مقالة منهجية

تعديل الجينوم بتقنية CRISPR-Cas9 في بكتيريا Mesorhizobium ciceri عبر تعطيل جين nodC لدراسات التكافل في الحمص

0 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71513

⸱

سبتمبر 25, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Root Nodule Symbiosis Laboratory, National Institute of Plant Genome Research, 2Microbial Engineering Laboratory, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تعطيل موقع nodC بوساطة CRISPR-Cas9 في بكتيريا Mesorhizobium ciceri باستخدام الإصلاح الموجه بالتماثل والفحص القائم على GFP لإنتاج طفرات معيبة في التكافل من أجل دراسات الجينوم الوظيفي في بكتيريا الريزوبيا المرتبطة بـالحمص.

الملخص

Mesorhizobium ciceri، وهو متعايش مثبت للنيتروجين في الحمص (*Cicer arietinum*)، لا يزال من الصعب تعديله وراثياً باستخدام طرق إعادة التركيب المتجانس التقليدية، والتي تتطلب جهداً مكثفاً وغالباً ما تترك علامات اختيار غير مرغوب فيها. نصف في هذا البروتوكول استراتيجية مبسطة لتحرير الجينوم باستخدام نظام البروتين 9 المرتبط بالتكرارات palindromic القصيرة المتباعدة بانتظام والمجمعة (CRISPR-associated protein 9 - Cas9) واسع النطاق من المضيف، والمكيف من أجل M. ciceriنوضح فعالية هذه الطريقة من خلال استهداف nodCالذي يشفر إنزيم N-acetylglucosaminyltransferase المطلوب لتخليق الهيكل الكيتيني في عوامل Nod، وهي جزيئات الإشارة الرئيسية المشاركة في التواصل الجزيئي التكافلي. يوضح هذا البروتوكول التصميم المنهجي للحمض النووي الريبوزي الموجه المفرد (sgRNAs) وبناء قالب الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR). وقد صُمم قالب HDR لتسهيل الدمج محدد الموقع لمراسل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) الذي يحيط بـ nodC موقع القطع. وعقب إيصال بنية Cas9/sgRNA/HDR من خلال التزاوج ثنائي الأبوين، تم تحديد الطفرات المفترضة باستخدام نهج فحص قائم على الفلورة. وأدى التعطيل الناجح لـ 1.3 kb nodC موضع ضمن عملية التعقد (عقدة الـ NOD (أو مستقبلات شبيهة بـ NOD)تم فحص الكاسيت في البداية من خلال معاينة تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في المستعمرات الطافرة باستخدام المجهر الفلوري. ثم تم التحقق من حدوث التعطيل بشكل إضافي عن طريق الهضم بإنزيمات القطع، وتضخيم الكاسيت المدمج من الحمض النووي الجينومي، وتسلسل سانجر. كما تم قياس تعبير البروتين الفلوري الأخضر كمياً باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مع النسخ العكسي. وللتحقق من التأثير الوظيفي للطفرة، أُجريت اختبارات عدوى نبات الحمص، والتي أظهرت ضعفاً في تكوين العقد الجذرية في النباتات الملقحة بـ ΔnodC M. ciceri مقارنةً بالسلالة البرية. وبوجه عام، يوفر هذا البروتوكول إطاراً فعالاً وقابلاً للتكرار لتعطيل الجينات بدقة وإجراء دراسات الجينوم الوظيفي في ميزوريزوبيوم (Mesorhizobium).

المقدمة

تم تطويع نظام نوكلياز البروتين 9 المرتبط بالتكرارات العنقودية المتناوبة منتظمة التباعد (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9)، والذي تم تحديده في الأصل كآلية مناعة تكيفية في بدائيات النواة، ليصبح أداة فعالة وموثوقة لتحرير الجينوم1,2. يستخدم النظام حمضاً نووياً ريبوزياً موجهًا اصطناعياً (sgRNA) لتحديد تسلسلات DNA المستهدفة من خلال ازدواج القواعد وفق نموذج Watson-Crick. يتكون sgRNA من 20 نوكليوتيد مكملة للمنطقة الجينومية المجاورة لتسلسل الزخرفة المجاورة للمباعد (PAM) من النوع NGG. يقوم Cas9 بإحداث كسر مزدوج السلسلة (DSB) في موقع محدد ضمن التسلسل المستهدف، عادةً ما يكون قبل 3 أزواج قاعدية (bp) من موقع PAM1. ويمكن إصلاح كسور DSB الناتجة إما عن طريق الربط النهائي غير المتماثل أو عن طريق الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) باستخدام قالب مانح3,4. وقد طُبقت هذه الاستراتيجية على نطاق واسع في نهج تعطيل الجينات، والإدخال الجيني (knock-in)، والحذف الجيني (knock-out) في البكتيريا5,6,7,8. الهدف الأساسي من هذا البروتوكول هو تطوير طريقة فعالة لتحرير الجينوم لبكتيريا Mesorhizobium ciceri باستخدام نظام CRISPR-Cas9 واسع المدى من حيث المضيف.

M. ciceri هي بكتيريا تربة سالبة الجرام تعمل كمتكافل داخلي أساسي مثبت للنيتروجين في نبات الحمص (Cicer arietinum)9. وتظهر إحدى سلالاتها، وهي M. ciceri CC1192، كفاءة عالية في تكوين العقد الجذرية، وقد تم تسلسل جينومها10. وعلى الرغم من أهميتها الزراعية، لا تزال التعديلات الجينية لأنواع Mesorhizobium محدودة. وقد تم سابقاً تطبيق أنظمة تعتمد على CRISPR في أنواع أخرى من الريزوبيا، بما في ذلك تداخل CRISPR (CRISPRi) في Rhizobium etli11، وتحرير الجينوم في Sinorhizobium meliloti12، وتحرير القواعد في S. meliloti13. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ عن منصة قوية لتحرير الجينوم في M. ciceri. تعتمد الطرق التقليدية على إعادة التركيب المتماثل بوساطة البلازميدات الانتحارية، وهي عملية تتطلب جهداً مكثفاً، وتحتاج إلى جولات متعددة من الاختيار، وغالباً ما تترك علامات مقاومة للمضادات الحيوية كـ "ندبات" جينومية14.

لمعالجة هذه القيود، تم تكييف نظام ناقل pCasPP، الذي تم تطويره في الأصل لبكتيريا Paenibacillus polymyxa، للاستخدام في بكتيريا M. ciceri15. يعتمد إطار pCasPP على بروتين Cas9 من بكتيريا Streptococcus pyogenes تم تحسين كودوناته لتناسب البكتيريا الشعاعية (actinomycetes) ذات المحتوى العالي من الـ GC، ويحتوي على كاسيت lacZ للفحص بالألوان الأزرق والأبيض لاستنساخ sgRNA تحت مُحفز gapdh التأسيسي8. تم إجراء تزاوج ثنائي الأبوين بين سلالة Escherichia coli المانحة وسلالة Mesorhizobium المستقبلة لنقل ناقل التعديل16. ولتعزيز كفاءة الفحص، تم دمج متغير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) المسمى bjGFP، والمحسن كودونياً في الأصل لبكتيريا Bradyrhizobium diazoefficiens، في قالب المانح لعملية HDR16. طُبقت استراتيجية الفحص القائمة على الفلورة هذه لاستهداف موقع nodC الأساسي، وهو الموقع المطلوب للمراحل المبكرة من إشارات التكافل بين البكتيريا ونبات الحمص17,18.

يوفر هذا البروتوكول بديلاً دقيقاً وفعالاً لأساليب الطفرات الكيميائية العشوائية أو الطفرات الناجمة عن الأشعة فوق البنفسجية (UV). في تجارب التحقق، أظهرت أكثر من 80% من المستعمرات المستعادة تألق GFP، وتم تأكيد المستعمرات المعدلة الممثلة بشكل أكبر عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتسلسل سانجر. وتوفر طفرات ΔnodC M. ciceri الناتجة مورداً مفيداً لدراسة إشارات التكافل والتفاعلات بين المضيف والميكروب. وبشكل عام، يوفر هذا الإطار لمجتمع أبحاث الريزوبيوم نهجاً فعالاً وقابلاً للتوسع لدراسات الجينوم الوظيفي في Mesorhizobium.

البروتوكول

أُجريت جميع البروتوكولات التجريبية التي تتضمن نمو النباتات، والتلقيح الميكروبي، والتعامل مع البكتيريا المعدلة وراثياً وفقاً للإرشادات واللوائح المؤسسية. وقد تم تنفيذ زراعة النباتات والتلقيحات البكتيرية تحت ظروف غرفة نمو محكومة. وتُصنف سلالة M. ciceri المستخدمة في هذه الدراسة ككائن مجهري من المستوى الأول للسلامة البيولوجية (BSL-1). ونظراً لأن جميع التجارب أُجريت تحت ظروف مختبرية محتواة دون إطلاق في الحقول، لم يتطلب الأمر الحصول على موافقة رسمية للسلامة البيولوجية المؤسسية وفقاً لسياسات السلامة البيولوجية في المؤسسة. كما تم تعقيم جميع النفايات البيولوجية الناتجة خلال الدراسة بجهاز الأوتوكلاف قبل التخلص منها.

1. تحضير الخلايا المختصة

تم تحضير والتحقق من كفاءة خلايا E. coli DH5α و E. coli S17-1λpir المختصة كيميائيًا وفقًا للإجراء الموصوف في الملف التكميلي 1.

2. تصميم الحمض النووي الريبوزي الموجه (Guide RNA)

  1. تصميم جزيئات RNA الموجهة (Guide RNAs)
    1. افتح منصة Benchling عبر الرابط (https://benchling.com/). قم بتسجيل الدخول إلى حساب Benchling موجود أو أنشئ حساباً جديداً.
    2. أنشئ مشروعاً جديداً وافتح أداة تصميم الدليل الخاصة بنظام CRISPR (CRISPR Guide Design Tool).
    3. قم بتحميل أو لصق تسلسل DNA المستهدف كاملاً لتصميم الـ RNA الموجه. اختر خيار التصميم "دليل واحد" (Single Guide) واضبط طول الدليل على 20 bp.
    4. اختر المرجع الجينومي من الخيارات المتاحة. لتصميم RNA موجه يستهدف M. ciceri، اختر Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 كجينوم مرجعي. استخدم NGG كتسلسل لزخرفة متجاورة للبروتوسبيسر (PAM) المطلوبة لنشاط إنزيم Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9).
    5. استخدم خوارزمية Hsu et al.19 لحساب ترددات القطع المتوقعة خارج الهدف (off-target). حافظ على درجة عتبة ≥50 لتقليل القطع غير النوعي عبر خلفية الجينوم المرجعي.
    6. استخدم خوارزمية Doench-Root20 لحساب درجات كفاءة القطع المتوقعة في الهدف (on-target). اضبط عتبة اختيار الهدف عند ≥60 لتحديد الأدلة ذات كفاءة القطع المتوقعة المواتية لـ Cas9 في الموقع المستهدف.
    7. انقر على "إنهاء" (Finish) لإنشاء قائمة بجزيئات RNA الموجهة المرشحة.
  2. اختيار جزيئات RNA الموجهة
    1. افتح لوحة مخرجات الـ RNA الموجه.
    2. أعطِ الأولوية لجزيئات sgRNA المرشحة المتوقع أن تحدث كسرًا مزدوج الخيط في غضون 100 bp من كودون بدء الترجمة (ATG)، مما يزيد من احتمالية إنتاج بروتين غير وظيفي.
    3. قيم درجات القطع خارج الهدف وفي الهدف. فضّل الدرجة الأعلى للقطع خارج الهدف على الدرجة الأعلى قليلاً للقطع في الهدف لتقليل مخاطر القطع غير المقصود خارج الهدف.
    4. اختر جزيء أو جزيئين من الـ RNA الموجه المفرد (sgRNAs) المرشحة التي تستوفي جميع معايير الاختيار.
  3. تحضير قليلات النيوكليوتيد (Oligonucleotides) للـ gRNA
    1. أنتج التسلسل المكمل العكسي للـ RNA الموجه المختار.
    2. أضف التسلسل 5′-ACGC إلى الطرف 5′ للـ RNA الموجه، وأضف التسلسل 5′-AAAC إلى الطرف 5′ للخيط المكمل العكسي.
    3. اطلب كلا قليتَي النيوكليوتيد مع فسفرة عند الطرف 5′ وتنقية باستخدام PAGE بمقياس تخليق 25 nmol.
  4. تلدين قليلات النيوكليوتيد للـ gRNA
    1. حضّر محلول HEPES المنظم بتركيز 30 mM عن طريق إذابة 7.15 g من حمض HEPES الحر في حوالي 800 mL من الماء المقطر. اضبط الـ pH إلى 7.8 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم وأكمل الحجم النهائي إلى 1 L.
    2. أعد تعليق كل قليلة نيوكليوتيد مفسفرة في ماء خالٍ من النيوكلييز لتركيز نهائي قدره 100 µM. امزج 5 µL من كل قليلة نيوكليوتيد مع 90 µL من محلول HEPES المنظم (30 mM) في أنبوب طرد مركزي دقيق معقم.
    3. استخدم جهاز الـ Vortex لفترة وجيزة ثم قم بالطرد المركزي لتجميع السائل. قم بتلدين قليلات النيوكليوتيد في جهاز التدوير الحراري (thermocycler) عن طريق التحضين عند 95°C لمدة 5 min ثم التبريد إلى 4°C بمعدل انحدار 0.1°C/s.
    4. خفف قليلات النيوكليوتيد الملدنة بمقدار 10 أضعاف باستخدام ماء خالٍ من النيوكلييز.
  5. تجميع الـ gRNA في ناقل pCasPP
    1. احصل على ناقل pCasPP الموصوف سابقاً من قبل Rütering et al.15.
    2. تم توفير تسلسل البلازميد بواسطة Jochen Schmid، وتم الحصول على البناء المستخدم في هذه الدراسة من خلال الدكتور Syed Shams Yazdani (ICGEB).  
    3. قم بتجميع تفاعل Golden Gate يحتوي على 100 ng من ناقل pCasPP، و0.3 µL من قطعة النيوكليوتيد الملدنة المدرجة، و2 µL من محلول T4 DNA ligase المنظم (10×)، و1 µL من إنزيم T4 DNA ligase، و1 µL من إنزيم القطع BbsI، وماء خالٍ من النيوكلييز للوصول إلى حجم نهائي قدره 20 µL.
    4. حضّر تفاعل ضابط سلبي عن طريق استبدال القطعة المدرجة بماء خالٍ من النيوكلييز.
    5. امزج التفاعلات بلطف وقم بالطرد المركزي لفترة وجيزة.
  6. ظروف دورة تجميع Golden Gate
    1. ضع أنابيب التفاعل في جهاز التدوير الحراري. قم بإجراء تسع دورات تتكون من 37°C لمدة 10 min تليها 16°C لمدة 10 min.
    2. حضن التفاعلات عند 50°C لمدة 5 min ثم عند 65°C لمدة 20 min. احفظ التفاعلات عند 4°C حتى وقت الاستخدام.
  7. تحويل تفاعلات التجميع
    1. أذب 50 µL من خلايا Escherichia coli DH5α المختصة على الثلج لمدة 10–15 min.
    2. أضف 3 µL من كل تفاعل تجميع Golden Gate إلى الخلايا المختصة. قم بمعالجة تفاعل الضابط السلبي بالتوازي. حضن المزيج على الثلج لمدة 30 min.
    3. قم بعمل صدمة حرارية للخلايا عند 42°C لمدة 45 s وأعد الأنابيب فوراً إلى الثلج لمدة 2 min. أضف 950 µL من وسط Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC).
    4. حضّر وسط SOC الذي يحتوي على 0.5% مستخلص خميرة، و2% تريبتون، و10 mM NaCl، و2.5 mM KCl، و10 mM MgCl₂، و10 mM MgSO₄، و20 mM جلوكوز. قم بتعقيم الوسط بالترشيح باستخدام مرشح حقنة 0.4 µm تحت ظروف معقمة.
    5. حضن المزارع عند 37°C وبسرعة 180 rpm لمدة 1 h.
  8. اختيار المحولات الإيجابية
    1. حضّر أطباق أغار LB مضافاً إليها 50 µg/mL نيوميسين، و0.2 mM إيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)، و32 mg/L من 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal). انثر 100 µL من مزرعة الاستعادة على الأطباق الانتقائية. حضن الأطباق عند 37°C لمدة 12–16 h.
    2. اختر المستعمرات البيضاء واستبعد المستعمرات الزرقاء. تأكد من أن طبق الضابط السلبي يحتوي على أقل من خمس مستعمرات.
  9. فحص وتوسيع المستعمرات الإيجابية
    1. انقل ثلاث إلى أربع مستعمرات بيضاء مستقلة إلى أطباق أغار LB انتقائية جديدة.
    2. حضن الأطباق عند 37°C لمدة 12–16 h. قم بتلقيح المستعمرات الفردية في 10 mL من وسط LB مضاف إليه 50 µg/mL نيوميسين.
    3. عالج كل بناء RNA موجه بشكل مستقل طوال مراحل سير العمل اللاحقة.
  10. التحقق من صحة بناءات pCasPP-gRNA
    1. احصد المزارع البكتيرية عن طريق الطرد المركزي. اعزل DNA البلازميد باستخدام طقم تنقية البلازميد ذو العمود السيليكي.
    2. قم بهضم DNA البلازميد المعزول باستخدام XbaI وEcoRI في محلول التفاعل المنظم المناسب لمدة 1 h عند 37°C.
    3. افصل نواتج الهضم على هلام أغاروز بتركيز 1% محضر في محلول Tris-acetate-EDTA (TAE) المنظم (1×) يحتوي على بروميد الإيثيديوم بتركيز نهائي 0.5 µg/mL.
    4. شغل الهلام عند 90–110 V حتى تهاجر جبهة الصبغة عبر حوالي 70–80% من طول الهلام. عاين قطع DNA باستخدام جهاز UV transilluminator.
    5. أكد المستعمرات الإيجابية من خلال الكشف عن قطعة بحجم 1,280 bp، وحدد ضوابط الناقل الفارغ من خلال الكشف عن قطعة بحجم 1,630 bp. يبلغ حجم ناقل pCasPP الفارغ حوالي 9,663 bp ويحتوي على جين lacZ؛ يؤدي إدراج قليلة النيوكليوتيد gRNA بطول 24 bp إلى إزالة قطعة lacZ، مما ينتج عنه بناء pCasPP أصغر يحتوي على gRNA. تُستخدم مواقع القطع XbaI وEcoRI التي تحيط بمنطقة lacZ للتأكيد التشخيصي لاستنساخ gRNA.
  11. تحضير مخزونات الجلسرول
    1. قم بتنمية مستعمرة إيجابية مؤكدة في وسط LB انتقائي.
    2. حضّر مخزون جلسرول عن طريق خلط 700 µL من المزرعة في طور النمو اللوغاريتمي مع 300 µL من الجلسرول المعقم بتركيز 50%. انقل المزيج إلى أنابيب تجميد (cryovials) معقمة. خزّن مخزونات الجلسرول عند −80°C.
      ملاحظة: تجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة. حضّر عدة حصص للحفاظ على استقرار البلازميد وحيوية البكتيريا. يمكن تخزين تفاعل تجميع Golden Gate المكتمل عند 4°C طوال الليل أو عند −20°C لمدة 1–2 أسبوع قبل التحويل.

3. تجميع قالب الإصلاح الموجه بالتماثل

  1. تحضير قطعة إدراج البروتين الفلوري الأخضر (GFP)
    1. الحصول على البلازميد pRJPaph-bjGFP الذي يحتوي على كاسيت المراسل الفلوري16 (الجدول 1)10,15,16,21,22,23. تم توفير البلازميد من قبل البروفيسور Hans-Martin Fischer (جامعة ETH Zurich، سويسرا) وهو متاح عبر Addgene (بلازميد رقم 67032).
    2. استئصال كاسيت gfp من pRJPaph-bjGFP عن طريق الهضم التقييدي باستخدام SacI وKpnI كما هو موضح في الملف التكميلي 2 (الخطوة 3.1). إن تسلسل gfp في pRJPaph-bjGFP عبارة عن جين bjGFP تخليقي مُحسَّن الكودونات لبكتيريا Bradyrhizobium diazoefficiens.
    3. تنقية قطعة gfp المتوقعة بطول 1081 bp.
  2. بناء pUC18-gfp
    1. الحصول على الهيكل الأساسي pUC18 (بلازميد Addgene رقم 50004)21.
    2. خطّي pUC18 باستخدام SacI وKpnI كما هو موضح في الملف التكميلي 2 (الخطوة 3.2).
    3. ربط قطعة gfp المنقاة في ناقل pUC18 المخطّي كما هو موضح في الملف التكميلي 2 (الخطوة 3.2).
    4. تحويل خلايا E. coli DH5α المختصة باستخدام إجراء التحويل الموضح في الخطوة 2.7، مع استبدال تفاعل تجميع Golden Gate بخليط الربط الناتج في الخطوة 3.2.3.
    5. اختيار المحولات الإيجابية والتحقق من إدراج gfp عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للمستعمرات كما هو موضح في الملف التكميلي 2 (الخطوة 3.2).
  3. تضخيم أذرع التماثل
    1. تصميم بادئات لتضخيم أذرع التماثل العلوية (UHA) والسفلية (DHA) بطول يتراوح تقريبًا بين 400-500 bp من الحمض النووي الجينومي لبكتيريا M. ciceri (الجدول 2).
    2. دمج مواقع التقييد SacI/EcoRI في بادئات UHA ومواقع التقييد XbaI/KpnI في بادئات DHA. استخدم البادئات F_nodC_Up_EcoRI وR_nodC_Up_SacI لتضخيم UHA والبادئات F_nodCdown_KpnI وR_nodCdown_XbaI لتضخيم DHA (الجدول 2).
    3. عزل الحمض النووي الجينومي لبكتيريا M. ciceri وفقًا لـ Weerakkody et al.25.
    4. تضخيم وتنقية قطع UHA وDHA كما هو موضح في الملف التكميلي 2 (الخطوة 3.3).
  4. بناء pUC18-UHA-gfp
    1. استنساخ قطعة UHA في pUC18-gfp باستخدام EcoRI وSacI كما هو موضح في الملف التكميلي 2 (الخطوة 3.4).
    2. تأكيد تجميع البلازميد بشكل صحيح عن طريق الهضم التقييدي باستخدام XbaI وKpnI. يجب أن ينتج عن التجميع الناجح قطع بطول 500 و3725 bp تقريبًا.
    3. المتابعة باستخدام مستنسخ واحد تم التحقق منه.
  5. بناء pUC18-UHA-gfp-DHA
    1. استنساخ قطعة DHA في pUC18-UHA-gfp باستخدام KpnI وXbaI كما هو موضح في الملف التكميلي 2 (الخطوة 3.5).
    2. تأكيد التجميع الصحيح عن طريق الهضم التقييدي باستخدام SacI وEcoRI. يجب أن ينتج عن التجميع الناجح قطع بطول 400 و4271 bp تقريبًا.
    3. التحقق من 5-6 مستنسخات مرشحة عن طريق تسلسل سانجر باستخدام البادئات F_nodC_Up_EcoRI وBjGFP_BP_F1 وR_nodCdown_XbaI (الجدول 2)، والتي تغطي معًا معظم تسلسل كاسيت الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR).
  6. تضخيم وتنقية قالب HDR النهائي
    1. تضخيم كاسيت HDR الكامل باستخدام البادئات F_FL_nodCgfp_XbaI وR_nodCdown_XbaI (الجدول 2).
    2. تنقية قطعة HDR المتوقعة بطول 2012 bp وهضم منتج PCR المنقى باستخدام XbaI كما هو موضح في الملف التكميلي 2 (الخطوة 3.6).
  7. تحضير ناقلات pCasPP-gRNA
    1. استرجاع بلازميدات pCasPP-gRNA1 وpCasPP-gRNA2 التي تم إنتاجها في الخطوة 2.
    2. خطّي البلازميدات باستخدام XbaI وإزالة الفوسفات من الهيكل الأساسي للناقل كما هو موضح في الملف التكميلي 2 (الخطوة 3.7).
  8. استنساخ قالب HDR في ناقلات pCasPP-gRNA
    1. ربط كاسيت HDR في pCasPP-gRNA1 أو pCasPP-gRNA2 المخطّي بواسطة XbaI كما هو موضح في الملف التكميلي 2 (الخطوة 3.8).
    2. تحويل خلايا E. coli DH5α المختصة واختيار المحولات على آجار LB يحتوي على 50 µg/mL من النيوميسين.
  9. فحص المستنسخات التي تحتوي على HDR
    1. فحص المحولات للكشف عن فلورة GFP باستخدام مجهر ستيريو فلوري مجهز بمجموعة مرشحات GFP قياسية (إثارة 470-488 nm؛ انبعاث 507-510 nm).
    2. تصنيف المستعمرات على أنها موجبة لـ GFP بناءً على وجود فلورة خضراء متميزة وموحدة تتجاوز بوضوح الفلورة الذاتية الضعيفة الملاحظة في مستعمرات التحكم السلبية غير المعدلة.
    3. تنمية المستنسخات الموجبة لـ GFP وعزل الحمض النووي للبلازميد.
  10. التحقق من تجميع ناقل HDR
    1. تأكيد إدراج HDR عن طريق الهضم التقييدي باستخدام XbaI.
    2. التحقق من نجاح التجميع من خلال تحرر قطعة HDR المتوقعة بطول 2012 bp إلى جانب هيكل ناقل pCasPP-gRNA بطول 9,300 bp تقريبًا.
      ملاحظة: بعد التعطيل الحراري للإنزيمات التقييدية والفوسفاتيز، يمكن تخزين خلائط التفاعل عند 4°C طوال الليل أو عند −20°C لمدة تصل إلى شهر واحد. تخزن بنيات البلازميد المؤكدة عند −20°C للحفظ طويل الأمد.
سلالة أو بلازميدالوصفالمرجع
Mesorhizobium ciceri CC1192السلالة المستقبلة المستخدمة في تحرير الجينوم بواسطة CRISPR-Cas9 واختبارات تعقد جذور الحمصهاسكيت وآخرون.10
pCasPPناقل تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 المستخدم لاستنساخ الحمض النووي الريبوزي الموجه وتوصيل قالب الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR)روتيرينج وآخرون.15
pRJPaph-bjGFPبلازميد تقرير GFP المستخدم كمصدر لكاسيت GFP
(بلازميد Addgene رقم 67032)		ليدرمان وآخرون.16
pUC18ناقل استنساخ عام مستخدم لتجميع قالب الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR)
(بلازميد Addgene رقم 50004)		نوراندر وآخرون.21
Escherichia coli S17-1λمستقبلات الأشعة تحت الحمراء السلبية (PIR)السلالة المانحة المستخدمة في الاقتران ثنائي الأبوينسيمون وآخرون.22
Escherichia coli DH5αمضيف الاستنساخ المستخدم لإكثار البلازميدهاناهان وآخرون.23

الجدول 1: السلالات البكتيرية والبلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة. يسرد هذا الجدول السلالات البكتيرية والبلازميدات المستخدمة في تكثير البلازميدات، وتحرير الجينوم بوساطة CRISPR-Cas9، وتجميع قالب الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR)، والتزاوج ثنائي الأبوين، والوسم الفلوري لبكتيريا Mesorhizobium ciceri CC1192.

الفئةالاسمالتسلسل (5′ figure-protocol-1 3′) أو وصف
سلالة بكتيريةEscherichia coli DH5αسلالة المضيف للاستنساخ
سلالة بكتيريةEscherichia coli S17-1λمستقبل البروتين المعتمد على الراندوم (Pir)السلالة المانحة للتزاوج ثنائي الآباء
ناقل الاستنساخpUC18ناقل العمود الفقري للاستنساخ
ناقل CRISPRpCasPPناقل CRISPR-Cas9 واسع المدى المضيف
بلازميد مراسلpRJPaph-bjGFPبلازميد مراسل GFP
بادئF_guide1_BbsIpACGCTGTTTACAGAGGCATGCAAG
بادئدليل_R1_BbsIpAAACCTTGCATGCCTCTGTAAACA
بادئدليل_F2_BbsIpACGCGCTTGTTCGGATCCGACCGT
بادئدليل_R2_BbsIpAAACACGGTCGGATCCGAACAAGC
بادئF_nodC_Up_EcoRIAAAGAATTCCTCATTGCAAGCCAGCAGT
بادئR_nodC_Up_SacIAAAGAGCTCCGGAAAGCTTGTTTCGGATCC
بادئF_nodCdown_KpnIAAAGGTACCTCGAGAGCACCGCATAAGAC
بادئR_nodCdown_XbaIAATTCTAGATGGTTCGGTACTTTCGTGCA
بادئF_FL_nodCgfp_XbaIAAATTCTAGACTCATTGCAAGCCAGCCAGT
بادئBjGFP_BP_F1GAAGTTCATCTGCACCACCG
بادئBjGFP_BP_R1GTCCTTGAACGAGATGGTGC
بادئBjGFP_BP_F2CCAACTTCAAGATCCGCCAC
بادئ (Primer)GFP_RCCAACTTCAAGATCCGCCAC
بادئBjGFP_BP_R2CTTGTACAGCTCGTCCATGC
بادئ16S_F1ATCCTGGCTCAGAACGAACG
بادئ16S_R1ATTCCCACGCGTTACTCACC
بادئ16S_F2AGTCCGAGAGGGTGAGTGG
بادئ16S_R2GTCAGTACCGAGCCAGTGAG
بادئF1_nodCCGATTTCCAGAACCGTCGTC
بادئnodC_RCGATTTCCAGAACCGTCGTC
بادئ (Primer)R1_nodCTCCCCTGCTACAATGAGGAC
بادئF2_nodCAGTGACTCCGCAATTCCAGA
بادئR2_nodCTGTCGGTAAAAGTGTTTCCC
بادئF1_nodBTGGTTCGGTACTTTCGTGCA
بادئR1_nodBAGTCGCGTGGATCAATGGAC
بادئF1_nodATGATCGTCGCTGAATTGGGC
بادئR1_nodACAACTGATGGAGCACTGGGT
بادئF1_nodDTGGCCTTAAGAGACGTGTCG
بادئR1_nodDAAATGCCTGACCAGCCGTAA

الجدول 2: السلالات البكتيرية والبلازميدات وبادئات قليلة النوكليوتيد المستخدمة في هذه الدراسة. يسرد هذا الجدول السلالات البكتيرية والبلازميدات وبادئات قليلة النوكليوتيد المستخدمة لبناء الحمض الريبي النووي الموجه المفرد (sgRNA)، وتجميع قالب الإصلاح الموجه بالتجانس (HDR)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التشخيصي، وتسلسل سانجر، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (RT-qPCR). يتم عرض تسلسلات البادئات باتجاه 5′ figure-protocol-2 3′. ملاحظة: يشير كل من BjGFP_BP_F2 و GFP_R إلى نفس التسلسل قليل النوكليوتيد ولكن تم إدراجهما تحت أسماء بادئات مختلفة لأنهما استُخدما في مقايسات تجريبية مختلفة.

4. التزاوج ثنائي الأبوين لنقل البلازميد إلى M. ciceri CC1192

  1. تحويل خلايا E. coli المانحة
    1. قم بتحويل خلايا E. coli S17-1λpir باستخدام تركيبات pCasPP-gRNA1-HDR أو pCasPP-gRNA2-HDR وفقاً للإجراء الموضح في الملف التكميلي 3 (الخطوة 4.1).
    2. اختر المستعمرات المتحولة على وسط LB agar يحتوي على 50 µg/mL من النيوميسين.
    3. افحص المستعمرات المتحولة للكشف عن تألق GFP باستخدام إثارة عند 488 nm تقريباً وكشف انبعاث عند 510–520 nm تقريباً.
    4. صنف المستعمرات على أنها موجبة لـ GFP إذا أظهرت تألقاً أخضر موحداً وواضحاً، يكون غائباً في مستعمرات التحكم من E. coli S17-1λpir غير المتحولة عند فحصها تحت نفس إعدادات المجهر.
    5. قم بتجهيز مخزونات الجلسرول من مستنسخات المانح المؤكدة أنها موجبة لـ GFP.
  2. تحضير المزارع البذرية والمبدئية
    1. حضر المزارع المبدئية لـ E. coli S17-1λpir المانحة و M. ciceri المستقبلة وفقاً لـ الملف التكميلي 3 (الخطوة 4.2).
    2. انمِ المزارع المبدئية حتى تصل الكثافة الضوئية OD₆₀₀ إلى 0.3–0.4، وهو ما يقابل كثافة خلوية تقديرية تبلغ حوالي 1 × 108 CFU/mL.
  3. تحضير المزارع الفرعية للتزاوج ثنائي الأبوين
    1. حضر المزارع الفرعية للمانح والمستقبل وانمِها حتى تصل إلى طور النمو الأسي المطلوب وفقاً لـ الملف التكميلي 3 (الخطوة 4.3).
    2. قس الكثافة الضوئية عند 600 nm (OD600) باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية والمرئية (UV–visible spectrophotometer) وفقاً لإجراء قياس الكثافة الضوئية الموضح في الملف التكميلي 1 (الخطوة 1.2.3).
  4. إجراء التزاوج ثنائي الأبوين
    1. قم بإجراء التزاوج ثنائي الأبوين باستخدام مرشح غشائي وفقاً لـ الملف التكميلي 3 (الخطوة 4.4).
    2. ضع أربع عينات من معلق التزاوج على مرشح غشائي من بولي فينيليدين الفلورايد (PVDF) معقم بقطر 0.22 µm (قطر 47 mm)، مع ضمان تباعد كافٍ بين النقاط لمنع الاختلاط.
  5. استعادة واختيار المتزاوجات
    1. استعد المتزاوجات وأجرِ اختياراً مزدوجاً بالمضادات الحيوية وفقاً لـ الملف التكميلي 3 (الخطوة 4.5).
    2. قم بنقل المتزاوجات بشكل متكرر في وسط يحتوي على الكاربنيسيلين فقط للتخلص من البلازميدات المتبقية.
    3. أكد عملية تنقية البلازميد (plasmid curing) من خلال عدم نمو المستعمرات في وسط يحتوي على النيوميسين، وعن طريق تفاعل PCR التشخيصي الذي يظهر غياب هيكل pCasPP مع الاحتفاظ بكاسيت HDR المدمج في الكروموسوم.
      ملاحظة: يلزم النقل المتتابع للتحقق من استقرار التعديل المدمج والتخلص من البلازميدات الفوق كروموسومية المتبقية.
  6. فحص المستعمرات الموجبة لـ GFP
    1. افحص المتزاوجات المنقاة للكشف عن تألق GFP وقارنها بمستعمرات التحكم من M. ciceri البرية وفقاً لـ الملف التكميلي 3 (الخطوة 4.6).
    2. اختر المستعمرات المتألقة كسلالات محتملة أن تكون موجبة لـ HDR.
    3. صنف المستعمرات على أنها موجبة لـ GFP إذا أظهرت تألقاً أخضر موحداً وواضحاً، يكون غائباً في مستعمرات M. ciceri البرية تحت نفس إعدادات المجهر وظروف التعريض.
    4. أكد المستعمرات الموجبة لـ GFP عن طريق تفاعل PCR التشخيصي قبل الانتقال إلى مرحلة التحقق اللاحقة.
    5. خزن المستعمرات المؤكدة على وسط yeast mannitol (YM) agar عند 4°C للحفظ قصير المدى، أو كمخزونات جلسرول تحتوي على 20%–25% جلسرول عند −80°C للحفظ طويل المدى.

5. التحقق من صحة طفرات nodC

  1. التحقق من دمج البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في موضع nodC
    1. تلقيح مستعمرة واحدة تعبر عن GFP *M. ciceri* مستعمرة في 10 مل من مرق المانيتول للخميرة (YMB) المضاف إليه 100 µg/mL كاربينيسيلين24يُحضن المزرع عند 28°C مع الرج بسرعة 180 دورة في الدقيقة لمدة 20-24 ساعة.
    2. يتم حصاد الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي بسرعة 8,000 × ج لمدة 10 دقائق عند 25°Cاجمع كتلة الخلايا المترسبة واستخلص الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين الجينومي وفقاً لـ Weerakkody et al.25.
    3. إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التشخيصي باستخدام الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) الجينومي كقالب (جدول ٢). قم بتحضير 10 µL تفاعل PCR يحتوي على 5 µL 2× مزيج PCR الرئيسي، 0.2 µM بادئات F1_nodB وnodC_R أو بادئات F1_nodB وgfp_R، و50 نانوجرام من الحمض النووي الجينومي.
    4. برمج جهاز التدوير الحراري لإجراء عملية مسخ أولية عند 95°C لمدة 5 دقائق، تليها 35 دورة من 95°C لمدة دقيقة واحدة، 62°C لمدة 30 ثانية، و 72°C لمدة 45 ثانية، مع تمديد نهائي عند 72°C لمدة 5 دقائق.
    5. يتم فصل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام هلام الأجاروز بنسبة 1% (وزن/حجم) كما هو موضح سابقاً. يتم تأكيد دمج البروتين الفلوري الأخضر (GFP) من خلال الكشف عن ناتج يبلغ طوله 430 زوجاً قاعدياً تقريباً في النوع البري (WT) وناتج يبلغ طوله 1500 زوج قاعدي تقريباً في الطفرة المحدثة باستخدام البادئات F1_nodB/nodC_R، وناتج يبلغ طوله 1000 زوج قاعدي تقريباً في الطفرة (مع عدم ظهور أي ناتج في النوع البري) باستخدام البادئات F1_nodB/gfp_R.
    6. تضمين الضوابط المناسبة أثناء التحقق من صحة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتم استخدام DNA البلازميد الذي يحتوي على التسلسل المستهدف كضابط موجب، وضابط خالٍ من القالب (NTC) يحتوي على ماء خالٍ من النوكلياز كضابط سالب.
  2. تحديد كمية تعبير البروتين الفلوري الأخضر (GFP) بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (RT-qPCR)
    1. عزل الحمض النووي الريبوزي (RNA) الكلي من النوع البري (WT) والطفرة *M. ciceri* المزارع باستخدام كاشف TRIzol وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. عالج الحمض الريبوزي (RNA) باستخدام إنزيم DNase I وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة لإزالة الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (gDNA) الملوث. تحقق من الإزالة الكاملة للحمض النووي (DNA) باستخدام ضابط خلو من إنزيم النسخ العكسي (−RT) أثناء تفاعل qPCR.
    3. تخليق الشريط الأول من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المتمم (cDNA) من 1 µg حمض RNA الكلي باستخدام طقم تخليق cDNA للشريط الأول متاح تجارياً وفقاً لإرشادات الشركة المصنعة. قم بتحضير 20 µL تفاعل يحتوي على حمض RNA، وبادئات oligo(dT)، وdNTPs، ومحلول منظم للتفاعل، ومثبط لإنزيم RNase، وإنزيم النسخ العكسي.
    4. حضّن تفاعل تخليق الحمض النووي الريبوزي المتمم (cDNA) عند 42°C لمدة 60 دقيقة، يليه التعطيل الحراري عند 70°C لمدة 5 دقائق. يُحفظ الـ cDNA عند درجة حرارة −20°C حتى وقت الاستخدام.
    5. قم بتحضير تفاعلات RT-qPCR في ثلاث مكررات تقنية. قم بتجميع 10 µL تفاعلات تحتوي على 5 µL 2× مزيج SYBR Green الرئيسي، 0.2 µM بادئات BjGFP_BP_F1 وBjGFP_BP_R1 لتضخيم GFP، أو بادئات 16S_F1 و16S_R1 لتضخيم الجين المرجعي (جدول 2), 2 µL قالب cDNA (حوالي 20 نانوغرام)، وماء خالٍ من النوكلياز.
    6. أجرِ تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام النسخ العكسي (RT-qPCR) وفقاً لظروف الدورات التالية: المسخ الأولي عند 95°C لمدة دقيقتين، تليها 40 دورة من 95°C لمدة 15 ثانية و 58°C لمدة 45 ثانية، يليه تحليل منحنى الانصهار من 65°C إلى 95°C.
    7. أجرِ تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) باستخدام نظام الكشف Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR. حلل مخططات التضخيم، وقيم Cيرجى تزويد النص المراد ترجمته. والقيم، ومنحنيات الانصهار باستخدام برنامج Bio-Rad CFX Manager.
    8. حساب التعبير الجيني النسبي باستخدام طريقة 2^-ΔΔCt−ΔΔعتبة الدورة (Ct) الطريقة. قم بتطبيع التعبير بالنسبة إلى الجين المرجعي 16S rRNA واستخدم WT *M. ciceri* استخدام السلالة كعينة معايرة. يتم تحليل ثلاث مكررات بيولوجية، مع قياس كل منها في ثلاث مكررات تقنية.
  3. تقييم إمكانية تكوين العقد الجذرية
    1. تحضير اللقاح البكتيري
      1. قم بتلقيح مستعمرات مفردة من السلالات البرية (WT) والطافرة في وسط YMB انتقائي يحتوي على 100 µg/mL كاربينيسيلين. تُحضن المزارع عند 28°C مع الرج بسرعة 180 دورة في الدقيقة لمدة تتراوح بين 30 و36 ساعة.
      2. قم بتخفيف المزارع بنسبة 1:100 في وسط YMB انتقائي طازج، وراقب النمو عن طريق قياس الكثافة الضوئية (OD).600 باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية والمرئية (UV–Visible spectrophotometer). يتم تصفير الجهاز باستخدام وسط YMB غير ملقح، ويستمر التحضين حتى تصل المزارع إلى كثافة ضوئية (OD600) تتراوح بين 0.3 و0.4، وهو ما يعادل تقريباً 1 × 108 وحدة تشكيل مستعمرة/مل.
      3. استخدم 3 مل من المعلق البكتيري المعياري لتلقيح كل نبتة.
    2. مقايسة عدوى نبات الحمص
      1. احصل على بذور من *C. arietinum* الصنف BDG25618,24 من معهد البحوث الزراعية الهندي (IARI) التابع للمجلس الهندي للبحوث الزراعية (ICAR)، نيودلهي، الهند.
      2. اغسل البذور جيداً بماء الصنبور الجاري، ثم بماء Milli-Q المصفى. قم بتعقيم سطح البذور باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم بتركيز 1% لمدة 5 دقائق مع الرج، ثم اشطفها خمس مرات بماء مصفى ومعقم.
      3. تُعامل البذور بمبيد الفطريات Bavistin بنسبة 0.1% (مسحوق carbendazim قابل للبلل بنسبة 50%) لمدة تتراوح بين 2 إلى 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة. تُغسل البذور المعاملة مرتين بماء نقي معقم.
      4. ضع البذور على ورق ترشيح معقم ورطب في أطباق بتري معقمة (110 مم × ٤٠ ملم)، ثم تُغلق باستخدام Parafilm، وتُحضن في الظلام عند 28°C ± 2°C لمدة 3 أيام.
      5. انقل الشتلات المنبتة بشكل فردي إلى رمل معقم. يتم تعقيم الرمل عند 121°C وضغط 15 psi لمدة 20 دقيقة قبل الاستخدام.
      6. قم بتحضير محلول مكينايت (McKnight) الغذائي الخالي من النيتروجين عن طريق إذابة 6.0 جم من CaSO₄، 1.0 جم من MgSO4₄·7 ساعات₂أ، 1.0 غ من KH₂أمر الشراء₄، 1.5 جم من KCl، و14.3 مجم من H₃أكسيد البورون₃، 0.4 ملغ من CuSO4₄·5 ساعات₂أو، 0.08 مجم MnSO4₄·4 ساعات₂O, 0.45 مجم H₂MoO₄، و1.1 ملجم من كبريتات الزنك (ZnSO4)₄·7H₂في ماء مقطر معقم حتى يصل الحجم النهائي إلى 5 لتر.
      7. تُزرع الشتلات في أوانٍ بقطر 10 سم تحتوي على رمل معقم، مع الحفاظ على أربع نباتات في كل إناء. وتُروى كل أوانٍ مرتين أسبوعياً بـ 20 مل من محلول McKnight's الخالي من النيتروجين.
      8. الحفاظ على النباتات تحت ظروف مضبوطة من 22°C ± 2°C (يوم)، 18°C ± 2°C (ليلاً)، ورطوبة نسبية تتراوح بين 55% و60%، وفترة ضوئية تتكون من 16 ساعة ضوء و8 ساعات ظلام، وشدة إضاءة تبلغ 200 µmol فوتونات م⁻2 s⁻1تُزرع الشتلات لمدة تتراوح بين 6 و7 أيام قبل التلقيح.
      9. أضف 3 مل من المعلق البكتيري مباشرة إلى كل شتلة. حافظ على مجموعات الضبط التي خضعت لمعاملة صورية عن طريق إضافة 3 مل من وسط YMB المعقم. استخدم 16 نبتة ككرارات بيولوجية لكل مجموعة معاملة.
      10. يتم حصاد الجذور والمجموع الخضري بعد 20 يوماً من التلقيح. تُعد العقد يدوياً، وتُسجل الكتلة الحيوية الطازجة فور الحصاد.
      11. تجفيف الأنسجة عند 65°C حتى يتم الوصول إلى وزن ثابت. ويُعرّف الوزن الثابت بأنه قياسان متتاليان يتم الحصول عليهما بعد فترات تجفيف مدتها 24 ساعة، وبفارق لا يتجاوز <٠.٠١ جم، ثم سجل الكتلة الحيوية الجافة.
      12. اعرض النتائج في صورة متوسط حسابي ± الخطأ المعياري (SE). إجراء تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA) متبوعاً باختبار توكي للمقارنات المتعددة (Tukey’s multiple-comparison test) باستخدام برنامج GraphPad Prism الإصدار 10.0، مع اعتبار أن P < دلالة إحصائية عند 0.05.
        ملاحظة: يجب الحفاظ على الظروف المعقمة طوال عمليات تعقيم البذور، والإنبات، والتلقيح، ونمو النبات.
        تنبيه: يجب التعامل مع محاليل هيبوكلوريت الصوديوم ومحاليل مبيدات الفطريات باستخدام معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات وواقيات العين.

النتائج

في هذا البروتوكول، تم تكييف تحرير الجينوم بتقنية CRISPR-Cas9 من أجل M. ciceri CC1192 من خلال استهداف الـ nodC الموضع الجيني. ولتحفيز فقدان الوظيفة، صُممت حمض نووي ريبوزي موجه (sgRNAs) لاستهداف الطرف 5′ المنطقة القريبة من الـ nodC تسلسل الترميز، مما يؤدي إلى إحداث كسر مزدوج الشريط (DSB) ضمن منطقة الترميز الأولية لتعطيل ترجمة البروتين المُشفر (الشكل 1-أ).

figure-results-1
الشكل 1. تصميم جزيئات RNA الموجهة المفردة (sgRNAs) التي تستهدف موقع nodC في بكتيريا Mesorhizobium ciceri. (أ) تمثيل تخطيطي لموقع M. ciceri nodC يوضح مواضع جزيئي sgRNAs بطول 20-bp المصممين للاستهداف بوساطة CRISPR-Cas9. تظهر مواقع استهداف sgRNA باللون الأزرق. (ب) التسلسلات النوكليوتيدية لـ sgRNA1 و sgRNA2 التي تستهدف موقع nodC. تمت الإشارة إلى التتابع المجاور للمسافة الفاصلة (PAM; 5′-NGG-3′) باللون الأحمر، وتم تمييز كودون بدء ترجمة nodC (ATG) باللون الأصفر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم تحديد تسلسلين مستهدفين بطول 20 bp مباشرة قبل تسلسل PAM من النوع 5′-NGG-3′ (الشكل 1B). وأسفر التحليل الحاسوبي (In silico) لهذه الـ sgRNAs المرشحة باستخدام خوارزمية Hsu et al.19 عن درجات نوعية بلغت 100، مما يشير إلى نوعية استهداف متوقعة عالية مع عدم اكتشاف أي تكامل ملحوظ خارج الهدف ضمن جينوم M. ciceri. ولوحظت اختلافات طفيفة في درجات كفاءة الاستهداف المتوقعة لـ sgRNAs المختارة (الجدول 3)، وهو ما وجّه عملية اختيار الدليل للتقييم التجريبي اللاحق.

الموضع المستهدف
(زوج قاعدي)		شريطتسلسل sgRNA (5'′ figure-results-2 3′)تتابعات PAMدرجة النوعيةدرجة الكفاءة
77+TGTTTACAGAGGCATGCAAGCGG10043.58
139+GCTTGTTCGGATCCGACCGTTGG99.747.63

الجدول 3: جزيئات RNA الموجهة المفردة (sgRNAs) المرشحة والمصممة لتحرير جين nodC في بكتيريا Mesorhizobium ciceri بوساطة نظام CRISPR-Cas9. تم تصميم جزيئات sgRNAs المرشحة باستخدام أداة تصميم أدلة CRISPR من Benchling، مع اعتماد Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 كجينوم مرجعي. وقد صُنفت الأدلة وفقاً لدرجات النوعية المتوقعة وكفاءة الاستهداف، واختيرت تلك التي تستهدف تسلسلات قريبة من كودون بدء الترجمة لجين nodC وتحتوي على تتابع PAM (NGG) المطلوب لبروتين Cas9 المستخلص من Streptococcus pyogenes (SpCas9).

لتسهيل عملية الإصلاح الموجه بالتجانس (HDR) والفحص القائم على الفلورة للطفرات المفترضة، تم تجميع كاسيت HDR باستخدام ناقل الاستنساخ pUC18 (الشكل 2). تم استئصال كاسيت المراسل gfp من pRJPaph-bjGFP عن طريق الهضم بإنزيمات القطع SacI وKpnI، ثم دمجها في هيكل pUC18 الخطي (الشكل 2A). وبعد التحويل إلى بكتيريا E. coli، تم تحديد المستنسخات الإيجابية المفترضة من خلال فحص اللون الأزرق والأبيض. كما تم التحقق من دمج قطعة gfp في هيكل pUC18 عن طريق تضخيم PCR باستخدام بادئات خاصة بالجين، والتي أنتجت قطعة تضخيم بطول 500 bp المتوقعة في المستنسخات الإيجابية (الشكل 2A).

figure-results-3
الشكل 2. بناء نظام CRISPR-Cas9 للإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) لتعطيل nodC. (أ) بناء والتحقق من البلازميد الوسيط pUC18-gfp. يوضح اللوح العلوي خريطة البلازميد pUC18-gfp الناتج عن إدراج كاسيت البروتين الفلوري الأخضر (gfp) في هيكل pUC18. يوضح اللوح الأوسط مستعمرات نموذجية بعد الفرز الأزرق والأبيض. يوضح اللوح السفلي التحقق من المستعمرات باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بواسطة زوج البادئات BjGFP_BP_F1 و BjGFP_BP_R2. (ب) التجميع المتسلسل لقالب HDR في هيكل pUC18. تؤكد خرائط البلازميد وتحليلات الهضم الإنزيمي إدراج ذراع التماثل العلوي (UHA)، وذراع التماثل السفلي (DHA)، وكاسيت HDR الكامل UHA-gfp-DHA. (ج) استنساخ والتحقق من كاسيت HDR UHA-gfp-DHA في ناقل pCasPP CRISPR-Cas9. يوضح اللوح العلوي خريطة بلازميد pCasPP-HDR النهائية، ويوضح اللوح السفلي الهضم الإنزيمي الذي يؤكد إدراج كاسيت HDR. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم تجميع بنية HDR لاحقاً عن طريق إدخال أذرع تماثل nodC تحيط بـ كاسيت gfp. تم استنساخ ذراع تماثل علوي (UHA) بطول 500 bp وذراع تماثل سفلي (DHA) بطول 400 bp، تم وضعهما بجوار موقع قطع Cas9 المتوقع، بالتتابع في بنية pUC18-gfp من خلال الهضم التقييدي والربط (الشكل 2B). وتم التأكد من تجميع كاسيت UHA-gfp-DHA بواسطة تحليل الهضم التقييدي، والذي أعطى الجزء المتوقع بطول 2012 bp (الشكل 2B). بعد ذلك، تم استنساخ كاسيت HDR الكامل في ناقل CRISPR pCasPP واسع النطاق للمضيف (الشكل 2C). وأكد تحليل الهضم التقييدي سلامة البنية النهائية والنجاح في تجميع ناقل توصيل تحرير الجينوم لـ M. ciceri (الشكل 2C).

أُجري تزاوج ثنائي الأبوين بين سلالة المانح E. coli S17-1λpir وسلالة المستقبل M. ciceri لنقل بناء pCasPP-gRNA-HDR إلى M. ciceri (الشكل 3A). يوضح الشكل 3B تنظيم أوبرون nod والاستبدال المتوقع لموقع nodC بواسطة كاسيت gfp من خلال إعادة التركيب المتماثل باستخدام قالب HDR. تم تحديد مستعمرات الناقلات المتصالبة في البداية عن طريق فحص فلورية GFP بعد التزاوج ثنائي الأبوين (الشكل 3B و 3C). أظهرت أكثر من 80% من المستعمرات المستعادة فلورية GFP مع gRNA2، وأظهرت أكثر من 65% من المستعمرات فلورية بعد إدخال gRNA1 (الشكل 3C). ونظراً لأن فحص الفلورية وحده لا يمكنه التمييز بين تعبير GFP المحمول على البلازميد والدمج الجينومي الناجح، فقد أُجري تحقق جزيئي لاحق لتأكيد الإدراج النوعي للموقع لكاسيت المراسل.

figure-results-4
الشكل 3. تعطيل موضع nodC في بكتيريا Mesorhizobium ciceri بواسطة نظام CRISPR-Cas9. (A) رسم تخطيطي للتزاوج ثنائي الأبوين المستخدم لنقل بنية pCasPP-gRNA-HDR من خلايا المانح Escherichia coli S17-1λpir إلى خلايا المستقبل من M. ciceri. (B) مخطط يوضح استبدال موضع nodC بـ كاسيت gfp عبر الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) بعد قطع CRISPR-Cas9. يحتوي قالب HDR على أذرع تماثل بطول 500 bp تقريباً في الاتجاه العلوي (upstream) و400 bp في الاتجاه السفلي (downstream) تحيط بكاسيت gfp. (C) فحص قائم على الفلورة لمستعمرات M. ciceri الناقلة. تظهر صور تمثيلية للمجهر المجسم بالفلورة والمجال المضيء للمستعمرات الموجبة لـ GFP، إلى جانب النسبة المئوية للنواقل الفلورية المستعادة بعد التزاوج ثنائي الأبوين باستخدام بنيات تحتوي على sgRNA1 أو sgRNA2. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

للتحقق من دمج كاسيت gfp في موقع nodC، خضعت مستعمرات ممثلة موجبة لـ GFP لتحليل PCR. وقد أدى تضخيم المنطقة الجينومية الممتدة بين nodB وnodC إلى إنتاج قطعة بطول 1511 bp في النسائل المعدلة، وهو ما يتفق مع دمج كاسيت التقرير، بينما أنتجت السلالة البرية (WT) قطعة تضخيم بطول 430 bp (الشكل 4A). كما أدى تضخيم PCR باستخدام بادئات خاصة بـ gfp وبادئات تحيط بـ nodC إلى توليد قطعة مميزة بطول 997 bp في النسائل المعدلة، في حين لم يتم رصد أي تضخيم في عينة الضبط من السلالة البرية، مما يدعم حدوث الإدخال في الموقع المحدد. وتم تأكيد اتجاه كاسيت التقرير باستخدام تسلسل سانجر (Sanger sequencing). بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم تعبير GFP في السلالات المعدلة باستخدام RT-qPCR، والذي أظهر زيادة في تراكم نسخ GFP مقارنة بالسلالة البرية (الشكل 4B). حُسبت قيم التعبير باستخدام طريقة 2−ΔΔCt وتم تطبيعها بالنسبة للجين المرجعي 16s، مع استخدام السلالة البرية كعينة ضبط. تمثل البيانات المتوسط ± الانحراف المعياري (SD) لثلاث مكررات بيولوجية (n = 3). وتم تحديد الدلالة الإحصائية بواسطة تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA) متبوعاً باختبار Dunnett مقابل عينة الضبط من السلالة البرية.

يتمثل القصور الحالي للدراسة في غياب ناقل تحكم، مثل pCasPP-HDR الفارغ من gRNA، لتحديد معامل إعادة الاندماج المرجعي. ويجب أن تتضمن الدراسات المستقبلية تحكماً من هذا النوع.

figure-results-5
الشكل 4. التحقق الجزيئي من طفرات ΔnodC Mesorhizobium ciceri. (A) تأكيد تعطيل جين nodC باستخدام تقنية PCR. يوضح اللوح الأيسر التضخيم باستخدام زوج البادئات F1_nodB و nodC_R. المسار M، سلم DNA؛ المسارات 1-4، طفرات ΔnodC M. ciceri؛ المسار WT، السلالة البرية من M. ciceri. يوضح اللوح الأيمن التضخيم باستخدام زوج البادئات F1_nodB و gfp_R. المسار M، سلم DNA؛ المسارات 1-4، طفرات ΔnodC M. ciceri؛ المسار WT، السلالة البرية من M. ciceri. أحجام قطع التضخيم المتوقعة موضحة. (B) التعبير النسبي للبروتين الفلوري الأخضر (GFP) في طفرات ΔnodC M. ciceri والذي تم تحديده عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (RT-qPCR). تم تطبيع التعبير الجيني بالنسبة للجين المرجعي 16S ribosomal RNA (16S rRNA) لـ M. ciceri وعُبّر عنه بالنسبة للتحكم من السلالة البرية (WT) باستخدام طريقة 2^−ΔΔCt. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. تم تحديد الدلالة الإحصائية بالنسبة للتحكم WT. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم تقييم التأثير البيولوجي لتعطيل جين nodC باستخدام اختبارات عدوى الحمص. شكلت النباتات الملقحة بسلالة WT من M. ciceri عقدًا جذرية مرئية، بينما أظهرت النباتات الملقحة بسلالة ΔnodC M. ciceri انخفاضًا ملحوظًا في تكوين العقد أو غيابها تمامًا (الشكل 5A). وظلت النباتات الضابطة غير الملقحة خالية من العقد، مما يؤكد الحفاظ على الظروف التجريبية المعقمة (الشكل 5A). وأظهر التحليل الكمي لمعايير نمو النبات فروقًا إضافية بين النباتات الملقحة بسلالة WT وتلك الملقحة بسلالة ΔnodC M. ciceri، بما في ذلك طول الجذر، والوزن الرطب للجذر، والوزن الجاف للجذر، وطول المجموع الخضري، والوزن الرطب للمجموع الخضري، والوزن الجاف للمجموع الخضري، وعدد العقد (الشكل 5B). وأظهرت النباتات الملقحة بسلالة WT أعدادًا أعلى من العقد وتحسنًا في المعايير المرتبطة بالنمو مقارنة بالنباتات الملقحة بسلالة ΔnodC M. ciceri والنباتات الضابطة غير الملقحة. وتتسق هذه النتائج مع تعطيل وظيفة تكوين العقد المرتبطة بجين nodC، وتدعم إمكانية تطبيق سير العمل هذا القائم على CRISPR-Cas9 في دراسات الجينوم الوظيفي لبكتيريا M. ciceri. تم تقييم البيانات الكمية للنمط الظاهري للنبات لمقارنة الفروق بين مجموعات المعالجة. وقد شمل التحليل ما مجموعه 90 مكررًا بيولوجيًا (n = 30 نباتًا لكل مجموعة معالجة). عُرضت البيانات في صورة المتوسط ± SD. وتم تقييم الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) يليه اختبار توكي (Tukey) للمقارنات المتعددة البعدية. واعتُبرت الفروق ذات دلالة إحصائية عند P < 0.05.

figure-results-6
الشكل 5. التحقق الوظيفي من طفرات ΔnodC Mesorhizobium ciceri باستخدام مقايسة عدوى الحمص. (أ) نباتات حمص (Cicer arietinum) نموذجية بعد 20 يوماً من التلقيح بسلالة M. ciceri البرية، أو سلالة ΔnodC M. ciceri، أو عينات ضابطة غير ملقحة. (ب) التحليل الكمي لمعايير نمو النبات وتكون العقد الجذرية، بما في ذلك طول الجذر، والوزن الرطب للجذر، والوزن الجاف للجذر، وطول المجموع الخضري، والوزن الرطب للمجموع الخضري، والوزن الجاف للمجموع الخضري، وعدد العقد. يتم عرض البيانات للنباتات الملقحة بسلالة M. ciceri البرية، أو سلالة ΔnodC M. ciceri، أو العينات الضابطة غير الملقحة. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. تم تحديد الدلالة الإحصائية بواسطة تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعاً باختبار توكي للمقارنات المتعددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1. البروتوكول التفصيلي لتحضير والتحقق من صحة خلايا Escherichia coli ذات الكفاءة الكيميائية. يوفر هذا الملف التكميلي الإجراء الكامل لتحضير والتحقق من صحة خلايا Escherichia coli DH5α و E. coli S17-1λpir ذات الكفاءة الكيميائية، بما في ذلك تحضير المزارع البكتيرية، وتحفيز الكفاءة، وحصاد الخلايا، والغسل باستخدام محلول CaCl₂–glycerol المنظم، وتوزيع العينات، والحفظ بالتجميد، والتحقق من خلال اختبار كفاءة التحول. كما يتضمن تدابير مراقبة الجودة الحرجة، وتوصيات التخزين، ومعايير قبول الكفاءة. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2. البروتوكول التفصيلي لبناء قوالب الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) وتجميع ناقلات تحرير الجينوم CRISPR-Cas9. يوفر هذا الملف التكميلي إجراءات مفصلة لاستئصال كاسيت البروتين الفلوري الأخضر (GFP)، وبناء البلازميد الوسيط pUC18-gfp، وتضخيم واستنساخ أذرع التماثل العلوية والسفلية، وتجميع قالب الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR) الكامل، وتحضير ناقلات pCasPP-guide RNA (gRNA)، وإدخال قوالب HDR في بلازميدات CRISPR-Cas9، وفحص المستعمرات بناءً على الفلورة، والتحقق من البلازميدات المؤشبة عن طريق تحليل التقييد وتسلسل سانجر. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 3. بروتوكول مفصل للتزاوج ثنائي الأبوين وإنتاج سلالات Mesorhizobium ciceri ناقلة مُوسومة بـ GFP. يصف هذا الملف التكميلي تحضير السلالات المانحة والمستقبلة، والتزاوج ثنائي الأبوين باستخدام مرشح غشائي، واستعادة السلالات الناقلة واختيارها باستخدام المضادات الحيوية، وإجراءات التخلص من البلازميد، والفحص القائم على الفلورة للمستعمرات المؤشبة، والتأكيد الجزيئي للسلالات المعدلة جينياً، والحفظ قصير وطويل الأمد للسلالات الناقلة من M. ciceri المؤكدة الإيجابية لـ GFP. كما يتم توفير تفاصيل ظروف الاستزراع، ومعايير التزاوج، وإجراءات الاختيار. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

إن إنشاء نظام تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 في M. ciceri يعالج قيدًا تقنيًا رئيسيًا في التلاعب الجيني بهذا المتعايش المثبت للنيتروجين والمهم زراعيًا. من خلال تعطيل موضع nodC باستخدام مراسل gfp والإصلاح الموجه بالتجانس (HDR)، يوفر سير العمل هذا إطارًا مدعومًا بالفلورة للتعديل الجينومي المستهدف في M. ciceri.

اعتمدت مناهج التلاعب الجيني التقليدية في الريزوبيا بشكل أساسي على الطفرات العشوائية القائمة على Tn5 أو التبادل الأليلي بوساطة sacB19,26,27. وعلى الرغم من أن هذه المناهج لا تزال ذات قيمة، إلا أنها تتطلب عمالة مكثفة، وغالباً ما تحتاج إلى جولات متعددة من الاختيار المضاد، وقد تترك علامات مقاومة للمضادات الحيوية داخل الجينوم مما يعقد جولات التحرير اللاحقة. وفي المقابل، يوفر تحرير الجينوم بوساطة CRISPR-Cas9 بديلاً أكثر استهدافاً وانسيابية للهندسة الجينومية. وقد أفادت دراسات حديثة باستخدام تحرير القواعد بوساطة CRISPR والأنظمة القائمة على Cas12e في S. meliloti لتقليل السُمية المرتبطة بـ Cas912,13، بينما تم استكشاف الكبت النسخي بوساطة dCas9 في R. etli11. وبحدود علمنا، تمثل هذه الدراسة أحد التطبيقات الأولى لتعطيل الكروموسومات بوساطة CRISPR-Cas9 في M. ciceri. يتضمن البروتوكول استهدافاً موجهاً بواسطة sgRNA، وتوصيلاً للبلازميد ثنائي الأبوين، وإعادة تركيب بوساطة HDR لتحرير مواقع محددة. كما يسهل دمج مراسل gfp ضمن كاسيت HDR الفحص السريع القائم على الفلورة للمستعمرات التي يُفترض تحريرها، مما يقلل من عدد المستعمرات التي تتطلب تحققا جزيئياً لاحقاً.

كانت عدة عوامل مهمة للتنفيذ الناجح لسير العمل. فقد أدى اختيار sgRNAs ذات نوعية متوقعة عالية إلى تقليل التأثيرات المحتملة خارج الهدف ضمن جينوم M. ciceri، بينما دعم الحفاظ على سلامة أذرع التماثل كفاءة إعادة التركيب بوساطة HDR. بالإضافة إلى ذلك، أدى تحسين ظروف نمو المانح والمستقبل أثناء التزاوج ثنائي الأبوين إلى تحسين استعادة المترافقات التحويلية. ومكّن الفرز القائم على الفلورة من التحديد السريع للطفرات المفترضة؛ ومع ذلك، ظل التحقق الجزيئي باستخدام PCR وتسلسل Sanger ضرورياً لتأكيد الدمج النوعي للموقع لكاسيت المراسل. ويمكن للدراسات المستقبلية استخدام ناقل pCasPP-HDR فارغ من gRNA كعنصر تحكم لتقدير معامل إعادة التركيب الأساسي.

بعيداً عن التقدم المنهجي، قد تدعم هذه المنصة الدراسات المستقبلية التي تبحث في إشارات التكافل والجينوميات الوظيفية في الريزوبيا المرتبطة بالحمص28. يمثل الحمص (Cicer arietinum L.) محصولاً بقولياً هاماً عالمياً ومساهماً رئيسياً في الأنظمة الزراعية المستدامة29,30. وتوفر سلالة ΔnodC M. ciceri التي تم إنتاجها في هذه الدراسة خلفية جينية مفيدة potentially للبحث في توافق المضيف والميكروب ومسارات الإشارات المرتبطة بتكوين العقد الجذرية. وقد أشارت الدراسات السابقة إلى أن الـ sRNAs تعمل كمؤثرات تنظيمية خلال المراحل المبكرة من تكافل العقد الجذرية31. وبناءً على ذلك، فإن سلالة ΔnodC M. ciceri الموصوفة هنا، والتي تفتقر إلى القدرة على تكوين العقد، قد تسهل الدراسات المستقبلية التي تركز على الآليات الجزيئية الكامنة وراء التواصل في منطقة الريزوسفيرا والتكافل المثبت للنيتروجين.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي مصالح مالية متضاربة أو تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

هذا العمل مدعوم من قبل منحة MK Bhan (HRD-16016/15/2023-AFS-DBT) المقدمة من وزارة التكنولوجيا الحيوية (DBT) للدكتورة Nandita Pasari. كما يحظى هذا العمل بدعم من منحة أساسية قدمت للدكتورة Senjuti Sinharoy من المعهد الوطني لأبحاث جينوم النبات في نيودلهي، الهند.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أجاروزجينيتيكس (Genetix)PG-40005الفصل الكهربائي للهلام
ورق ألومنيومروليا’sGF83048115الاستخدام المختبري العام
آجار بكتيريولوجيHiMediaGRM026تحضير الأوساط الزرعية
منصة Benchling لتصميم أدلة CRISPRBenchlingنظرًا لعدم وجود نص مصدر في طلبك، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي الذي ترغب في ترجمته لكي أتمكن من تحويله إلى اللغة العربية وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية الدقيقة المذكورة في التعليمات.تصميم الحمض النووي الريبوزي الموجه
حمض البوريكHiMediaPCT0102ماكنايت’تحضير المحلول
دورق مخروطي من زجاج البوروسيليكاتسيجماCLS5100500تحضير المزرعة
أنابيب زجاجية من البوروسيليكاتسيجماDWK73500-1075تحضير المزرعة
كلوريد الكالسيوم ثنائي الهيدراتHiMediaMB034تحضير الخلايا المختصة
كبريتات الكالسيوم ثنائية الهيدراتHiMediaGRM328ماك نايت’تحضير المحلول
كاربينيسيلين ثنائي الصوديومDuchefa BiochemieDUC-C0109.005-18تُستخدم في 100 µg/mL
طقم تخليق الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المتمم (cDNA synthesis kit)Thermo Fisher ScientificAB1543Aتخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)
غلاف بلاستيكي لاصقالتهاب المفاصل العظمي10954049الاستخدام المختبري العام
طقم الاستنساخ/إنزيم T4 DNA ligaseThermo Fisher ScientificK1422تفاعلات الربط
أحمر الكونغوHiMedia573-58-0العمل على المزارع الميكروبية
كبريتات النحاس (II) خماسية الهيدراتHiMediaPCT0104ماكنايت’تحضير المحاليل
أنبوبة استزراعBorosil9800U08استزراع المزرعة البكتيرية الأولية؛ 15 سم × ٢.٥ سم
مقياس الرقم الهيدروجيني الرقمي (pH meter)Eutech Instrumentsجهاز EC PH TUTOR DSضبط الأس الهيدروجيني (pH)
فوسفات ثنائي البوتاسيومHiMediaTC596Mتحضير وسط YMB
سلم الحمض النووي (DNA ladder)BIO-HELIXDM015-R500الترحيل الكهربائي للهلام
طقم إزالة DNaseInvitrogenAM1907إزالة الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) من الحمض النووي الريبوزي (RNA) المعزول
مزيج dNTPThermo ScientificR0181تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
إيثانولSigma-Aldrich1.00983.0511استُخدم بتركيز 75%
بروميد الإيثيديومSigma-AldrichE1510صبغ هلام الحمض النووي (DNA)
إنزيم الفوسفاتاز القلوي الحساس للحرارة FastAPThermo Fisher ScientificEF0651إزالة مجموعة الفوسفات من الناقل أثناء الاستنساخ
محلول FastDigest المنظمThermo Fisher ScientificB64عمليات الهضم التقييدي
كلوريد الحديديك اللامائيHiMediaTC583ماكنايت’تحضير المحلول
مجهر ستيريو فلوريNikonSMZ25فحص البروتين الفلوري الأخضر (GFP)
مبيد فطري، Bavistinكريستال لحماية المحاصيلبافيستين كاربندازيم 50% WPمعالجة البذور
طقم استخلاص الهلامQIAGEN28704تنقية الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA)
جليسيرولThermo Fisher ScientificQ24505خلايا كفؤة/مخزونات الجلسرين
حضّانة نمو مع هزاز مداريمجلس البحوث الطبية (MRC)LOM-150الاستنبات البكتيري
قفازات يدKimtech97612معدات الوقاية الشخصية
هيبس (HEPES)HiMediaMB016تلدين قليلة النيوكليوتيد
إيزوبروبيل-بيتا-دي-1-ثيوجالاكتوبيرانوزيد (IPTG)G BiosciencesRC1113Dالفحص باللونين الأزرق والأبيض
خزانة تدفق الهواء الصفائحيبيولينك (Biolink)BL-H1300التعامل المعقم
آغار LBHiMediaM1151أطباق المزارع البكتيرية
مرق LBHiMediaG1245المزرعة البكتيرية
كبريتات المغنيسيومHiMediaGRM1281-500Gتحضير وسط YMB
كبريتات المغنيسيوم سباعية الهيدراتHiMediaPCT0008ماكنايت’تحضير المحلول
كبريتات المنجنيز (II) رباعية الهيدراتSigma-AldrichM3634ماكنايت’تحضير المحلول
مانيتولHiMediaMB198تحضير وسط YMB
ماك نايت’محلولمُحضّر مختبرياًبما أنه لم يتم توفير نص مصدري للترجمة، يرجى تزويدي بالنص الذي ترغب في ترجمته من الإنجليزية إلى العربية وفقاً للمعايير المهنية المذكورة، وسأقوم بتنفيذه بدقة علمية ولغوية تامة.محلول مغذٍ للنبات
رؤوس ماصة دقيقة، 0.2–10 µLTarsons521000مناولة السوائل
رؤوس ماصة دقيقة، 2–200 µLTarsons521010مناولة السوائل
رؤوس ماصة دقيقة، 200–1000 µLTarsons521020Xمناولة السوائل
أنبوب طرد مركزي دقيق، 0.5 ملTarsons500000تداول العينات
أنبوب طرد مركزي دقيق، 1.5 ملTarsons500010التعامل مع العينات
أنبوب طرد مركزي دقيق، 2.0 ملTarsons500020مناولة العينات
حمض الموليبديكSigma-Aldrich232084ماكنايت’تحضير المحلول
مقياس الطيف الضوئي NanoDropThermo Fisher Scientific13-400-519تقدير كمية الحمض النووي DNA/RNA
نيومايسينDuchefa BiochemieM0135يُستخدم في 50 µg/mL
ماء خالٍ من النوكليازHiMediaML064-100ملاستخدامات البيولوجيا الجزيئية
المزيج الرئيسي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR master mix)Thermo Fisher ScientificK01712× مزيج رئيسي
شرائط أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، 0.2 ملTarsons610040تجهيز تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
أطباق بتري، 90 ممالخلايا الجذعية متعددة القدرات2041أطباق الآجار
ماصة، 0.1–2.5 µLEppendorfN10178Mمناولة السوائل
ماصة، 0.5–10 µLEppendorfH40069Lمناولة السوائل
ماصة، 2–20 µLEppendorfH30046Mمناولة السوائل
ماصة، 10–100 µLEppendorfI00395Mمناولة السوائل
ماصة، 20–200 µLEppendorfM38186Mمناولة السوائل
ماصة، 100–1000 µLEppendorfN20610Mمناولة السوائل
طقم استخلاص الحمض النووي البلازميدي (Plasmid DNA extraction kit)QIAGEN12143عزل البلازميد
كلوريد البوتاسيومHiMediaTC010ماك نايت’تحضير المحلول
فوسفات ثنائي هيدروجين البوتاسيوم اللامائيHiMediaTC011Mماكنايت’تحضير المحلول
مرشح غشائي من بولي فينيليدين فلوريد (PVDF)، 0.22 µm، ٤٧ ممMilliporeSigmaGVWP04700التزاوج ثنائي الأبوين
جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقيBio-RadCFX96تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي مع النسخ العكسي (RT-qPCR)
جهاز طرد مركزي مبرد يوضع على الطاولةEppendorf04-987-373حصاد الخلايا
إنزيم القطع، BbsIThermo Fisher ScientificER1011استنساخ الحمض النووي الريبوزي الموجه (gRNA)
إنزيم القطع، EcoRIThermo Fisher ScientificFD0274الاستنساخ
إنزيم القطع، KpnIThermo Fisher ScientificFD0524الاستنساخ
إنزيم القطع، SacIThermo Fisher ScientificFD1133الاستنساخ
إنزيم التقييد، XbaIThermo Fisher ScientificFD0684الاستنساخ
DNase خالية من RNaseQIAGEN79254تنقية الحمض الريبي النووي (RNA)
رملرام سوراتالرملركيزة نمو النباتات
جهاز تسلسل الحمض النوويApplied Biosystemsجهاز تحليل الحمض النووي ABI3730xlتسلسل سانجر
وسط SOCمُحضّر مخبرياًلا ينطبقاستعادة التحول
كلوريد الصوديومHiMediaTC046تحضير الأوساط الزراعية
هيدروكسيد الصوديومHiMediaPCT1325ضبط الرقم الهيدروجيني لـ HEPES
شفرة جراحية معقمةميديكير للجراحة16020استئصال الهلام/التعامل مع الأنسجة
حقنة معقمةHMD Dispovanمحقنة سعة 10 مل بدون إبرةالترشيح التعقيمي
مرشح محقنة معقم، 0.22 µmMerck Millex Durapore12766842التعقيم بالترشيح
مزيج SYBR Green الرئيسيNew England BiolabsM3003Eتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي مع النسخ العكسي (RT-qPCR)
تتراسيكلينDuchefa BiochemieT01050تُستخدم عند 5 µg/mL
جهاز الدورات الحراريةApplied BiosystemsA24811تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)
لفافة أنسجةروليا’s07AAECR4885K1ZTالاستخدام المختبري العام
كاشف TRIzolInvitrogen15596026عزل الحمض النووي الريبوزي (RNA)
جهاز التصوير بالأشعة فوق البنفسجية (UV transilluminator)Analytik JenaTW-43تصوير الهلام
جهاز مطياف الامتصاص الذري للأشعة فوق البنفسجية والمرئيةEppendorfD30قياس الكثافة الضوئية عند طول موجي 600 نانومتر (OD600)
كوفيتات VisEppendorf30079345قياس الكثافة الضوئية عند 600 نانومتر (OD600)
جهاز مزج دواميتعديل حيادي (Neuation)iSWIX-VTخلط العينات
X-galG BiosciencesRC1233الفحص باللونين الأزرق والأبيض
مستخلص الخميرةHiMediaRM668-500Gتحضير الأوساط الزرعية
كبريتات الزنك سباعية الهيدراتSigma-AldrichZ0251ماكنايت’تحضير المحلول

المراجع

  1. Doudna JA, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
  2. Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology. 2013;31(3):233-9.
  3. Bertrand C, Thibessard A, Bruand C, Lecointe F, Leblond P. Bacterial NHEJ: a never ending story. Molecular microbiology. 2019;111(5):1139-51.
  4. Loureiro A, da Silva GJ. Crispr-cas: Converting a bacterial defence mechanism into a state-of-the-art genetic manipulation tool. Antibiotics. 2019;8(1):18.
  5. Altenbuchner J. Editing of the Bacillus subtilis genome by the CRISPR-Cas9 system. Applied and environmental microbiology. 2016;82(17):5421-7.
  6. Wang Y, et al. Bacterial genome editing with CRISPR-Cas9: deletion, integration, single nucleotide modification, and desirable “clean” mutant selection in Clostridium beijerinckii as an example. ACS synthetic biology. 2016;5(7):721-32.
  7. Oh J-H, van Pijkeren J-P. CRISPR–Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic acids research. 2014;42(17):e131-e.
  8. Cobb RE, Wang Y, Zhao H. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system. ACS synthetic biology. 2015;4(6):723-8.
  9. Wanjofu EI, et al. Nodulation and growth promotion of chickpea by Mesorhizobium isolates from diverse sources. Microorganisms. 2022;10(12):2467.
  10. Haskett T, et al. Complete genome sequence of Mesorhizobium ciceri strain CC1192, an efficient nitrogen-fixing microsymbiont of Cicer arietinum. Genome Announcements. 2016;4(3):10.1128/genomea. 00516-16.
  11. Bellahsen O, Díaz-Méndez R, Romero D. Genomic engineering in Rhizobium etli: implementation and evaluation of systems based on dCas9. Frontiers in Microbiology. 2025;16:1604430.
  12. Liu G, et al. An efficient CRISPR/Cas12e system for genome editing in Sinorhizobium meliloti. ACS Synthetic Biology. 2023;12(3):898-903.
  13. Wang L, Xiao Y, Wei X, Pan J, Duanmu D. Highly efficient CRISPR-mediated base editing in Sinorhizobium meliloti. Frontiers in Microbiology. 2021;12:686008.
  14. Schäfer A, et al. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. 1994;145(1):69-73.
  15. Rütering M, et al. Tailor-made exopolysaccharides—CRISPR-Cas9 mediated genome editing in Paenibacillus polymyxa. Synthetic Biology. 2017;2(1):ysx007.
  16. Ledermann R, Bartsch I, Remus-Emsermann MN, Vorholt JA, Fischer H-M. Stable fluorescent and enzymatic tagging of Bradyrhizobium diazoefficiens to analyze host-plant infection and colonization. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2015;28(9):959-67.
  17. Göttfert M. Regulation and function of rhizobial nodulation genes. FEMS microbiology reviews. 1993;10(1-2):39-63.
  18. Kant C, Pradhan S, Bhatia S. Dissecting the root nodule transcriptome of chickpea (Cicer arietinum L.). PLoS One. 2016;11(6):e0157908.
  19. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 2013;31(9):827-32.
  20. Doench JG, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature biotechnology. 2016;34(2):184-91.
  21. Norrander J, Kempe T, Messing J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 1983;26(1):101-6.
  22. Simon R, Priefer U, Pühler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Bio/technology. 1983;1(9):784-91.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. [4] Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods in enzymology. 1991;204:63-113.
  24. Alexandre A, et al. Natural populations of chickpea rhizobia evaluated by antibiotic resistance profiles and molecular methods. Microbial Ecology. 2006:128-36.
  25. Weerakkody LR, et al. A rapid, inexpensive and effective method for the efficient isolation of genomic DNA from Gram-negative bacteria. Molecular Genetics and Genomics. 2024;299(1):26.
  26. Selbitschka W, Niemann S, Pühler A. Construction of gene replacement vectors for Gram− bacteria using a genetically modified sacRB gene as a positve selection marker. Applied microbiology and biotechnology. 1993;38(5):615-8.
  27. Yadav A, Singh RP, Singh AL, Singh M. Identification of genes involved in phosphate solubilization and drought stress tolerance in chickpea symbiont Mesorhizobium ciceri Ca181. Archives of microbiology. 2021;203(3):1167-74.
  28. Dicenzo GC, et al. Multidisciplinary approaches for studying rhizobium–legume symbioses. Canadian Journal of Microbiology. 2019;65(1):1-33.
  29. Calia C, et al. A bibliometric analysis of chickpea agronomic practices in the world during 45 years of scientific research. Legume Science. 2024;6(1):e219.
  30. Sandhu J, Tripathi S, Chaturvedi S. Chickpea nutritional status and value chain for sustainable development.  Sustainable food value chain development: Perspectives from developing and emerging economies: Springer; 2023. p. 175-83.
  31. Ren B, Wang X, Duan J, Ma J. Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation. Science. 2019;365(6456):919-22.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تحرير CRISPR-Cas9الإصلاح الموجه بالتماثلمراسل GFPالمجهر الفلوريتسلسل سانجرمقايسة عدوى الحمصالجينوميات الوظيفية

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.