منصة هجينة للتحليل الحيوي المعتمدة على زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد للتصوير البصري باستخدام إسفنجات الفيبروين الحريرية

ملخص

تصف المقالة منهجية بسيطة وسهلة الوصول وقابلة للتكرار لإنتاج وزراعة سقالات الحرير لخلايا سرطان الثدي 4T1-iRFP720 تحت ظروف تدفقها التدفق لدعم الزراعة الديناميكية. تم تقييم نمو وهجرة الخلايا كدليل على المفهوم باستخدام جهاز تصوير بصري داخل الجسم كقراءة غير جراحية رئيسية.

الملخص

نقدم منصة هجينة مبتكرة للتحليل الحيوي مصممة للتقييم قبل السريري لخصائص الخلية. يجمع النظام بين زراعة خلوية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) نمت على مصفوفة صناعية خارج الخلية مع تكوين مصفوفة مستوحاة من الكروماتوغرافيا. الإسفنج، المصنوعة من البروتين البنيوي الحرير الليبرويني، تعمل كمصفوفة خارج الخلية محاكاة حيوية وطور ثابت. تم إنتاج إسفنجات ألياف الحرير داخليا باستخدام عملية متعددة الخطوات تتضمن إزالة بروتينات السيريسين المتأصلة من ألياف الحرير الخام، تليها الذوبان والغسيل الكلوي لتنقية محلول الفيبروين، ثم الذوبان في المذيب العضوي، ثم صب طبقة الملح لإنتاج إسفنجيات تعتمد على الحرير بأحجام مسامية مسيطر عليها بين 500–800 ميكرومتر. تم زراعة سلاسل خلايا سرطان الثدي المعدلة وراثيا 4T1-iRFP720 و4T1-wt (التحكم غير الفلوري) داخل سقالات حرير باستخدام تدفق مستمر عبر مضخة، وتم تحليل نموها الخلوي وخصائصها بشكل غير جراحي باستخدام تقنيات التصوير البصري (جهاز التصوير البصري في الجسم الحي ). من خلال دمج المزايا الرئيسية للأنظمة الكروماتوغرافية (الأتمتة، القابلية للتكرار) مع الأهمية البيولوجية لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المتقدمة، تمكن المنصة من النمذجة المخبرية لبنية وشكل الأنسجة الشبيهة مع تسهيل مراقبة السلوك الخلوي الديناميكي. بالتوازي، يتيح تطبيق تقنية التصوير الطبي المراقبة الفورية والمطولة لهجرة ونمو الخلية، إلى جانب عوامل أخرى. يوفر هذا النهج إمكانات كبيرة لدراسة سلوكيات الخلايا على نطاق ماكروسكوبي في نظام تدفق يشبه الطبق. من خلال تحسين الصلة الفسيولوجية للنماذج المختبرية ، قد تساعد هذه الطريقة في سد الفجوة الانتقالية إلى الدراسات الحية وتتوافق مع إطار التقليل والاستبدال والتنقيح (3R) للتجارب الحيوانية.

المقدمة

في الأنسجة الحية، يحدث هجرة الخلايا ونموها ضمن مصفوفة خارج الخلية ثلاثية الأبعاد غير متجانسة (ECM)، تسترشده إشارات حيوية وكيميائية حيوية، مثل تدفق السائل الخلفي وتفاعلات الخلية. تنظم هذه العوامل قطبية الخلايا، والانتقال الآلي، والحركة المنسقة، وهي الأساس لعمليات بيولوجية رئيسية بما في ذلك إصلاح الأنسجة وغزو السرطان 1,2,3,4.

على الرغم من أهميتها، فإن معظم اختبارات الهجرة في المختبر، مثل اختبارات الخدش واختبارات ترانسويل، تقيم حركة الخلية المفردة على ركائز مسطحة وثابتة. ورغم بساطتها وفعاليتها، إلا أن هذه الأساليب ثنائية الأبعاد تعيد بشكل ضعيف السمات الهيكلية والديناميكية للبيئة الدقيقة في الجسم الحي. يصبح هذا القيد أمرا بالغ الأهمية في سياق انتشار السرطان، حيث تهاجر خلايا الورم معا عبر مصفوفات أنسجة متنوعة ميكانيكيا وكيميائيا ^3,7,8. بينما لا تزال اختبارات الخدش ثنائية الأبعاد شائعة لأنها سهلة التنفيذ، إلا أنها لا تعكس تعقيد ECM أو تأثيرات تدفق السائل⁶. توفر الأساليب القائمة على ترانسويل قراءات كمية، ولكن فقط عند نقاط نهاية ثابتة، مما يمنع المراقبة المستمرة للهجرة ^6,9.

أظهرت الدراسات الحديثة أن التدفق الخلالي يعزز الإمكانات النقلية، في حين أن صلابة وتركيب ECM تعزز الانتقال الظهاري-الميزنشيمي والهجرة الجماعية ^4,10. الأنظمة ثلاثية الأبعاد الأكثر تقدما، مثل الكرويدات والأورجينويد، تقارب بيئات ECM الأصلية بشكل أفضل؛ ومع ذلك، غالبا ما يكون استخدامها مقيدا بالتغير، ومحدودية الوصول التجريبي، وصعوبات التحليل الموحد^11,12. توفر منصات الميكروفلويدية تحكما متفائقا في الظروف الميكانيكية والموائع، لكن اعتمادها على طرق ومعدات تصنيع متخصصة يحد من استخدامها الواسع¹³. لذا، يظل إعادة خلق هذه الإشارات المتكاملة في المختبر بطريقة مضبوطة، وسهلة الوصول، وغير جراحية، وفعالة من حيث التكلفة تحديا كبيرا ^5,14.

لمعالجة هذه التحديات وجسر الفجوة بين الاختبارات ثنائية الأبعاد التقليدية والنماذج المعقدة في الجسم الحي ، طورنا منصة خلوية ثلاثية الأبعاد بسيطة تدعم التدفق تعتمد على سقالة الإسفنج الحريرية المصنوعة من الفيبروين. يستخدم النظام إسفنجة حريرية ذات خصائص ميكانيكية قابلة للضبط كهيكل شبيه بنظام ECM. تم اختيار الحرير لبنيته المسامية، التي تسمح بالتدفئة اللطيفة وتدعم التدفق الخلالي الفسيولوجي¹⁵. توافقه الحيوي واستخدامه الراسخ في الهندسة الطبية الحيوية وهندسة الأنسجة يجعله مادة مناسبة لهذا التطبيق. أظهر منشور حديث استدامة السقالة البيئية وإمكانات إعادة التدوير¹⁶. في دراسة أخرى، أظهرنا أيضا قدرتها على التكيف عبر وسائل تصوير مختلفة، مثل التصوير المقطعي بانبعاث البوزيترون¹⁷. وقد شكل هذا العمل السابق أساسا لوصف المنهجية الحالي، حيث نبني على نفس مفهوم المنصة في تكوين مبسط قائم على التصوير البصري في الجسم الحي . تظهر هذه الدراسات معا إمكانات النظام في التقييم المعتمد على التصوير متعدد الوسائط لهياكل الأنسجة الهندسية وتدعم استخدامه كمنصة تجريبية متعددة الاستخدامات لدمج الزراعة المختبرية والقراءات ذات الصلة في الجسم الحي عبر نماذج خلايا السرطان المختلفة.

كإثبات مفهوم، زرعنا خلايا سرطان الثدي الثلاثية السلبية 4T1 الموسومة ب iRFP720 داخل المدرج تحت حالتين تدفق منخفضتين بالإجهاد القصي لمدة خمسة أيام. كشفت المراقبة البصرية غير الجراحية في الجسم الحي، عن أنماط نمو مميزة موجهة بتدفق الدم وتغيرات كبيرة في ديناميكيات تجمعات الخلايا مقارنة بعناصر التحكم الثابتة. من خلال التركيز على البساطة الهندسية وقابلية التكرار، يوفر هذا النموذج جسرا عمليا بين الاختبارات ثنائية الأبعاد والدراسات الحية، مما يمكن الباحثين من فحص، على نطاق كبير وبشكل غير جراحي، الخصائص الخلوية التي تعبر عن التدفق في صيغة فسيولوجية ذات صلة وسهلة الوصول. على عكس المنهجيات السابقة التي غالبا ما تعتمد على تحليلات النهاية المدمرة أو تفتقر إلى معايير التلقيح الموحدة، يقدم هذا البروتوكول إطارا منهجيا لتحسين إنتاج السقالات، وبعد ذلك بذرع الخلايا والتصوير. يعزز هذا النهج المتانة التجريبية ويوفر رؤية أكثر شمولا وطولية للديناميكيات الجماعية للخلايا داخل المصفوفات ثلاثية الأبعاد، مما يمثل تحسنا كبيرا مقارنة بالطرق الحالية لمراقبة النمو والهجرة.

البروتوكول

القسم الأول يوضح تحضير سقالات ألياف الحرير بناء على عمل منشور سابق^{. 16}. تصف الأقسام التالية تحسين كثافة بذر الخلايا، ودمج التدفق، والتصوير البصري لمراقبة حركة الخلايا ونموها. استخدمت هذه الدراسة حصريا خطوط خلايا سرطان الثدي المعروفة في الفأر (4T1-wt و 4T1-iRFP720) ولم تشمل المشاركين البشر، أو عينات المرضى، أو الأنسجة الأولية، أو الحيوانات الحية. وفقا للإرشادات المؤسسية والوطنية، لم تكن هناك حاجة للموافقة الأخلاقية. تظهر نظرة عامة تخطيطية لسير العمل في الشكل 1.

1. تحضير إسفنجة الحرير الليفبروين

1. تنظيف وإزالة الصمغ من الشرنقة.
   1. اقطع شرانق دودة القز بومبيكس موري إل. باستخدام مشرط أمان.
   2. قم بإزالة اليرقات واستخرج الطبقة الداخلية للشرنقة (الطبقة المدمجة المحيطة مباشرة بتجويف اليرقة) باستخدام إبرة تشريح قياسية.
   3. املأ كأسا ب 1.6 لتر من الماء المقطر المزدوج (ddH₂O).
   4. أضف قضيب تحريك مغناطيسي واجعل الماء يغلي أثناء التحريك؛ غط الكأس بورق الألمنيوم لتسريع التسخين وتقليل فقدان الماء.
   5. أضف 3.4 جرام من Na_2CO3 عندما تصل درجة حرارة الماء إلى حوالي 70 درجة مئوية.
   6. عندما يبدأ الخليط بالغليان، ضع 4 جرام من الشرانق المحضرة في المحلول وحرك بقضيب زجاجي.
   7. اغلي الشرانق لمدة 30 دقيقة، مع التحريك بقضيب زجاجي كل 10 دقائق لضمان التعرض المناسب.
   8. أزل الحرير من المحلول وشطفه عدة مرات بماء الصنبور لإزالة ما تبقى من السيريسين.
   9. اعصر كمية كبيرة من الماء وافرد ألياف الحرير على طبق من ورق الألمنيوم المعد.
   10. جفف ألياف الحرير في فرن مسخن مسبقا على درجة حرارة 50 درجة مئوية حتى تجف تماما (حوالي 18 ساعة).
2. الانحلال والغسيل الكلوي
   1. استخدم الإيثانول المطلق وCaCl₂ اللامائي للخطوات التالية. مصفوفة الذوبان تتكون من جزء واحد من CaCl₂، وجزئين من الإيثانول، و8 أجزاء من ddH₂O. نسبة الحرير المقشر الجاف إلى مصفوفة الذوبان هي 1:10 [باللون الأبيض والبيض].
   2. وزن الحرير المجفف وحسب الكميات المناسبة من المكونات لمصفوفة الذوبان.
   3. املأ الكمية المناسبة من CaCl₂ في قارورة دائرية الأسفل مزودة بقضيب تحريك.
   4. قس الكمية المطلوبة من الإيثانول وDDH₂O وامزجهما.
   5. أضف خليط الإيثانول-ddH₂O إلى CaCl₂ أثناء التحريك.
   6. قم بتركيب جهاز ارتجاع وسخن الخليط إلى 100 درجة مئوية في حمام زيت، مما يسمح لمادة CaCl₂ بالذوبان وجعل الخليط يغلي.
   7. عندما يبدأ الخليط بالغلي، أضف الحرير المجفف وسخنه تحت الارتجاع لمدة 45 دقيقة.
   8. جهز أنابيب غسيل السليلوز بطول 15 سم بوزن 3.5 كيلو دالتون عن طريق شطفها عدة مرات بالماء لإعادة الترطيب، ثم ثبت أحد الطرفين ملفوفا حول قضيب زجاجي بمشبك ختم.
   9. بعد الغليان، انقل محلول الحرير الساخن إلى الأنبوب وأغلق الطرف المقابل بمشبك، مع ترك فجوة 2–3 سم بين السائل ومشبك الختم، دون أي حواجز هوائية.
   10. ضع أنبوب الغسيل المملوء في كأس سعة 2 لتر مملوء ب ddH₂O وقم بالغسيل في درجة حرارة الغرفة لمدة 72 ساعة، مع تغيير الماء مرتين يوميا لضمان التنقية الفعالة.
   11. قم بالطرد المركزي للمحلول عند حرارة 4500 × جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   12. صب المادة الفائقة بلطف في أنابيب الطرد المركزي دون إزعاج الحبيبة، واحتفظ بالأنابيب عند -20 درجة مئوية.
       ملاحظة: املأ أنابيب الطرد المركزي حتى لا تتجاوز نصف طاقتها وتجمدها في وضع أفقي.
3. التجميد الجسدي
   1. سخن مضخة التفريغ لمدة 20 دقيقة وشغل جهاز التجميل المغناطيسي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   2. ضع أنابيب الطرد المركزي المجمدة، مباشرة من الفريزر، في قارورة ذات قاع مستدير.
   3. اربط القارورة بجهاز التجميل الليلي وقم بتخميد الليوفيا لمدة 24 ساعة.
   4. حتى الاستخدام الآخر، احتفظ بفيبروين الحرير المحمر في مكان جاف ودرجة حرارة الغرفة.
4. صب المذيبات وغسل الجسيمات
   1. أضف الكمية المطلوبة من الحرير المحمر إلى 1,1,1,3,3,3-سعداء فلورو إيزوبروبانول (HFIP) في حاوية عينة بول تحت غطاء أبخرة للحصول على محلول بنسبة 16٪ [w/v] بحجم نهائي 30 مل، ثم أغلق الحاوية بغطاء.
      تحذير: HFIP مادة تآكلية وضارة إذا تم استنشاقها أو ابتلاعه أو امتصاصه عبر الجلد؛ تعامل مع المذيب في غطاء بخاري أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE)، وتجنب ملامسة الجلد والعينين والأبخرة. في حالة حدوث انسكاب، اجمع السائل باستخدام مواد ماصة ونظف المناطق المتأثرة. نقل المواد الملوثة إلى حاويات النفايات الخطرة المخصصة.
   2. أغلق الحاوية بإحكام وضعها على الهزاز المداري بسرعة 70 دورة في الدقيقة لمدة 18 ساعة للسماح للحرير بالذوب.
   3. باستخدام شبكات مختلفة باستخدام منخل NaCl ووضع نسبة 500–800 ميكرومتر جانبا.
   4. املأ طبق بتري (قطره 9 سم، وقطر قاع 8.5 سم) ب 100 جرام من الملح المنخل (نسبة 500–800 ميكرومتر)، مما ينتج ارتفاعا 1.2 سم. تأكد من أن السطح مستو بشكل متساو.
   5. اسكب بلطف 25.5 مل من محلول الحرير الجاهز فوق طبقة الملح (بوروجين لتكوين مسام الإسفنج).
   6. غط طبق بتري بالغطاء وضعه على هزاز مداري لمدة 10 دقائق بسرعة 70 دورة في الدقيقة لتسرب موحد لمحلول الحرير إلى سرير الملح.
   7. حضن طبق بتري عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة مع إغلاق الغطاء؛ بعد ذلك، يتم حضن طبق بتري المكشوف عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة إضافية.
   8. لتحفيز تكوين صفائح بيتا، اغمر المركب الحريري في كأس يحتوي على الميثانول لمدة 20 دقيقة، ثم أخرجها وجففها في فرن عند 50 درجة مئوية (حوالي ساعة واحدة).
      تحذير: الميثانول سام للغاية؛ أمسك بغطاء بخار أثناء ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، وتجنب ملامسة الجلد والتعرض للبخار. في حالة حدوث انسكاب، اجمع السائل باستخدام مواد ماصة ونظف المناطق المتأثرة. نقل المواد الملوثة إلى حاويات النفايات السامة المخصصة.
   9. قم بإزالة المادة البورجينية NaCl عن طريق غمر المركب الحريري في كأس يحتوي على ماء صنبور دافئ لمدة لا تقل عن 3 ساعات مع تبادل الماء كل 20-30 دقيقة حتى تصل المادة إلى ملمس ناعم يشبه الإسفنج دون وجود أجزاء صلبة متبقية.
   10. تخزين إسفنجة الحرير في إيثانول بنسبة 70٪ للتعقيم والحفظ قصير الأمد عند 4 درجات مئوية.
       ملاحظة: تم جمع المحاليل التي تحتوي على HFIP كنفايات مذيبات هالوجينة، بينما تم التخلص من نفايات الميثانول بشكل منفصل كنفايات مذيبات عضوية غير هالوجينية وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية المؤسسية. لإزالة التلوث بعد الاستخدام، كانت الحاويات والأسطح التي تتعرض لمادة HFIP أو الميثانول تغسل بمذيب متوافق وتنظفها بمحلول منظف. تم جمع الشطف الأولي والمواد الاستهلاكية الملوثة كنفايات كيميائية خطرة.

2. تحضير وتوازن سقالة الحرير

1. قص إسفنجات ألياف الحرير باستخدام ثقب خزعة قطرها 6 مم للحصول على سقالات أسطوانية بقطر 6 مم وارتفاع 12 مم.
   ملاحظة: يمكن تخزين سقالات الإسفنج المصنوعة من الحرير الليبروين الجاهز في إيثانول بنسبة 70٪ على درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى 4 أشهر؛ للتخزين الممتد، ينصح بالاستبدال الدوري بالإيثانول الطازج. يمكن تخزين السقالات المتساوية في وسط زراعة الخلايا عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
2. ضع العينات في أنابيب الطرد المركزي مع 70٪ إيثانول للتعقيم.
3. قم بتنفيذ الخطوات التالية في خزانة سلامة بيولوجية معتمدة لمنع التلوث.
4. استنشق الإيثانول باستخدام ماصة أثناء الضغط على الإسفنجة باستخدام الملقط.
5. ضع الإسفنجيات في طبق بتري يحتوي على 10–20 مل من وسائط معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI)-1640 مكمل لغمرها بالكامل.
6. تبادل الوسائط ثلاث مرات مع هزة بسيطة بين كل تبادل.
7. بعد الغسل الثالث، أضف وسائط جديدة، أغلق الغطاء بإحكام، ولفها بطبقة من البرافين.
8. احتفظ الإسفنج بالإسفنجة في الثلاجة لمدة أسبوع على الأقل على درجة حرارة 4 درجات مئوية قبل استخدامها في زراعة الخلايا. خلال هذه الفترة، تبادل الوسائط 4–5 مرات.
   ملاحظة: تأكد من إزالة الإيثانول بالكامل، لأن الإيثانول المتبقي سام للخلايا ويؤثر على ارتباط الخلايا وصلاحيتها.

3. قياس الخلفية وتحسين التصوير

1. نقل أنابيب الترشيح الفارغة الشفافة بصريا وأنابيب الترشيح الشفافة بصريا التي تحتوي على سقالات حريرية غير مزروعة إلى التصوير البصري الحي .
   ملاحظة: تم إجراء التصوير باستخدام تصوير بصري داخل الجسم الحي في وضع التألق الفوقي ثنائي الأبعاد.
2. أجر التصوير في أزواج مرشحات مختلفة (الإثارة: 675 نانومتر، 745 نانومتر؛ الانبعاث: 720 نانومتر، 800 نانومتر)، أوقات التعريض (4–60 ثانية)، أرقام التوقفات (1–8)، مجال الرؤية (13.5–22.5 سم)، ومستويات مصابيح مختلفة (منخفضة ومرتفعة).
3. تقييم التألق الذاتي عن طريق تصوير المنصتين تحت ظروف متطابقة قبل استخدام السقالات المزروعة بالخلايا.
4. استبدل مدخل Luer-lock الذكر بموصل Luer-lock أنثوي مقطوع لإعدادات التصوير فقط لإزالة التأثير الذاتي عالي الشدة من موصل Luer-lock الذكوري. إذا كانت المواد متشابهة في جميع التجارب، فإن هذه الخطوة مطلوبة مرة واحدة فقط.
    

4. تحضير معلقات الخلايا والزرع على سقالات الحرير الليفية

ملاحظة: قم بجميع الخطوات التالية في خزانة السلامة البيولوجية تحت ظروف معقمة، حيث تتضمن هذه الإجراءات التعامل مع خلايا حية وعينات تحتوي على خلايا.

1. راقب خلايا سرطان الثدي الثلاثية السلبية في فئران 4T1 من النوع البري (4T1-wt) و4T1-iRFP720 بانتظام للكشف عن التلوث واستقرار تعبير iRFP720.
2. الحفاظ على خلايا سرطان الثدي الثلاثية السلبية في فئران 4T1-wt و4T1-iRFP720 في وسط RPMI-1640 مدعوم ب 10٪ مصل العجل الجنيني، 1٪ L-جلوتامين، و1٪ بنسلين/ستربتوميسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون_2.
3. خلايا المرور عند التقاء حوالي 80٪ باستخدام 0.25٪ تريبسين-EDTA، وفقا لإجراءات زراعة الخلايا المعقمة القياسية.
4. استخدم أرقام ممرات متطابقة وظروف الزراعة لخلايا 4T1-wt و4T1-iRFP720 لجميع التجارب المقارنة.
5. جهز كثافة بذور الخلايا تتراوح بين 5 × 10⁴ إلى 5 × 10⁷ خلايا/مل (تتوافق مع نطاق من 1 × 10⁴ إلى 1 ×^{10 7} خلايا لكل 200 ميكرولتر). جهز التركيزات التالية لتحليل التصوير لتقييم شدة الإشارة عبر كثافات الخلايا المختلفة وتحديد التركيز الأمثل: 5 × 10⁴، 3.38 × 10⁵، 6.25 × 10⁵، 1.25 × 10⁶، 2.5 × 10⁶، 3.75 × 10⁶، 5 × 10⁶، 1.25 × 10⁷، 2.5 × 10^{7، و5} × 10⁷ خلايا/مل.
6. تحضير تعليقات مقابلة لخلايا 4T1-وزن عند نفس نطاق التركيز مع خلايا 4T1-iRFP720 لتعمل كعناصر تحكم غير فلورية.
7. ضع السقالات الفردية (المحضرة في القسم 2) في أطباق بترى معقمة غير معالجة.
   ملاحظة: استخدم أطباق بتري غير معالجة لتقليل التصاق الخلايا بالسطح البلاستيكي ولتعزيز التصاق الخلايا بالسقالة الحريرية.
8. أزل الوسط الزائد من حول كل سقالة ومن السقالة باستخدام ماصحة، مع الحرص على عدم تشويه الهيكل.
9. توضع مبيبت 200 ميكرولتر من نظام تعليق الخلية المناسب مباشرة على السطح العلوي لكل سقالة، مما يضمن امتصاص الحجم بالكامل داخل السقالة.
10. حضن السقالات لمدة 4 ساعات عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون_دون إزعاج الصحون للسماح بتثبيت الخلايا.
11. بعد 4 ساعات، انقل كل سقالة مزروعة بالخلايا بعناية إلى بئر يحتوي على صفيحة تحتوي على 1 مل من الوسط الكامل المسخن مسبقا.
12. حضانة السقالات طوال الليل (16–24 ساعة) عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون_.

5. تجميع منصات المعايرة باستخدام الفريتس

ملاحظة: قم بجميع خطوات التجميع في خزانة أمان بيولوجية باستخدام قفازات معقمة، وملاقط معقمة، وأدوات معقمة.

1. قم بإزالة السقالات الحريرية المجمعة من البذور الخلوية من ألواح 24 بئر باستخدام ملقط معقم، مع دعم كل سقالة بلطف لتجنب الضغط.
2. أدخل سقالة واحدة مزودة ببذور خلية في الجزء السفلي من أنبوب استخراج الطور الصلب الشفاف بصريا باستخدام قضيب دفع عمودي معقم.
3. ضع فريت بولي إيثيلين معقم مباشرة فوق السقالة باستخدام قضيب الدفع.
   ملاحظة: استخدم فريت البولي إيثيلين فقط أثناء تحسين الإشارة، لأن حجم المسامات أصغر من قطر الخلية ويمنع هجرة الخلايا أو أي اتصال آخر بين الخلية. كما يتيح ذلك فصل الإشارة بوضوح، مما يسمح بتحديد تركيز الخلية الدقيق المقابل لكل إشارة.
4. كرر تسلسل التكديس، سقالة واحدة تليها فريت واحدة، حتى يتم إدخال خمسة سقالات مزروعة بالخلايا وخمسة فريت.
5. أغلق أسفل أنبوب الترشيح بموصل أنثوي معقم من نوع Luer-lock.
6. أغلق الجزء العلوي من أنبوب الاستخراج بموصل لوير لوك ذكر معقم.

6. تحسين الإشارة باستخدام جهاز التصوير البصري في الجسم الحي باستخدام منصات معايرة مع فريت (مرة واحدة فقط للتحقق من صحة النظام)

1. نقل منصات مزروعة بالخلايا للمعايرة إلى غرفة التصوير البصري داخل صندوق مظلم محكم الضوء لحماية الخلايا الفلورية من التبييض الضوئي.
2. تحضير التصوير البصري في الجسم الحي وفقا لإجراءات السلامة والتشغيل المؤسسية.
3. ضع منصات مجمعة من بذور الخلايا على منصة التصوير.
4. التقاط صور إبيفلورية ثنائية الأبعاد باستخدام الإثارة عند 675 نانومتر والانبعاث عند 720 نانومتر، وتحسين معلمات التصوير، بما في ذلك زمن التعريض، عامل التثبيت، ورقم f، لتحقيق أقصى شدة إشارة ضمن نطاق الكشف الخطي (انظر الشكل التكميلي 1 والشكل التكميلي 2).
5. تضمين أنبوب استخراج شفاف بصريا واحد على الأقل يحتوي على سقالات مزروعة بخلايا 4T1-wt عند كثافات خلاية متطابقة كمرجع غير فلوري.
6. احصل على صور لجميع العينات باستخدام إعدادات الاقتناء المتطابقة لتمكين المقارنة الكمية لشدة الفلورة (انظر الشكل التكميلي 3 والشكل التكميلي 4).
7. قم بقياس إشارات الفلورة باستخدام برنامج تحليل التصوير البصري في الجسم الحي وتحديد الكثافة المثلى لبذور الخلايا (أي 5 × 10^{إلى 6} خلايا لكل سقالة) التي توفر أقصى إشارة دون تشبع (انظر الشكل التكميلي 5).
   ملاحظة: تم اختيار الإعدادات النهائية لنظام التصوير البصري في الجسم الحي بناء على تجارب تحسين لضمان اكتساب الإشارة ضمن النطاق الديناميكي الخطي للنظام، مع تجنب تشبع سعة السقالات والحفاظ على نسبة إشارة إلى خلفية مستقرة عبر الظروف التجريبية وظروف التحكم. استنادا إلى الإعدادات المحسنة، قم بزرع جميع المفاعلات الحيوية التجريبية ب 5 ×^{10 أو 6} خلايا/سقالات. إجراء التصوير في وضع التألق ثنائي الأبعاد مع الإعدادات التالية: الإثارة: 675 نانومتر (عرض النطاق 30 نانومتر); الانبعاث: 720 نانومتر (عرض النطاق 20 نانومتر)، زمن التعريض: 10 ثوان، عامل التثبيت: 8، رقم F: 8.

7. تجميع المنصة التجريبية (بدون قطع الريت)

1. بعد تحسين الإشارة، يتم زرع سقالات تجريبية بكثافة خلوية مثالية محددة (أي 5 ×^{10 6} خلايا/200 ميكرولتر، انظر القسم 4).
2. تجميع منصة تجريبية باستخدام خمسة إسفنجيات حريرية إجمالا: سقالة واحدة ببذور خلايا وأربع سقالات فارغة بدون ألياف بولي إيثيلين لتمكين التواصل الخلوي.
3. أغلق الجزء العلوي من أنبوب الترشيح بموصل لوير لوك ذكر معقم.
4. تكوين نظام الزراعة لتناسب ظروف الزراعة الثابتة أو الديناميكية
   1. الزراعة الثابتة: أغلق المنفذ السفلي بموصل أنثوي معقم من نوع Luer-lock. ثم يوضع النظام في أنبوب طرد مركزي بغطاء غير مرتخ.
      ملاحظة: بما أن قفل لوير الذكري له فتحة، فإن هذا التكوين يسمح بتبادل الغاز مع تقليل خطر التلوث. في هذا الإعداد، يتم تبديل الوسائط يدويا داخل الغطاء مرة واحدة يوميا.
   2. الزراعة الديناميكية: وصل المنفذ السفلي بأنبوب معقم ووصل خط السحب بقفل لوير الذكر في المنفذ العلوي لتمكين زراعة التروية. تزويد وإزالة الوسائط بشكل مستمر باستخدام نظام مضخات التبيضية (الشكل الإضافي 6).

8. الثقافة الديناميكية في المنصة

1. ابدأ بتعقيم المضخة والأنابيب المرتبطة بها عن طريق غسل 70٪ إيثانول عند أقصى تدفق لمدة 10 دقائق.
2. اشطف المضخة والأنبوب بوسط معقم كامل لمدة لا تقل عن 10 دقائق لإزالة بقايا الإيثانول. استبدل بوسط جديد واستمر في التروية لمدة 10 دقائق إضافية لضمان توازن النظام الكامل قبل الاستخدام.
   ملاحظة: تأكد من أن جميع المكونات مملوءة بالكامل بالوسط وخالية من فقاعات الهواء قبل تلقيح الخلايا.
3. توصيل مدخل لوئر لوك الذكر (الأعلى) من المفاعل المجمع بخط مخرج المضخة باستخدام أنابيب معقمة وموصلات لوور-لوك.
4. قم بتوصيل مدخل المضخة بخزان معقم يحتوي على وسط كامل.
5. توصيل مخرج المفاعل (القاسي) بخزان الوسط لإنشاء حلقة تروية إعادة تدوير. يتيح هذا التكوين تدفق الوسط المستمر عبر السقالة مع الحفاظ على نظام الحلقة المغلقة.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول، يتم إجراء التفريغ باستخدام تكوين إعادة تدوير، حيث يتم تدوير الوسط باستمرار بين الخزان والمفاعل. يقلل هذا النهج من الاستهلاك المتوسط مع الحفاظ على تدفق مستمر.
6. اضبط معدل التدفق المطلوب على المضخة ليستهدف إجهاد القص الاسمي للجدار (مثل 1 دين/سم² و4 دين/سم²)، باستخدام نصف قطر القناة الداخلية ( = 3 مم) بناء على افتراض تدفق بوازوي¹⁹:
   
   حيث τ هو إجهاد القص الجداري (dyn/cm²)، وQ هو معدل التدفق الحجمي (سم³/ث)، هو لزوجة السائل لوسط RPMI-1640 (0.958 × 10-3 نيوتن·ثانية/^{م 2} عند 37 درجة مئوية)²⁰. على الرغم من أن النظام الفعلي يحتوي على سقالة حريرية مسامية وبالتالي ينحرف عن هذه الهندسة المثالية، إلا أن القيم المحسوبة استخدمت كمعايير تشغيلية موحدة لتمكين مقارنات قابلة للتكرار بين ظروف التدفق. كانت معدلات التدفق المقابلة 0.133 مل/دقيقة و0.531 مل/دقيقة، واستخدمت كشروط تروية للزراعة.
7. ابدأ التروية وراقب النظام بحثا عن التسربات وتكون الفقاعات والتدفق المستقر.
8. ابدأ التروية باستخدام مثبط الهجرة أو مركب اختبار (مثل Cucurbitacin E (Cucurbitacin E) عند 0.05 ميكرومول/لتر في وسط كامل) أو بدونه (تحكم) وحافظ على الإعداد بالكامل عند 37 °C في حاضنة رطبة مع 5٪_CO2 حتى خمسة أيام. لذلك، قم بتوصيل مدخل المضخة بخزان معقم يحتوي على وسط كامل بما في ذلك مركب الاختبار المعني، وابدأ المضخة بإعدادات مشابهة لتلك المستخدمة سابقا.
   ملاحظة: تأكد من إزالة الإيثانول بالكامل من المضخة والأنابيب من خلال تنفيذ خطوات التنظيف المتوسطة المحددة. تخلص من الجزء الأولي من الوسط بعد الشطف قبل الاتصال بالمفاعلات المزروعة بالخلايا وتأكد من أن النظام ممتلئ بالكامل بوسط جديد وخالي من فقاعات الهواء.

9. التصوير الفلوري للمنصة التجريبية

1. أوقف المضخة، وافصل جميع الأنابيب مع الحفاظ على الظروف المعقمة.
2. أغلق أسفل أنبوب SPE باستخدام موصل Luer-lock أنثوي، وضع النظام بأكمله داخل أنبوب طرد مركزي معقم بسعة 50 مل، وأغلق الأنبوب بإحكام.
3. نقل النظام إلى خزانة السلامة البيولوجية لمتابعة جميع الخطوات التالية. داخل غطاء المحرك، استبدل موصل لوير الذكر بموصل لوير لوك أنثوي مقطوع لإغلاق النظام بالكامل.
4. ضع النظام المغلق مرة أخرى في أنبوب طرد مركزي معقم بسعة 50 مل وأغلق الأنبوب بإحكام للنقل.
   ملاحظة: اعتمادا على ظروف المختبر، لا يلزم إيقاف التدفق للتصوير عندما يكون النظام مشدودا. ومع ذلك، لم يكن ذلك ممكنا في الإعدادات التجريبية المحددة.
5. انقل المفاعلات المغلقة إلى غرفة نظام التصوير البصري داخل صندوق مظلم ومحكم الضوء لحماية الخلايا الفلورية من التبييض الضوئي.
6. ضع المفاعلات على منصة نظام التصوير البصري في الجسم الحي ، في الحامل المناسب.
7. احصل على صور إبفلورية ثنائية الأبعاد باستخدام المعلمات المحسنة مسبقا (أي الإثارة 675 نانومتر، الانبعاث 720 نانومتر، زمن التعريض 10 ثوان، التركيب 8، الرقم f-رقم 8).
8. أدرج 4T1-wt متلقية بذر، وهيكل غير مزروع، وتحكم مفاعل فارغ لكل جلسة تصوير.
9. قم بقياس إشارات الفلورة باستخدام تحليل التصوير البصري في الجسم الحي .
10. رسم النتائج الكمية لمجموعات الضابطة والعلاج وإنشاء رسوم بيانية مقارنة لعرض تأثير مركب الاختبار على النتيجة المقاسة.

10. تحليل الصور للمنصة التجريبية

1. احصل على صور فلورية في اليوم 0 و3 و5 وتحليل باستخدام برنامج تحليل الصور.
2. لكل صورة، قم بإجراء معايرة مكانية قبل التحليل. قس الطول الفيزيائي المعروف لمنصة التجربة بالبكسل باستخدام أداة الخط، وأدخل المسافة الحقيقية المقابلة (85 مم) عبر تحليل > Set Scale لتحديد تحويل البكسل إلى الطول.
3. بعد المعايرة، قم بقياس مساحة الفلورسنت عن طريق تحديد منطقة الاهتمام (ROI) يدويا باستخدام أداة الاختيار الحر.
4. لتقليل تحيز المستخدم، حدد العائد على الاستثمار باستخدام معايير بصرية متسقة بناء على شدة إشارة الفلورة بالنسبة للخلفية. قم بإجراء جميع التحليلات تحت إعدادات متطابقة، وحيثما أمكن، اجعل مشغل مدرب واحد يجري التحليل.
5. تحديد إشارة الفلورسنت كمناطق ساطعة يمكن تمييزها بوضوح عن الخلفية الداكنة في صور برامج تحليل التصوير البصري في الجسم الحي ، واستخدام هذه الإشارات لتوجيه تقسيم يدوي متسق.
6. قس المناطق المختارة باستخدام تحليل > قياس، وسجل قيم المساحة لكل نقطة زمنية. كرر هذا الإجراء لجميع الصور عبر جميع المجموعات التجريبية.
7. تطبيع قياسات المساحة إلى قيمة اليوم 0 المقابلة لكل عينة باستخدام برامج جداول البيانات لأخذ الفروقات في الحجم الابتدائي في الاعتبار، والتعبير عن النتائج كتغير في الطية بالنسبة للخط الأساسي (اليوم 0 = 1).

11. التحليل الإحصائي

1. قم بإجراء جميع التجارب على الأقل بثلاث نسخ.
2. كرر جميع التجارب ثلاث مرات على الأقل (n = 3)، وحدد القيم المتوسطة بالإضافة إلى الانحرافات المعيارية (SD).
3. تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل النوفاع ثنائي الاتجاه متبوعا باختبار المقارنة المتعددة لتوكي مع α = 0.05.

النتائج

يصف هذا البروتوكول منصة سهلة الاستخدام ومنخفضة التكلفة للمراقبة الماكروسكوبية لنمو وحركة الخلايا في بيئة ثلاثية الأبعاد ذات صلة فسيولوجية. تستخدم الطريقة إسفنجات ألياف الحرير كمحاكاة للتحكم في ECM وتتضمن تدفقا داخليا مضبوطا لنمذجة ظروف الأنسجة الديناميكية. يتم تصوير الشكل 1 نظرة مخططة على الإجراءات خطوة بخطوة من تصنيع إسفنجة الحرير والسقالات إلى زرع الخلايا وتجميع المنصات التجريبية.

في البداية، كان لا بد من إنتاج سقالات من ألياف ا...

المناقشة

عملية إنتاج إسفنجة الحرير الموصوفة في هذا البروتوكول موحدة، مما يضمن تصنيع السقالات القابلة للتكرار، كما ورد في دراسة سابقة¹⁶. يعد إنتاج الإسفنجات تحت ظروف موحدة بالكامل، مثل ارتفاع/كمية سرير الملح، وحجم محلول الحرير، وحضانة الميثانول، أمرا بالغ الأهمية للحصول على إسفنجات موحدة وقابلة للمقارنة. يجب أن تتبع الإسفنجات المنتجة معايير بروتوكول مراقبة الجودة التي نشرت في وقت سابق^{من 16}. بعبارة قصيرة، يجب أن تستوفي الإسفنج معايير مثل ارتفاع السرير...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Sigma-Aldrich	8.04515	تحذير: خطير. يُستخدم لإذابة الحرير المجمد
لوحة 24 بئر	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	تخزين ركائز الخلايا المزروعة أثناء الحضانة
خلايا سرطان الثدي ثلاثية السلبية الفأرية 4T1-iRFP720	مختبر العلاج الكيميائي الكبير للسرطان (MMCT)، جامعة فيينا	N/A	تجارب زراعة الخلايا؛ تم اشتقاق 4T1-iRFP720 داخليًا من 4T1 الأصلي (ATCC: CRL-2539)
خلايا سرطان الثدي ثلاثية السلبية الفأرية 4T1-wt	مختبر العلاج الكيميائي الكبير للسرطان (MMCT)، جامعة فيينا	ATCC: CRL-2539	تجارب زراعة الخلايا
جهاز Bruker Alpha Compact FTIR مع وحدة أخذ العينات بالترانزستور البلاتيني	Bruker	A220/D-01	تحليل FT-IR
كلوريد الكالسيوم، عديم الماء، ≥ 93٪ من درجة الكواشف	Sigma-Aldrich	902179	لتحضير مصفوفة الذوبان
قارورة زراعة الخلايا، T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	مواد استهلاكية؛ لزراعة الخلايا
قارورة زراعة الخلايا، T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	مواد استهلاكية؛ لزراعة الخلايا
الطرد المركزي 5804 R	Eppendorf	5805000010	يُستخدم لفصل العينات بالتدوير
موصل لوربلوك مركب (موصل لوربلوك أنثوي)	Braun Melsungen AG	4495101	يُستخدم لتجميع النظام
Cucurbitacin E	Sigma-Aldrich	SML0577	مثبط لتنقل الخلايا
مثقاب خزعة جلدي، ø 6 ملم	Dahlhausen	1190001006	يُستخدم للحصول على ركائز إسفنجية أسطوانية
أنابيب غسيل الكلى (3.5 كيلو دالتون، السليلوز)	Spectra/Por من Spectrum Labs	SPEC132724	لغسيل محلول الحرير
محلول فوسفاط الملح في Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537	لصيانة الخلايا
الإيثانول، مطلق	Merck	1.07017	لتحضير مصفوفة الذوبان
Excel	Microsoft	v2604	تنظيم البيانات، والحسابات الأساسية، والتخطيط
مصل العجل الجنيني (FCS) المعطّل حراريًا	Biowest	S181H-500	ملحق لوسائل زراعة الخلايا
Fiji (المعروف سابقًا باسم ImageJ)	مصدر مفتوح (https://imagej.net/software/fiji/)	N/A	معالجة الصور وتحليلها
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	التحليل الإحصائي وتوليد الرسوم البيانية
مضخة HPLC Hitachi L-7120 LaChrom	Merck	K-5244	لظروف الثقافة الديناميكية في النظام المجمع
نظام IVIS 200 Spectrum CT	PerkinElmer	128201	نظام التصوير البصري مع قدرة التصوير المقطعي
برنامج IVIS Living Image	PerkinElmer	v4.5.2	البرنامج لاكتساب، وتصور، والتحليل الكمي لبيانات التصوير IVIS
مجهر المسح الإلكتروني JEOL JSM-6510	JEOL GmbH	JSM-6510	صور SEM
L-جلوتامين، محلول 200 ملي مولار، مناسب لزراعة الخلايا (L-Glu)	Sigma-Aldrich	G7513	ملحق لوسائل زراعة الخلايا
آلة التجفيف بالتبريد Alpha 2-4 LD Plus	Martin Christ	101542	لتجفيف الحرير
موصل لوربلوك ذكر	Supelco (Sigma-Aldrich)	57020-U	محول لخزانات العينات
الميثانول، ≥ 99.9٪، درجة خلط الكروماتوغرافيا HPLC	Carl Roth	7342.1	تحذير: سام. تحفيز تكوين صفائح بيتا في المركبات المصنوعة من الحرير
أنابيب استخراج الطور الصلب الضوئي (SPE) الشفافة بدون فرط	Sigma Aldrich	57240-U	يُستخدم لتجميع النظام
برنامج OPUS Spectroscopy	Bruker	v7.5	تحليل FT-IR
المهرج المداري والخطّي MI0103002	Four E'S Scientific	MI0103002	توزيع/خلط موحد
Parafilm PM996	Sigma-Aldrich	P7793	لإغلاق/لف الأطباق والحاويات للتخزين (على سبيل المثال، التبريد)
البنسلين-ستربتوميسين، سائل، مناسب لزراعة الخلايا (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	ملحق لوسائل زراعة الخلايا
طبق بتري، 9 سم	VWR	391-0598	لصب الإسفنجات على قاعدة الملح؛ لزرعها على ركائز الحرير
فرطات البولي إيثيلين لأنابيب SPE 1 مل	Supelco (Sigma Aldrich)	57244	يُستخدم لتجميع النظام
وسط RPMI-1640، مناسب لزراعة الخلايا	Sigma-Aldrich	R0883	يُستخدم الوسط المضاف لمعادلة إسفنجة الحرير، وصيانة زراعة الخلايا والتجارب ذات الصلة
ماص سرولوجي، 10 مل	Sarstedt	86.1254.025	مواد استهلاكية؛ لصيانة الخلايا
ماص سرولوجي، 25 مل	Sarstedt	86.1685.020	مواد استهلاكية؛ لصيانة الخلايا
ماص سرولوجي، 5 مل	Sarstedt	86.1253.025	مواد استهلاكية؛ لصيانة الخلايا
أمعاء الحرير من دودة القز Bombyx mori L.	محطة تجارب تربية دودة القز والزراعة، فراتسا، بلغاريا	N/A	المواد الخام لإنتاج إسفنجة الحرير
كربونات الصوديوم، عديمة الماء، ≥ 99.5٪ ACS	VWR	11552.A3	يُستخدم لإزالة الحرير، أي إزالة السركين
كلوريد الصوديوم، ≥ 98٪، تقني	VWR	27788.366	لصب الإسفنجات على قاعدة الملح
قضيب دفع عمود SPE	Carl ROTH	36P9.1	يُستخدم لتجميع النظام
غربال تحليلي من الفولاذ المقاوم للصدأ، 500 ميكرومتر (ISO 3310-1)	ATECHNIK GmbH	200.050.222-046	لغربال NaCl
غربال تحليلي من الفولاذ الم