مقالة منهجية

تقدير كمية الفلوريد في المصل والعظام والأسنان في نموذج فئران باستخدام الانتشار المُيسَّر بواسطة هيكساميثيل دي سيلوكسان وقياسات القطب الانتقائي للأيونات

20 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/71488

⸱

أغسطس 28, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تحضير أطباق الانتشار المسهلة بواسطة الهكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS)، يليه قياسات القطب الانتقائي للأيونات لتقدير كتلة أيونات الفلوريد في مصل الدم والعظام والأسنان للفئران. توفر هذه الطريقة نهجاً حساساً قائماً على المعايرة لتقييم تراكم الفلوريد في العينات البيولوجية.

الملخص

يعد تقدير مستويات الفلورايد في الأنسجة البيولوجية أمراً أساسياً لفهم التعرض للفلورايد وعمليات استقلابه وسميته. يصف هذا البروتوكول طريقة حساسة وقابلة للتكرار لقياس كتلة أيونات الفلورايد في المصل والعظام والأسنان باستخدام الانتشار المُيسّر بواسطة الهيكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS) متبوعاً بالتحليل باستخدام القطب الانتقائي للأيونات (ISE). يتم جمع العينات البيولوجية، بما في ذلك المصل وعظم الفخذ والقواطع الفكية، من فئران تعرضت لمعالجات محكومة من الفلورايد. يتم تحويل عينات العظام والأسنان إلى رماد، ثم طحنها وترطيبها، بينما يتم معالجة المصل مباشرة. تُنقل كل عينة إلى طبق انتشار يحتوي على ماء فائق النقاء ويُغلق بغطاء مبطن بالبترولاتوم يحتوي على قطرات من هيدروكسيد الصوديوم التي تعمل كمصائد للفلورايد. يؤدي حقن حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS إلى بدء تحرر الفلورايد وانتشاره، مما يسمح بالتقاط أيونات الفلورايد المتحررة كمياً في المصائد. بعد عملية الانتشار التي تستمر طوال الليل، تُجمع قطرات مصيدة الفلورايد في عينة واحدة، وتُحمض لتصل إلى نطاق pH المطلوب، وتُضبط إلى حجم محدد لقياسها بواسطة ISE. وتعمل أطباق انتشار المعايرة المُحضرة بكتل معروفة من الفلورايد على إنشاء منحنى قياسي للتقدير الكمي، بينما تتحقق عينات مراقبة الجودة من استقرار القطب. تظهر النتائج التمثيلية للفئران في مرحلتي المراهقة والنضج التي تعرضت لـ 0 أو 125 ppm من الفلورايد قدرة هذه الطريقة على اكتشاف الاختلافات المعتمدة على العمر والجرعة في مستويات الفلورايد عبر المصل والعظام والأسنان. يوفر هذا البروتوكول نهجاً قوياً قائماً على المعايرة لتقدير كمية الفلورايد في مصفوفات بيولوجية متنوعة، وهو مناسب جداً للدراسات التي تبحث في التعرض للفلورايد، وترسبه في الأنسجة، والنتائج السمية في النماذج الفأرية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه الطريقة في قدرتها على تقدير كمية الفلورايد بدقة في العينات الصغيرة جداً، بما في ذلك 3–5 mg من الرماد المستخلص من القواطع الفردية للفئران، لأن عملية الانتشار تركّز كل الفلورايد المتحرر في حجم عينة قابل للقياس يقل عن 100 µL.

المقدمة

يعد الفلوريد أنيوناً يوجد بشكل طبيعي، ويعمل المستوى الأمثل منه بفعالية في الوقاية من تسوس الأسنان1,2,3,4,5. وفي الولايات المتحدة (U.S.)، تم تطبيق فلورة مياه المجتمع بتركيز 0.7 ppm كاستراتيجية للصحة العامة لتقليل معدلات الإصابة بالتسوس وتعزيز صحة الفم6. ومع ذلك، فإن تناول كميات مفرطة من الفلوريد لفترات طويلة يمكن أن يؤثر سلباً على أنسجة متعددة؛ حيث يؤدي التعرض العالي للفلوريد إلى اضطراب تكوين المينا7,8,9، وتغيير تكوين العظام10، والإضرار بسلامة الهيكل العظمي11.

على المستوى الخلوي، يؤدي التعرض للفلووريد إلى حدوث عدة اضطرابات أيضية، بما في ذلك الإجهاد التأكسدي12، وإجهاد الشبكة الإندوبلازمية13، وتعديلات فوق جينية تغير التعبير الجيني14، والموت الخلوي المبرمج في الخلايا المينائية15,16,17,18. وعلى الصعيد العالمي، تشكل التركيزات المرتفعة من الفلووريد في المياه الجوفية (>1.5 ppm) مصدر قلق صحي كبير. وقد قدرت دراسة حديثة للنمذجة التنبؤية أن ما يقرب من 180 مليون شخص حول العالم قد يتأثرون بالتعرض المفرط للفلووريد، مع تركز العبء الأكبر في آسيا وأفريقيا1. وبالإضافة إلى مياه الشرب، يحدث التعرض للفلووريد أيضاً من خلال الأطعمة (مثل المأكولات البحرية؛ ~1.9 ppm)، والمشروبات (مثل الشاي؛ 0.5–6 ppm19)، ومنتجات العناية بالأسنان مثل معجون الأسنان20 (1,000–1,500 ppm).

لذلك، يعد فهم التعرض للفلوريد واستقلابه وترسبه في الأنسجة أمرًا ضروريًا لتقييم كل من فوائده العلاجية وآثاره السمية المحتملة. ويعد التقدير الكمي الدقيق للفلوريد في العينات البيولوجية — بما في ذلك البول والمصل والعظام والأسنان — مكونًا حيويًا في هذا العمل. ومع ذلك، فإن القياس يمثل تحديًا تحليليًا نظرًا للسلوك الكيميائي للفلوريد وألفته القوية للمصفوفات الغنية بالكالسيوم. ويستقر ما يقرب من 99% من فلوريد الجسم في الأنسجة المعدنية مثل العظام والأسنان21. ولمواجهة هذه التحديات، تم تطوير مجموعة متنوعة من التقنيات التحليلية، بما في ذلك قياس الجهد باستخدام القطب الانتقائي للأيونات (ISE)، والكروماتوغرافيا الأيونية، والمقاييس اللونية، وإجراءات المعايرة، والطرق النووية أو القائمة على التنشيط22. ومن بين هذه التقنيات، برزت تقنية الانتشار المسهل بواسطة الهكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS) مقترنة بالقياس باستخدام القطب الانتقائي للفلوريد كواحد من أكثر النهج موثوقية واستخدامًا للمصفوفات البيولوجية نظرًا لحساسيتها وقابلية تكرار نتائجها وتوافقها مع أنواع العينات المتنوعة23,24,25,26,27,28,29.

على الرغم من توفر طرق تحليلية متعددة، إلا أن كل نهج يعاني من قيود قد تحد من استخدامه في الأبحاث التجريبية أو السريرية. يوفر الكروماتوغرافيا الأيونية حساسية وانتقائية عاليتين، ولكنه يتطلب أجهزة متخصصة وتحضيراً مكثفاً للعينات30,31. أما المقاييس اللونية، مثل طريقة SPADNS (sodium 2‑(parasulfophenylazo)‑1,8-dihydroxynaphthalene-3,6‑disulfonate)، فهي بسيطة وغير مكلفة، ولكنها عرضة للتداخل من العكارة والكروموفورات الداخلية، مما يحد من موثوقيتها في العينات البيولوجية المعقدة22,32,33. وتعد طرق المعايرة ذات تكلفة منخفضة ومباشرة، ولكنها تفتقر إلى الحساسية المطلوبة للكشف عن آثار الفلوريد في معظم العينات البيولوجية34. وتوفر التقنيات النووية أو القائمة على التنشيط حساسية استثنائية، ولكنها تتطلب الوصول إلى مفاعلات أو مصادر نيوترونية قائمة على المسرعات، مما يجعلها غير عملية للاستخدام المختبري الروتيني35. وفي المقابل، يوفر الانتشار المسهل بواسطة HMDS متبوعاً بقياس ISE توازناً عملياً بين الحساسية والتكلفة وسهولة الوصول، مع ضمان التحرير الكامل للفلوريد من الأنسجة الرخوة والمعدنية على حد سواء. وهذا مفيد بشكل خاص للدراسات التي تشمل الحيوانات الصغيرة، حيث تكون كمية الأنسجة المتاحة محدودة، وتنتج الهياكل المعدنية مثل القواطع في الفئران ما بين 3–5 mg فقط من الرماد لكل سن.

تتيح قدرة طريقة الانتشار–ISE على تركيز كل الفلوريد المتحرر في حجم صغير ومحدد إجراء تقدير كمي دقيق حتى في العينات الصغيرة للغاية. وهذا يجعل هذه الطريقة مناسبة تماماً لدراسات الحركية السمية، وتجارب الاستجابة للجرعة، وأبحاث استقلاب الفلوريد عبر المراحل النمائية. وقد استُخدمت القوارض الصغيرة، وبخاصة فئران C57BL/6J، على نطاق واسع كنماذج حيوانية لدراسة تأثيرات الفلوريد7,9,12,29,36 .

في هذا البروتوكول، يطبق المؤلفون تقنية الانتشار المُسهل بواسطة HMDS متبوعة بقياس القطب الانتقائي للفلوريد لتقدير كمية الفلوريد في المصل والعظام والأسنان التي جُمعت من فئران تعرضت لجرعة عالية من الفلوريد (125 ppm) مقارنة بمجموعات ضابطة غير معالجة. كما يقارن المؤلفون تراكم الفلوريد في الفئران المراهقة (6 أسابيع عند بدء العلاج) والفئران البالغة (18 أسبوعاً عند بدء العلاج) لتقييم الاختلافات المعتمدة على العمر في استقلاب الفلوريد وترسبه في الأنسجة. وقد تم اختيار القواطع السفلية كنسيج سني ممثل لأن القواطع لدى القوارض تبزغ باستمرار وتصل إلى حالة توازن مستقر بين البزوغ والتآكل الإطباقي بحلول الأسبوع السابع تقريباً من العمر. يوفر نمط النمو المستمر هذا تدرجاً ثابتاً ومتاحاً لتطور المينا، مما يجعل القواطع الفأرية نموذجاً واسع الاستخدام ومعتمداً للبحث في تكوين المينا وتفلور الأسنان.

البروتوكول

لقد تم إجراء جميع الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول وفقاً للإرشادات واللوائح الخاصة باستخدام الحيوانات الفقارية والمعتمدة من قبل لجنة الرعاية والاستخدام المؤسسية للحيوانات (IACUC) في جامعة نوفا ساوث إيسترن (بروتوكول رقم 2023.02.MSuz1)، المعتمدة من قبل الجمعية الدولية لتقييم واعتماد الرعاية الصحية للحيوانات المختبرية (AAALAC). وقد التزم جميع العمل الذي أُجري على الحيوانات بدليل الرعاية والاستخدام للحيوانات المختبرية وإرشادات الجمعية الطبية البيطرية الأمريكية (AVMA) لقتل الحيوانات رحمةً. جميع المواد المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. الحيوانات و تحضير وإعطاء فلوريد الصوديوم في نموذج فأري

  1. الحيوانات: يتم توزيع ذكور الفئران من سلالة C57BL/6J على فئتين عمريتين: المراهقة (6 أسابيع عند بدء العلاج)، والبالغة (18 أسبوعاً عند بدء العلاج).
    1. يتم تزويد كل مجموعة إما بماء منزوع الأيونات وخالٍ من الفلوريد (0 ppm F⁻) أو ماء شرب مدعم بفلوريد الصوديوم (125 ppm F⁻) لمدة فترة تعرض تبلغ 6 أسابيع.
    2. يتم تضمين خمسة حيوانات في كل حالة عمرية وعلاجية (N = 5/group).
    3. في نهاية فترة التعرض، يتم جمع المصل وعظام الفخذ والقواطع الفكية السفلية، وتجهيز جميع العينات التي تم جمعها للتحليلات اللاحقة.
      ​ملاحظة: العينة: المواد المعالجة مثل العظام المرمَدة، والأسنان المرمَدة، والمصل.
  2. إيواء الحيوانات والنظام الغذائي: يتم إيواء الفئران في ظروف مختبرية قياسية مع إتاحة الغذاء والماء ad libitum (بحرية).
    1. يتم توفير نظام غذائي خالٍ من الفلوريد بدءاً من أسبوع واحد قبل جمع الأسنان والعظام والمصل لتقليل مستويات الفلوريد الخلفية.
  3. ماء الشرب المضاف إليه فلوريد الصوديوم
    1. لتحضير ماء الشرب المدعم بالفلوريد، يُذاب فلوريد الصوديوم (NaF) في ماء منزوع الأيونات للوصول إلى تركيز الفلوريد المطلوب (مثلاً 125 ppm F⁻).
    2. يُرشح المحلول عبر مرشح تفريغ بمسامية 0.2 µm في زجاجة معقمة بالـ autoclave. يتم تحضير محلول جديد كل يومين.
      تحذير: مادة NaF سامة في حال بلعها وقد تسبب تهيجاً للجلد والعينين. يجب التعامل معها داخل خزانة استخلاص الغازات (fume hood) مع ارتداء معطف المختبر، وقفازات النتريل، ونظارات السلامة.
  4. بالنسبة لماء التحكم الخالي من الفلوريد، يتم ترشيح الماء منزوع الأيونات عبر مرشح تفريغ بمسامية 0.2 µm في زجاجة معقمة بالـ autoclave. يتم تحضير ماء جديد كل يومين.
  5. يتم توفير ماء الشرب المدعم بالفلوريد أو الخالي منه ad libitum للمدة المطلوبة لعلاج الفلوريد. يتم مراقبة مستويات المياه يومياً واستبدال الزجاجات كل يومين.
  6. في نهاية فترة التعرض، يتم قتل الحيوانات رحيماً باستخدام استنشاق ثاني أكسيد الكربون (CO₂) يليه فصل الرأس. تم إجراء عمليات القتل الرحيم وفقاً لإرشادات AVMA للقتل الرحيم للحيوانات وتم اعتمادها كجزء من بروتوكول IACUC المؤسسي.
    تحذير: غاز CO2 مادة مسببة للاختناق. يجب إجراء العمليات في منطقة جيدة التهوية والتأكد من عمل الغرفة بشكل صحيح. تجنب التعرض المباشر للاستنشاق.

2. تحضير العينة لقياس الفلوريد

  1. جمع الدم
    1. يتم القتل الرحيم للفئران عن طريق استنشاق CO₂ وجمع الدم فوراً عبر وخز القلب النهائي باستخدام حقنة توبيركولين سعة 1 mL. يُنقل الدم إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL. يتم التخلص من جميع الإبر والحقن المستخدمة في حاوية نفايات الأدوات الحادة المعتمدة في المؤسسة.
      تنبيه: إبر الحقن حادة وقد تسبب إصابات وخز؛ يجب التعامل معها بحذر.
    2. يُحفظ الدم لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة، ثم يُوضع في جهاز الطرد المركزي لمدة 10 min عند 2,000 × g.
    3. يُنقل السائل الطافي (المصل) إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ويُحفظ عند −80 °C.
      تنبيه: تشكل المجمدات ذات الحرارة المنخفضة جداً مخاطر الإصابة بلسعات الصقيع. يجب ارتداء قفازات عازلة عند التعامل مع الأنابيب وتجنب ملامسة الجلد لفترات طويلة للأسطح الباردة.
  2. العظام
    1. استخراج عظام الفخذ: بعد القتل الرحيم، يتم تشريح الأرجل الخلفية عند مفاصل الورك.
    2. تُزال جميع الأنسجة الرخوة بعناية من عظام الفخذ. تُغسل الأنسجة ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات. تُحفظ العظام عند -80 °C لحين المعالجة اللاحقة. يتم التخلص من الأنسجة الرخوة المزالة وأي مواد ملوثة في مجرى النفايات البيولوجية الخاص بالمؤسسة.
      ملاحظة: يمكن تثبيت الأنسجة في 4% بارافورمالدهيد مع 2% سكروز لمدة 12–16 h للتخزين طويل الأمد في 70% إيثانول. لا يؤثر إجراء التثبيت هذا على دقة تقدير كمية الفلوريد اللاحقة.
    3. تُشطف العظام جيداً بالماء منزوع الأيونات. تُجفف الرطوبة الزائدة باستخدام مناديل ورقية خالية من الوبر.
    4. تُنقل العظام إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL بأغطية مفتوحة للسماح بالتبخر، وتوضع في فرن تجفيف عند 60 °C لمدة 12–16 h.
      تنبيه: قد يسبب فرن التجفيف حروقاً. يجب استخدام قفازات مقاومة للحرارة عند التعامل مع العينات.
    5. تتريف العظام: تُنقل العظام المجففة إلى بوتقات ألومينا. توضع البوتقات في فرن مَفْحم وتُسخن إلى 600 °C بمعدل 150 °C/h، ثم تُترك لمدة 6 h. يُترك الفرن ليبرد إلى ما دون 200 °C قبل إخراج البوتقات. يتم التخلص من أي شظايا عظمية متبقية أو مستهلكات ملوثة في مجرى النفايات البيولوجية الخاص بالمؤسسة.
      تنبيه: يصل الفرن المَفْحم والبوتقات إلى درجات حرارة قصوى، مما يشكل خطراً شديداً بحدوث حروق. يجب دائماً ترك الفرن ليبرد قبل التعامل مع البوتقات. عند إخراج البوتقات، يجب ارتداء معطف المختبر ونظارات السلامة وقفازات مقاومة للحرارة، واستخدام ملاقط طويلة لتجنب الملامسة المباشرة للأسطح الساخنة.
      خطوة حرجة: سيؤدي التتريف غير المكتمل إلى التأثير سلباً على التحليلات اللاحقة. يجب التحقق من وصول المادة العظمية إلى حالة أكسدة كاملة قبل المتابعة؛ حيث إن أي كربون متبقٍ سيتداخل مع القياسات اللاحقة.
      ​ملاحظة: يجب أن يظهر العظم المُتَرَّف بشكل صحيح بلون رمادي فاتح إلى أبيض بشكل موحد. تشير الجزيئات الداكنة — خاصة البقايا السوداء أو الشبيهة بالفحم — إلى احتراق غير مكتمل. في حال وجود تغير في اللون، يتم تمديد مدة التتريف للسماح بالإزالة الكاملة للمواد العضوية.
    6. تخزين العظام المُتَرَّفة: فور الانتهاء من التتريف، تُنقل العظام إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL. تُغلق الأنابيب بـ Parafilm وتُحفظ في مجفف فراغي حتى الاستخدام.
  3. الأسنان
    1. استخراج القواطع السفلية: يتم إجراء قطع أفقي عند مستوى المفصل الفكي الصدغي لفصل الفك السفلي عن الفك العلوي.
    2. يتم إجراء قطوع سهمية وسطية لتقسيم كل من الفك العلوي والسفلي إلى نصفين أيمن وأيسر.
    3. تُغسل الأنسجة ثلاث مرات بالماء منزوع الأيونات وتُستخرج القواطع السفلية بعناية. تُحفظ القواطع المستخرجة عند -80 °C لحين الاستخدام اللاحق. يتم التخلص من الأنسجة الرخوة المستخرجة وأي مستهلكات ملوثة في مجرى النفايات البيولوجية الخاص بالمؤسسة.
      تنبيه: استخدم أدوات التشريح الحادة بحذر عند إجراء القطوع في المفصل الفكي الصدغي والمستوى السهمي الوسطي لتجنب الإصابة الشخصية. يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر ونظارات السلامة.
      ملاحظة: يمكن تثبيت الأنسجة في 4% بارافورمالدهيد مع 2% سكروز لمدة 12–16 h للتخزين طويل الأمد في 70% إيثانول. لا يؤثر إجراء التثبيت هذا على دقة تقدير كمية الفلوريد اللاحقة.
    4. تجهيز الأسنان للتتريف: تُشطف الأسنان جيداً بالماء منزوع الأيونات وتوضع في 1% بيروكسيد الهيدروجين (H₂O₂) لمدة 12–16 h. يتم التخلص من محاليل بيروكسيد الهيدروجين المستهلكة كنفايات كيميائية خطرة.
    5. تُشطف مرة أخرى بالماء منزوع الأيونات، وتُجفف لفترة وجيزة باستخدام منديل خالي من الوبر، ثم تُنقل إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL بأغطية مفتوحة. توضع الأنابيب في فرن تجفيف عند 60 °C لمدة 12–16 h.
      تنبيه: بيروكسيد الهيدروجين مادة مؤكسدة وقد يسبب تهيج الجلد والعينين. يجب التعامل معه في خزانة استرداد الأبخرة (fume hood) مع ارتداء معطف المختبر وقفازات النتريل ونظارات السلامة. تجنب ملامسته للمواد القابلة للاحتراق.
    6. تتريف الأسنان: تُنقل الأسنان المجففة إلى بوتقات ألومينا وتُتَرَّف في فرن مَفْحم عند درجة حرارة استقرار 600 °C لمدة 20 h، باستخدام معدل رفع حراري قدره 150 °C/h.
    7. تُخرج البوتقات فقط بعد أن يبرد الفرن إلى ما دون 200 °C.
      تنبيه: يصل الفرن المَفْحم والبوتقات إلى درجات حرارة قصوى، مما يشكل خطراً شديداً بحدوث حروق. اترك الفرن يبرد إلى ما دون 200 °C قبل التعامل مع البوتقات. عند إخراج البوتقات، ارتدِ معطف المختبر ونظارات السلامة وقفازات مقاومة للحرارة، واستخدم ملاقط طويلة لتجنب الملامسة المباشرة للأسطح الساخنة.
      خطوة حرجة: تأكد من الأكسدة الكاملة؛ حيث إن الكربون المتبقي سيتداخل مع التحليلات اللاحقة.
      ملاحظة: يجب أن تظهر مادة الأسنان المُتَرَّفة بلون رمادي فاتح إلى أبيض بشكل موحد. يُعاد التتريف إذا بقيت رواسب سوداء.
    8. تخزين عينات الأسنان المُتَرَّفة: فور الانتهاء من التتريف، تُنقل الأسنان إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة ذات قاع مستدير سعة 2 mL.
    9. تُغلق الأنابيب بـ Parafilm وتُحفظ في مجفف فراغي حتى الاستخدام.

3. تحضير أطباق الانتشار المسهلة بواسطة HMDS

  1. الكواشف والمواد
    1. حمض الكبريتيك 6 N: قبل يومين على الأقل من تحضير أطباق الانتشار، قم بإعداد محلول مخزون من حمض الكبريتيك 6 N.
      ملاحظة: طبق الانتشار: وعاء محكم الإغلاق مصمم لإنشاء بيئة مغلقة خاضعة للتحكم، حيث يمكن التقاط المكونات المنطلقة من مادة بيولوجية معالجة بواسطة مصيدة كيميائية مثبتة في الغطاء. يمنع التصميم المحكم التبادل مع الهواء الخارجي ويضمن توجيه المواد التحليلية المنطلقة نحو المصيدة لقياسها لاحقاً.
    2. ضع بيكر بلاستيكي سعة 1 L مع قضيب تحريك مغناطيسي على جهاز خلط مغناطيسي وأضف 416 mL من الماء فائق النقاء.
    3. باستخدام ماصة سيرولوجية سعة 50 mL، أضف ببطء 84 mL من H₂SO₄ بتركيز 36 N إلى الماء مع التحريك المستمر. سيصبح المحلول ساخناً؛ اتركه ليبرد حتى درجة حرارة الغرفة. تخلص من أي محاليل حمض كبريتيك غير مستخدمة أو مستنفدة كنفايات كيميائية خطرة وفقاً لنظام تدفق النفايات الكيميائية في المؤسسة.
      تنبيه: حمض الكبريتيك مادة أكالة للغاية. تعامل معه داخل خزانة استخلاص الأبخرة مع ارتداء قفازات مقاومة للأحماض، ومئزر مختبر، ونظارات واقية. في حالة الملامسة، اشطف المنطقة فوراً بكميات وفيرة من الماء.
    4. حمض الكبريتيك 6 N المشبع بـ HMDS: انقل حمض الكبريتيك 6 N إلى قمع فصل سعة 2 L وأضف 15 mL من هكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS).
    5. تأكد من إغلاق السدادة والصنبور بإحكام، وأمسك قمع الفصل بشكل جانبي، ورجّه بقوة حتى تظهر قطرات صغيرة من HMDS.
    6. افتح السدادة لتحرير الغاز المتصاعد وكرر العملية مرتين إضافيتين.
    7. اترك السدادة مفتوحة قليلاً لعدة ساعات. احفظ قمع الفصل الذي يحتوي على حمض الكبريتيك 6 N المشبع بـ HMDS في حامل داخل خزانة استخلاص الأبخرة الكيميائية. تخلص من حمض الكبريتيك المحتوي على HMDS والمواد الملوثة كنفايات كيميائية خطرة.
      تنبيه: مادة HMDS قابلة للاشتعال وسامة عن طريق الاستنشاق. تعامل معها في خزانة استخلاص الأبخرة مع ارتداء مئزر مختبر، وقفازات، ونظارات واقية. تحفظ بعيداً عن مصادر الاشتعال.
    8. هيدروكسيد الصوديوم 0.05 N: أذب 1 g من حبيبات NaOH في 25 mL من الماء فائق النقاء لتحضير محلول مخزون بتركيز 1 N.
    9. اخلط 2 mL من محلول NaOH المخزون 1 N مع 38 mL من الماء فائق النقاء للحصول على محلول NaOH بتركيز 0.05 N.
    10. قسم محلول NaOH بتركيز 0.05 N إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL للاستخدام الواحد، وثبّت الأغطية بـ Parafilm، واحفظ الأنابيب في مجفف فراغي لتقليل امتصاص CO₂. تخلص من محاليل هيدروكسيد الصوديوم غير المستخدمة أو المستنفدة كنفايات كيميائية خطرة.
      تنبيه: هيدروكسيد الصوديوم مادة كاوية للغاية ويمكن أن تسبب حروقاً شديدة. ارتدِ مئزر مختبر، وقفازات، ونظارات واقية. تعامل مع المحاليل بحذر لتجنب الرذاذ.
    11. حمض الأسيتيك 0.2 N: أضف 575 µL من حمض الأسيتيك الثلجي إلى ماء فائق النقاء واضبط الحجم النهائي إلى 50 mL لتحضير حمض أسيتيك 0.2 N. تخلص من محاليل حمض الأسيتيك كنفايات كيميائية خطرة.
      تنبيه: حمض الأسيتيك مادة أكالة وقد يسبب تهيجاً للجلد والعينين والجهاز التنفسي. تعامل معه في خزانة استخلاص أبخرة كيميائية مع ارتداء مئزر مختبر، وقفازات، ونظارات واقية.
    12. الفازلين (Petrolatum): صهر حوالي 100 g من الفازلين عند 60 °C في فرن. اسحب الفازلين السائل في محاقن سعة 10 mL واتركه ليبرد ويتصلب. يمكن تخزين المحاقن المملوءة بالفازلين في درجة حرارة الغرفة لعدة أسابيع.
    13. أطباق بتري: استخدم أطباق بتري غير معالجة مقاس 60 × 15 mm لتحضير أطباق الانتشار.
    14. اصنع ثقباً صغيراً في غطاء طبق بتري باستخدام إبرة محقنة 18-G مسخنة.
    15. غطِّ الحافة الداخلية للغطاء بطبقة مستمرة من الفازلين كختم باستخدام محقنة سعة 10 mL مزودة بإبرة غير مدببة 14 G. تخلص من جميع الإبر المستخدمة في حاوية نفايات حادة معتمدة في المؤسسة.
      تنبيه: إبر المحاقن حادة ويمكن أن تسبب إصابات ثقبية. تعامل معها بحذر وتخلص منها في حاويات الأدوات الحادة المعتمدة. عند تسخين الإبر، ارتدِ قفازات مقاومة للحرارة وواقيات للعين لمنع الحروق.
    16. المحاليل المخزونة من NaF لأطباق انتشار المعايرة. أذب 4.19 g من NaF في 1 L من الماء فائق النقاء لتحضير محلول مخزون بتركيز 100 mM. حضّر محاليل مخزونة بتركيزات 10 mM و100 µM و10 µM عن طريق تخفيفات متسلسلة بنسبة 1:10 من محلول 100 mM.
      ملاحظة: مول واحد من NaF يوفر 19 g من F⁻؛ وبالتالي، فإن 1 µL من 10 µM NaF يحتوي على 0.19 ng من F⁻، و 1 µL من 10 mM NaF يحتوي على 190 ng من F⁻.
      ​ملاحظة: أطباق انتشار المعايرة: أطباق انتشار تستخدم خصيصاً للمعايرة بكتلة معروفة من أيونات الفلوريد (F¯).
  2. تحضيرات أطباق الانتشار الخاصة بكل عينة
    1. طبق انتشار المصل: انقل 3 mL من الماء فائق النقاء إلى قاع طبق بتري وأضف 75 µL من المصل. تخلص من أي مواد ملوثة بالمصل في نظام النفايات البيولوجية في المؤسسة. تابع بالخطوة 3.4.
    2. طبق انتشار العظام
      1. سحق رماد العظام: استخدم ملعقة دقيقة لطحن العظام الرمادية داخل أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 mL حتى تصبح مسحوقاً ناعماً. ابدأ بمعالجة رماد العظام المسحوق على الفور. تخلص من المواد الاستهلاكية الملوثة برماد العظام في نظام النفايات الكيميائية في المؤسسة.
      2. وزن وترطيب رماد العظام
        1. ضع القاع الفارغ لطبق بتري على كفة وزن ميزان تحليلي بدقة قراءة 0.1 mg على الأقل.
        2. انقل رماد العظام المطحون من أنبوبة الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 mL إلى طبق بورسلين صغير لتقليل الشحنة الاستاتيكية ومنع تشتت المسحوق.
        3. باستخدام ملعقة دقيقة، أضف حوالي 5 mg من رماد العظام إلى الطبق وغطِّ المسحوق فوراً بـ 3 mL من الماء فائق النقاء قبل إزالة الطبق من الميزان التحليلي لتجنب تشتت الرماد.
        4. سجل الوزن الدقيق لكل عينة من رماد العظام. تابع بالخطوة  3.4.
    3. طبق انتشار الأسنان
      1. طحن الأسنان الرمادية
        1. انقل القواطع الرمادية إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة مستديرة القاع سعة 2 mL وأضف خرزة من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 5 mm إلى كل أنبوبة. أغلق الأنابيب وثبّت الأغطية بـ Parafilm.
        2. اسحق القواطع الرمادية في جهاز bead beater بسرعة 2,500 rpm لمدة 10 s. ابدأ بمعالجة الأسنان المطحونة على الفور.
      2. وزن وترطيب الأسنان الرمادية
        1. صب كامل محتويات الأنبوبة، بما في ذلك خرزة الفولاذ المقاوم للصدأ، في قاع طبق الانتشار الموضوع على كفة وزن ميزان تحليلي. تخلص من المواد الاستهلاكية الملوثة التي تحتوي على رماد الأسنان في نظام النفايات الكيميائية في المؤسسة.
        2. أزل خرزة الفولاذ المقاوم للصدأ من الطبق وسجل الوزن الدقيق لرماد الأسنان (عادة ما يكون 3–4 mg لكل قاطع فكي سفلي).
        3. أضف فوراً 3 mL من الماء فائق النقاء لتغطية رماد الأسنان قبل إزالة الطبق من الميزان لمنع تشتت الرماد الناتج عن التفريغ الاستاتيكي. تابع بالخطوة  3.4.
  3. أطباق انتشار المعايرة ومراقبة الجودة
    1. بالتوازي مع أطباق انتشار العينات، حضّر مجموعتين من أطباق انتشار المعايرة لمعايرة من 5 إلى 6 نقاط، ومجموعة واحدة مطابقة من أطباق انتشار مراقبة الجودة، بما في ذلك عينة فارغة (blank).
      ملاحظة: أطباق انتشار مراقبة الجودة: تحضر بشكل مطابق لأطباق انتشار المعايرة ولكنها تستخدم بشكل دوري للتحقق من استقرار القطب الكهربائي وضمان أداء قياس متسق.
    2. انقل 3 mL من الماء فائق النقاء في كل من 11 أو 13 طبق بتري وأضف محلول NaF المخزون لتغطية نطاق كتلة F¯ المتوقع في عينات العينات. تابع بالخطوة  3.4 لإكمال تجميع طبق الانتشار37.
  4. إكمال تجميع طبق الانتشار
    1. لبناء ترسب مصيدة الفلوريد، يتم إضافة 50 µl من NaOH بتركيز 0.05 N على شكل ثلاث قطرات على السطح الداخلي لغطاء طبق بتري، بعيداً عن حافة الغطاء.
      ملاحظة: مصيدة الفلوريد (F¯ Trap): مكون في أطباق الانتشار يقوم باحتجاز F¯، وهو تحديداً هيدروكسيد الصوديوم (NaOH).
    2. اقلب الغطاء دون تحريك قطرات NaOH وأحكم إغلاقه على قاع الطبق باستخدام الفازلين.
    3. لتحضير محلول حمض الكبريتيك 3 N المشبع بـ HMDS، اخلط أحجاماً متساوية من حمض الكبريتيك 6 N المشبع بـ HMDS والماء فائق النقاء. حضّر المحلول طازجاً قبل الاستخدام مباشرة، حيث لا يمكن تخزينه.
    4. احقن 3 mL من حمض الكبريتيك 3 N المشبع بـ HMDS المحضر عبر الثقب الموجود في الغطاء إلى الماء الموجود في قاع طبق الانتشار باستخدام محقنة 10 ml مزودة بإبرة 20 G. احرص على عدم رشق الحمض على السطح الداخلي للغطاء عند إدخال إبرة المحقنة أو سحبها.
    5. انتشار الفلوريد بتسهيل من HMDS: أغلق ثقب الحقن فوراً بقطرة من الفازلين تغطي الفتحة تماماً، وضع أطباق الانتشار على جهاز هزاز متغير السرعة (variable rocker) مضبوط على سرعة بطيئة. يتم التحضين طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (الشكل 1).

figure-protocol-1
الشكل 1: مخطط لطبق انتشار العظام لاستخلاص الفلوريد واحتجازه. يوضح الشكل 1 تصميم طبق انتشار العظام الذي تم تجميعه في طبق بتري غير معالج بمقاس 60 × 15 mm. يحتوي الغطاء على فتحة حقن صغيرة محكمة الغلق بخرزة من البترولاتوم. وعلى السطح الداخلي للغطاء، توضع ثلاث قطرات من NaOH كمصائد لأيونات الفلوريد (F⁻)، حيث تكون معلقة من الغطاء أثناء عملية الانتشار. يتم إغلاق الغطاء بإحكام لمنع تسرب الهواء إلى قاعدة الطبق باستخدام البترولاتوم. ويحتوي قاع طبق بتري على ماء فائق النقاء، وحمض كبريتيك مشبع بالهيكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS)، ورماد العظام، والتي تشكل معاً بيئة التفاعل لتحرير الفلوريد واحتجازه لاحقاً. تم إنشاء هذا الشكل بواسطة المؤلفين باستخدام Biorender، والشكل مرخص بموجب رخصة CC BY. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. قياس الفلوريد باستخدام قطب انتقائي للأيونات (ISE)

  1. تجهيز القطب الانتقائي للأيونات (ISE)
    1. املأ القطب الانتقائي للفلوريد ثنائي القناة بمحلول الملء المناسب، ثم صِله بجهاز مقياس الجهد (potentiometer)، وثبّت القطب في حامل الأقطاب.
    2. ضع طبق بتري غير معالج على رافعة مقصية أسفل سطح الاستشعار الخاص بالقطب، مع التأكد من أن سطح الاستشعار موازٍ لقاع طبق بتري، ثم ارفع طاولة الرافعة المقصية بحيث يكون طبق بتري ملامساً للقطب تقريباً (الشكل 2).
  2. تحضير العينات للقياس
    ملاحظة: العينات: يُشار في هذا البروتوكول بكلمة "العينات" فقط إلى المنتجات النهائية المقاسة باستخدام القطب الانتقائي للأيونات (ISE)، والمكونة من مصيدة F¯ بعد الانتشار، والتي دُمجت لاحقاً مع حمض الأسيتيك والماء. 
    1. لضبط pH العينة عند 5، أخرج طبق الانتشار من الهزاز وارفع الغطاء بعناية عن طريق كسر سدادة البترولاتوم بعد انتهاء فترة التحضين. اقلب الغطاء على سطح مستوٍ، مع التأكد من بقاء قطرات مصيدة F¯ الثلاث دون تحريك.
    2. أضف 15–20 µL من حمض الأسيتيك بتركيز 0.2 N إلى قطرة واحدة باستخدام ماصة P20، ثم ادمج القطرات الثلاث جميعها في قطرة واحدة دون تغيير طرف الماصة.
      ملاحظة: تميل العينات ذات تركيزات F¯ العالية إلى امتلاك pH ابتدائي أقل، وبالتالي تتطلب كمية أقل من حمض الأسيتيك بتركيز 0.2 N لضبط pH عند 5 مقارنة بالعينات التي تحتوي على F¯ أقل. ونظراً لأن حجم العينة المتبقي بعد تسجيل جهد القطب (الخطوة 5.3) يكون ضئيلاً، استخدم أي كمية متبقية من العينة للتحقق من pH باستخدام ورق كاشف.
    3. لضبط حجم العينة، اضبط ماصة P100 على 75 µL، واسحب الحجم الكامل لمصيدة F¯ دون إدخال هواء، واضبط العينة لتصبح 75 µL تماماً باستخدام مياه فائقة النقاء.
    4. نفذ هذه الخطوة بعناية لضمان دقة الحجم اللازم لحسابات تركيز الفلوريد. احتفظ بالعينة في طرف الماصة وانتقل فوراً إلى الخطوة 4.3.
  3. قياس العينات، والمعايرة، وعينات ضبط الجودة
    1. لقياس جهد القطب للعينة، وزّعها بين سطح الاستشعار للقطب الانتقائي للفلوريد وطبق بتري. تأكد من أن سطح الاستشعار الكامل للقطب مغمور تماماً في السائل، دون ملامسة طبق بتري مباشرة. اترك جهاز مقياس الجهد حتى يستقر وسجّل الجهد (mV) المعروض بواسطة ISE.
    2. حدد منحنى المعايرة القياسي عن طريق قياس المجموعة الأولى من معايير المعايرة بالتتابع، بدءاً من أدنى تركيز لـ F¯ وصولاً إلى أعلى تركيز.
      1. ارسم جهد القطب (mV) مقابل لوغاريتم F¯ (ng) لإنشاء منحنى المعايرة (الشكل 3). طبق الانحدار الأسي للحصول على معادلة المنحنى القياسي ومعامل التحديد (R2). تُقبل منحنيات المعايرة فقط عندما تكون قيمة R2 ≥ 0.99.
    3. قس كل عينة من العينات وسجّل جهد القطب (mV).
    4. لمراقبة استقرار القطب والكشف عن أي انزياح محتمل في المقايسة، قس عينات ضبط الجودة على فترات متقطعة خلال كل دورة تحليلية.
      1. قارن قيم عينات ضبط الجودة مباشرة مع عينات المعايرة المقابلة وتأكد من التوافق في حدود 5% تقريباً للتحقق من استقرار أداء القطب بمرور الوقت.
      2. قس دورياً طبق انتشار فارغاً (Blank) للتأكد من عدم وجود تلوث بالفلوريد أثناء التعامل مع العينات والانتشار.
  4. لحساب كتلة F¯(ng) في كل عينة، استخدم معادلة المنحنى القياسي. ثم اقسم هذه الكتلة على حجم (µL) المصل، أو كتلة (mg) رماد العظام أو الأسنان المضاف إلى طبق الانتشار.
    1. مثال لحساب تركيز F¯ في رماد العظام (ng/mg)
      1. كتلة رماد العظام المضافة إلى طبق الانتشار: 5.1 mg؛ جهد القطب لعينة حجمها 75 µL: –31.6 mV
      2. الخطوة 1: حساب كتلة الفلوريد باستخدام معادلة المعايرة
        1. كتلة F⁻ (ng) = 3505.4 x e(-0.043x-31.6)
        2. كتلة F⁻ (ng) = 13,641 ng
      3. الخطوة 2: حساب تركيز الفلوريد في رماد العظام
        1. تركيز F⁻ =  13,641 ng  /  5.1  mg
        2. تركيز F⁻ =  2,675 ng / mg (ppm)

figure-protocol-2
الشكل 2: مخطط لإعداد قياس القطب الانتقائي للأيونات (ISE). يوضح الشكل 2 التكوين المستخدم لقياسات أيون الفلوريد باستخدام قطب انتقائي للأيونات (ISE) مزدوج القناة. يتم وضع طبق بتري على رافعة مقصية للسماح بالضبط الدقيق لارتفاعه بالنسبة للقطب. يتصل الـ ISE بمقياس جهد كهربائي ويوجه بحيث يكون سطح الاستشعار موازياً لمستوى طبق بتري، مع الحفاظ على مسافة تبلغ حوالي 1–2 mm. بعد تحديد المسافة، يتم سحب حجم صغير من العينة (75 µL) بالماصة في الفجوة الموجودة بين سطح الاستشعار وطبق بتري، مع ضمان تغطية العينة لمنطقة استشعار القطب بالكامل أثناء القياس. تم إنشاء هذا الشكل من قبل المؤلفين باستخدام Biorender، والشكل مرخص بموجب رخصة CC BY. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-3
الشكل 3: منحنى المعايرة وجدول المعايرة المقابل لتقدير كمية كتلة أيونات الفلوريد في عينات من أسنان. اللوحة العلوية: مثال لمنحنى معايرة مستخدم لتحديد كتلة أيونات الفلوريد في عينات من أسنان. يوضح المحور السيني جهد القطب (mV، مقياس خطي)، ويوضح المحور الصادي كتلة أيونات الفلوريد المقابلة (ng F⁻، مقياس لوغاريتمي). تم رسم نقاط المعايرة المقاسة كخط متصل، بينما يظهر انحدار الأسي المجهز كخط منقط. ويعرض مربع داخلي معادلة المنحنى القياسي ومعامل التحديد (R2 = 0.99). اللوحة السفلية: جدول يحتوي على القيم العددية المستخدمة لإنشاء منحنى المعايرة. يسرد الصف الأول جهود الأقطاب الخمسة (mV) المسجلة لعينات المعايرة. ويوفر الصف الثاني كتل أيونات الفلوريد المقابلة (ng F⁻) لكل عينة معايرة. ويسرد الصف الثالث أحجام (µL) المحلول المخزون من NaF بتركيز 10 mM المضافة إلى أطباق انتشار المعايرة؛ وتكافئ كتلة أيونات الفلوريد المضافة هذه الكتلة المحتجزة في كل عينة معايرة بعد الانتشار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

لتوضيح تطبيق هذا البروتوكول لقياس تركيزات الفلوريد (F-) في المواد البيولوجية، تم إنشاء عينات من المصل والعظم والقواطع السفلية التي جُمعت من فئران تعرضت لمعالجات محكومة بالفلوريد. تم تقسيم ذكور الفئران من سلالة C57BL/6J إلى فئتين عمريتين، المراهقة (6 أسابيع) والبالغة (18 أسبوعاً)، ووُفر لها إما مياه منزوعة الأيونات خالية من الفلوريد (0 ppm F⁻) أو مياه شرب مدعمة بفلوريد الصوديوم (125 ppm F⁻) لمدة تعرض استمرت 6 أسابيع. تضمنت كل حالة عمرية وعلاجية خمسة حيوانات. وفي نهاية فترة التعرض، تم استخلاص المصل وعظام الفخذ والقواطع السفلية، ثم جُهزت عينات المواد وحُللت وفقاً للبروتوكول. وفيما يلي ملخص لتركيزات الفلوريد التمثيلية التي قيست في المصل والعظم والأسنان.

figure-results-1
الشكل 4تراكيز الفلوريد المقاسة في المصل، وعظم الفخذ، والقواطع السفلية. تم توزيع ذكور الفئران من سلالة C57BL/6J على فئتين عمريتين: المراهقة (6 أسابيع، شريط مفتوح) والبالغة (18 أسبوعاً، شريط ممتلئ)، وزُوِّدت إما بمياه منزوعة الأيونات خالية من الفلوريد (0 جزء في المليون من F⁻) أو مياه شرب مدعمة بفلوريد الصوديوم (125 جزء في المليون من F⁻) لمدة فترة تعريض استمرت 6 أسابيع. وفي نهاية فترة التعريض، تم قياس مستويات الفلوريد في (أ) المصل، و(ب) عظم الفخذ، و(ج) القواطع السفلية من مجموعات العلاج نفسها. وكانت قيم المصل التي تقل عن حد الكشف (<(0.02 جزء في المليون) وتم رسمها بيانياً للتوضيح ولكن استُبعدت من التحليل الإحصائي. عُبِّر عن البيانات في صورة متوسطات ± الانحراف المعياري. أُجريت المقارنات بين مجموعتي المراهقين والبالغين باستخدام اختبار مان-ويتني يو (Mann–Whitney U test) مع تطبيق تصحيح بونفروني-دان (Bonferroni–Dunn correction) للمقارنات المتعددة. *p < 0.05, **p < 0.01 (العدد = 5/مجموعة). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تركيزات الفلوريد في المصل
في كل من المجموعتين المراهقة والبالغة اللتين عولجتا بـ 0 ppm من الفلوريد، كانت تركيزات الفلوريد في المصل أقل من حد الكشف الخاص بالقطب الانتقائي للأيونات (<0.02 ppm). وفي مجموعات العلاج بـ 125 ppm، ارتفع مستوى الفلوريد في المصل إلى 0.3 ± 0.2 ppm في المجموعة المراهقة وإلى 0.7 ± 0.2 ppm في المجموعة البالغة (p = 0.06).أُجريت المقارنة بين المجموعة المراهقة والمجموعة البالغة في علاج 125 ppm باستخدام اختبار Mann–Whitney U مع تصحيح Bonferroni–Dunn للمقارنات المتعددة. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). استُبعدت مجموعات العلاج بـ 0 ppm من التحليل الإحصائي. (الشكل 4A، الجدول 1).

تركيزات الفلوريد في عظم الفخذ
في مجموعات العلاج بـ 0‑ppm، كانت تركيزات الفلوريد في عظم الفخذ أقل بكثير لدى المراهقين (292 ± 39 ppm) مقارنة بالحيوانات البالغة (896 ± 55 ppm) (p < 0.01). وفي المقابل، في مجموعات 125‑ppm، كانت تركيزات الفلوريد لدى المراهقين (4,108 ± 482 ppm) أعلى بكثير منها لدى الحيوانات البالغة (2,966 ± 612 ppm) (p = 0.04). أُجريت المقارنات بين مجموعات المراهقين والبالغين باستخدام اختبار Mann–Whitney U مع تصحيح Bonferroni–Dunn للمقارنات المتعددة. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). (الشكل 4B، الجدول 1). يوضح الشكل 5A مقدار التغير (fold‑change) في فلوريد عظم الفخذ بين علاجي 0‑ppm و 125‑ppm لكل مجموعة عمرية. أظهر المراهقون زيادة بمقدار 14 ضعفاً في مستويات الفلوريد عند 125 ppm، بينما أظهرت الفئران البالغة زيادة بمقدار 3 أضعاف.

تركيزات الفلوريد في القواطع السفلية
في مجموعات 0 ppm، كانت تركيزات الفلوريد في القواطع السفلية أقل بكثير لدى المراهقين (35 ± 4 ppm) مقارنة بالحيوانات البالغة (123 ± 23 ppm) (p = 0.03). وفي مجموعات العلاج بتركيز 125 ppm، ارتفعت تركيزات الفلوريد في القواطع إلى 5641 ± 955 ppm لدى المراهقين و4392 ± 1694 ppm لدى الحيوانات البالغة. أُجريت المقارنات بين مجموعات المراهقين والبالغين باستخدام اختبار Mann–Whitney U مع تصحيح Bonferroni–Dunn للمقارنات المتعددة. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/group). (الشكل 4C، الجدول 1). وعلى الرغم من أن تركيزات الفلوريد المطلقة عند 125 ppm لم تختلف بشكل ملحوظ بين الفئات العمرية، إلا أن معامل التغير (fold-change) من 0 ppm إلى 125 ppm كان أكبر بكثير لدى الفئران المراهقة (زيادة بمقدار 161 ضعفاً) مقارنة بالفئران البالغة (زيادة بمقدار 36 ضعفاً) (الشكل 5B).

figure-results-2
الشكل 5: يُظهر المراهقون زيادة مضاعفة أكبر في تراكم الفلورايد في العظام والقواطع مقارنة بالفئران البالغة. التغير المضاعف في تركيزات الفلورايد من علاج بـ 0 ppm إلى 125 ppm من الفلورايد في الفئران المراهقة (العمود المفتوح) والبالغة (العمود الممتلئ). (A) عظم الفخذ و (B) القاطع الفكي السفلي من نفس مجموعات العلاج. تم التعبير عن البيانات كمتوسطات ± SD. أُجريت المقارنات بين المجموعات المراهقة والبالغة باستخدام اختبار t غير المزدوج. * p < 0.05، (N = 5/group). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

العينةالمصلعظم الفخذالقاطع السفلي
الفئة العمريةمراهقبالغمراهقبالغمراهقبالغ
مجموعة العلاج0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192N/A72711114909
المتوسط< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
الانحراف المعياريNA0.2NA0.239482556123955231694

الجدول 1: قياسات الفلوريد الفردية في المصل، وعظم الفخذ، والقواطع الفكية السفلية. يدرج الجدول 1 تركيزات الفلوريد الفردية (ppm F⁻) المقاسة في عينات المصل، وعظم الفخذ، والقواطع الفكية السفلية من الفئران المراهقة والبالغة التي تعرضت إما لـ 0 ppm أو 125 ppm من الفلوريد. وبالنسبة لكل نوع من الأنسجة، يتم عرض البيانات في أعمدة مقابلة لمجموعات العلاج الأربع: مراهقة 0 ppm، ومراهقة 125 ppm، وبالغة 0 ppm، وبالغة 125 ppm. ويتضمن كل عمود القيم الفردية الخمس المسجلة (N = 5)، متبوعة بمتوسط الحساب والانحراف المعياري (SD). وفي مجموعة مصل الفئران المراهقة 0 ppm، كانت جميع القيم المسجلة أقل من حد الكشف الخاص بالقطب الانتقائي للأيونات (<0.02 ppm). ويوفر الجدول البيانات الرقمية الخام التي تستند إليها قيم الملخص والمقارنات الإحصائية الموضحة في الشكل 4.

المناقشة

تم الحصول على قياسات الفلوريد باستخدام قطب انتقائي للأيونات (ISE) متخصص في الفلوريد يشتمل على غشاء بلوري من فلوريد اللانثانوم (LaF₃)38,39. يشكل هذا الغشاء روابط La–F مستقرة للغاية، مما يؤدي إلى تفضيل قوي لأيونات الفلوريد على الهاليدات الأخرى. ووفقاً للأدبيات الكهروكيميائية المعتمدة ومواصفات الشركة المصنعة، يظهر غشاء LaF₃ معاملات انتقائية منخفضة جداً للكلوريد، مما يشير إلى أن أيونات الكلوريد لا تسبب تداخلاً قابلاً للقياس في ظل الظروف المستخدمة في هذا البروتوكول. وعلى الرغم من وجود الكلوريد بشكل طبيعي في الأسنان والعظام، إلا أن نشاطه لا يؤثر على جهد القطب، وتكون الإشارة المسجلة انعكاساً لنشاط الفلوريد تحديداً. يتوافق حد الكشف الأدنى البالغ 0.02 ppm مع أدنى تركيز قابل للقياس الكمي والمثبت من قبل الشركة المصنعة لقطب Orion الانتقائي للفلوريد. ويعكس هذا الحد أدنى تركيز للفلوريد يحافظ عنده القطب على استجابة نيرنستية مستقرة وعلاقة خطية مع منحنى المعايرة. وبما أن حد الكشف محدد بخصائص غشاء القطب ومثبت من قبل الشركة المصنعة، لم تكن هناك حاجة إلى تحديد تجريبي إضافي لهذا البروتوكول؛ ومع ذلك، وفيما يتعلق بنطاق الكشف العلوي، لاحظ المؤلفون أن كتل الفلوريد التي تتجاوز 38,000 ng تقريباً في مصيدة NaOH بحجم 50 µL أدت إلى استجابة غير خطية للقطب، مما يشير إلى أن منحنى المعايرة لم يعد موثوقاً عند أحمال الفلوريد العالية جداً. ومن المرجح أن تعود هذه اللاخطية إلى تجاوز القوة الأيونية المثلى ونطاق النشاط للقطب في ظل الظروف التجريبية المحددة، بدلاً من أن تعكس حداً علوياً متأصلاً في الـ ISE نفسه. وبالنسبة للعينات المتوقع أن تحتوي على كتل من الفلوريد فوق هذه العتبة، يُنصح بزيادة حجم مصيدة NaOH للحفاظ على القياسات ضمن النطاق الديناميكي الخطي للقطب.

يجب مراعاة هذا الاعتبار عند تطبيق البروتوكول على العينات التي تحتوي على محتوى فلوريد مرتفع بشكل غير عادي. ونظراً لأن خطوة الانتشار تستهلك كامل حجم العينة، تعذر إجراء قياسات مكررة وتجارب الاسترداد بعد الإضافة (spike‑and‑recovery) على العينات البيولوجية. ولضمان الدقة التحليلية والضبط، تم إدراج معايير ضبط الجودة (QC) التي تحتوي على تركيزات معروفة من الفلوريد في كل سلسلة قياس. وقد تمت معالجة معايير ضبط الجودة هذه وقياسها بنفس طريقة العينات التجريبية. وفي جميع عمليات التشغيل، كانت تركيزات الفلوريد المقاسة لمعايير ضبط الجودة ضمن نطاق 5% باستمرار من قيمها المتوقعة. لكل سلسلة مكونة من 10–20 عينة من العينات المدروسة، تم تحضير مجموعتين مستقلتين من 5–6 عينات معايرة بالتوازي مع العينات المدروسة، وتم تسجيل منحنى معايرة قبل كل جلسة قياس. وتم ضبط نطاق المعايرة لكل عملية تشغيل لتقريب كتل الفلوريد المتوقعة في العينات المدروسة، والتي اعتمدت على نوع العينة، وكتلة المادة المضافة إلى طبق الانتشار، ومجموعة العلاج وعمر الحيوان. بالنسبة لقياسات المصل، كانت معايير المعايرة تقابل تركيزات فلوريد تبلغ حوالي 0.06–1.20 ppm في العينة. أما بالنسبة لقياسات العظام والأسنان، فقد كانت معايير المعايرة تقابل تركيزات فلوريد تبلغ حوالي 19–7,600 ppm في العينة.

يوفر هذا البروتوكول نهجاً حساساً وقابلاً للتكرار لتقدير كمية أيونات الفلوريد في المصل والعظام والأسنان باستخدام الانتشار المُيسّر بواسطة hexamethyldisiloxane متبوعاً بالتحليل باستخدام القطب الانتقائي للأيونات (ISE). وتعمل هذه الطريقة على التقاط الفلوريد المنطلق من مصفوفات بيولوجية متنوعة بشكل موثوق، وتسمح بالتقييم الكمي لتراكم الفلوريد بعد التعرض الخاضع للرقابة. وتظهر النتائج التمثيلية للفئران المراهقة والبالغة فروقاً واضحة تعتمد على العمر والجرعة في ترسب الفلوريد عبر الأنسجة، مما يؤكد فائدة هذا النهج لدراسة استقلاب الفلوريد والحركية السمية in vivo.

تكمن إحدى نقاط القوة الرئيسية في هذا البروتوكول في استخدام أطباق الانتشار التي تفصل مادياً بين تفاعل إطلاق الفلوريد والبيئة التي يتم فيها احتجاز الفلوريد. ويقلل التصميم المختوم بالفازلين (petrolatum) من التبادل الجوي ويضمن الالتقاط الفعال لأيونات الفلوريد المتحررة بواسطة قطرات هيدروكسيد الصوديوم الموجودة على الغطاء. ويوفر حمض الكبريتيك المشبع بـ HMDS قوة دفع قوية ومتسقة لإطلاق الفلوريد من الأنسجة المعدنية، بما في ذلك الهياكل عالية التكلس مثل العظام والأسنان. يتيح قياس ISE اللاحق، والمعاير بمعايير مطابقة للانتشار، تحديداً كمياً دقيقاً عبر نطاق ديناميكي واسع. وميزة أخرى لهذا النهج هي قدرته على تحديد كمية الفلوريد في العينات البيولوجية الصغيرة للغاية؛ حيث تنتج الأنسجة المعدنية من الفئران، وخاصة القواطع السفلية، ما يتراوح بين 3–5 mg فقط من الرماد لكل سن. وغالباً ما تتطلب الطرق التحليلية التقليدية كتل عينات أكبر أو محتوى فلوريد أعلى لتحقيق كشف موثوق. وفي المقابل، يعمل التصميم القائم على الانتشار على تركيز كل الفلوريد المتحرر من العينة بأكملها في حجم صغير ومحدد، مما يسمح بتحديد كمي دقيق حتى في العينات الضئيلة ذات الكتلة المطلقة المنخفضة من الفلوريد. وتعد هذه الميزة قيمة بشكل خاص للدراسات التي تشمل حيوانات صغيرة، أو توفر محدود للأنسجة، أو هياكل معدنية مستأصلة مجهرياً.

تتمثل إحدى القيود الأساسية لهذه الطريقة في حد الكشف الخاص بالقطب الانتقائي للأيونات (ISE) المستخدم في هذه الدراسة (0.02 ppm). فغالباً ما كانت عينات المصل المأخوذة من حيوانات التحكم الخالية من الفلوريد تقل عن هذا الحد، مما حال دون قياس التركيزات المنخفضة للغاية من الفلوريد. قد يتطلب الأمر زيادة كتلة أو حجم العينة المضافة إلى طبق الانتشار، في حال توفرها، أو استخدام تقنيات تحليلية بديلة عند قياس التركيزات الزهيدة القريبة من حد الكشف أو التي تقل عنه. بالإضافة إلى ذلك، تتطلب هذه الطريقة عملية انتشار تستمر طوال الليل وتعاملاً دقيقاً مع الكواشف المسببة للتآكل، مما قد يحد من الإنتاجية في الدراسات ذات الأحجام الكبيرة. ورغم أن تقنية ISE توفر قياساً كمياً حساساً للفلوريد الكلي، إلا أنها لا تستطيع تقييم التوزيع المكاني داخل الأنسجة. لذا، يمكن دمج مناهج تكميلية، مثل المجهر الإلكتروني الماسح المقترن بمطيافية الأشعة السينية المشتتة للطاقة (SEM-EDX) أو انبعاث أشعة غاما المستحث بالجسيمات (PIGE)، لتصور ورسم خرائط توزيع الفلوريد على المقياسين المجهري والعياني. وتسمح هذه الأنماط القائمة على التصوير بتقييم تراكم الفلوريد الموضعي في الأنسجة المعدنية أو الرخوة، وبذلك تكمل قياسات ISE وتوفر تقييماً أكثر شمولاً لمحتوى الفلوريد في الأنسجة.

يمكن لعدة عوامل تقنية متكررة أن تؤثر على دقة وموثوقية انتشار الفلوريد وقياسه في هذا البروتوكول، وتبرز ملاحظاتنا كيف يساهم تحضير المعايرة، وإحكام إغلاق طبق الانتشار، والتحكم في pH، وأداء القطب الكهربائي، والتعامل مع العينات مجتمعة في تحديد جودة البيانات. تشمل الأسباب المحتملة لمنحنى معايرة غير خطي (R2 < 0.99) أو قراءات عينات الأنسجة خارج النطاق المتوقع، أخطاء في حساب حجم محلول NaF المخزون المضاف إلى طبق الانتشار أو أخطاء في الماصة أثناء تحضير معايير المعايرة. الإجراء الموصى به: تحضير مجموعتين مستقلتين على الأقل من عينات المعايرة لكل تشغيلة بحيث تتوفر مجموعة احتياطية في حال وقع منحنى معايرة واحد خارج النطاق المتوقع. قد يتسبب عدم إحكام إغلاق طبق الانتشار أيضاً في فقدان الفلوريد أثناء الانتشار، مما يؤدي إلى قراءات منخفضة بشكل زائف. يحدث هذا عادةً عند وضع كمية غير كافية من الفازلين على حافة غطاء طبق الانتشار. الإجراء الموصى به: وضع كمية وفيرة من هلام الفازلين حول حافة غطاء طبق الانتشار والضغط بقوة لضمان الإغلاق التام. يمكن أن تؤدي أخطاء الماصة عند إضافة محلول حمض الخليك إلى مصيدة NaOH إلى إزاحة pH العينة خارج النطاق الأمثل pH 5.0، مما يؤدي إلى استرداد غير دقيق للفلوريد. الإجراء الموصى به: فحص pH كل عينة باستخدام ورق pH والتخلص من أي عينة تقع خارج pH 5. قد تقع عينات المعايرة أيضاً خارج حدود التسجيل الصالحة للقطب الكهربائي الانتقائي للفلوريد؛ حيث تعتبر التركيزات الأقل من 0.02 ppm أدنى من حد كشف القطب الكهربائي. الإجراء الموصى به: عدم استخدام عينات معايرة تحتوي على أقل من 0.02 ppm من الفلوريد. وعلى العكس من ذلك، يمكن لعينات المعايرة ذات تركيزات الفلوريد العالية جداً أن تغير القوة الأيونية للمحلول وتنتج استجابات غير خطية للقطب الكهربائي. الإجراء الموصى به: في بداية المشروع، يتم تحضير محاليل معايرة تغطي نطاقاً واسعاً من تركيزات الفلوريد لتحديد نطاق العمل الخطي للقطب الكهربائي المحدد المستخدم. إذا تجاوزت عينات الأنسجة هذا النطاق الخطي، يتم تقليل كتلة الأنسجة أو زيادة حجم مصيدة NaOH وتعديل حجم حمض الخليك وفقاً لذلك للحفاظ على pH 5. في حال صعوبة الحصول على منحنيات معايرة خطية في نطاق 0.02–1 ppm: يكون السبب الشائع هو تقادم القطب الكهربائي، حيث تفقد الأقطاب الكهربائية الانتقائية للفلوريد القديمة حساسيتها عند تركيزات الفلوريد المنخفضة جداً. الإجراء الموصى به: استبدال القطب الكهربائي الانتقائي للفلوريد. تحدث قراءات مقياس الجهد غير المستقرة (انجراف أو قفز الإشارة) عادةً عندما لا يكون سطح الاستشعار في القطب الكهربائي مغموراً بالكامل في محلول العينة. الإجراء الموصى به: خفض القطب الكهربائي بحيث يكون سطح الاستشعار مغطى بالكامل بالعينة السائلة.

بشكل عام، يوفر هذا البروتوكول نهجاً قوياً قائماً على المعايرة لتقدير كمية الفلوريد في مصفوفات بيولوجية متنوعة، وهو مناسب جداً للدراسات التي تبحث في التعرض للفلوريد، وترسبه في الأنسجة، والنتائج السمية في النماذج الفأرية.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عن عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم الأبحاث الواردة في هذا المنشور من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم؛ زمالات JSPS للبحوث الخارجية 202560528 (S.Y.)، ومؤسسة دعم الأبحاث في ولاية ساو باولو (FAPESP)؛ 2024/07452-9 (J.S.T.)، والمعهد الوطني لأبحاث الأسنان والوجه والجمجمة التابع للمعاهد الوطنية للصحة؛ R01DE027648 (M.S.) و K02DE029531 (M.S.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الأسيتيك، جليديSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
بوتقات الألوميناأدفاليو تكنولوجي (Advalue Technology)قطر خارجي 12 مم × 25 مم ارتفاع، AL-6212AL-6212
ميزان تحليليVWRVWR 124B2، د = 0.1 ملغم—
جهاز طحن العينات بالخرزالمعيار المرجعيBeadBug 6—
إبرة محقنة ذات طرف غير مدببأمازونإبرة ذات سن غير مدبب للأغراض الصناعية، 14 G × 0.5 بوصةX001TT8KX1
ثاني أكسيد الكربونإير غاز (AirGas)——
خزانة استخلاص الغازات الكيميائيةMott Manufacturingنموذج 7421040—
سكروز (+D)Thermo Scientific99.7% في الكيمياء الحيوية177142500
محلول ملء القطب الكهربائيThermo Scientificمحلول ملء Orion IonPlus900061
محلول الكحول الإيثيليKoptec140 درجة إثبات2401
مجمّد، −80 °CThermo Scientificسلسلة Revco RDE—
قفازات مقاومة للحرارةFisher Scientificقفازات Bel-Art Clavies للتعقيم بالبخار والمواد الخطرة بيولوجياًH13201
هيكساميثيل ديسيلوكسان (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
بيروكسيد الهيدروجينVWRJ.T. Baker، بنسبة 30%2204-01
قطب انتقائي للأيوناتThermo Scientificقطب انتقائي للأيونات من Orion للفلووريد، ثنائي القناة9609BNWP
خلاط مغناطيسيVWRجهاز تحريك 360—
ملعقة مسطحة دقيقةأمازونملعقة نحت الشمع رقم 7A، من الفولاذ المقاوم للصدأ—
جهاز طرد مركزي دقيقEppendorf5427R5404000131
فرن التخميدThermo Scientificفرن مَفْلَة صغير لسطح المختبر من Thermolyne، سعة 1.3 لتر، طراز FB1315MFB1315M
فرنBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
محلول البارافورمالدهيد في المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS)Thermo Scientific4% بارافورمالدهيد في المحلول الملحي الملحّ بالـ PBSJ19943-K2
طبق بتريVWR60 × 15 مم، غير معالج25384-092
فازلين (Petrolatum)Thermo Scientificفازلين، أبيض، نقي417090010
ورق كاشف الأس الهيدروجيني (pH)Fisher ScientificpH-Fix 4.5–10.092120.3
طبق بورسلينFisher Scientificبوطقة Fisherbrand، سعة 5 مل، ارتفاع 20 مم، شكل مرتفعFB-965-B
مقياس الجهد الكهربائيThermo Scientificمقياس Orion Dual Star لدرجة الحموضة والأقطاب الانتقائية للأيونات (pH/ISE)2115102
حامل حلقي مع ماسكVWRمشبك حلقي، 15 سم470104-526
نظام غذائي للقوارضBio-ServF1515, AIN-76A, ½ الرواسبF1515
رافعة مقصيةأمازونرافعة المقص المختبرية—
قمع فصلFisher ScientificEisco، زجاج بوروسيليكات، 2 لترS89285
كلوريد الصوديومFisher Scientificمعتمد من الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS)، بلوريS271-1
فلوريد الصوديومFisher Scientificمعتمد من الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS)، مسحوقS299-100
هيدروكسيد الصوديومFisher Scientificكبيبات بيضاءBP359-500
خرز الفولاذ المقاوم للصدأFisher ScientificScientific Industries، 5 مم، 100 قطعةSI-CS05
حمض الكبريتيكFisher Scientificدرجة الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS Grade)A300-500
TISAB IIThermo Scientificمحلول تطبيق Orion IonPlus940909
مجفف بالتفريغFisher Scientificمجفف فراغي موفر للمساحة من Bel-Art، مقاس 10 بوصاتF42010-0000
مرشح تفريغFisher Scientificمرشح علوي للقارورة من نوع Flow، بولي إيثر سلفون (PES)، 90 مم، 0.2 µm597-4520
هزاز متغير السرعةميدساي (MidSci)LabDoctor / Benchmark Scientific—

المراجع

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
  2. Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O'Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2
  3. Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885
  4. Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273
  5. Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279
  6. Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038
  7. Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302
  8. Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629
  9. Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.
  10. Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948
  11. Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.
  12. Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.
  13. Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200
  14. Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600
  15. Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.
  16. Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436
  17. Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495
  18. Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2
  19. Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.
  20. Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486
  21. Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.
  22. Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.
  23. Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.
  24. Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2
  25. Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.
  26. Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339
  27. Martínez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657
  28. Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.
  29. Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.
  30. Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.
  31. Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.
  32. Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.
  33. Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.
  34. Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.
  35. Kučera J, Štefánik, M. & Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.
  36. Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583
  37. Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.
  38. Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.
  39. Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BiologyFluorideHexamethyldisiloxane HMDS facilitated diffusionion selective electrodeserumboneteeth
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة