مقالة منهجية

طريقة قطع داخل الغرفة للتقدير الكمي اللحظي للمواد المتطايرة الناتجة عن جرح الأوراق والتبادل الغازي

31 مشاهدة

⸱

سبتمبر 11, 2026

 ,  ,  , 
1Institute of Agricultural and Environmental Sciences, Estonian University of Life Sciences, 2Estonian Academy of Sciences

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول نهجاً قياسياً للقطع داخل الغرفة لتحديد بداية وتوقيت ذروة وحركية الانبعاثات المتطايرة الناجمة عن الجروح، بالتزامن مع قياسات تبادل الغازات.

الملخص

تلعب المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) التي تطلقها أوراق النباتات أدواراً رئيسية في إرسال إشارات الإجهاد، والتفاعلات بين النبات والغلاف الجوي، والدفاع النباتي. ومن بين هذه المركبات، تَنبعث المركبات العضوية المتطايرة المستحثة بالجروح (wVOCs) خلال ثوانٍ من حدوث تلف ميكانيكي، أو افتراس عشبي، أو اضطراب بيئي. وتعتمد ديناميكيات انبعاثها بشكل قوي على توقيت وشدة وطريقة تمزق الأنسجة. ومع ذلك، لا يزال التحديد الكمي الدقيق يمثل تحدياً بسبب الآثار الميكانيكية الاصطناعية، وظروف التعرض المتغيرة، والفترات الزمنية الفاصلة بين الإصابة والقياس. تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً قياسياً لاستئصال الأوراق داخل غرفة مخصصة للمراقبة الآنية للمركبات العضوية المتطايرة المستحثة بالجروح وتبادل الغازات. وقد تم دمج قاطع جراحي في غرفة محمولة لتبادل الغازات لتمكين إجراء قطوع نظيفة ومحكومة داخل غرفة محكمة الإغلاق تحت ظروف مستقرة من الضوء والرطوبة وCO2 ودرجة الحرارة. وقام مقياس طيف الكتلة بزمن الطيران بنقل البروتونات (PTR-TOF-MS) بقياس الانبعاثات المتطايرة باستمرار عند مخرج الغرفة، مما قلل من التأخير وتشوه الإشارة. ويسمح هذا الإعداد بتحديد بداية الانبعاث، وتوقيت الذروة، وأقصى معدل ارتفاع، وإجمالي الإطلاق بدقة زمنية عالية. وقد أظهر تطبيق هذه الطريقة على Quercus rubra وAcer platanoides وGossypium hirsutum قدرتها على تمييز أنماط انبعاث متباينة مستحثة بالجروح عبر أنواع مختلفة من الأوراق. ومن خلال القضاء على التأخيرات المرتبطة بأخذ العينات التقليدي، تحدد هذه الطريقة المسار الحركي الكامل للانبعاثات المستحثة بالجروح وتتجاوز القيود الرئيسية للطرق السابقة. كما أنها توفر إطاراً قوياً لدراسة استجابات الإجهاد السريعة في فيزيولوجيا النبات، والكيمياء الحيوية البيئية، والتفاعلات بين النبات والغلاف الجوي.

المقدمة

تستجيب النباتات للإصابة عن طريق إطلاق إشارة كيميائية سريعة، ولكن يظل التقاط هذه الإشارة بدقة تحدياً تقنياً. ففي غضون ثوانٍ من التعرض لآفات العواشب، أو أضرار الرياح، أو الاضطراب الميكانيكي، تطلق النباتات دفعة عابرة من المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) التي تنشط الدفاعات الداخلية وتهيئ النباتات المجاورة1,2,3,4. وتشمل هذه المركبات العضوية المتطايرة المستحثة بالجروح (wVOCs) المواد المتطايرة للأوراق الخضراء (GLVs)، والميثانول، والكحوليات والألدهيدات قصيرة السلسلة، والتربينويدات، ومشتقات الأوكسيليبين. وتنشأ هذه المركبات إما من التخليق الحيوي الجديد في خلايا النسيج المتوسط أو من تمزق هياكل التخزين مثل القنوات الراتنجية والشعيرات النباتية. وباعتبارها إشارات إجهاد فورية، تعمل الـ wVOCs على تنسيق الدفاعات الفسيولوجية، والوساطة في التواصل بين النباتات، والتفاعل مع كيمياء الغلاف الجوي1,5,6,7.

نظراً لأن الرعي الطبيعي يجمع بين الضرر الميكانيكي والمحفزات اللعابية والميكروبية، تستخدم الدراسات التجريبية الجروح المحاكات لعزل الاستجابات الناتجة عن الإصابة الفيزيائية وحدها8. ومع ذلك، فإن الطبيعة العابرة للمركبات العضوية المتطايرة المحفزة بالجروح (wVOCs) تجعل من الصعب التقاطها بطبيعتها. وغالباً ما تفتقر الطرق التقليدية، مثل أخذ عينات الحيز الرأسي الساكن المقترنة بتقنية الكروماتوغرافيا الغازية-مطياف الكتلة (GC-MS)، إلى رصد دفق الانبعاث الأولي وتؤدي إلى تشويه ملفه الحركي9,10. كما أن تأخيرات التوازن، ودرجات حرارة التحضين المرتفعة، وخطوط أخذ العينات الممتدة تزيد من زمن الاستبقاء وتؤدي إلى تشويه الإشارة المسجلة، خاصة بالنسبة للمركبات التفاعلية مثل السيسكيتربينات9,11,12. وتؤدي هذه العوامل مجتمعة إلى تقليل مقدار الإشارة وطمس الديناميكيات الزمنية للانبعاثات المتطايرة المحفزة بالجروح، مما يعقد تفسير استجابات النبات للإجهاد.

تؤدي العديد من الدراسات أيضاً إلى مقاطعة عملية القياس من أجل إحداث جروح في الأوراق خارج الغرفة. وتتسبب هذه المقاطعة في زعزعة استقرار تدفق الغاز، وتغيير توقيت الجرح، وتقليل التحكم في دقة الشق13,14,15. ونتيجة لذلك، غالباً ما تضيع الدقائق الأولى التي تلي الإصابة أو تتشوه13، وهي الفترة التي تصل فيها معدلات الانبعاث إلى ذروتها وتظهر فيها الأنماط الحركية المميزة3,6,16,17. وقد نقلت بعض المنهجيات عملية استئصال الأوراق إلى داخل غرف ذات حجم كبير باستخدام شفرات Teflon أو ثقابات ميكانيكية12,18,19. ومع ذلك، أدت هذه التجهيزات غالباً إلى عدم استقرار في الإغلاق، وعدم اتساق في أطوال القطع، وشقوق غير متساوية بسبب انزياح القاطع أو الاختلافات في صلابة الأوراق. كما أدى حجم الغرفة الكبير إلى تأخير تجدد الهواء وتوسيع نطاق الإشارة المتطايرة16. ومجتمعة، تمنع هذه القيود التجريبية التوصيف الدقيق للديناميكيات الزمنية للانبعاثات الناجمة عن الجروح تحت ظروف فسيولوجية مستقرة.

للتغلب على هذه التحديات، تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً لإحداث جروح في الوقت الفعلي داخل الغرفة، يدمج قاطعاً جراحياً في نظام تبادل غازي مقترن بمطياف الكتلة بزمن الطيران لتفاعل نقل البروتون (PTR-TOF-MS). يتيح هذا البروتوكول إجراء جرح للأوراق والكشف عن المركبات المتطايرة بشكل متزامن تحت ظروف بيئية مضبوطة، مع قياس تدفقات المواد المتطايرة وتبادل الغازات في الوقت ذاته بدقة زمنية عالية. ومن خلال إجراء عملية استئصال الأوراق داخل غرفة القياس، يقلل البروتوكول من تأخيرات أخذ العينات المرتبطة بالأساليب التقليدية، ويحافظ على الديناميكيات الزمنية للمركبات المتطايرة الناتجة عن الجروح والتي تنبعث بسرعة، كما يوضح إجراء قطع موحد عبر أوراق ذات خصائص ميكانيكية مختلفة. وتسمح هذه الدقة الزمنية بالتوصيف المباشر لبداية وتوقيت ذروة وحركية انبعاث المواد المتطايرة المستحثة بالجروح والخاصة بكل نوع.

تم تقييم البروتوكول باستخدام ثلاثة أنواع ذات خصائص تشريحية وفسيولوجية متباينة (Quercus rubra، وAcer platanoides، وGossypium hirsutum) لإثبات مدى قابليته للتطبيق على أنواع مختلفة من الأوراق. ويؤكد تطبيق ظروف قياس متطابقة على جميع الأنواع أن البروتوكول قادر على تحليل ديناميكيات المركبات العضوية المتطايرة (VOCs) الناجمة عن الجروح عبر مجموعة واسعة من أنماط الانبعاث مع تقليل التباين التجريبي. ويعد هذا النهج قابلاً للتطبيق بشكل واسع في الدراسات التي تتطلب قياسات ذات دقة زمنية عالية للمركبات العضوية المتطايرة الناجمة عن الجروح تحت ظروف بيئية محكومة. وتوفر هذه الميزات مجتمعة إطاراً معيارياً لاستقصاء استجابات النبات السريعة للإجهاد، وتسهل تطبيق البروتوكول عبر مختلف الأنواع والأنظمة التجريبية.

البروتوكول

زُرعت جميع النباتات تحت ظروف بيئية محكومة في غرف نمو. والكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في الـ جدول المواد.

1. بناء وتركيب قاطع الأوراق داخل الغرفة

  1. صناعة قاطع أوراق دوار مصمم ليتناسب مع الأبعاد الداخلية (4 cm × 2 cm) لرأس القياس القياسي.
  2. تثبيت شفرة حلاقة بقضيب من الفولاذ المقاوم للصدأ (بقطر 1 mm) باستخدام لحام الفضة لضمان الاستقرار الميكانيكي.
    تحذير: شفرات الحلاقة حادة للغاية. يجب ارتداء قفازات مقاومة للقطع أثناء التعامل معها. بعد الاستخدام، يتم التخلص من شفرات الحلاقة وفقاً لإجراءات السلامة المختبرية المؤسسية الخاصة بالأجسام الحادة. يتم إجراء لحام الفضة تحت تهوية مناسبة مع ارتداء نظارات واقية.
  3. إدخال القضيب الحامل للشفرة في إبرة حقنة من الفولاذ المقاوم للصدأ (القطر الخارجي 1.6 mm) للسماح بالدوران المحوري الحر.
  4. سد كلا طرفي الإبرة باستخدام سدادة من polytetrafluoroethylene (PTFE) منخفضة الانبعاثات للحفاظ على الظروف المحكمة للهواء مع الحفاظ على القدرة على الدوران.
  5. تركيب مقبض تدوير يدوي عند الطرف القريب من القضيب لتمكين الدوران المتحكم فيه للقاطع الداخلي.
  6. تثبيت دعامتين مرنتين مصنوعتين من صفيحة نحاس زنكي زنبركية (بسمك 0.2 mm) على السطح الخارجي للإبرة لتثبيت القاطع في النصف السفلي من الغرفة.
  7. عمل شق مثلثي في حشية الغرفة السفلية للسماح بإدخال الشفرة دون ملامسة سطح الورقة.
  8. سد نقطة الإدخال باستخدام معجون سد منخفض الانبعاثات لمنع تسرب الغاز.
    ملاحظة: قبل المتابعة، تأكد من أن تركيب القاطع لم يؤثر سلباً على إحكام غلق الغرفة. تحقق من أن الغرفة تغلق تماماً، وأن المزدوجة الحرارية تظل ملامسة لسطح الورقة، وأن نظام تبادل الغازات يشير إلى تدفق هواء مستقر دون وجود دليل على التسرب. لا تتابع إلا بعد التأكد من استقرار ظروف الغرفة. اختر طول الشفرة لإحداث قطع بطول 10 mm تقريباً. يظهر آلية القطع المتكاملة وموضعها داخل غرفة الورقة في الشكل 1B.

إعداد أخذ عينات الكروماتوغرافيا الغازية-مطياف الكتلة (GC-MS) للتحليل الكيميائي؛ منفذ PTR-TOF-MS.
الشكل 1: نظام تبادل غازي معدل مع قاطع أوراق مدمج داخل الغرفة وخطوط أخذ عينات للمواد المتطايرة.​  (A) نظرة عامة على نظام التبادل الغازي المعدل، توضح منفذ أخذ عينات PTR-TOF-MS وخط أخذ عينات GC–MS الموضوع بالقرب من مخرج الغرفة لجمع المواد المتطايرة. (B) عرض مقرب للغرفة المفتوحة يوضح آلية القطع المدمجة والمنطقة التي توضع فيها الورقة أثناء إحداث الجرح. القاطع مدمج بإحكام داخل الغرفة، مما يسمح بجرح الورقة دون فتح الغلاف أثناء القياس. يتيح هذا التكوين مراقبة انبعاثات المواد المتطايرة والتبادل الغازي في الوقت الفعلي تحت ظروف بيئية محكومة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. تهيئة مسارات أخذ عينات المواد المتطايرة

  1. قم بتركيب وصلة تائية من التفلون (Teflon T-piece) بقطر داخلي 1/16″ أو 1/8″ بجوار مخرج الغرفة (الشكل 1A) لتقليل طول الأنابيب بين الغرفة ومحلل المواد المتطايرة.
  2. صِل المخرج بنظام تجميع المركبات العضوية المتطايرة (VOC) باستخدام أنابيب خاملة (على سبيل المثال FEP أو PTFE؛ بقطر داخلي 1.6 mm). قم بتركيب الوصلة التائية مباشرة بجوار مخرج الغرفة للحفاظ على أقصر طول ممكن للأنابيب بين الغرفة ومحلل المواد المتطايرة، مما يقلل من الحجم الداخلي، وزمن المكوث، وفقد الامتصاص.
  3. حافظ على تدفق الهواء في الغرفة عند 750 µmol s-1.
    ملاحظة: تؤدي الأنابيب الخاملة القصيرة إلى تقليل الامتصاص وزمن المكوث للمركبات التفاعلية.

3. تحضير المادة النباتية

  1. قم بزراعة Quercus rubra و Acer platanoides و Gossypium hirsutum في غرفة بيئية محكومة عند درجة حرارة 25 °C نهاراً / 20 °C ليلاً، ورطوبة نسبية 60%، وكثافة ضوئية 1000 µmol m-2 s-1، وفترة ضوئية 16 h/ 8 h لمدة 4 أشهر.
  2. حافظ على النباتات تحت تركيز CO2 الجوي المحيط (~430 ppm) طوال فترة التجربة.
  3. قم بري جميع النباتات كل يومين حتى تصل التربة إلى السعة الحقلية.
  4. اختر أوراقاً متمددة بالكامل وغير هرمة من مرحلة نمو متقاربة لإجراء التجارب.

4. تجارب جرح الأوراق وجمع المركبات العضوية المتطايرة (VOC)

  1. تغليف الورقة وضبط الظروف البيئية
    1. ضع ورقة متصلة ومتمددة بالكامل داخل الكيوفيت المجهزة بقطاعة داخلية.
    2. اضبط درجة حرارة الكتلة على 25 °C، والرطوبة النسبية للهواء على 60%، وشدة الضوء النشطينياً على 1000 µmol m-2 s-1 (90% أحمر، 10% أزرق)، وتدفق الهواء على 750 µmol s-1.
    3. اترك الورقة تتأقلم تحت الظروف البيئية المختارة حتى يتم الوصول إلى قيم الحالة المستقرة لصافي تمثيل CO2، والموصلية الثغرية، وإشارات المركبات العضوية المتطايرة (VOC) الأساسية، وعادة ما يحدث ذلك خلال 20–30 دقيقة بعد تغليف الورقة.
  2. إجراء قياسات التبادل الغازي، والفلورة، ومراقبة المركبات العضوية المتطايرة
    1. ابدأ القياسات المتزامنة للتبادل الغازي والمركبات العضوية المتطايرة باستخدام دقة 1 Hz.
    2. بعد إتمام قياسات التبادل الغازي، سجل عائد الفلورة في الحالة المستقرة (Fs) ثم طبق نبضة تشبع (8000 µmol m-2 s-1، 0.6 s) عبر مقياس الفلورة الخاص بالغرفة (3055-FL) لتحديد أقصى عائد للفلورة (Fm′) في الأوراق المتكيفة مع الضوء.
    3. أطفئ الضوء النشطينياً وعرّض الورقة للتكيف مع الظلام لمدة 20 دقيقة.
    4. سجل تنفس الورقة في الظلام.
    5. قس الفلورة الأولية (F₀) باستخدام ضوء قياس مُعدّل ضعيف (0.03 µmol m-2 s-1)، تتبعها نبضة تشبع للحصول على أقصى فلورة في الأوراق المتكيفة مع الظلام (Fm).
    6. أعد تشغيل الضوء النشطينياً.
    7. واصل قياسات المركبات العضوية المتطايرة والتبادل الغازي تحت نفس الظروف البيئية حتى يستقر الخط الأساسي لما قبل الجرح.
      ملاحظة: قبل إحداث الجرح، تأكد من استقرار الظروف البيئية المختارة ومن وصول صافي تمثيل CO₂، والنتح، وإشارات المركبات العضوية المتطايرة الأساسية إلى قيم الحالة المستقرة. لا تتابع الإجراء إلا بعد الحفاظ على هذه الظروف تحت إعدادات القياس المختارة.
  3. جرح الورقة وجمع المركبات العضوية المتطايرة
    1. أدخل خرطوشة المركبات العضوية المتطايرة الأولى في خط المخرج وقم بتوصيلها بمضخة أخذ عينات هواء محمولة ذات تدفق ثابت. اسحب هواء الغرفة عبر الخرطوشة بمعدل تدفق ثابت قدره 200 mL min-1. استخدم خرطوشة امتزاز من الفولاذ المقاوم للصدأ متعددة الطبقات (طول 10.5 cm، قطر داخلي 3 mm) مناسبة لالتقاط المتطايرات C3–C17، ومعبأة بـ Carbotrap C 20/40 mesh (0.2 g)، وCarbopack B 40/60 mesh (0.1 g)، وCarbotrap X 20/40 mesh (0.1 g)، مرتبة من أضعف إلى أقوى قوة امتزاز في اتجاه أخذ العينات.
      ملاحظة: قبل أخذ العينات، قم بتهيئ الخراطيش عن طريق تمرير الهيليوم عالي النقاء عبر الخرطوشة بمعدل 200 mL min-1 لمدة 3 ساعات عند 250 °C. يتيح أخذ العينات بالخرطوشة إجراء تحليل GC-MS لاحق خارج الخط لتحديد المركبات عند الحاجة وفقاً لأهداف التجربة. ورغم أن الجمع بالخراطيش يشكل جزءاً من سير العمل الموصوف هنا، فإن النتائج التمثيلية المعروضة في هذه الدراسة مشتقة من قياسات PTR-TOF-MS المستمرة. طابق اختيار المادة الممتزة مع نطاق التطاير وقطبية المركبات العضوية المتطايرة المستهدفة، وكذلك مع ظروف أخذ العينات.
    2. اجمع المركبات العضوية المتطايرة لما قبل الجرح لمدة 15 دقيقة بمعدل 200 mL min-1.
    3. استبدل الخرطوشة واجمع المركبات العضوية المتطايرة لمدة دقيقتين.
    4. أدر القطاعة الداخلية بزاوية 360° لقص الورقة دون فتح الغرفة وأعد الشفرة إلى وضعها الأصلي.
      ملاحظة: ضع الورقة داخل الغرفة بحيث يتم إجراء الشق في النصل المغلف مع الحفاظ على إحكام غلق الغرفة تماماً. كلما سمح حجم الورقة ومورفولوجيتها، تجنب القص عبر العرق الرئيسي وحافظ على اتساق موقع الشق قدر الإمكان بين العينات. نظراً لأن تلف العروق الرئيسية يمكن أن يزيد بشكل كبير من انبعاثات المتطايرات الناجمة عن الجرح، فإن التحديد المتسق لموقع الجرح يحسن من إمكانية تكرار التجربة5.
      تنبيه: تأكد من أن الغرفة مغلقة تماماً قبل القص.
    5. واصل جمع المركبات العضوية المتطايرة باستخدام نفس الخرطوشة لمدة 13 دقيقة.
    6. أدخل خرطوشة ثالثة واجمع المركبات العضوية المتطايرة لمدة 15 دقيقة.
    7. قم بتشغيل جهاز PTR-TOF-MS باستمرار خلال جميع الفترات للكشف في الوقت الفعلي.
      ملاحظة: قبل وبعد كل قياس للنبات، اجمع عينة خلفية من الغرفة الفارغة تحت نفس الظروف البيئية. استخدم قياسات الخلفية هذه لتصحيح الخط الأساسي لبيانات انبعاث المركبات العضوية المتطايرة أثناء تحليل البيانات.

5. الكشف عن المواد المتطايرة وتشغيل الجهاز

  1. اضبط درجات حرارة المدخل وأنبوب الانجراف في جهاز PTR-TOF-MS على 80 °C، وتدفق المدخل على 100 mL min-1، وتدفق بخار الماء على 4.0 mL min-1، وتيار الأيونات على 4.0 mA، وضغط غرفة الانجراف على 2.1 mbar، ونسبة كثافة مجال أنبوب الانجراف على 115 Td، وضغط وحدة TOF-MS على 1.2 × 10-7 mbar.
  2. سجل الإشارات المتطايرة بدقة زمنية تبلغ 1 Hz مع فاصل عينة قدره 400 ps.
  3. قم بمعايرة جهاز PTR-TOF-MS قبل كل تجربة باستخدام خليط غاز قياسي معتمد يحتوي على مركبات عضوية تطايرية (VOCs) ممثلة للفئات الرئيسية للمواد المتطايرة في النباتات. قم بمعالجة بيانات المعايرة وحساب تركيزات المركبات العضوية المتطايرة باستخدام برنامج PTR-MS Viewer وفقاً للإجراءات الموضحة13,16.

6. تحليل عينات الخرطوشة بواسطة جهاز GC-MS خارج الخط

ملاحظة: يصف الإجراء التالي التحليل غير المتصل للعينات المجمعة في الخراطيش أثناء سير العمل المذكور أعلاه. يوفر تحليل GC-MS تحديداً تكميلياً للمركبات، بينما تستند النتائج الممثلة المعروضة في هذه الدراسة إلى قياسات PTR-TOF-MS المستمرة.

  1. قم بإجراء الامتصاص الحراري للخراطيش باستخدام وحدة امتصاص حراري آلية متصلة بنظام GC-MS وفقاً للإجراء الذي وصفه Kännaste et al.20.
  2. حدد المركبات من خلال المقارنة مع المعايير الأصلية ومكتبة NIST للأطياف الكتلية. قم بإجراء الكشف الطيفي الكتلي باستخدام تأين الاصطدام الإلكتروني (70 eV)، وأكد هويات المركبات عبر مطابقة كل من أزمنة الاستبقاء والأطياف الكتلية مع المعايير الأصلية عند توفرها.
    ملاحظة: يتبع أخذ عينات الخراطيش البروتوكول المعدل من Kännaste et al.20 لالتقاط المواد المتطايرة C3–C17.

7. تحليل البيانات

  1. اطرح خلفية الغرفة الفارغة من جميع آثار الانبعاثات قبل التحليل. حدد خط الأساس ما قبل الجرح لكل كتلة مراقبة على أنه متوسط الإشارة خلال فترة زمنية ثابتة مباشرة قبل القطع.
  2. استخدم وقت القطع كنقطة مرجعية مشتركة لجميع الكتل المراقبة. حدد بداية الانبعاث بأنها أول زيادة يمكن اكتشافها في إشارة المركبات العضوية المتطايرة (VOC) المصححة وفقاً لخط الأساس بعد قطع الورقة.
    ملاحظة: عُرِفت بداية الانبعاث بأنها أول زيادة متتالية فوق خط الأساس ما قبل الجرح وتستمر حتى مرحلة الصعود في دفق الانبعاث، وبذلك يتم استبعاد التقلبات المنعزلة التي تعزى إلى ضوضاء الجهاز.
  3. احسب الوقت اللازم للوصول إلى الذروة على أنه الفاصل الزمني بين وقت القطع وأقصى إشارة انبعاث. احسب أقصى ميل لدفق الانبعاث من المشتقة الأولى للإشارة المصححة وفقاً لخط الأساس باستخدام متوسط الميول الأمامية والخلفية بين نقاط البيانات المتجاورة13. حدد مقدار الذروة على أنه أقصى قيمة انبعاث مرصودة أثناء الدفق.

النتائج

لتقييم ما إذا كان موقع أخذ عينات المواد المتطايرة يؤثر على اكتشاف الإشارة، قارنا بين تكوينين باستخدام حقن غاز محكوم في غرفة الأوراق. في أحد الإعدادين، تم أخذ عينات من المواد المتطايرة مباشرة عند مخرج الغرفة في غرفة تبادل الغازات المعدلة (الشكل 1). وفي المقابل، في الإعداد الآخر، مر الهواء عبر أنابيب محلل تبادل الغازات قبل الوصول إلى الكاشف. وقد أتاح تسجيل كلتا الإشارتين في آن واحد إجراء مقارنة مباشرة للديناميكيات الزمنية لكل منهما.

أدى حقن المركبات المتطايرة النقية إلى استجابات سريعة من الكاشف مع ظهور قمم انبعاث متميزة (الشكل 2). وعند أخذ العينات مباشرة من مخرج الغرفة، ارتفعت الإشارات فور الحقن، ووصلت إلى قيم قصوى حادة، ثم تلاشت بسرعة. أما عند أخذ العينات بعد أنابيب المحلل، فقد أنتجت المركبات نفسها استجابات متأخرة ومخمدة.

بالنسبة للإيزوبرين (m/z 69)، كان التأخير الزمني بين مواقع أخذ العينات ضئيلًا، وظلت قيم الذروة متشابهة (الشكل 2A). أما بالنسبة لـ Z-3-hexen-1-ol (m/z 83)، فقد أدى المرور عبر الأنابيب إلى تقليل ارتفاع الذروة وتوسيع منحنى الاضمحلال مقارنة بأخذ العينات المباشر (الشكل 2B). وكان هذا التأثير أقوى ما يكون بالنسبة لـ α-pinene (m/z 137)، حيث أدى المرور عبر الأنابيب إلى تخفيف الذروة بشكل قوي مقارنة بالإشارة المقاسة مباشرة عند مخرج الغرفة (الشكل 2C).

منحنيات استجابة مطيافية الكتلة؛ m/z 69, 83, 137؛ حقن الغاز؛ استجابة الكاشف مقابل الزمن.
الشكل 2: تأثير موضع أخذ العينات على الاستجابة الزمنية للكشف عن المواد المتطايرة. تم تسجيل الاستجابات لحقن مواد نقية من (A) isoprene (m/z 69)، و (B) Z-3-hexen-1-ol، والذي تم الكشف عنه بشكل أساسي كأيون شظية m/z 83، و (C) α-pinene (m/z 137) في موضعين لأخذ العينات. تمثل الخطوط المتصلة أخذ العينات مباشرة بعد مخرج الغرفة، بينما تمثل الخطوط المتقطعة موضع أخذ العينات القياسي قبل محللات CO₂/H₂O بعد المرور عبر أنابيب نظام تبادل الغازات. تشير الأسهم إلى حقن الغاز. تم تطبيع الاستجابات بالنسبة لأقصى إشارة تم اكتشافها بواسطة PTR-QMS عند أخذ العينات بجوار الغرفة. ولتوضيح الاختلافات في شكل الاستجابة، تم إزاحة المسارات الزمنية لأخذ العينات القياسي بمقدار 0.9 s بالنسبة لأخذ العينات المباشر. تم تعديل هذا الشكل عن Rasulov et al.16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

أدى قطع الأوراق إلى تحفيز انبعاثات متطايرة سريعة ومحددة للمركبات في جميع الأنواع (Quercus rubra وAcer platanoides وGossypium hirsutum)، وقد رصد النظام هذه الانبعاثات في غضون ثوانٍ. وبما أن إعداد غرفة القياس قد حدد بدقة كلًا من وقت بدء الانبعاث وتوقيت الذروة، فقد أتاح ذلك قياس الحركية الخاصة بكل مركب دون مقاطعة عملية القياس.

عبر جميع الأنواع، تم اكتشاف إشارة PTR-TOF-MS المهيمنة والمستحثة بالجروح عند m/z 99، والتي نُسبت مبدئيًا إلى مركبات من نوع hexenal المشتقة من LOX بناءً على دراسات PTR-TOF-MS سابقة (الشكل 3، الشكل 4، والشكل 5). وتراوحت انبعاثات الذروة بين 24–300 nmol m-2 s-1 عبر الأنواع الثلاثة، مما يوضح قدرة البروتوكول على تحليل ديناميكيات المركبات العضوية المتطايرة (VOC) المستحثة بالجروح عبر نطاق واسع من شدة الانبعاثات (الشكل 3، الشكل 4، والشكل 5). وفي جميع الحالات، زادت m/z 99 خلال ثوانٍ من القطع، ووصلت إلى الذروة في غضون ~39–57 s، وأظهرت الارتفاع الأكثر حدة من بين الكتل التي تمت مراقبتها (الجدول 1)، مما يحددها كالمكون الحاد المهيمن في تدفق الجروح.

ظلت الكتلة 69 مهملة قبل القطع في A. platanoides (الشكل 4B) و G. hirsutum (الشكل 5B)، وزادت بنسبة طفيفة فقط بعد الجرح. وفي المقابل، أظهرت Q. rubra انبعاثات أساسية كبيرة قبل القطع، تلتها زيادة عابرة متواضعة ثم استقرار لاحق، وهو ما يتفق مع إطلاق الإيزوبرين التأسيسي المتراكب على استجابة الجرح (الشكل 3B).

كشفت الكتل الأخرى التي تمت مراقبتها عن تسلسل زمني واضح بعد القطع. وبصرف النظر عن النوع، حددت القيم m/z 43 و57 و69 و99 المرحلة المبكرة من التدفق، بينما بلغت القيم m/z 45 و83 ذروتها في وقت لاحق (الشكل 3، والشكل 4، والشكل 5؛ الجدول 1). كان هذا النمط أكثر وضوحاً في A. platanoides، حيث بدأت القيمة m/z 45 في الارتفاع فور القطع ولكنها بلغت ذروتها فقط بعد ~155 s، مما يشير إلى استجابة أبطأ وأطول أمداً من الشظايا المبكرة المرتبطة بـ LOX (الشكل 4A; الجدول 1). وبالمثل، بلغت القيمة m/z 83 ذروتها في وقت لاحق من الشظايا المبكرة في جميع الأنواع، وكانت متأخرة بشكل خاص في G. hirsutum، حيث وصلت إلى حدها الأقصى فقط بعد ~223 s (الشكل 5A; الجدول 1).

رسم بياني لمطيافية الامتصاص العابر؛ حركية M43+ و M45+ و M83+؛ الزمن مقابل التركيز.
الشكل 3: الانبعاثات المتطايرة الناتجة عن الجروح والمقاسة بدقة زمنية في ورقة نموذجية من شجرة Quercus rubra. (A) m/z 43 و 45 و 83. (B) m/z 57 و 69 و 99. عند t = 0، تم قطع الورقة باستخدام قاطعة أوراق داخل الغرفة كما هو موضح في الشكل 1، مما أحدث شقاً بطول 10 mm. تمت مراقبة الانبعاثات المتطايرة باستمرار باستخدام مطياف كتلة زمن الطيران بتفاعل نقل البروتون (PTR-TOF-MS)، وقِيست معدلات تبادل الغازات بنظام Walz GFS-3000. تظهر الإشارات كملفات انبعاث نموذجية مصححة من خط الأساس توضح الدقة الزمنية التي يمكن تحقيقها باستخدام هذا البروتوكول. راجع الجدول 1 للحصول على واصفات حركية نموذجية مستخلصة من ملفات الانبعاث هذه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

على الرغم من هذه الميزات المشتركة، توضح القياسات التمثيلية أن مسارات الانبعاث يمكن أن تختلف بين الأنواع. في Q. rubra، ارتفعت m/z 43 و 57 بسرعة ولكنها تباعدت خلال مرحلة الاضمحلال، حيث انخفضت m/z 57 بشكل أبطأ من m/z 43 (الشكل 3A،B). أما في A. platanoides، فقد انعكس هذا النمط، حيث أظهرت m/z 43 انخفاضاً أبطأ في المرحلة المتأخرة (الشكل 4A). وفي G. hirsutum، كانت جميع الإشارات أقل مقداراً، وجمعت ملفات الانبعاث بين القمم الأولية السريعة والاضمحلال الأكثر تدرجاً. ومن الملاحظ أن m/z 45 أظهرت زيادة ثانوية صغيرة خلال مرحلة الاضمحلال (الشكل 5A).

رسم بياني لنتائج الكروماتوغرافيا يوضح قمم M43 وM45 وM83 والتغيرات الديناميكية لـ M57 وM69 وM99.
الشكل 4: الانبعاثات المتطايرة الناتجة عن الجروح والمحددة زمنياً في ورقة نموذجية من Acer platanoides. (A) m/z 43 و45 و83. (B) m/z 57 و69 و99. تم قطع الورقة عند t = 0 باستخدام قاطع داخل الغرفة (الشكل 1؛ شق بطول 10 mm). قيست الانبعاثات المتطايرة باستمرار باستخدام مقياس طيف الكتلة بزمن الطيران وتفاعل نقل البروتون (PTR-TOF-MS)، وقيس التبادل الغازي باستخدام نظام Walz GFS-3000. تظهر الإشارات كملفات تعريف انبعاث نموذجية مصححة من الخط القاعدي توضح الدقة الزمنية التي يمكن تحقيقها باستخدام هذا البروتوكول. راجع الجدول 1 للحصول على واصفات حركية نموذجية مستخرجة من ملفات تعريف الانبعاث هذه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تشير هذه الأنماط مجتمعة إلى أن الانبعاثات الناجمة عن الجروح تتبع تسلسلاً خاصاً بكل مركب بدلاً من أن تكون دفقاً واحداً متزامناً، حيث تتبعها مكونات مبكرة حادة استجابات متأخرة وأكثر اتساعاً.

رسمان بيانيان حركيان لأيونات السلسلة M (M_43، M_45، M_83؛ M_57، M_69، M_99) بمرور الوقت.
الشكل 5: الانبعاثات المتطايرة الناجمة عن الجروح والمحددة زمنياً في ورقة نموذجية من نبات Gossypium hirsutum. (أ) m/z 43 و45 و83. (ب) m/z 57 و69 و99. تم قطع الورقة عند t = 0 باستخدام قاطع داخل الغرفة (الشكل 1؛ شق بطول 10 mm). تم قياس الانبعاثات المتطايرة باستمرار باستخدام مطياف كتلة زمن الطيران بتفاعل نقل البروتون (PTR-TOF-MS)، وقيس التبادل الغازي باستخدام نظام Walz GFS-3000. تظهر الإشارات كملفات تعريف انبعاث نموذجية مصححة من خط الأساس، توضح الدقة الزمنية التي يمكن تحقيقها باستخدام هذا البروتوكول. راجع الجدول 1 للحصول على الواصفات الحركية النموذجية المستخلصة من ملفات تعريف الانبعاثات هذه. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

يتيح البروتوكول المقدم هنا تحليلاً عالي الدقة الزمنية للانبعاثات المتطايرة الناجمة عن الجروح تحت ظروف تجريبية مضبوطة. ومن خلال دمج عملية القطع مباشرة داخل غرفة الورقة والمراقبة المستمرة للإشارات المتطايرة (الشكل 1)، يلتقط النظام استجابة الانبعاث دون التشوهات التي قد تنتج عن تأخر أخذ العينات، أو فتح الغرفة، أو التعامل مع الورقة خارج إعداد القياس. ويمكن لهذه الاضطرابات أن تؤدي إلى إزاحة كل من التوقيت الظاهري وقيمة ذروة الانبعاثات في القياسات المعتمدة على الغلاقات3,6,13,17. ومن خلال الحفاظ على عمليتي التجريح والقياس في الغرفة نفسها، يحافظ البروتوكول على الجدول الزمني للانبعاثات ويسمح بكميّة دقيقة ومحددة زمنياً للاستجابات المتطايرة الناجمة عن الإجهاد.

النوعالكتلة الجزيئية البروتونيةمقدار الذروة (nmol m-2 s-1)بداية الظهور بعد القطع (s)زمن الذروة (s)الميل الأقصى (nmol m-2 s-2)
Quercus rubra4321.91~0.055.61.49
4510.527111.40.29
5721.272055.61.37 
69145.625611.44
8324.132171.81.39
99243.162157.418.17
Acer platanoides4320.265.4541.59
4518.061.8154.80.55
5718.6510.841.41.55
6915.1510.841.41.13
838.787.257.60.76
99292.8610.843.223.62
Gossypium hirsutum433.55.448.60.19
454.98995.40.29
572.4810.8360.18
692.4212.637.80.17
834.8314.4223.20.3
9923.4712.639.61.95

الجدول 1: قيم ممثلة لمقدار الذروة، وبداية الانبعاث، والزمن اللازم للوصول إلى الذروة، والميل الأقصى المستخلصة من قياسات PTR-TOF-MS المستمرة بعد جرح الأوراق. تشمل القيم مقدار الذروة، وبداية الانبعاث، والزمن اللازم للوصول إلى الذروة، والميل الأقصى. توضح هذه القيم نوع الواصفات الحركية التي يولدها البروتوكول، وهي مقدمة كأمثلة لإثبات المفهوم بدلاً من كونها مقارنات إحصائية بين الأنواع. تم تعريف بداية الانبعاث على أنها أول زيادة يمكن اكتشافها فوق خط الأساس ما قبل الجرح بعد القطع، والزمن اللازم للوصول إلى الذروة على أنه الفاصل الزمني بين القطع وأقصى إشارة، والميل الأقصى على أنه أقصى مشتقة أولى للإشارة المصححة وفقاً لخط الأساس.

أظهرت مقارنة مواقع أخذ العينات أن تكوين أخذ العينات أثر بشكل ملحوظ على الإشارة المسجلة (الشكل 2). فقد حافظ أخذ العينات المباشر عند مخرج الغرفة على التكوين السريع للقمم، بينما أدى أخذ العينات بعد أنابيب المحلل إلى تأخير تكوين القمم وتوهين شدة الإشارة. وكان هذا التأثير ضئيلاً بالنسبة للإيزوبرين (m/z 69)، ومتوسطاً بالنسبة لـ m/z 83، والأقوى بالنسبة لـ α-pinene (m/z 137)، وهو ما يتفق مع زيادة التشوه المرتبط بالنقل للمركبات الأثقل أو الأكثر تفاعلاً10,21. إن الامتصاص على أسطح الأنابيب، وتأخر النقل عبر خط أخذ العينات، والتفاعلات الكيميائية أثناء النقل يمكن أن تؤدي إلى توسيع أو توهين قمم الانبعاث، مما يغير بالتالي تفسير حركية المواد المتطايرة9,12,21.

تتمثل الميزة الأساسية للبروتوكول الحالي في قدرته على تحليل المرحلة المبكرة من الانبعاثات المتطايرة الناجمة عن الجروح. وقد ظهرت هذه المرحلة المبكرة في جميع الأنواع في غضون ثوانٍ من عملية القطع، وسيطرت عليها دفعة عند m/z 99، والتي أظهرت أعلى مقدار للقمة وأشد ميل أقصى (الشكل 3, الشكل 4، و الشكل 5; الجدول 1). وحدثت القيم القصوى للقمم في غضون ~40–57 s بعد القطع، وهو وقت أبكر بكثير من 100–280 s التي يتم الإبلاغ عنها عادةً في الدراسات السابقة13,19,22. ومن المرجح أن يعكس هذا التغير التزامن بين إحداث الجرح والكشف عنه داخل الغرفة، مما يقلل من التأخيرات الناتجة عن التعامل مع الأوراق والنقل عبر خط أخذ العينات.

من خلال مزامنة عملية الإحداث الجرح والكشف ضمن نفس الغلاف، استطاع البروتوكول أيضاً تحديد تسلسل على مستوى الشظايا، حيث ارتفعت قيم m/z 43 و57 مباشرة بعد القطع، بينما بلغت قيمة m/z 45 ذروتها لاحقاً وأظهرت ديناميكيات تحلل أوسع (الشكل 3، الشكل 4، و الشكل 5؛ الجدول 1)). ويظل هذا الترتيب متسقاً مع الدراسات السابقة القائمة على تقنية PTR، رغم غياب الفصل على مستوى المركبات مقارنة بتقنية GC-MS، والتي تسيطر فيها ألدهيدات C6 المشتقة من ليبوكساجينيز على الانبعاثات المبكرة، تليها الكحوليات الناتجة عن المسارات اللاحقة والمنتجات ذات الصلة19,22. وبالتوافق مع دراسات PTR-TOF-MS السابقة، تتماشى إشارة m/z 99 السائدة مع المركبات من نوع hexenal، والتي تم تحديد شظية نزع الماء الخاصة بها عند m/z 81 كإشارة مبكرة رئيسية، بينما تعكس قيمة m/z 83 مساهمات من hexenols وhexanal22. ويدعم هذا التسلسل بشكل أكبر وجود تسلسل هرمي يعتمد على الحجم والمسار، حيث يتم إطلاق المركبات المؤكسجة الأصغر التي تتكون بسرعة في وقت مبكر مقارنة بالجزيئات الأكبر أو الأكثر تعقيداً13,23.

إلى جانب الشظايا المشتقة من ليبوكسيجيناز، أظهرت الإشارة عند نسبة الكتلة إلى الشحنة (m/z) 69، والتي نُسبت مبدئياً إلى الإيزوبرين، مسارات انبعاث متميزة بين الأمثلة التمثيلية (الشكل 3, الشكل 4، و الشكل 5). *Q. rubra* أظهرت انبعاثات خط أساسية كبيرة، في حين أن .A. platanoides و *G. hirsutum* أنتجت مستويات ضئيلة فقط، وهو ما يتوافق مع خصائص انبعاثها المعروفة24,25وبعبر الأنواع المختلفة، استجاب الإيزوبرين بشكل ضعيف فقط للإصابة بالجروح، وهو ما يتسق مع... من البداية (de novo) تخليق عن طريق مسار MEP، الذي يعتمد على التمثيل الغذائي الضوئي، وبالتالي يتأثر بشكل غير مباشر فقط بالإصابة الميكانيكية15.

تعكس هذه الديناميكيات السريعة استجابات كيميائية حيوية معروفة للأوراق تجاه التلف الميكانيكي. إذ ينشط الإصابة الميكانيكية بسرعة مسار ليبوكساجيناز، الذي ينتج نبضات عابرة من المركبات المتطايرة C6 والمركبات المؤكسجة ذات الصلة الناتجة عن أكسدة دهون الغشاء5,7,17,22,23. وتظهر هذه الانبعاثات ديناميكيات غير متماثلة بقوة، مع ارتفاع سريع بعد تمزق الأنسجة، تتبعها مرحلة اضمحلال أبطأ16. ويتكشف هذا النمط غير المتماثل في النظام الحالي على مقياس زمني يتراوح من ثوانٍ إلى دقائق، كما توضحه الواصفات الحركية التمثيلية الملخصة في الجدول 1، بينما تذكر الدراسات التي تسبب جروحاً للأوراق خارج الغرفة حدوث ذروات متأخرة13. ويسمح هذا الميز الزمني المبكر بالتقاط الإشارة منذ بدايتها، مما يقلل من التشتت الزمني، ويُمكّن من التحديد الكمي المباشر لكل من مرحلتي الارتفاع والاضمحلال. وتحدد هذه السمات الحركية مجتمعة مسار الانبعاث الكامل، والذي غالباً ما تقلل من تقديره نهوج أخذ العينات المنفصلة أو المتأخرة5,15.

يؤدي توحيد عملية القطع داخل الغرفة إلى تحسين إمكانية تكرار التجربة من خلال ضمان اتساق هندسة الجرح وشدته، وكلاهما يتحدد بطول الشق ويؤثر بشكل مباشر على مقدار انبعاثات المركبات العضوية المتطايرة (VOC)5,18,22. ومع ذلك، ونظراً لأن شفرة القطع تشغل موضعاً ثابتاً داخل الغرفة، فإن مكان الشق يتأثر بحجم الورقة ومورفولوجيتها والحاجة إلى الحفاظ على سد محكم للهواء. وينبغي قدر الإمكان وضع الشق ضمن النصل بين العروق مع تجنب العرق الوسطي والعروق الرئيسية الأخرى. ومع ذلك، لا يمكن ضمان التجنب الكامل للعروق الرئيسية دائماً، خاصة في الأوراق الضيقة أو الصغيرة. ونظراً لأن تلف العروق الرئيسية يمكن أن يغير بشكل كبير من انبعاثات المركبات العضوية المتطايرة الناجمة عن الجرح5، فيجب الحفاظ على اتساق موقع الشق قدر الإمكان بين العينات في التجربة الواحدة.

تعد المحافظة على ظروف بيئية مستقرة أمراً بالغ الأهمية للحصول على قياسات قابلة للتكرار للمركبات العضوية المتطايرة (VOC) الناتجة عن الجروح. ونظراً لأن إنتاج المركبات العضوية المتطايرة وإطلاقها وانتقالها يتأثر بالظروف البيئية، فقد تم الحفاظ على ثبات درجة حرارة الغرفة، والرطوبة، والإشعاع، وتركيز CO2، وتدفق الهواء طوال جميع القياسات. ويؤدي توحيد هذه المتغيرات إلى تقليل التباين التجريبي وتحسين قابلية تكرار حركية المركبات العضوية المتطايرة الناتجة عن الجروح. بالإضافة إلى ذلك، وبما أن البروتوكول متوافق تماماً مع قياسات تبادل الغازات المتزامنة، فقد تربط التطبيقات المستقبلية ديناميكيات انبعاث المركبات العضوية المتطايرة مباشرة بالتغيرات في عملية التمثيل الضوئي والنتح تحت ظروف تجريبية متطابقة26. وقد تساعد هذه القياسات في التمييز بين التنظيم الكيميائي الحيوي لإنتاج المركبات العضوية المتطايرة والعمليات الفيزيائية التي تؤثر على إطلاق المواد المتطايرة، بما في ذلك زيادة تبخر المركبات المؤكسجة القابلة للذوبان في الماء من الأنسجة المجروحة16. وبناءً على ذلك، لا ينبغي تفسير الاختلافات بين المعاملات أو الأنواع إلا عندما تكون الظروف البيئية، وهندسة الجرح، والمادة النباتية، بما في ذلك مرحلة نمو الورقة، موحدة طوال التجربة12.

على الرغم من أن النهج السابقة التي اعتمدت على القياس داخل الغرفة قد أثبتت جدوى قياسات المركبات العضوية المتطايرة (VOC) الناتجة عن الجروح في الوقت الفعلي، إلا أنها كشفت أيضاً عن قيود تقنية هامة. فقد أدت القطوع غير المنتظمة، وعدم اتساق حجم الجرح، والاضطرابات في سد الغرفة إلى إحداث تباين في القياسات18,19. بالإضافة إلى ذلك، اعتمدت هذه النهج غالباً على أحجام غرف كبيرة نسبياً، مما أدى إلى إبطاء تجديد الهواء، وتأخير تشكل الذروة، وتوسيع ملامح الإشارة المتطايرة22,27. وتصبح هذه التأثيرات أكثر وضوحاً بالنسبة للمركبات الأقل تطايراً وقد تختلف باختلاف درجة الحرارة21. وفي المقابل، فإن الغرفة الأصغر المستخدمة في البروتوكول الحالي (حجم داخلي ~8 mL) تقلل من زمن بقاء الهواء، مما يساهم في ظهور البداية الأكثر حدة الملحوظة في قياساتنا (الشكل 1).

تم تطوير هذا البروتوكول لإجراء تجارب فيزيولوجية محكومة بدلاً من المراقبة المباشرة in situ للنظم البيئية للغابات. تُجرى القياسات على أوراق متصلة تحت ظروف بيئية محددة جيداً، مما يقلل من التباين التجريبي ويسمح بتوصيف دقيق لحركية المركبات العضوية المتطايرة (VOC) الناتجة عن الجروح. وستعتمد التطبيقات الميدانية على توفر أنظمة محمولة لتبادل الغازات والكشف عن المركبات العضوية المتطايرة. ومع ذلك، وبما أن آلية القطع المتكاملة يمكن تكييفها مع تكوينات مختلفة للغرف بإجراء تعديلات طفيفة فقط، فإن هذا النهج سيكون قابلاً للنقل بسهولة إلى منصات تبادل الغازات المحمولة والمنصات التجريبية الأخرى مع توفر هذه التقنيات. وتوسع هذه المرونة من فرص استقصاء استجابات النبات السريعة للإجهاد مع الحفاظ على الدقة الزمنية المطلوبة للتوصيف الدقيق لديناميكيات انبعاث المركبات العضوية المتطايرة، مما يسهل الدراسات الميكانيكية لأولى الاستجابات الفيزيولوجية والكيميائية الحيوية لتلف الأوراق.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

نقر بتلقي تمويل من مجلس البحوث الإستوني (PRG2207) ووزارة التعليم والبحوث في إستونيا (مركز التميز Agro-CropFuture، "الإيكولوجيا الزراعية والمحاصيل الجديدة في المناخات المستقبلية"، TK200U1).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
نظام GC-MS مع جهاز نزع حراري TD-20ShimadzuGCMS-QP2010 Plus; TD-20نظام GC-MS مع جهاز نزع حراري TD-20. www.shimadzu.com
نظام تبادل الغازات GFS-3000Walz GmbHGFS-3000قياسات تبادل الغازات في الأوراق. www.walz.com
هيليوم عالي النقاء (99.999%)مورد محليN/Aيُستخدم لتهيئة خرطوشة الامتزاز والنزع الحراري بواسطة GC-MS. www.airliquide.com (أو مورد مكافئ).
معيار معايرة الإيزوبرينSigma-Aldrich Chemie GmbHCustomمعيار معايرة إيزوبرين مخصص (3.43 ppm). www.sigmaaldrich.com
معجون سد منخفض الانبعاثاتمورد محليN/Aيُستخدم لسد نقطة إدخال القاطع في الغرفة.
خرطوشة امتزاز متعددة الطبقات من الفولاذ المقاوم للصدأSupelcoCustomالطول 10.5 cm × القطر الداخلي 3 mm؛ محشوة بـ Carbotrap C (0.2 g, 20–40 mesh)، وCarbopack B (0.1 g, 40–60 mesh)، وCarbotrap X (0.1 g, 20–40 mesh). تُستخدم للتعريف الاختياري للمركبات العضوية المتطايرة (VOCs) عبر GC-MS خارج الخط. www.sigmaaldrich.com
مضخة محمولة لأخذ عينات الهواء بتدفق ثابتSKC Inc.210-1003MTXمضخة محمولة لأخذ عينات الهواء بتدفق ثابت.
مطياف الكتلة PTR-TOF 8000Ionicon Analytik GmbHPTR-TOF 8000الكشف عن المركبات العضوية المتطايرة (VOC). www.ionicon.com
سلك لحام فضيمورد محليN/Aيُستخدم لتثبيت شفرة حلاقة بقضيب من الفولاذ المقاوم للصدأ.
صفيحة نحاس زنبركية (سمك 0.2 mm)مورد محليN/Aدعامات مرنة تُستخدم لتثبيت القاطع.
قضيب من الفولاذ المقاوم للصدأ (قطر 1 mm)مورد محليN/Aقضيب دعم القاطع.
إبرة حقنة من الفولاذ المقاوم للصدأ (القطر الخارجي 1.6 mm)مورد محليN/Aغلاف لشفرة قاطع دوارة.
سدادات تيفلونمورد محليN/Aتُستخدم لسد غلاف القاطع مع السماح بالدوران.
وصلة تيفلون على شكل حرف Tمورد محليN/Aتُركب بالقرب من مخرج الغرفة لتقليل طول الأنابيب.
أنابيب تيفلون (FEP أو PTFE)مورد محليN/Aخط أخذ عينات المركبات العضوية المتطايرة (VOC) بين الغرفة والكواشف.
مزيج غاز معايرة المركبات العضوية المتطايرة (VOC)Ionimed GmbHCustom1 ppm من كل مركب في N2؛ يُستخدم لمعايرة PTR-TOF-MS. www.ionimed.com

المراجع

  1. Bergman ME, Huang XQ, Baudino S, Caissard JC, Dudareva N. Plant volatile organic compounds: emission and perception in a changing world. Curr Opin Plant Biol. 2025;85:102706.
  2. Luo R, Lun X, Gao R, Wang L, Yang Y, Su X, et al. A review of biogenic volatile organic compounds from plants: research progress and future prospects. Toxics. 2025;13(5):1-35.
  3. Molleman F, Mandal M, Sokół-Łętowska A, Walczak U, Volf M, Mallick S, et al. Simulated herbivory affects the volatile emissions of oak saplings, while neighbourhood affects flavan-3-ols content of their leaves. J Chem Ecol. 2024;50(5-6):250-261.
  4. Huang PC, Berg-Falloure KM, Gao X, Meeley R, Kolomiets MV. Pentyl leaf volatiles promote insect and pathogen resistance via enhancing ketol-mediated defense responses. Plant Physiol. 2025;197(2):1-18.
  5. Portillo-Estrada M, Niinemets Ü. Massive release of volatile organic compounds due to leaf midrib wounding in Populus tremula. Plant Ecol. 2018;219(9):1021-1028.
  6. Engelberth M, Engelberth J. Leaf developmental stages strongly modulate indole emissions in response to simulated insect herbivory. Plants (Basel). 2025;14:3761.
  7. Matsui K. How and why plants came to smell green: the origins, biosynthesis, and roles of green leaf volatiles. J Exp Bot. 2025;76:1-14.
  8. Waterman JM, Cazzonelli CI, Hartley SE, Johnson SN. Simulated herbivory: the key to disentangling plant defence responses. Trends Ecol Evol. 2019;34(5):447-458.
  9. Tholl D, Boland W, Hansel A, Loreto F, Röse USR, Schnitzler JP. Practical approaches to plant volatile analysis. Plant J. 2006;45(4):540-560.
  10. Ormeño E, Goldstein A, Niinemets Ü. Extracting and trapping biogenic volatile organic compounds stored in plant species. TrAC Trends Anal Chem. 2011;30(7):978-989.
  11. Chang YY, Huang YM, Chang HT. Using headspace gas chromatography-mass spectrometry to investigate the volatile terpenoids released from the Liquidambar formosana leaf and its essential oil. Forests. 2024;15(9):1-12.
  12. Niinemets Ü, Kuhn U, Harley PC, Staudt M, Arneth A, Cescatti A, et al. Estimations of isoprenoid emission capacity from enclosure studies: measurements, data processing, quality and standardized measurement protocols. Biogeosciences. 2011;8(8):2209-2246.
  13. Portillo-Estrada M, Kazantsev T, Talts E, Tosens T, Niinemets Ü. Emission timetable and quantitative patterns of wound-induced volatiles across different leaf damage treatments in aspen (Populus tremula). J Chem Ecol. 2015;41(12):1105-1117.
  14. Waterman JM, Cofer TM, Von Laue OM, Mateo P, Wang L, Erb M. Leaf size determines damage- and herbivore-induced volatile emissions in maize. Plant Cell Environ. 2025;48(5):3766-3777.
  15. Yuan Y, Mao Y, Yuan H, Guo M, Zhou G, Niinemets Ü, et al. Impacts of mechanical injury on volatile emission rate and composition in 45 subtropical woody broad-leaved storage and non-storage emitters. Plants (Basel). 2025;14(5):1-40.
  16. Rasulov B, Talts E, Niinemets Ü. A novel approach for real-time monitoring of leaf wounding responses demonstrates unprecedentedly fast and high emissions of volatiles from cut leaves. Plant Sci. 2019;283:256-265.
  17. Portillo-Estrada M, Okereke CN, Jiang Y, Talts E, Kaurilind E, Niinemets Ü. Wounding-induced VOC emissions in five tropical agricultural species. Molecules. 2021;26(9):1-20.
  18. Mithöfer A, Wanner G, Boland W. Effects of feeding Spodoptera littoralis on lima bean leaves. II. Continuous mechanical wounding resembling insect feeding is sufficient to elicit herbivory-related volatile emission. Plant Physiol. 2005;137(3):1160-1168.
  19. Brilli F, Ruuskanen TM, Schnitzhofer R, Müller M, Breitenlechner M, Bittner V, et al. Detection of plant volatiles after leaf wounding and darkening by proton transfer reaction time-of-flight mass spectrometry (PTR-TOF). PLoS One. 2011;6(5):e20419.
  20. Kännaste A, Copolovici L, Niinemets Ü. Gas chromatography-mass spectrometry method for determination of biogenic volatile organic compounds emitted by plants. In: Rodríguez-Concepción M, editor. Plant Isoprenoids Methods and Protocols. New York (NY): Humana Press; 2014. p. 161-169.
  21. Schaub A, Blande JD, Graus M, Oksanen E, Holopainen JK. Real-time monitoring of herbivore-induced volatile emissions in the field. Physiol Plant. 2010;138(2):123-133.
  22. Fall R, Karl T, Hansel A, Jordan A, Lindinger W. Volatile organic compounds emitted after leaf wounding: on-line analysis by proton-transfer-reaction mass spectrometry. J Geophys Res Atmos. 1999;104(D13):15963-15974.
  23. Kaur D, Schedl A, Lafleur C, Martinez Henao J, van Dam NM, Rivoal J, et al. Arabidopsis transcriptomics reveals the role of Lipoxygenase2 (AtLOX2) in wound-induced responses. Int J Mol Sci. 2024;25(11):5898.
  24. Gentner DR, Ormeño E, Fares S, Ford TB, Weber R, Park JH, et al. Emissions of terpenoids, benzenoids, and other biogenic gas-phase organic compounds from agricultural crops and their potential implications for air quality. Atmos Chem Phys. 2014;14(11):5393-5413.
  25. Harley P, Deem G, Flint S, Caldwell M. Effects of growth under elevated UV-B on photosynthesis and isoprene emission in Quercus gambelii and Mucuna pruriens. Glob Chang Biol. 1996;2(2):149-154.
  26. Lobo-do-Vale R, Schenk HJ, Kübert A, Lintunen A. Gas phase in plants: integrating physiology, ecology and environmental sciences. Tree Physiol. 2026;46(13):1-4.
  27. Niinemets Ü. Whole plant photosynthesis. In: Flexas J, Loreto F, Medrano H, editors. Terrestrial Photosynthesis in a Changing Environment A Molecular Physiological and Ecological Approach. Cambridge: Cambridge University Press; 2012. p. 399-423.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.