباع نظام غذائي خالٍ من الفلوريد بدءًا من أسبوع واحد قبل جمع عينات الأسنان والعظام والمصل، وذلك لتقليل مستويات الفلوريد الخلفية.
  3. مياه الشرب المحتوية على فلوريد الصوديوم
    1. لتحضير مياه شرب مدعمة بالفلوريد، يتم إذابة فلوريد الصوديوم (NaF) في ماء منزوع الأيونات للوصول إلى تركيز الفلوريد المطلوب (على سبيل المثال، 125 جزء في المليون من F⁻).
    2. قم بترشيح المحلول عبر 0.2 µm يُصفى المزيج باستخدام مرشح تفريغ في زجاجة معقمة بجهاز الأوتوكلاف. ويُحضر محلول جديد كل يومين.
      تنبيه: مادة NaF سامة في حال بلعها، وقد تسبب تهيجاً للجلد والعينين. يجب التعامل معها داخل خزانة استخلاص الأدخنة مع ارتداء معطف المختبر، وقفازات النيتريل، ونظارات السلامة.
  4. للحصول على مياه تحكم خالية من الفلوريد، يتم ترشيح الماء منزوع الأيونات عبر 0.2 µm يُرشح باستخدام مرشح تفريغ الهواء في زجاجة معقمة بجهاز التعقيم البخاري. تُحضّر مياه عذبة كل يومين.
  5. توفير مياه شرب مدعمة بالفلورايد أو خالية من الفلورايد بشكل حر (ad libitum) للمدة المطلوبة لمعالجة الفلوريد. راقب مستويات المياه يومياً واستبدل الزجاجات كل يومين.
  6. في نهاية فترة التعريض، تُقتل الحيوانات رحمةً عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO₂) يليه فصل الرأس. وقد نُفذت إجراءات القتل الرحيم وفقاً لإرشادات الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية (AVMA) للقتل الرحيم للحيوانات، وتم اعتمادها كجزء من بروتوكول اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان (IACUC).
    تنبيه: أول أكسيد الكربون (CO)2 تعتبر هذه المادة مسببة للاختناق. لذا، يجب تنفيذ الإجراءات في منطقة جيدة التهوية والتأكد من أن غرفة العمل تعمل بشكل صحيح. تجنب التعرض المباشر للاستنشاق.

2. تحضير العينة لقياس الفلوريد

  1. جمع الدم
    1. يتم القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق CO₂ وجمع الدم فوراً عبر ثقب القلب النهائي باستخدام حقنة توبيركولين سعة 1 mL. يُنقل الدم إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL. يتم التخلص من جميع الإبر والحقن المستخدمة في حاوية نفايات الأدوات الحادة المعتمدة في المؤسسة.
      تنبيه: إبر الحقن حادة وقد تسبب إصابات ثقب؛ يجب التعامل معها بحذر.
    2. يُحفظ الدم لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة، ثم يُطرد مركزياً لمدة 10 min عند 2,000 × g.
    3. يُنقل السائل الطافي (المصل) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ويُحفظ عند −80 °C.
      تنبيه: تشكل المجمدات ذات درجة الحرارة فائقة الانخفاض مخاطر الإصابة بقضمة الصقيع. يجب ارتداء قفازات عازلة عند التعامل مع الأنابيب وتجنب ملامسة الجلد لفترات طويلة للأسطح الباردة.
  2. العظام
    1. استخراج عظام الفخذ: بعد القتل الرحيم، يتم تشريح الأرجل الخلفية عند مفاصل الورك.
    2. تُزال جميع الأنسجة الرخوة بعناية من عظام الفخذ. تُغسل الأنسجة ثلاث مرات في ماء منزوع الأيونات. تُحفظ العظام عند -80 °C حتى مرحلة المعالجة التالية. يتم التخلص من الأنسجة الرخوة المزالة وأي مواد ملوثة في مجرى النفايات البيولوجية الخاص بالمؤسسة.
      ملاحظة: يمكن تثبيت الأنسجة في 4% paraformaldehyde مع 2% sucrose لمدة 12–16 h للتخزين طويل الأمد في 70% ethanol. إجراء التثبيت هذا لا يؤثر على دقة التقدير الكمي للفلووريد لاحقاً.
    3. تُشطف العظام جيداً بالماء منزوع الأيونات. تُجفف الرطوبة الزائدة باستخدام مناديل ورقية خالية من الوبر.
    4. تُنقل العظام إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL مع ترك الأغطية مفتوحة للسماح بالتبخر، وتوضع في فرن تجفيف عند 60 °C لمدة 12–16 h.
      تنبيه: قد يتسبب فرن التجفيف في حدوث حروق. استخدم قفازات مقاومة للحرارة عند التعامل مع العينات.
    5. تَحْوِيل العظام إلى رماد: تُنقل العظام المجففة إلى بوتقات ألومينا. توضع البوتقات في فرن مَفْحَل (muffle furnace) وتُسخن إلى 600 °C بمعدل 150 °C/h، ثم تُترك لمدة 6 h. يُترك الفرن ليبرد إلى أقل من 200 °C قبل إخراج البوتقات. يتم التخلص من أي شظايا عظمية متبقية أو مستهلكات ملوثة في مجرى النفايات البيولوجية الخاص بالمؤسسة.
      تنبيه: يصل الفرن المَفْحَل والبوتقات إلى درجات حرارة قصوى، مما يشكل خطراً جسيماً بحدوث حروق. اترك الفرن دائماً ليبرد قبل التعامل مع البوتقات. عند إخراج البوتقات، ارتدِ معطف المختبر ونظارات السلامة وقفازات مقاومة للحرارة، واستخدم ملقطاً طويلاً لتجنب الملامسة المباشرة للأسطح الساخنة.
      خطوة حرجة: سيؤدي التحويل غير الكامل إلى رماد إلى الإضرار بالتحليلات اللاحقة. تأكد من أن المادة العظمية قد وصلت إلى حالة التأكسد الكامل قبل المتابعة؛ حيث إن أي كربون متبقٍ سيتداخل مع القياسات اللاحقة.
      ملاحظة: يجب أن يظهر العظم المحوّل إلى رماد بشكل صحيح بلون رمادي فاتح إلى أبيض موحد. تشير الجسيمات الداكنة — خاصة الرواسب السوداء أو الشبيهة بالفحم — إلى احتراق غير كامل. في حال وجود تغير في اللون، قم بتمديد مدة التحويل إلى رماد للسماح بالإزالة الكاملة للمواد العضوية.
    6. تخزين العظام المحولة إلى رماد: فور الانتهاء من عملية التحويل إلى رماد، تُنقل العظام إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL. تُغلق الأنابيب بـ Parafilm وتُحفظ في مجفف تفريغ (vacuum desiccator) حتى وقت الاستخدام.
  3. الأسنان
    1. استخراج القواطع السفلية: يتم إجراء قطع أفقي عند مستوى المفصل الفكي الصدغي لفصل الفك السفلي عن الفك العلوي.
    2. يتم إجراء قطوع سهمية وسطية لتقسيم كل من الفك العلوي والسفلي إلى نصفين أيمن وأيسر.
    3. تُغسل الأنسجة ثلاث مرات في ماء منزوع الأيونات وتُستخرج القواطع السفلية بعناية. تُحفظ القواطع المستخرجة عند -80 °C حتى وقت الاستخدام. يتم التخلص من الأنسجة الرخوة المستخرجة وأي مستهلكات ملوثة في مجرى النفايات البيولوجية الخاص بالمؤسسة.
      تنبيه: استخدم أدوات التشريح الحادة بحذر عند إجراء القطوع في المفصل الفكي الصدغي والمستوى السهمي الوسطي لتجنب الإصابة الشخصية. ارتدِ معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر ونظارات السلامة.
      ملاحظة: يمكن تثبيت الأنسجة في 4% paraformaldehyde مع 2% sucrose لمدة 12–16 h للتخزين طويل الأمد في 70% ethanol. إجراء التثبيت هذا لا يؤثر على دقة التقدير الكمي للفلووريد لاحقاً.
    4. تحضير الأسنان للتحويل إلى رماد: تُشطف الأسنان جيداً بالماء منزوع الأيونات وتوضع في 1% hydrogen peroxide (H₂O₂) لمدة 12–16 h. يتم التخلص من محاليل hydrogen peroxide المستهلكة كنفايات كيميائية خطرة.
    5. تُشطف الأسنان مرة أخرى بالماء منزوع الأيونات، وتُجفف لفترة وجيزة باستخدام منديل خالي من الوبر، ثم تُنقل إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL مع ترك الأغطية مفتوحة. توضع الأنابيب في فرن تجفيف عند 60 °C لمدة 12–16 h.
      تنبيه: hydrogen peroxide مادة مؤكسدة وقد تسبب تهيج الجلد والعينين. يجب التعامل معها داخل خزانة استخلاص من الأدخنة (fume hood) مع ارتداء معطف المختبر وقفازات نيتريل ونظارات السلامة. تجنب ملامستها للمواد القابلة للاشتعال.
    6. تحويل الأسنان إلى رماد: تُنقل الأسنان المجففة إلى بوتقات ألومينا وتُحوّل إلى رماد في فرن مَفْحَل عند درجة حرارة استقرار تبلغ 600 °C لمدة 20 h، باستخدام معدل تسخين قدره 150 °C/h.
    7. تُخرج البوتقات فقط بعد أن يبرد الفرن إلى أقل من 200 °C.
      تنبيه: يصل الفرن المَفْحَل والبوتقات إلى درجات حرارة قصوى، مما يشكل خطراً جسيماً بحدوث حروق. اترك الفرن ليبرد إلى أقل من 200 °C قبل التعامل مع البوتقات. عند إخراج البوتقات، ارتدِ معطف المختبر ونظارات السلامة وقفازات مقاومة للحرارة، واستخدم ملقطاً طويلاً لتجنب الملامسة المباشرة للأسطح الساخنة.
      خطوة حرجة: تأكد من التأكسد الكامل؛ حيث إن الكربون المتبقي سيتداخل مع التحليلات اللاحقة.
      ملاحظة: يجب أن تظهر مادة السن المحولة إلى رماد بلون رمادي فاتح إلى أبيض موحد. أعد عملية التحويل إلى رماد إذا بقيت رواسب سوداء.
    8. تخزين عينات الأسنان المحولة إلى رماد: فور الانتهاء من عملية التحويل إلى رماد، تُنقل الأسنان إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة مستديرة القاع سعة 2 mL.
    9. تُغلق الأنابيب بـ Parafilm وتُحفظ في مجفف تفريغ (vacuum desiccator) حتى وقت الاستخدام.

3. تحضير أطباق الانتشار الميسرة باستخدام HMDS

  1. الكواشف والمواد
    1. حمض الكبريتيك بتركيز 6 عياري: قبل يومين على الأقل من تحضير أطباق الانتشار، قم بتحضير محلول مخزون من حمض الكبريتيك بتركيز 6 عياري.
      ملاحظة: طبق الانتشار: وعاء محكم الإغلاق مصمم لإنشاء بيئة مغلقة خاضعة للتحكم، بحيث يمكن التقاط المكونات المنبعثة من مادة بيولوجية معالجة بواسطة مصيدة كيميائية مثبتة في الغطاء. ويمنع التصميم المحكم الإغلاق التبادل مع الهواء الخارجي، ويضمن توجيه المواد التحليلية المنبعثة نحو المصيدة لقياسها لاحقاً.
    2. ضع بيكر بلاستيكياً سعة 1 لتر يحتوي على قضيب تحريك مغناطيسي على جهاز خلط مغناطيسي، وأضف 416 مل من الماء فائق النقاء.
    3. باستخدام ماصة سيرولوجية سعة 50 مل، أضف ببطء 84 مل من حمض H₂SO₄ بتركيز 36 عياريًا إلى الماء مع التحريك المستمر. سيرتفع درجة حرارة المحلول؛ لذا اتركه حتى يبرد ليصل إلى درجة حرارة الغرفة.. يتم التخلص من أي محاليل حمض الكبريتيك غير المستخدمة أو المستنفدة كنفايات كيميائية خطرة ضمن نظام تصريف النفايات الكيميائية في المؤسسة.
      تنبيه: حمض الكبريتيك مادة مآكلة للغاية. يجب التعامل معه داخل خزانة استخلاص الأدخنة مع ارتداء قفازات مقاومة للأحماض، ومعطف مختبر، ونظارات واقية. في حال حدوث تلامس، يُشطف الجزء المصاب فوراً بكميات وفيرة من الماء.
    4. حمض الكبريتيك 6 عياري المشبع بـ HMDS: يُنقل حمض الكبريتيك 6 عياري إلى قمع فصل سعة 2 لتر، ويُضاف إليه 15 مل من الهيكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS).
    5. تأكد من إغلاق السدادة والصنبور بإحكام، وأمسك قمع الفصل بشكل أفقي، ثم رجّه بقوة حتى تظهر قطرات صغيرة من HMDS.
    6. افتح السدادة لتحرير غاز التظهير، وكرر هذه العملية مرتين إضافيتين.
    7. اترك السدادة مفتوحة جزئيًا لعدة ساعات. احفظ القمع الفاصل الذي يحتوي على حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS بتركيز 6 عياري في حامل داخل خزانة استخلاص الأدخنة الكيميائية. تخلص من حمض الكبريتيك المحتوي على HMDS والمواد الملوثة كنفايات كيميائية خطرة.
      تنبيه: مادة HMDS قابلة للاشتعال وسامة عند استنشاقها. يجب التعامل معها داخل خزانة استخلاص الأدخنة مع ارتداء معطف المختبر والقفازات ونظارات السلامة. تُحفظ بعيداً عن مصادر الاشتعال.
    8. هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 0.05 عياري: أذب 1 غرام من حبيبات NaOH في 25 مل من الماء فائق النقاء لتحضير محلول مخزون بتركيز 1 عياري.
    9. امزج 2 مل من محلول NaOH المخزون بتركيز 1 عياري مع 38 مل من الماء شديد النقاء للحصول على محلول NaOH بتركيز 0.05 عياري.
    10. وزع محلول هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بتركيز 0.05 عياري إلى أنبوبة طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل للاستخدام الواحد، وأحكم إغلاق الأغطية باستخدام Parafilm، ثم احفظ الأنابيب في مجفف فراغي لتقليل امتصاص ثاني أكسيد الكربون (CO₂). تخلص من محاليل هيدروكسيد الصوديوم غير المستخدمة أو المستهلكة كنفايات كيميائية خطرة.
      تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم مادة كاوية للغاية ويمكن أن تسبب حروقاً شديدة. يجب ارتداء معطف المختبر، والقفازات، ونظارات السلامة. تعامل مع المحاليل بحذر لتجنب الرذاذ.
    11. حمض الخليك 0.2 عياري: أضف 575 µL أضف حمض الخليك الثلجي إلى الماء فائق النقاء واضبط الحجم النهائي ليصل إلى 50 مل لتحضير حمض خليك بتركيز 0.2 عياري. تخلص من محاليل حمض الخليك كنفايات كيميائية خطرة.
      تنبيه: حمض الأسيتيك مادة مآكلة وقد يسبب تهيجاً للجلد والعينين والجهاز التنفسي. يجب التعامل معه داخل خزانة استخلاص من الأدخنة الكيميائية مع ارتداء معطف المختبر والقفازات ونظارات السلامة.
    12. الفازلين: يُصهر ما يقرب من 100 غرام من الفازلين عند 60 °C في فرن. اسحب البترولاتوم السائل إلى محاقن سعة 10 مل، واتركه ليبرد ويتصلب. يمكن تخزين المحاقن المملوءة بالبترولاتوم في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع.
    13. طبق بتري: استخدم أطباق بتري غير معالجة بمقاس 60 × 15 مم لتحضير أطباق الانتشار.
    14. أحدث ثقباً صغيراً في غطاء طبق بتري باستخدام إبرة حقنة قياس 18-G مُسخنة.
    15. قم بطلاء الحافة الداخلية للغطاء بطبقة مستمرة من الفازلين (petrolatum) باستخدام حقنة سعة 10 مل مزودة بإبرة غير مدببة مقاس 14 G. تخلص من جميع الإبر المستخدمة في حاوية معتمدة من المؤسسة للتخلص من النفايات الحادة.
      تنبيه: إبر المحاقن حادة ويمكن أن تسبب إصابات ثقبية. تعامل معها بحذر وتخلص منها في حاويات الأدوات الحادة المعتمدة. عند تسخين الإبر، ارتدِ قفازات مقاومة للحرارة وواقيات للعين لمنع الحروق.
    16. محاليل NaF القياسية لمعايرة أطباق الانتشار. أذب 4.19 جم من NaF في 1 لتر من الماء عالي النقاء لتحضير محلول قياسي بتركيز 100 ميلي مولار. حضّر تركيز 10 ميلي مولار، 100 µM، و 10 µM المحاليل القياسية عن طريق تخفيفات متسلسلة بنسبة 1:10 من محلول بتركيز 100 مللي مولار.
      ملاحظة: يوفر مول واحد من NaF مقدار 19 جم من F⁻؛ وبناءً على ذلك، 1 µL من 10 µM يحتوي NaF على 0.19 نانوغرام من F⁻ و 1 µL يحتوي [الحجم] من NaF بتركيز 10 ميليمولار على 190 نانوغرام من F⁻.
      ملاحظة: أطباق الانتشار الخاصة بالمعايرة: أطباق انتشار تُستخدم خصيصاً للمعايرة باستخدام كتلة معروفة من أيونات الفلوريد (F¯).
  2. تحضيرات أطباق الانتشار الخاصة بكل عينة
    1. طبق انتشار المصل: يتم نقل 3 مل من الماء فائق النقاء باستخدام الماصة إلى قاع طبق بيتري، ثم يُضاف 75 µL مصل. يتم التخلص من أي مواد ملوثة بالمصل في مجرى النفايات البيولوجية المؤسسي. استمر في الخطوة 3.4.
    2. طبق انتشار العظام
      1. سحق رماد العظام: استخدم ملعقة دقيقة (micro spatula) لطحن العظام المرمّدة داخل أنابيب جهاز الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل حتى تتحول إلى مسحوق ناعم. ابدأ بمعالجة رماد العظام المسحوق على الفور. تخلص من المواد الاستهلاكية الملوثة برماد العظام عبر مسار النفايات الكيميائية في المؤسسة.
      2. وزن وترطيب رماد العظام
        1. ضع الجزء السفلي الفارغ من طبق بتري على كفة ميزان تحليلي بدقة قراءة لا تقل عن 0.1 مجم.
        2. انقل رماد العظم المطحون من أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 2 مل إلى طبق صغير من البورسلين لتقليل الشحنة الساكنة ومنع تشتت المسحوق.
        3. باستخدام ملعقة مجهرية، أضف ما يقرب من 5 ملغم من رماد العظام إلى الطبق، وقم بتغطية المسحوق فوراً بـ 3 مل من الماء عالي النقاء قبل إزالة الطبق من الميزان التحليلي لتجنب تشتت الرماد.
        4. سجل الوزن الدقيق لكل عينة من رماد العظام. انتقل إلى الخطوة 3.4.
    3. طبق انتشار الأسنان
      1. طحن الأسنان المرمّدة
        1. انقل القواطع المحروقة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة مستديرة القاع سعة 2 مل، وأضف خرزة من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 5 مم إلى كل أنبوب. أغلق الأنابيب وأحكم إغلاق الأغطية باستخدام Parafilm.
        2. اطحن القواطع المحولة إلى رماد باستخدام جهاز Bead beater بسرعة 2,500 دورة في الدقيقة لمدة 10 ثوانٍ. ابدأ بمعالجة الأسنان المطحونة فوراً.
      2. وزن وترطيب الأسنان المرمّدة
        1. اسكب كامل محتويات الأنبوب، بما في ذلك الخرزة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ، في قاع طبق الانتشار الموضوع على كفة ميزان تحليلي. تخلص من المواد الاستهلاكية الملوثة التي تحتوي على رماد الأسنان عبر مسار النفايات الكيميائية في المؤسسة.
        2. أخرج الخرزة المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ من الطبق، وسجّل الوزن الدقيق لرماد السن (عادةً ما يتراوح بين 3 إلى 4 ملجم لكل قاطع فكي سفلي).
        3. أضف فوراً 3 مل من الماء فائق النقاء لتغطية رماد السن قبل رفع الطبق عن الميزان، وذلك لمنع تشتت الرماد الناتج عن التفريغ الاستاتيكي. ثم انتقل إلى الخطوة 3.4.
  3. معايرة وضبط جودة أطباق الانتشار
    1. بالتوازي مع أطباق انتشار العينات، قم بتجهيز مجموعتين من أطباق انتشار المعايرة لإجراء معايرة مكونة من 5-6 نقاط، ومجموعة واحدة مماثلة من أطباق انتشار ضبط الجودة، بما في ذلك عينة فارغة.
      ملاحظة: أطباق انتشار مراقبة الجودة: تُحضّر بشكل مطابق لأطباق انتشار المعايرة، ولكن يُستخدم بعضها بشكل دوري للتحقق من استقرار القطب الكهربائي وضمان اتساق أداء القياس.
    2. انقل بواسطة الماصة 3 مل من الماء عالي النقاء إلى كل طبق من أطباق بتري الـ 11 أو 13، ثم أضف محلول NaF المخزون لتغطية نطاق كتلة F¯ المتوقع في عينات العينات. استمر في الخطوة 3.4 لإكمال تجميع طبق الانتشار.37.
  4. إتمام تجميع طبق الانتشار
    1. لبناء ترسب مصيدة الفلورايد، 50 µl تُضاف ثلاث قطرات من هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بتركيز 0.05 عياري على السطح الداخلي لغطاء طبق بيتري، بعيداً عن حافة الغطاء.
      ملاحظة: مصيدة الفلوريد (F¯ Trap): أحد مكونات أطباق الانتشار التي تعمل على احتجاز أيونات الفلوريد (F¯)، وهي تحديداً هيدروكسيد الصوديوم (NaOH).
    2. اقلب الغطاء دون تحريك قطرات NaOH، وأحكم إغلاقه على قاعدة الطبق باستخدام الفازلين.
    3. لتحضير محلول حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS بتركيز 3 عياري، اخلط أحجاماً متساوية من حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS بتركيز 6 عياري وماء فائق النقاء. يجب تحضير المحلول حديثاً قبل الاستخدام مباشرةً، حيث لا يمكن تخزينه.
    4. احقن 3 مل من حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS بتركيز 3 عياري والمُحضّر مسبقاً عبر الفتحة الموجودة في الغطاء إلى الماء الموجود في قاع طبق الانتشار، وذلك باستخدام حقنة سعة 10 مل مزودة بإبرة مقاس 20 G. احرص على عدم تطاير الحمض على السطح الداخلي للغطاء عند إدخال إبرة الحقنة أو سحبها.
    5. الانتشار الفلوريدي المُيسر بواسطة HMDS: قم بسد فتحة الحقن فوراً بقطرة من الفازلين بحيث تغطي الفتحة بالكامل، ثم ضع أطباق الانتشار على هزاز متغير السرعة مضبوط على سرعة بطيئة. تُحضن الأطباق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1).

اتزان استاتيكي؛ مخطط لطبق بتري؛ تجربة رماد العظام والماء وحمض الكبريتيك المشبع بـ HDMS.
الشكل 1: مخطط لطبق انتشار العظام لاستخلاص وحجز الفلوريد. يوضح الشكل 1 تصميم طبق انتشار العظام المجمع في طبق بتري غير معالج بمقاس 60 × 15 mm. يحتوي الغطاء على ثقب حقن صغير محكم الإغلاق بخرزة من الفازلين. وعلى السطح الداخلي للغطاء، وُضعت ثلاث قطرات من NaOH كأفخاخ لأيونات الفلوريد (F⁻)، تكون معلقة من الغطاء أثناء عملية الانتشار. يتم إغلاق الغطاء بإحكام لمنع تسرب الهواء مع قاعدة الطبق باستخدام الفازلين. يحتوي قاع طبق بتري على ماء فائق النقاء، وحمض كبريتيك مشبع بـ hexamethyldisiloxane (HMDS)، ورماد العظام، والتي تشكل معاً بيئة التفاعل لتحرير الفلوريد وحجزه لاحقاً. أنشأ المؤلفون هذا الشكل باستخدام Biorender، والشكل مرخص بموجب رخصة CC BY. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. قياس الفلوريد باستخدام قطب انتقائي للأيونات (ISE)

  1. إعداد القطب الانتقائي للأيونات (ISE)
    1. املأ القطب الانتقائي للفلوريد ثنائي القناة بمحلول التعبئة المناسب، وقم بتوصيله بجهاز مقياس الجهد (potentiometer)، وثبّت القطب في حامل الأقطاب.
    2. ضع طبق بتري غير معالج على رافعة مقصية أسفل سطح الاستشعار الخاص بالقطب، مع التأكد من أن سطح الاستشعار موازٍ لقاع طبق بتري، وارفع طاولة الرافعة المقصية بحيث يكون طبق بتري ملامسًا تقريبًا للقطب (الشكل 2).
  2. تحضير العينات للقياس
    ملاحظة: العينات: يُشار في هذا البروتوكول إلى المنتجات النهائية المقاسة بواسطة القطب الانتقائي للأيونات (ISE) فقط كعينات، والتي تتكون من مصيدة F¯ بعد الانتشار، والتي دُمجت لاحقًا مع حمض الأسيتيك والماء. 
    1. لضبط الرقم الهيدروجيني (pH) للعينة إلى 5، أزل طبق الانتشار من الهزاز وارفع الغطاء بعناية عن طريق كسر سدادة الفازلين (petrolatum seal) بعد فترة الحضانة. اقلب الغطاء على سطح مستوٍ، مع التأكد من بقاء قطرات مصيدة F¯ الثلاث دون تحريك.
    2. أضف 15–20 µL من حمض الأسيتيك بتركيز 0.2 N إلى قطرة واحدة باستخدام ماصة P20، ثم ادمج القطرات الثلاث جميعها في قطرة واحدة دون تغيير طرف الماصة.
      ملاحظة: تميل العينات ذات تركيزات F¯ العالية إلى امتلاك رقم هيدروجيني (pH) أولي أقل، وبالتالي تتطلب كمية أقل من حمض الأسيتيك بتركيز 0.2 N لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5 مقارنة بالعينات التي تحتوي على كمية أقل من F¯. نظرًا لأن حجم العينة المتبقي بعد تسجيل جهد القطب (الخطوة 5.3) يكون ضئيلًا، استخدم أي عينة متبقية متاحة للتحقق من الرقم الهيدروجيني باستخدام ورق كاشف.
    3. لضبط حجم العينة، اضبط ماصة P100 على 75 µL، واسحب الحجم الكامل لمصيدة F¯ دون إدخال هواء، واضبط العينة لتصبح 75 µL تمامًا باستخدام ماء عالي النقاء.
    4. نفذ هذه الخطوة بعناية لضمان دقة الحجم من أجل حسابات تركيز الفلوريد. احتفظ بالعينة في طرف الماصة وانتقل فورًا إلى الخطوة 4.3.
  3. قياس العينات، وعينات المعايرة، وعينات ضبط الجودة
    1. لقياس جهد القطب للعينة، قم بتفريغها بين سطح الاستشعار للقطب الانتقائي للفلوريد وطبق بتري. تأكد من غمر سطح الاستشعار بالكامل للقطب في السائل، دون ملامسة طبق بتري بشكل مباشر. اترك جهاز مقياس الجهد حتى يستقر وسجل الجهد (mV) الذي يعرضه القطب الانتقائي للأيونات (ISE).
    2. حدد منحنى المعايرة القياسي عن طريق قياس المجموعة الأولى من معايير المعايرة بالتتابع، بدءًا من أدنى تركيز لـ F¯ وصولاً إلى أعلى تركيز.
      1. ارسم جهد القطب (mV) مقابل لوغاريتم F¯ (ng) لإنشاء منحنى المعايرة (الشكل 3). طبق الانحدار الأسي للحصول على معادلة المنحنى القياسي ومعامل التحديد (R2). تُقبل منحنيات المعايرة فقط عندما تكون قيمة R2 ≥ 0.99.
    3. قس كل عينة من العينات وسجل جهد القطب (mV).
    4. لمراقبة استقرار القطب والكشف عن أي انزياح محتمل في المقايسة، قم بقياس عينات ضبط الجودة بشكل متقطع طوال كل دورة تحليلية.
      1. قارن قيم عينات ضبط الجودة مباشرة مع عينات المعايرة المقابلة لها وتحقق من التطابق في حدود 5% تقريبًا للتأكد من استقرار أداء القطب بمرور الوقت.
      2. قم بقياس طبق انتشار فارغ (blank) بشكل دوري للتأكد من عدم وجود تلوث بالفلوريد أثناء مناولة العينات والانتشار.
  4. لحساب كتلة F¯ (ng) في كل عينة، استخدم معادلة المنحنى القياسي. ثم اقسم هذه الكتلة على الحجم (µL) للمصل، أو الكتلة (mg) لرماد العظام أو الأسنان المضاف إلى طبق الانتشار.
    1. مثال لحساب تركيز F¯ في رماد العظام (ng/mg)
      1. كتلة رماد العظام المضافة إلى طبق الانتشار: 5.1 mg؛ جهد القطب لعينة حجمها 75 µL: –31.6 mV
      2. الخطوة 1: احسب كتلة الفلوريد باستخدام معادلة المعايرة
        1. كتلة F⁻ (ng) = 3505.4 x e(-0.043x-31.6)
        2. كتلة F⁻ (ng) = 13,641 ng
      3. الخطوة 2: احسب تركيز الفلوريد في رماد العظام
        1. تركيز F⁻ = 13,641 ng / 5.1 mg
        2. تركيز F⁻ = 2,675 ng / mg (ppm)

إعداد القطب الانتقائي للأيونات (ISE) مع مقياس الجهد وعينة موضوعة على رافعة مقصية لقياس الأيونات.
الشكل 2: مخطط لإعداد قياس ISE. يوضح الشكل 2 التكوين المستخدم لقياسات أيونات الفلوريد باستخدام قطب انتقائي للأيونات (ISE) ثنائي القناة. يتم وضع طبق بتري على رافعة مقصية للسماح بتعديل ارتفاعه بدقة بالنسبة للقطب. يتم توصيل ISE بمقياس جهد وتوجيهه بحيث يكون سطح الاستشعار موازياً لمستوى طبق بتري، مع الحفاظ على مسافة تبلغ حوالي 1–2 mm. بعد ضبط المسافة، يتم سحب حجم صغير من العينة (75 µL) بواسطة الماصة ووضعه في الفجوة بين سطح الاستشعار وطبق بتري، مما يضمن تغطية العينة لمنطقة استشعار القطب بالكامل أثناء القياس. تم إنشاء هذا الشكل من قبل المؤلفين باستخدام Biorender، والشكل مرخص بموجب رخصة CC BY. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

منحنى معايرة أيون الفلوريد؛ جهد القطب مقابل التركيز؛ نتيجة تحليل الانحدار الخطي.
الشكل 3: منحنى المعايرة وجدول المعايرة المقابل لتقدير كمية كتلة أيون الفلوريد في عينات من أنسجة الأسنان. اللوحة العلوية: مثال لمنحنى معايرة مستخدم لتحديد كتلة أيون الفلوريد في عينات من أنسجة الأسنان. يمثل المحور السيني جهد القطب (mV، مقياس خطي)، ويمثل المحور الصادي كتلة أيون الفلوريد المقابلة (ng F⁻، مقياس لوغاريتمي). تم رسم نقاط المعايرة المقاسة كخط متصل، بينما يظهر انحدار الأسس الموائم كخط منقط. ويعرض مربع داخلي معادلة المنحنى القياسي ومعامل التحديد (R2 = 0.99). اللوحة السفلية: جدول يحتوي على القيم العددية المستخدمة لإنشاء منحنى المعايرة. يسرد الصف الأول جهود القطب الخمسة (mV) المسجلة لعينات المعايرة. ويوفر الصف الثاني كتل أيون الفلوريد المقابلة (ng F⁻) لكل عينة معايرة. ويسرد الصف الثالث أحجام (µL) من محلول NaF المخزون بتركيز 10 mM المضافة إلى أطباق انتشار المعايرة؛ وتكافئ كتلة أيون الفلوريد المضافة هذه الكتلة المحتجزة في كل عينة معايرة بعد عملية الانتشار. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

لإثبات تطبيق هذا البروتوكول في قياس تركيزات الفلوريد (F-) في المواد البيولوجية، تم الحصول على عينات من مصل الدم والعظام والقواطع الفكية السفلية المجمعة من فئران تعرضت لمعالجات فلوريد محكومة. تم توزيع ذكور فئران من سلالة C57BL/6J على فئتين عمريتين: المراهقة (6 أسابيع) والناضجة (18 أسبوعًا)، ووُفّرت لها إما مياه منزوعة الأيونات خالية من الفلوريد (0 ppm F⁻) أو مياه شرب مضاف إليها فلوريد الصوديوم (125 ppm F⁻) لمدة تعرض استمرت 6 أسابيع. شملت كل حالة عمرية وعلاجية خمسة حيوانات. وفي نهاية فترة التعرض، تم جمع مصل الدم وعظام الفخذ والقواطع الفكية السفلية، ثم جُهزت عينات المواد وحُللت وفقًا للبروتوكول. وفيما يلي ملخص لتركيزات الفلوريد التمثيلية المقاسة في المصل والعظام والأسنان.

تأثير الفلوريد على مستويات F⁻؛ المصل، وعظم الفخذ، والقاطع؛ بيانات المخطط الشريطي؛ مقارنة وجود الفلوريد.
الشكل 4تركيزات الفلوريد المقاسة في المصل، وعظم الفخذ، والقواطع الفكية السفلية. تم تقسيم ذكور الفئران من سلالة C57BL/6J إلى فئتين عمريتين: المراهقة (6 أسابيع، شريط مفتوح) والبالغة (18 أسبوعاً، شريط ممتلئ)، وقُدم لها إما ماء منزوع الأيونات وخالٍ من الفلوريد (0 جزء في المليون من F⁻) أو ماء شرب مدعم بفلوريد الصوديوم (125 جزء في المليون من F⁻) لمدة تعريض استمرت 6 أسابيع. وفي نهاية فترة التعريض، قيست مستويات الفلوريد في (أ) المصل، و(ب) عظمة الفخذ، و(ج) القواطع الفكية السفلية من مجموعات المعالجة نفسها. أما قيم المصل التي كانت أقل من حد الكشف (<(0.02 جزء في المليون) رُسمت لأغراض التصوير المرئي ولكن استُبعدت من التحليل الإحصائي. عُبر عن البيانات كمتوسطات ± الانحراف المعياري. أُجريت المقارنات بين مجموعتي المراهقين والبالغين باستخدام اختبار مان-ويتني يو (Mann–Whitney U test) مع تصحيح بونفيروني-دان (Bonferroni–Dunn correction) للمقارنات المتعددة. *p < 0.05, **p < 0.01 (العدد = 5 لكل مجموعة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تركيزات الفلوريد في المصل
في كل من مجموعتي المراهقين والبالغين المعالجتين بـ 0 ppm من الفلوريد، كانت تركيزات الفلوريد في المصل أقل من حد الكشف الخاص بالقطب الانتقائي للأيونات (<0.02 ppm). أما في مجموعات العلاج بـ 125 ppm، فقد ارتفع تركيز الفلوريد في المصل إلى 0.3 ± 0.2 ppm في مجموعة المراهقين وإلى 0.7 ± 0.2 ppm في مجموعة البالغين (p = 0.06). أُجريت المقارنة بين مجموعة المراهقين ومجموعة البالغين المعالجتين بـ 125 ppm باستخدام اختبار Mann–Whitney U مع تصحيح Bonferroni–Dunn للمقارنات المتعددة. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). وقد استُبعدت مجموعات العلاج بـ 0 ppm من التحليل الإحصائي. (الشكل 4A، الجدول 1).

تركيزات الفلورايد في عظم الفخذ
في مجموعات العلاج بتركيز 0‑ppm، كانت تركيزات الفلورايد في عظم الفخذ أقل بكثير لدى المراهقين (292 ± 39 ppm) مقارنة بالحيوانات البالغة (896 ± 55 ppm) (p < 0.01). وفي المقابل، في مجموعات تركيز 125‑ppm، كانت تركيزات الفلورايد لدى المراهقين (4,108 ± 482 ppm) أعلى بكثير منها لدى الحيوانات البالغة (2,966 ± 612 ppm) (p = 0.04). أجريت المقارنات بين مجموعات المراهقين والبالغين باستخدام اختبار Mann–Whitney U مع تصحيح Bonferroni–Dunn للمقارنات المتعددة. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). (الشكل 4B، الجدول 1). يوضح الشكل 5A مقدار التغير في تركيز الفلورايد في عظم الفخذ بين علاجي 0‑ppm و 125‑ppm لكل مجموعة عمرية؛ حيث أظهر المراهقون زيادة بمقدار 14 ضعفاً في مستويات الفلورايد عند تركيز 125 ppm، بينما أظهرت الفئران البالغة زيادة بمقدار 3 أضعاف.

تركيزات الفلوريد في القواطع السفلية
في مجموعات 0 ppm، كانت تركيزات الفلوريد في القواطع السفلية أقل بكثير لدى المراهقين (35 ± 4 ppm) مقارنة بالحيوانات البالغة (123 ± 23 ppm) (p = 0.03). أما في مجموعات العلاج بـ 125 ppm، فقد ارتفعت تركيزات الفلوريد في القواطع إلى 5641 ± 955 ppm لدى المراهقين و4392 ± 1694 ppm لدى الحيوانات البالغة. أُجريت المقارنات بين مجموعتي المراهقين والبالغين باستخدام اختبار Mann–Whitney U مع تصحيح Bonferroni–Dunn للمقارنات المتعددة. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). (الشكل 4C، الجدول 1). وعلى الرغم من أن تركيزات الفلوريد المطلقة عند 125 ppm لم تختلف بشكل ملحوظ بين الفئات العمرية، إلا أن مقدار التغير (fold-change) من 0 ppm إلى 125 ppm كان أكبر بكثير لدى الفئران المراهقة (زيادة بمقدار 161 ضعفاً) مقارنة بالفئران البالغة (زيادة بمقدار 36 ضعفاً) (الشكل 5B).

تأثير الفلوريد على العظام: مخطط أعمدة يوضح التغير النسبي في عظم الفخذ والقاطع في العينات المراهقة والبالغة.
الشكل 5: تظهر الفئران المراهقة زيادة نسبية أكبر في تراكم الفلوريد في العظام والقواطع مقارنة بالفئران البالغة. التغير النسبي في تركيزات الفلوريد عند الانتقال من معالجة بـ 0 ppm إلى 125 ppm من الفلوريد في الفئران المراهقة (العمود المفتوح) والبالغة (العمود المظلل). (A) عظم الفخذ و(B) القاطع الفكي السفلي من مجموعات المعالجة نفسها. البيانات معبر عنها كمتوسطات ± SD. أُجريت المقارنات بين المجموعتين المراهقة والبالغة باستخدام اختبار t غير المزدوج. * p < 0.05، (N = 5/group). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

عينةمصلعظم الفخذالقاطع السفلي
الفئة العمريةالمراهقناضجالمراهقناضجالمراهقناضج
مجموعة العلاج0 جزء في المليون١٢٥ جزء في المليون0 جزء في المليون125 جزء في المليون0 جزء في المليون125 جزء في المليون 0 جزء في المليون١٢٥ جزء في المليون 0 جزء في المليون١٢٥ جزء في المليون٠ جزء في المليون١٢٥ جزء في المليون
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192لم يتم توفير نص للمراجعة أو الترجمة. يرجى تزويدنا بالنص المصدر باللغة الإنجليزية لنتمكن من البدء في عملية الترجمة العلمية إلى اللغة العربية.72711114909
المتوسط الحسابي< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
الانحراف المعياريلا يوجد نص للترجمة.0.2ليس هناك نص متاح للترجمة. يرجى تزويدي بالنص المصدر باللغة الإنجليزية للبدء في عملية الترجمة.0.239482556123955231694

الجدول 1: قياسات الفلوريد الفردية في المصل، وعظم الفخذ، والقواطع الفكية السفلية. يسرد الجدول 1 تركيزات الفلوريد الفردية (ppm F⁻) المقاسة في عينات المصل، وعظم الفخذ، والقواطع الفكية السفلية لفئران في مرحلتي المراهقة والنضج تعرضت إما لـ 0 ppm أو 125 ppm من الفلوريد. وبالنسبة لكل نوع من الأنسجة، تُعرض البيانات في أعمدة تقابل مجموعات العلاج الأربع: المراهقة 0 ppm، والمراهقة 125 ppm، والناضجة 0 ppm، والناضجة 125 ppm. يتضمن كل عمود القيم الفردية الخمس المسجلة (N = 5)، متبوعة بالمتوسط الحسابي والانحراف المعياري (SD) المحسوبين. وفي مجموعة المصل للمراهقين 0 ppm، كانت جميع القيم المسجلة أقل من حد الكشف للقطب الانتقائي للأيونات (<0.02 ppm). يوفر الجدول البيانات الرقمية الأولية التي تستند إليها قيم الملخص والمقارنات الإحصائية الموضحة في الشكل 4.

المناقشة

تم الحصول على قياسات الفلوريد باستخدام قطب انتقائي للأيونات (ISE) متخصص في الفلوريد يشتمل على غشاء بلوري من فلوريد اللانثانوم (LaF₃)38,39. يشكل هذا الغشاء روابط La–F مستقرة للغاية، مما يؤدي إلى تفضيل قوي لأيونات الفلوريد على الهاليدات الأخرى. ووفقاً للأدبيات الكهروكيميائية المعتمدة ومواصفات الشركة المصنعة، يظهر غشاء LaF₃ معاملات انتقائية منخفضة جداً للكلوريد، مما يشير إلى أن أيونات الكلوريد لا تسبب تداخلاً قابلاً للقياس في ظل الظروف المستخدمة في هذا البروتوكول. وعلى الرغم من وجود الكلوريد بشكل طبيعي في الأسنان والعظام، إلا أن نشاطه لا يؤثر على جهد القطب، وتكون الإشارة المسجلة انعكاساً لنشاط الفلوريد تحديداً. يتوافق حد الكشف الأدنى البالغ 0.02 ppm مع أدنى تركيز قابل للقياس الكمي والمثبت من قبل الشركة المصنعة لقطب Orion الانتقائي للفلوريد. ويعكس هذا الحد أدنى تركيز للفلوريد يحافظ عنده القطب على استجابة نيرنستية مستقرة وعلاقة خطية مع منحنى المعايرة. وبما أن حد الكشف محدد بخصائص غشاء القطب ومثبت من قبل الشركة المصنعة، لم تكن هناك حاجة إلى تحديد تجريبي إضافي لهذا البروتوكول؛ ومع ذلك، وفيما يتعلق بنطاق الكشف العلوي، لاحظ المؤلفون أن كتل الفلوريد التي تتجاوز 38,000 ng تقريباً في مصيدة NaOH بحجم 50 µL أدت إلى استجابة غير خطية للقطب، مما يشير إلى أن منحنى المعايرة لم يعد موثوقاً عند أحمال الفلوريد العالية جداً. ومن المرجح أن تعود هذه اللاخطية إلى تجاوز القوة الأيونية المثلى ونطاق النشاط للقطب في ظل الظروف التجريبية المحددة، بدلاً من أن تعكس حداً علوياً متأصلاً في الـ ISE نفسه. وبالنسبة للعينات المتوقع أن تحتوي على كتل من الفلوريد فوق هذه العتبة، يُنصح بزيادة حجم مصيدة NaOH للحفاظ على القياسات ضمن النطاق الديناميكي الخطي للقطب.

يجب مراعاة هذا الاعتبار عند تطبيق البروتوكول على العينات التي تحتوي على محتوى فلوريد مرتفع بشكل غير عادي. ونظراً لأن خطوة الانتشار تستهلك كامل حجم العينة، تعذر إجراء قياسات مكررة وتجارب الاسترداد بعد الإضافة (spike‑and‑recovery) على العينات البيولوجية. ولضمان الدقة التحليلية والضبط، تم إدراج معايير ضبط الجودة (QC) التي تحتوي على تركيزات معروفة من الفلوريد في كل سلسلة قياس. وقد تمت معالجة معايير ضبط الجودة هذه وقياسها بنفس طريقة العينات التجريبية. وفي جميع عمليات التشغيل، كانت تركيزات الفلوريد المقاسة لمعايير ضبط الجودة ضمن نطاق 5% باستمرار من قيمها المتوقعة. لكل سلسلة مكونة من 10–20 عينة من العينات المدروسة، تم تحضير مجموعتين مستقلتين من 5–6 عينات معايرة بالتوازي مع العينات المدروسة، وتم تسجيل منحنى معايرة قبل كل جلسة قياس. وتم ضبط نطاق المعايرة لكل عملية تشغيل لتقريب كتل الفلوريد المتوقعة في العينات المدروسة، والتي اعتمدت على نوع العينة، وكتلة المادة المضافة إلى طبق الانتشار، ومجموعة العلاج وعمر الحيوان. بالنسبة لقياسات المصل، كانت معايير المعايرة تقابل تركيزات فلوريد تبلغ حوالي 0.06–1.20 ppm في العينة. أما بالنسبة لقياسات العظام والأسنان، فقد كانت معايير المعايرة تقابل تركيزات فلوريد تبلغ حوالي 19–7,600 ppm في العينة.

يوفر هذا البروتوكول نهجاً حساساً وقابلاً للتكرار لتقدير كمية أيونات الفلوريد في المصل والعظام والأسنان باستخدام الانتشار المُيسّر بواسطة hexamethyldisiloxane متبوعاً بالتحليل باستخدام القطب الانتقائي للأيونات (ISE). وتعمل هذه الطريقة على التقاط الفلوريد المنطلق من مصفوفات بيولوجية متنوعة بشكل موثوق، وتسمح بالتقييم الكمي لتراكم الفلوريد بعد التعرض الخاضع للرقابة. وتظهر النتائج التمثيلية للفئران المراهقة والبالغة فروقاً واضحة تعتمد على العمر والجرعة في ترسب الفلوريد عبر الأنسجة، مما يؤكد فائدة هذا النهج لدراسة استقلاب الفلوريد والحركية السمية in vivo.

تكمن إحدى نقاط القوة الرئيسية في هذا البروتوكول في استخدام أطباق الانتشار التي تفصل مادياً بين تفاعل إطلاق الفلوريد والبيئة التي يتم فيها احتجاز الفلوريد. ويقلل التصميم المختوم بالفازلين (petrolatum) من التبادل الجوي ويضمن الالتقاط الفعال لأيونات الفلوريد المتحررة بواسطة قطرات هيدروكسيد الصوديوم الموجودة على الغطاء. ويوفر حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS قوة دفع قوية ومتسقة لإطلاق الفلوريد من الأنسجة المعدنية، بما في ذلك الهياكل عالية التكلس مثل العظام والأسنان. يتيح قياس ISE اللاحق، والمعاير بمعايير مطابقة للانتشار، تحديداً كمياً دقيقاً عبر نطاق ديناميكي واسع. وميزة أخرى لهذا النهج هي قدرته على تحديد كمية الفلوريد في العينات البيولوجية الصغيرة للغاية؛ حيث تنتج الأنسجة المعدنية من الفئران، وخاصة القواطع السفلية، ما يتراوح بين 3–5 mg فقط من الرماد لكل سن. وغالباً ما تتطلب الطرق التحليلية التقليدية كتل عينات أكبر أو محتوى فلوريد أعلى لتحقيق كشف موثوق. وفي المقابل، يعمل التصميم القائم على الانتشار على تركيز كل الفلوريد المتحرر من العينة بأكملها في حجم صغير ومحدد، مما يسمح بتحديد كمي دقيق حتى في العينات الضئيلة ذات الكتلة المطلقة المنخفضة من الفلوريد. وتعد هذه الميزة قيمة بشكل خاص للدراسات التي تشمل حيوانات صغيرة، أو توفر محدود للأنسجة، أو هياكل معدنية مستأصلة مجهرياً.

تتمثل إحدى القيود الأساسية لهذه الطريقة في حد الكشف الخاص بالقطب الانتقائي للأيونات (ISE) المستخدم في هذه الدراسة (0.02 ppm). فغالباً ما كانت عينات المصل المأخوذة من حيوانات التحكم الخالية من الفلوريد تقل عن هذا الحد، مما حال دون قياس التركيزات المنخفضة للغاية من الفلوريد. قد يتطلب الأمر زيادة كتلة أو حجم العينة المضافة إلى طبق الانتشار، في حال توفرها، أو استخدام تقنيات تحليلية بديلة عند قياس التركيزات الزهيدة القريبة من حد الكشف أو التي تقل عنه. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب هذه الطريقة عملية انتشار تستمر طوال الليل وتعاملاً دقيقاً مع الكواشف المسببة للتآكل، مما قد يحد من الإنتاجية في الدراسات ذات الأحجام الكبيرة. ورغم أن تقنية ISE توفر قياساً كمياً حساساً للفلوريد الكلي، إلا أنها لا تستطيع تقييم التوزيع المكاني داخل الأنسجة. لذا، يمكن دمج مناهج تكميلية، مثل المجهر الإلكتروني الماسح المقترن بمطيافية الأشعة السينية المشتتة للطاقة (SEM-EDX) أو انبعاث أشعة غاما المستحث بالجسيمات (PIGE)، لتصور ورسم خرائط توزيع الفلوريد على المقياسين المجهري والعياني. وتسمح هذه الأنماط القائمة على التصوير بتقييم تراكم الفلوريد الموضعي في الأنسجة المعدنية أو الرخوة، وبذلك تكمل قياسات ISE وتوفر تقييماً أكثر شمولاً لمحتوى الفلوريد في الأنسجة.

يمكن لعدة عوامل تقنية متكررة أن تؤثر على دقة وموثوقية انتشار الفلوريد وقياسه في هذا البروتوكول، وتبرز ملاحظاتنا كيف يساهم تحضير المعايرة، وإحكام إغلاق طبق الانتشار، والتحكم في pH، وأداء القطب الكهربائي، والتعامل مع العينات مجتمعة في تحديد جودة البيانات. تشمل الأسباب المحتملة لمنحنى معايرة غير خطي (R2 < 0.99) أو قراءات عينات الأنسجة خارج النطاق المتوقع، أخطاء في حساب حجم محلول NaF المخزون المضاف إلى طبق الانتشار أو أخطاء في الماصة أثناء تحضير معايير المعايرة. الإجراء الموصى به: تحضير مجموعتين مستقلتين على الأقل من عينات المعايرة لكل تشغيلة بحيث تتوفر مجموعة احتياطية في حال وقع منحنى معايرة واحد خارج النطاق المتوقع. قد يتسبب عدم إحكام إغلاق طبق الانتشار أيضاً في فقدان الفلوريد أثناء الانتشار، مما يؤدي إلى قراءات منخفضة بشكل زائف. يحدث هذا عادةً عند وضع كمية غير كافية من الفازلين على حافة غطاء طبق الانتشار. الإجراء الموصى به: وضع كمية وفيرة من هلام الفازلين حول حافة غطاء طبق الانتشار والضغط بقوة لضمان الإغلاق التام. يمكن أن تؤدي أخطاء الماصة عند إضافة محلول حمض الخليك إلى مصيدة NaOH إلى إزاحة pH العينة خارج النطاق الأمثل pH 5.0، مما يؤدي إلى استرداد غير دقيق للفلوريد. الإجراء الموصى به: فحص pH كل عينة باستخدام ورق pH والتخلص من أي عينة تقع خارج pH 5. قد تقع عينات المعايرة أيضاً خارج حدود التسجيل الصالحة للقطب الكهربائي الانتقائي للفلوريد؛ حيث تعتبر التركيزات الأقل من 0.02 ppm أدنى من حد كشف القطب الكهربائي. الإجراء الموصى به: عدم استخدام عينات معايرة تحتوي على أقل من 0.02 ppm من الفلوريد. وعلى العكس من ذلك، يمكن لعينات المعايرة ذات تركيزات الفلوريد العالية جداً أن تغير القوة الأيونية للمحلول وتنتج استجابات غير خطية للقطب الكهربائي. الإجراء الموصى به: في بداية المشروع، يتم تحضير محاليل معايرة تغطي نطاقاً واسعاً من تركيزات الفلوريد لتحديد نطاق العمل الخطي للقطب الكهربائي المحدد المستخدم. إذا تجاوزت عينات الأنسجة هذا النطاق الخطي، يتم تقليل كتلة الأنسجة أو زيادة حجم مصيدة NaOH وتعديل حجم حمض الخليك وفقاً لذلك للحفاظ على pH 5. في حال صعوبة الحصول على منحنيات معايرة خطية في نطاق 0.02–1 ppm: يكون السبب الشائع هو تقادم القطب الكهربائي، حيث تفقد الأقطاب الكهربائية الانتقائية للفلوريد القديمة حساسيتها عند تركيزات الفلوريد المنخفضة جداً. الإجراء الموصى به: استبدال القطب الكهربائي الانتقائي للفلوريد. تحدث قراءات مقياس الجهد غير المستقرة (انجراف أو قفز الإشارة) عادةً عندما لا يكون سطح الاستشعار في القطب الكهربائي مغموراً بالكامل في محلول العينة. الإجراء الموصى به: خفض القطب الكهربائي بحيث يكون سطح الاستشعار مغطى بالكامل بالعينة السائلة.

بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول نهجاً قوياً قائماً على المعايرة لتقدير كمية الفلوريد في مصفوفات بيولوجية متنوعة، وهو مناسب جداً للدراسات التي تبحث في التعرض للفلوريد، وترسبه في الأنسجة، والنتائج السمية في النماذج الفأرية.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عن عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم؛ زمالات JSPS للبحوث الخارجية 202560528 (S.Y.)، ومؤسسة دعم الأبحاث في ولاية ساو باولو (FAPESP)؛ 2024/07452-9 (J.S.T.)، والمعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه والجمجمة التابع للمعاهد الوطنية للصحة؛ R01DE027648 (M.S.) و K02DE029531 (M.S.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الأسيتيك، جليديSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
بوتقات الألوميناأدفاليو تكنولوجي (Advalue Technology)قطر خارجي 12 مم × 25 مم ارتفاع، AL-6212AL-6212
ميزان تحليليVWRVWR 124B2، د = 0.1 ملغم—
جهاز طحن العينات بالخرزالمعيار المرجعيBeadBug 6—
إبرة محقنة ذات طرف غير مدببأمازونإبرة ذات سن غير مدبب للأغراض الصناعية، 14 G × 0.5 بوصةX001TT8KX1
ثاني أكسيد الكربونإير غاز (AirGas)——
خزانة استخلاص الغازات الكيميائيةMott Manufacturingنموذج 7421040—
سكروز (+D)Thermo Scientific99.7% في الكيمياء الحيوية177142500
محلول ملء القطب الكهربائيThermo Scientificمحلول ملء Orion IonPlus900061
محلول الكحول الإيثيليKoptec140 درجة إثبات2401
مجمّد، −80 °CThermo Scientificسلسلة Revco RDE—
قفازات مقاومة للحرارةFisher Scientificقفازات Bel-Art Clavies للتعقيم بالبخار والمواد الخطرة بيولوجياًH13201
هيكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
بيروكسيد الهيدروجينVWRJ.T. Baker، بنسبة 30%2204-01
قطب انتقائي للأيوناتThermo Scientificقطب انتقائي للأيونات من Orion للفلووريد، ثنائي القناة9609BNWP
خلاط مغناطيسيVWRجهاز تحريك 360—
ملعقة مسطحة دقيقةأمازونملعقة نحت الشمع رقم 7A، من الفولاذ المقاوم للصدأ—
جهاز طرد مركزي دقيقEppendorf5427R5404000131
فرن التخميدThermo Scientificفرن مَفْلَة صغير لسطح المختبر من Thermolyne، سعة 1.3 لتر، طراز FB1315MFB1315M
فرنBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
محلول البارافورمالدهيد في المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS)Thermo Scientific4% بارافورمالدهيد في المحلول الملحي الملحّ بالـ PBSJ19943-K2
طبق بتريVWR60 × 15 مم، غير معالج25384-092
فازلين (Petrolatum)Thermo Scientificفازلين، أبيض، نقي417090010
ورق كاشف الأس الهيدروجيني (pH)Fisher ScientificpH-Fix 4.5–10.092120.3
طبق بورسلينFisher Scientificبوطقة Fisherbrand، سعة 5 مل، ارتفاع 20 مم، شكل مرتفعFB-965-B
مقياس الجهد الكهربائيThermo Scientificمقياس Orion Dual Star لدرجة الحموضة والأقطاب الانتقائية للأيونات (pH/ISE)2115102
حامل حلقي مع ماسكVWRمشبك حلقي، 15 سم470104-526
نظام غذائي للقوارضBio-ServF1515, AIN-76A, ½ الرواسبF1515
رافعة مقصيةأمازونرافعة المقص المختبرية—
قمع فصلFisher ScientificEisco، زجاج بوروسيليكات، 2 لترS89285
كلوريد الصوديومFisher Scientificمعتمد من الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS)، بلوريS271-1
فلوريد الصوديومFisher Scientificمعتمد من الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS)، مسحوقS299-100
هيدروكسيد الصوديومFisher Scientificكبيبات بيضاءBP359-500
خرز الفولاذ المقاوم للصدأFisher ScientificScientific Industries، 5 مم، 100 قطعةSI-CS05
حمض الكبريتيكFisher Scientificدرجة الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS Grade)A300-500
TISAB IIThermo Scientificمحلول تطبيق Orion IonPlus940909
مجفف بالتفريغFisher Scientificمجفف فراغي موفر للمساحة من Bel-Art، مقاس 10 بوصاتF42010-0000
مرشح تفريغFisher Scientificمرشح علوي للقارورة من نوع Flow، بولي إيثر سلفون (PES)، 90 مم، 0.2 µm597-4520
هزاز متغير السرعةميدساي (MidSci)LabDoctor / Benchmark Scientific—

المراجع

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
  2. Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O'Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2
  3. Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885
  4. Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273
  5. Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279
  6. Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038
  7. Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302
  8. Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629
  9. Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.
  10. Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948
  11. Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.
  12. Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.
  13. Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200
  14. Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600
  15. Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.
  16. Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436
  17. Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495
  18. Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2
  19. Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.
  20. Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486
  21. Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.
  22. Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.
  23. Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.
  24. Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2
  25. Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.
  26. Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339
  27. Martínez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657
  28. Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.
  29. Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.
  30. Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.
  31. Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.
  32. Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.
  33. Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.
  34. Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.
  35. Kučera J, Štefánik, M. & Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.
  36. Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583
  37. Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.
  38. Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.
  39. Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تقدير كمية الفلوريدالانتشار بمساعدة HMDSفلوريد المصلفلوريد العظامفلوريد الأسنانالعينات البيولوجيةالمنحنى القياسيالترسيب النسيجي
تقدير كمية الفلوريد في المصل والعظام والأسنان في نموذج فئران باستخدام الانتشار المُيسَّر بواسطة هيكساميثيل دي سيلوكسان وقياسات القطب الانتقائي للأيونات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.