مقالة منهجية

حقن دقيق للإنترلوكين-6 في مجرى دم يرقات أسماك الزرد TSC لدراسة السلوكيات الشبيهة بالاضطرابات النفسية العصبية

152 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/71524

⸱

يونيو 26, 2026

 , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, International Institute of Molecular Mechanisms and Machines, IMol, Polish Academy of Sciences, 2Warsaw-4-PhD doctoral school, International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

في هذه المقالة

ملخص

لنمذجة كيفية تأثير الإشارات الالتهابية على تطور الأعصاب في الكائنات الحساسة وراثيا، نقدم بروتوكولا لحقن IL-6 في قناة كوفييه (الوريد الكاردينالي الشائع) في يرقات سمك الزرد، مما يمكن من تحفيز الالتهاب بشكل محكم وتقييم تأثيره التطوري في سياق مركب التصلب الدرني (TSC).

الملخص

المرضى المصابون بمركب التصلب الدرني (طفرات TSC1/TSC2) يظهرون تعبيرا متغيرا لاضطراب طيف التوحد (ASD)، ومن المعروف أن تنشيط المناعة لدى الأم يزيد من خطر الإصابة بالتوحد. الإنترلوكين-6 (IL-6) هو سيتوكين متعدد الخواص له أدوار راسخة في تنظيم المناعة، والالتهابات، والعمليات الالتهابية العصبية. ينتج عن عدة أنواع من الخلايا المناعية استجابة للعدوى أو إصابة الأنسجة، وغالبا ما يوصف بأنه وسيط التهابي. ومن الجدير بالذكر أن IL-6 يمكنه عبور الحاجز الدموي الدماغي وقد تورط في التهاب الأعصاب والحالات النفسية العصبية المرتبطة بالالتهابات، بما في ذلك اضطراب طيف التوحد (ASD) والإعاقة الذهنية (ID). هنا، نصف بروتوكولا لتحفيز إشارات التهابية جهازية في أسماك الزرد عن طريق توصيل IL-6 إلى مجرى الدم عن طريق الحقن في قناة كوفييه. يتيح هذا النهج الاستجابات الالتهابية المسيطر عليها وقابلة للتكرار لدراسة التغيرات الناتجة عن الالتهاب في التطور المبكر. يوضح البروتوكول الخطوات الأساسية لتحضير IL-6، والحقن الدقيق، والتطبيقات التجريبية في نماذج سمك الزرد للأمراض والالتهاب العصبي، بما في ذلك الدراسات المصممة لاستكشاف التفاعلات بين الجينات والبيئة. من خلال تمكين التحفيز المنظم للإشارات الالتهابية الجهازية، يوفر هذا النهج منصة متعددة الاستخدامات لدراسة كيفية تقاطع القابلية الجينية والتعرضات الالتهابية لتشكيل نتائج التطور.

المقدمة

فهم كيفية تشكيل الإشارات الالتهابية للتطور العصبي المبكر أمر ضروري لتحليل الآليات الكامنة وراء اضطرابات النمو العصبي، خاصة في السياقات الحساسة جينيا. الهدف الأساسي من هذا البروتوكول هو توفير نهج دقيق وقابل للتكرار لتحفيز إشارات التهابية جهازية في يرقات سمك الزبرا من خلال الحقن الدقيق المباشر للإنترلوكين-6 (IL-6) في قناة كوفييه (الوريد الأساسي الشائع).

يجسد مركب تصلب السل (TSC) مثل هذه التفاعلات بين الجينات والبيئة. TSC هو اضطراب وراثي نادر ناتج عن طفرات في TSC1 أو TSC2، والتي ترمز إلى الهامارتين والتوبيرين على التوالي، وهما بروتينان يشكلان مركبا يثبط عادة إشارات mTORC1. فقدان هذا التثبيط يؤدي إلى فرط تنشيط مسار mTORC1، مما يؤدي إلى نمو خلاوي غير طبيعي وطيف واسع من المظاهر السريرية، بما في ذلك اضطراب طيف التوحد (ASD)1,2. يقدر أن اضطراب طيف التوحد يصيب ~1.5٪ من الأفراد الذين يبلغ متوسط عمرهم ~3 سنواتفي الدول المتقدمة. يتميز اضطراب طيف التوحد بسلوكيات متكررة، وضعف التفاعلات الاجتماعية، وانخفاض المرونة الإدراكية4، وغالبا ما يواجه المرضى تحديات سلوكية عصبية إضافية مثل القلق أو الاكتئاب أو الإعاقة الذهنية3. ومن الجدير بالذكر أن 40٪-60٪ من الأفراد المصابين ب TSC يظهرون سمات مرتبطة باضطراب طيف التوحد2، ومع ذلك تختلف شدة الأعراض بشكل كبير – حتى بين المرضى الذين لديهم طفرات مماثلة – مما يشير إلى أن العوامل البيئية تعدل المخاطر المدفوعة بعوامل وراثية.

أحد هذه العوامل هو الالتهاب. على الرغم من أن أسباب اضطراب طيف التوحد لا تزال غير معروفة إلى حد كبير، إلا أن الالتهاب العصبي عبر مناطق دماغية متعددة كان مرتبطا منذ زمن طويل5. تشير الأدلة المتزايدة قبل السريرية والسريرية إلى أن الالتهاب العصبي الجنيني الناتج عن تنشيط المناعة الأمومة (MIA) وارتفاع إشارات السيتوكين الناتج قد يساهم بشكل كبير في المرض لاضطراب طيف التوحد6. لذا، فإن نمذجة تعرض السيتوكين الالتهابي في الأنظمة الحساسة وراثيا، مثل TSC، يوفر إطارا قويا لاستكشاف كيفية تقاطع الإشارات المناعية مع اضطراب تنظيم mTORC1 لتؤثر على تطور الدماغ المبكر.

ينبع مبرر تطوير هذا البروتوكول من الاعتراف المتزايد بأن الالتهاب الذي يعبر عن السيتوكين، بما في ذلك إشارات IL-6، يمكن أن يتفاعل مع الهشاشة الجينية للتأثير على مسارات النمو العصبي. السيتوكينات هي بروتينات جليكوبروتينية منخفضة الوزن جزيئيا تنسق التواصل داخل الجهاز المناعي. في اضطراب طيف التوحد، أبلغت عدة دراسات باستمرار عن مستويات مرتفعة من السيتوكينات الالتهابية، بما في ذلك IL-6 في الدم المحيطي 7,8,9,10، مما يدعم الفرضية القائلة بأن اضطراب إشارات IL-6 قد تساهم في السمات النمائية والسلوكية العصبية المميزة للاضطراب. يعد IL-6 وسيطا رئيسيا في تنشيط المناعة الناتج عن أنواع مختلفة من خلايا المناعة استجابة للعدوى أو تلف الأنسجة. نظرا لأن IL-6 يمكنه عبور الحاجز الدموي-الدماغي والتأثير المباشر على الخلايا العصبية والخلايا النجمية والدبقية الدبقية الدقيقة، فقد تم الربط بارتفاع مستمر لهذا السيتوكين في تغيير مسارات النمو العصبي، واللدونة المشبكية، والتوازن المناعي العصبي – وهي آليات يتم استكشافها بشكل متزايد في فيزيولوجيا مرض طيف التوحد11,12. تعزز هذه الروابط أكثر من خلال دراسات MIA، حيث يؤدي ارتفاع IL-6 لدى الأم أثناء الحمل إلى تعطيل تطور دماغ الجنين وزيادة خطر الإصابة بالتوحد13. ومع ذلك، غالبا ما تعتمد نماذج الفقاريات الحالية على التحفيز المناعي الجهازي من خلال جزيئات مرتبطة بالممرضات أو نماذج تعرض الأم، مما يمكن أن يسبب تنوعا، وينشط مسارات مناعية متعددة في آن واحد، ويحد من القدرة على عزل المساهمة المحددة ل IL-6. يتغلب الحقن المجهري المباشر ب IL-6 في سمك الزرد على هذه القيود من خلال تمكين التلاعب المستهدف بسيتوكين واحد داخل كائن شفاف وقابل للتعامل وراثيا.

تقدم سمكة الزرد عدة مزايا لدراسة التأثيرات التطورية المدفوعة بالسيتوكين. تسمح شفافيتها البصرية بتصور الاستجابات المناعية والعصبية في الوقت الحقيقي؛ تمكن تطورها السريع من التجارب عالية الإنتاجية؛ ومسارات الإشارات السيتوكينية المحفوظة لديهم تجعلها نموذجا قويا للفقاريات لتشريح آليات الالتهاب14،15،16،17،18. في الدراسات التجريبية، من الضروري توصيل مواد خارجية (بكتيريا، خلايا سرطانية، حمض نووي، جسيمات نانوية، إلخ) إلى يرقات سمك الزرد. إحدى الطرق تتضمن تعريض اليرقات لمحلول يحتوي على المادة المعنية، مما يسمح بالامتصاص السلبي عبر الجلد أو الخياشيم أو الجهاز الهضمي. الطريقة الثانية والأكثر مباشرة هي الحقن الدقيق، حيث يتم توصيل المواد الخارجية إلى حجرات جنينية أو يرقة محددة باستخدام إبر زجاجية دقيقة 19,20,21. ومن المهم أن الحقن الدقيق في قناة كوفييه يوفر مسارا موثوقا للتوصيل الجهازي، مما يضمن التوزيع السريع ل IL-6 في جميع أنحاء الدورة الدموية دون التأثيرات المربكة لتحفيز المناعة الكائنية الكاملة.

في هذا البروتوكول، نقدم إجراء خطوة بخطوة من تحضير حقن الحقن إلى حقن IL-6 في مجرى الدم عبر قناة كوفييه من يرقات سمك الزرد بعد يومين وثلاثة من الإخصاب (DPF). تعد هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للباحثين الذين يحققون في كيفية تأثير الإشارات الالتهابية المحددة على العمليات التطورية المبكرة، والتفاعلات بين الجينات والبيئة في نماذج اضطرابات النمو العصبي أو المناعية، أو العواقب الخلوية والجزيئية للتعرض للسيتوكين في الجسم الحي، أو التفاعل بين الطفرات الجينية ومسارات الإشارات الالتهابية. من خلال تقديم نهج محكم ومحدد بالسايتوكينات ودقيق من الناحية التنموي، يوفر هذا البروتوكول منصة متعددة الاستخدامات لاستكشاف الآليات التي تشكل من خلالها IL-6 والإشارات المناعية المرتبطة بها النتائج المناعية والعصبية والسلوكية المبكرة.

البروتوكول

في الإجراء الموضح هنا، تم استخدام خط سمك الزرد tsc2vu242/+ 22,23. جميع التجارب التي أجريت تم إجراؤها وفقا لجميع التشريعات ذات الصلة، ولا حاجة لموافقة إضافية من لجنة الأخلاقيات تحديدا لأن المرحلة التنموية المستخدمة (<5 DPF) تقع خارج نطاق المراجعة الأخلاقية الإلزامية. يعرض الشكل 1 مخططا للبروتوكول.

1. سحب الماصات الدقيقة

  1. تحضير إبر الحقن الدقيق من شعيرات زجاج البوروسيليكات باستخدام جهاز سحب الماصيل الدقيقة، وفقا للإجراءات المعروفة24.
  2. استخدم شعيرات زجاجية بوروسيليكات بطول 10 سم (قطر خارجي 1.0 مم، ذات جدران رقيقة) وحملها في جهاز سحب ميكروبايبت.
  3. ضع الشعيرة الدموية بعناية داخل عربة السحب، مع ضمان محاذاة دقيقة داخل الأخدود المحدد، وتثبيتها بإحكام باستخدام مشابك الأدوات لمنع الحركة أثناء السحب.
  4. اضبط الشعيرات الشعرية بحيث تكون مركزة داخل خيط التسخين، لضمان تسخين منتظم على طول المنطقة ليتم سحبها لتكون الإبر بشكل متسق.
  5. ابدأ برنامج السحب باستخدام معلمات محسنة (مثلا، لأداة سوتر استخدم الحرارة: 533، السحب: 50، السرعة: 60، التأخير: 90، والضغط: 200) لتوليد إبر حقن دقيقة ذات رؤوس دقيقة.
    تحذير: الإبر الدقيقة المستخرجة من الشعيرات الدموية الزجاجية هشة ويمكن أن تتشقق أو تسد أو تطور أطراف غير منتظمة بسهولة مما يغير حجم الحقن. افحص كل إبرة تحت المجهر المجسم قبل الاستخدام، وتجنب لمس طرفها للأسطح الصلبة، واستبدل الإبر فورا إذا لوحظت مقاومة أو تسرب أو حجم قطرة غير متناسق.
    ملاحظة: بعد عملية السحب، تتكون رؤوس إبر مدببة في كلا طرفي الشعيرات الدموية. قبل الاستخدام، يجب فتح الطرف بعناية عن طريق كسره بلطف باستخدام ملقط ناعم تحت المجهر المجسم لتحقيق حجم الفتحة المطلوب للحقن المجهري.

2. تحضير المخازن ومحلول المرق

  1. حضر محلول مخزون بحجم 60× من وسط جنين E3 (انظر الجدول 1). قم بتعقيم المحلول عن طريق التعقيم وتخزينه عند 4 درجات مئوية. للاستخدام، قم بتخفيف المحلول الأصلي في ماء فائق النقي للحصول على محلول عمل 1× E3.
    ملاحظة: يمكن تخزين محلول مخزوني 60× من وسط E3 للأجنة عند 4 درجات مئوية للتخزين طويل الأمد.
  2. حضر محلول مخزوني بقيمة 20x من التريسين (MS-222) كما هو موضح في الجدول 1. خزن المحلول عند 4 درجات مئوية في الظلام لمنع التحلل. قبل الاستخدام، قم بتخفيف تركيز العمل إلى 1× في وسط E3.
    ملاحظة: قم بضبط درجة الحموضة لمحلول التريسين الأصلي إلى 7.5 باستخدام 1 M Tris pH 9.0. يمكن جمع هذا المحلول وحفظه في درجة حرارة -20 درجة مئوية (مجمد) للتخزين طويل الأمد أو تخزينه عند 4 درجات مئوية. يتحلل التريكاين عند التيار المغناطيسي وتحت الضوء إلى مركب سام.
    تحذير: يجب توخي الحذر عند استخدام الترايساين (MS-222) للتخدير، لأن التعرض النادر أو المفرط يمكن أن يؤثر سلبا على فسيولوجيا وسلوك اليرقة. التعرض المفرط يمكن أن يضعف وظيفة القلب ويغير السلوك لاحقا، بينما يزيد نقص التخدير من خطر الإصابة أثناء التركيب. استخدم فقط التركيز الفعال الأدنى ومدة العلاج، والسماح بالتعافي الكامل في وسط الجنين الجديد قبل إجراء الفحوصات السلوكية.
  3. حضر محلول أغاروز بنسبة 1٪ (بدون ضخامة) في وسط E3 عن طريق التسخين حتى يذوب تماما.
    ملاحظة: إذا تم تحضيره مسبقا، يمكن تخزين المحلول عند 4 درجات مئوية وإعادة تسخينه قبل الاستخدام. في يوم التجربة، حافظ على حالة الأغاروز في حالة سائلة عند 55–60 درجة مئوية لمنع التصلب المبكر.
  4. حضر محلول NaCl بنسبة 0.9٪ (بدون ضغط) واحتفظ به في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع أو عند 4 درجات مئوية للتخزين لفترة طويلة. قبل الاستخدام، توازن المحلول إلى درجة حرارة الغرفة أو حضن المحلول عند 28.5 درجة مئوية لمطابقة الظروف الفسيولوجية للأجنة.
  5. حضر محلول IL-6 بسعة 2 بيجا/نانولتر بتركيز NaCl بنسبة 0.9٪. استخدم Aliquot المحلول لتجنب تكرار دورات التجمد والذوبان وتخزينه عند -20 درجة مئوية. قبل الاستخدام، قم بإذابة الخليط ورفع العليكوت إلى درجة حرارة الغرفة.
  6. حضر محلول عمل بحجم 0.5 ملغ/مل من البروناز في وسط E3 من محلول مخزون 20 ملغ/مل محضر في ماء فائق النقي.

3. الحصول على الأجنة وتربيتها حتى 2 DPF

  1. قم بإعداد التكاثر الجماعي بوضع عدة أسماك زرد كبيرة من نوع tsc2vu242/vu242 في حوض التكاثر.
    ملاحظة: يمكن فصل الذكور والإناث طوال الليل باستخدام مقسم لمنع التكاثر المبكر، مع إزالة المقسم في صباح اليوم التالي لتحفيز التزاوج المتزامن. بدلا من ذلك، يمكن الحفاظ على الأسماك بدون فاصل في بيئة يتم التحكم فيها بالضوء، حيث يعمل الانتقال من الظلام (الليل) إلى النور (الصباح) كإشارة للإخراج.
  2. في اليوم التالي، أزل المقسم (إذا استخدم) ودع عملية التكاثر تستمر لمدة تقارب ساعة واحدة.
  3. جمع الأجنة المخصبة بسرعة ونقلها إلى أطباق بتري بسمك 100 مم تحتوي على 40 مل من وسط الأجنة E3، مع الحفاظ على كثافة لا تزيد عن ~60 جنينا في كل طبق لضمان التطور الأمثل.
  4. حضانة الأجنة عند 28.5 درجة مئوية تحت دورة نهارية محكمة تتكون من 14 ساعة ضوء و10 ساعات مظلمة.
  5. عند 1 DPF و2 dpf، فحص الأجنة تحت المجهر المجسم وإزالة الأجنة الميتة، والبويضات غير المخصبة، والحطام للحفاظ على جودة الزراعة.
  6. استبدل وسط E3 بمحلول جديد لتقليل تراكم النفايات ودعم النمو الطبيعي للجنين.

4. تحضير صفائح الأغاروز للحقن الدقيق والإزالة

  1. حضر محلول أغاروز بنسبة 1٪ (بدون ضخامة) في وسط E3 وسخنه حتى يذوب الأغاروز تماما ويصبح المحلول شفافا.
  2. اترك المحلول يبرد لفترة وجيزة، ثم صب حوالي 30 مل في طبق بتري بحجم 100 مم، لضمان طبقة متساوية عبر السطح.
  3. بينما لا يزال الأغاروز سائلا لكنه يبدأ في التماسك، ضع قالب سيليكون بلطف على السطح لإنشاء أخاديد متجانسة.
    ملاحظة: هنا، تستخدم قوالب السيليكون ذات الأنماط الهرمية (الشكل 2) لتوليد آبار قادرة على الاحتفاظ بفائض E3 أثناء الحقن الدقيق. تم تصميم هذه الآبار لتوفير الاستقرار المؤقتة أثناء المعالجة والحقن من خلال الحفاظ على رطوبة كافية لمنع الجفاف وضمان بقاء الجنين لعدة دقائق خارج ظروف الحضانة القياسية.
  4. جهز أطباق بتري مغطاة بالأجوروز لإزالة القشرة الإنزيمية (قطر 50 مم) عن طريق صب حوالي 5 مل من محلول الأغاروز المنصهر بنسبة 1٪ (مع الزجاج) وتدوير الطبق بلطف لتغطية السطح بشكل متساو.
  5. أزل أي فائض من الأغاروز.
  6. اترك الأغاروز ليتصلب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10–15 دقيقة. بمجرد أن تثب، تكون الأطباق جاهزة للاستخدام في التكسير الإنزيمي للأجنة.

5. إزالة الانقسام الإنزيمي لأسماك 2 dpf

  1. انقل حوالي 100 جنين في كوريونات عند 2 DPF إلى طبق بتري صغير (50 مم) مغطى بالأجاروز.
  2. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من وسط E3 لتقليل تخفيف المحلول الإنزيمي وضمان إزالة التآكل الفعال.
  3. أضف 4 مل من محلول البروناز الطازج (تركيز المخزون: 20 ملغ/مل [المعد في ماء فائق النقي]، تركيز العمل: 0.5 ملغ/مل [مخفف في E3]) إلى الطبق، لضمان غمر الأجنة بالكامل.
    تحذير: يجب التحكم في علاج البرونايز بعناية، لأن فرط الهضم قد يضر الأنسجة اليرقة، مما يؤدي إلى زيادة هشاشة أثناء التعامل وقد يؤثر على البقاء أو السلوك. استخدم فقط الحد الأدنى من وقت التعرض الفعال، وغسل الأجنة جيدا بعد ذلك لمنع استمرار النشاط الإنزيمي.
  4. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 3–5 دقائق، مع مراقبة إطلاق الكوريونات تحت المجهر المجسم.
  5. قم بتدوير الطبق أو تدوير الطبق بلطف بشكل متقطع لتسهيل إزالة الكوريونات الإنزيمية. استمر حتى يتم تحرير غالبية الأجنة من الكشوريونات.
    ملاحظة: تأكد من أن الأجنة العارية مغمورة دائما في المحلول؛ وإلا، قد ينفجر كيس الصفار، مما يؤدي إلى وفاة الأجنة.
  6. بمجرد تحقيق إزالة التكاثر، غسل الأجنة جيدا عن طريق نقلها عبر 5–6 تغييرات من وسط E3 الطازج.
    ملاحظة: تأكد من أن الأجنة العارية مغمورة دائما في المحلول؛ وإلا، قد ينفجر كيس الصفار، مما يؤدي إلى وفاة الأجنة.
  7. تأكد من إزالة جميع الكوريونات وبقايا البرونازي لمنع تلف اليرقات والحفاظ على ظروف الزراعة المثلى.
  8. نقل ~50 يرقة متقلبة إلى طبق بتري بحجم 100 مم يحتوي على 40 مل من وسط E3 باستخدام ماصة باستور زجاجية.
  9. حافظ على اليرقات في هذه الظروف حتى يتم حقنها بمجهزة.

6. حقن أجنة سمك الزرد

  1. تحت المجهر المجسم (تكبير ≥150×)، استخدم ملقطات دقيقة لكسر طرف الشعيرة الزجاجية المسحوبة بحذر (القسم 1)، مما يولد ميكروبايبت بفتحة قطرها حوالي 3 ميكرومتر.
    ملاحظة: يمكن التعرف على الماصة الدقيقة المناسبة من خلال التأكد من أن الرأس مفتوح بدقة، دون تسطح مرئي أو سطح مفتوح كبير عند الطرف. إذا كسر الطرف بشكل واسع جدا، فلن يخترق جلد السمكة بفعالية وقد يؤدي إلى حقن ضعيف أو غير منتظم. لذلك، يجب إجراء فتح الأطراف بعناية تحت المجهر المجسم بتكبير عالي، لضمان انقطاع بسيط ومتحكم فيه في نهاية الشعيرات الدموية.
  2. جهز محاليل حقن تحتوي على 0.9٪ (بدون ضخامة) NaCl (تحكم) أو IL-6 (2 بيجرام/نالولتر) في 0.9٪ NaCl وإضافة 1 ميكرولتر من 0.1٪ تريبان بلو لكل 10 ميكرولتر من المحلول لتسهيل الرؤية أثناء الحقن.
  3. قم بملء الماصة الدقيقة المحضرة بسعة ~3 ميكرولتر من محلول الحقن باستخدام رأس المحمل الدقيق، لضمان عدم إدخال فقاعات هواء.
  4. ثبت الميكروبايبت المحملة في حامل الشعيرات الدموية (الشكل 2) المتصل بنظام الحقن الدقيق.
  5. ضع قطرة صغيرة من الزيت المعدني على شريحة معايرة.
  6. قم بمعايرة حجم الحقن عن طريق طرد القطرات إلى الزيت المعدني وقياس قطرها باستخدام شريحة معايرة (الشكل 2) بمقياس 0.01 مم. اضبط ضغط الحقن (بين 300–500 هكتوباسكال) لتحقيق حجم قطرة ~1 نانولتر.
  7. أضف التريسين (MS-222) إلى وسط E3 الذي يحتوي على يرقات بتركيز نهائي 1× للتخدير. لتقليل التوتر وضمان التخدير المستمر، استخدم اليرقات على دفعات صغيرة.
  8. انقل اليرقات الفردية بحجم 2 DPF إلى صفيحة حقن أجاروز متصلبة. يمكن وضع عدة يرقات (مثل حتى 10) في كل طبق، حسب قدرة التعامل.
  9. ضع الطبق تحت المجهر المجسم. باستخدام ماصحة زجاجية، وجه كل يرقة بلطف بحيث تكون قناة كوفييه واضحة وقابلة للوصول.
    ملاحظة: عند العمل مع عدة يرقات، تأكد من بقاء سطح الأجاروز مرطبا عن طريق إضافة قطرات من وسط E3 يحتوي على تريكائين (1×) بشكل دوري لمنع الجفاف.
  10. ضع طرف الماصي عند نقطة دخول قناة كوفييه (كما هو موضح في الشكل 3)، ويمكن التعرف عليه بتتبع خلايا الدم المتحركة نحو القلب تحت المجهر المجسم.
  11. حقن قطرتين متتاليتين (~1 نانولتر لكل منهما) من المحلول المحضر في قناة كوفييه، بفاصل حوالي 20 ثانية بين الحقن للسماح بالتوزيع الصحيح.
  12. بعد الحقن، انقل اليرقات بلطف من صفيحة الأاروز إلى طبق بتري جديد بحجم 100 مم يحتوي على 40 مل من وسط E3. قلل من الإجهاد الميكانيكي أثناء النقل.
  13. أعد اليرقات إلى الحاضنة عند 28.5 درجة مئوية للاستعادة.
  14. في اليوم التالي (3 DPF)، كرر إجراء الحقن الدقيق كما هو موضح في الخطوات 6.8–6.13.
    ملاحظة: الحقنة الواحدة تنتج إشارات قصيرة الأمد فقط ولا تستجيب سلوكية ثابتة، بينما تضمن الحقنة الثانية تنشيط مستمر لمسارات الالتهاب عبر نافذة التطور المبكرة لليرقات ذات الصلة بالتطور العصبي وتحدث تغييرات سلوكية كما هو موضح في قسم النتائج التمثيلية.
  15. عند 5 DPF، استخدم اليرقات للتطبيقات اللاحقة، بما في ذلك الفحوصات السلوكية، وتصوير الدماغ، أو تحليل التألق المناعي.

النتائج

لتقييم تأثيرات حقن IL-6 المجهري على فسيولوجيا وسلوك اليرقة، قارنا بين اليرقات المحقونة ب IL-6 واليرقات التي حقنها NaCl عبر فترة البقاء وبين قراءتين سلوكيين شائعتين لتقييم السلوكيات الشبيهة بالقلق والتكرار في أسماك الزرد. لم يؤثر حقن IL-6 الدقيق على قابلية اليرقة مقارنة بحقن NaCl (الشكل 4A). كانت معدلات البقاء عند 5 dpf غير مميزة بين المجموعتين المحقونات ب IL-6 وحقن NaCl، مما يشير إلى أن نظام الجرعات يتحمله جيدا ولا يسبب سمية غير محددة. الحقن الدقيقة نفسها قللت من قابلية العيش قليلا مقارنة بالأشقاء غير المحقونين، مما يشير إلى تأثير معتدل مرتبط بالتعامل بشكل مستقل عن التعرض ل IL-6. وهذا يؤكد أن البروتوكول مناسب للتحليلات السلوكية اللاحقة.

للتحقق من أن نموذج حقن IL-6 المجهري يحفز استجابة التهابية قابلة للقياس عند 5 DPF، قمنا بقياس البروستاجلاندين E2 (PGE2)، وهو وسيط لاحق للإشارات الالتهابية المدفوعة بالسيتوكينات25. أظهر الطفرات المتماثلة tsc2-/- مستويات PGE2 مرتفعة حتى بدون حقن IL-6، وهي أعلى بكثير من إخوتها من النوع البري (WT) tsc2+/+ (الشكل 4B). أظهرت الطفرات غير المتجانسة tsc2+/- زيادة طفيفة وغير معنوية في PGE2 الأساسي مقارنة بيرقات WT، لكن الأهم من ذلك، ارتفعت مستويات PGE2 لديهم بشكل حاد بعد الحقن الدقيق ل IL-6. يتوافق هذا النمط مع هدفنا في نمذجة تفاعلات الجين × البيئة: تظل يرقات WT غير متأثرة إلى حد كبير بالتعرض الخفيف والعابر ل IL-6، بينما تظهر الطفرات المعرضة وراثيا tsc2+/- استجابة التهابية واضحة.

تماشيا مع هذه الفروقات المعتمدة على النمط الجيني في نغمة الالتهاب، قمنا بعد ذلك بفحص ما إذا كانت الإشارات الناتجة عن IL-6 تترجم إلى تغييرات سلوكية قابلة للقياس في اختبار المجال المفتوح. أظهر اختبار مفتوح عند 5 DPF (كما وصفسابقا 22) أن يرقات tsc2 المتحولة أظهرت سلوكا قلقا متزايدا مقارنة بالأشقاء WT (الشكل 4C); ومع ذلك، لم تؤثر الحقن الدقيقة ل IL6 على هذا السلوك. تحديدا، قضت يرقات tsc2+/- و tsc2-/-- وقتا أطول بكثير في المنطقة الخارجية للساحة وأظهرت انخفاضا في استكشاف المركز مقارنة ب tsc2+/+، بما يتوافق مع الأنماط الظاهرية المرتبطة بالقلق المثبتة في يرقات سمك الزرد.

زادت حقن IL-6 من أنماط السباحة المتكررة والنمطية، خاصة في يرقات tsc2+/- المتحولة (الشكل 4D–E)، وهي ميزة سلوكية تستخدم عادة كقراءة ذات صلة باضطراب طيف التوحد في نماذج سمك الزرد26. كشف القياس الدقيق للتكرار المتكرر، المعرف بأنه ثلاث أو أكثر من السباحة الدائرية المتتالية، عن زيادة كبيرة في نسبة الطفرات المحقونة ب IL-6 tsc2+/- التي تظهر هذا السلوك مقارنة بالمتحولين الذين حقنوا ب NaCl. هذا التعزيز الانتقائي للسباحة المتكررة في اليرقات الحساسة وراثيا يدعم تفاعل الجين × البيئة، حيث يكشف التحفيز الالتهابي الخفيف أو يعزز الميل السلوكية الشبيهة باضطراب طيف التوحد تحديدا في خلفية الطفرة tsc2+/-

figure-results-1
الشكل 1: مخطط البروتوكول. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: إعداد محطة العمل بالحقن الدقيق. مخطط لمحطة العمل الميكرو الحقنة المستخدمة في حقن يرقات سمك الزرد. (1) ميكروبايبت زجاجية مثبتة على حامل الحاقن؛ (2) طبق بتري مطلى بالأجاروز مع آبار مصبوبة لتحديد موقع اليرقات؛ (3) زيت معدني للمعايرة؛ (4) محلول تريبان الأزرق؛ (5) إبر زجاجية مسحوبة؛ (6) شريحة معايرة؛ (7) أطراف الماصة الممتدة؛ (8) ماصة باستور؛ (9) قالب سيليكون. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: الحقن في قناة كوفييه. (أ) تمثيل تخطيطي لقناة موقع حقن كوفييه (الوريد الأساسي الشائع) في يرقات سمك الزرد ومسارات الحركة المفتوحة التمثيلية عند 5 DPF. (ب) صور تمثيلية للتحكم (غير المحقون)، والحقن باستخدام NaCl، وIL-6. شريط المقياس: 250 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: النتائج التمثيلية لتفاعل بيئة الجين x باستخدام خط tsc2 الطفر. (أ) معدلات البقاء (٪) يرقات tsc2vu242 خلال فترة التجربة عبر مجموعات التحكم (غير المحقونة)، والحقنة ب NaCl، وIL-6 المحقونة. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM عند 5 dpf (n = 4 نسخ تجريبية مستقلة، كل نمط جيني × تركيبة معالجة تحتوي على 60–70 سمكة). تم إجراء التحليل الإحصائي باستخدام ANOVA تلاه اختبار Tukey بعد الاختبار للمقارنة الزوجية. لوحظت فروقات ذات دلالة إحصائية بين المجموعة الضابطة ومجموعات حقن IL-6 (p = 0.00150) وبين المجموعة الضابطة ومجموعات حقن NaCl (p = 0.00243). (B) مخططات الصندوق التي تمثل مستويات PGE2 لدى طفرات وأشقاء tsc2، تم قياسها عند 5 dpf باستخدام مجموعة اختبار ELISA المرتبطة بالإنزيم (ELISA) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (ANOVA ثنائي الاتجاه للنمط الجيني: F = 7.4503؛ P = 0.01234). كل عينة تحتوي على 20 رأسا (تم استخدام الذيل في التصنيف الجيني). النقاط في مخططات الصناديق تمثل النسخ البيولوجية. (ج) مخططات صندوقية لنتائج اختبار المجال المفتوح لأسماك tsc2 المتحولة تظهر الوقت النسبي الذي قضاه بجانب الجدران لكل نمط جيني بعد حقن NaCl وIL-6 وللعناصر غير المحقونة (تحليل النوم الثلاثي الاتجاه للنمط الجيني: F = 7.021؛ P = 0.00106). تم إجراء اختبار المجال المفتوح باستخدام غرفة تحليل آلية (جدول المواد) وفقا للبروتوكول المبلغ عنهسابقا في 22. (د) شكل نموذجي يظهر سلوكا استكشافيا عشوائيا بعد حقن NaCl والتكرار المتكرر بعد حقن IL-6. (ه) مخططات الصندوق التي تمثل عدد الحيوانات التي تظهر سلوكيات تكرارية طبيعية ومتكررة لكل نمط جيني من tsc2 بعد الحقن ب NaCl أو IL-6 وللأسماك الضابطة غير المحقونة (تحليل أنوي ثنائي الاتجاه للنمط الجيني: F = 5.7615؛ P = 0.005849). تم استخدام ثلاث نسخ تجريبية مستقلة، كل نمط جينيتي × تركيبة علاجية تحتوي على 60–70 سمكة لهذا الغرض. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

حل مخزون 60 × E3
المادة الكيميائيةالتركيز النهائيالمبلغ
NaCl297 مللي مولار17.4 ج
KCl10.7 ملليمتر0.8 جرام
CaCl219.6 مللي مولار2.18 جرام
MgCl2·6H2O24 مللي مولار4.89 جرام
فائق H2O فائقلا يوجدملء حتى 1 لتر
المجموعلا يوجد1 لتر
محلول مخزون التريكائين
المادة الكيميائيةالتركيز النهائيالمبلغ
تريكائين15.3 مللي مولار1 ج
1 M Tris-HCl pH 921 مللي مول5.25 مل
فائق H2O فائقلا يوجد244.75 مل
المجموعلا يوجد250 مل

الجدول 1: تركيب محاليل E3 والتريكين.

المناقشة

كما هو متوقع، أظهر الطفرون المتماثلون من tsc2 مستويات أساسية عالية من القلق الشبيه، متوافقة مع الأنماط الظاهرية المبلغ عنهاسابقا 22,27. ونظرا لأن هذه اليرقات تظهر بالفعل تشوهات سلوكية شديدة، لم يؤد حقن IL-6 إلى تفاقم نمطها الظاهري أكثر. على النقيض من ذلك، أظهرت تغاير الزيجوت tsc2 تغيرات واضحة ناتجة عن IL-6. تسلط هذه الحساسية الانتقائية الضوء على فائدة هذا البروتوكول في فحص تفاعلات الجينات × البيئة، حيث تتفاعل الإشارات الالتهابية الخفيفة ولكن الممتدة مع الضعف الجيني الكامن في تشكيل النتائج السلوكية العصبية.

يظل التعرض لمتلازمة الالتهاب الخفيف أكثر النماذج استخداما لتحفيز الالتهاب في أسماك الزرد، وينتج استجابة مناعية واسعة وقوية تتميز بتحفيز قوي للسيتوكينات الالتهابية، وتجنيد خلايا المناعة الفطرية،والوفيات المعتمدة على الجرعة. رغم قوته، ينشط LPS مسارات مستقبلات شبيهة ب Toll عدة مسارات في نفس الوقت 28,29,30، مما يصعب عزل مساهمة السيتوكينات الفردية في التأثيرات العصبية التطورية اللاحقة. على النقيض من ذلك، يوفر بروتوكول الحقن الدقيق IL-6 الموضح هنا نهجا مستهدفا ومسيطر عليه من خلال رفع سيتوكين واحد معروف بأنه مركزي في تنشيط المناعة لدى الأم. ومن المهم أن حقن IL-6 لا تزيد من معدل الوفيات مقارنة بالضبطات التي تم حقنها ب NaCl، مما يتيح فحص الأنماط السلوكية والجزيئية دون الخلط في السمية. علاوة على ذلك، ينتج حقن IL-6 إشارات التهابية محددة في المراحل اللاحقة، كما يتضح من ارتفاع مستويات PGE2، ويحفز تغييرات سلوكية قابلة للقياس - خاصة زيادة السباحة المتكررة في يرقات tsc2 غير المتغاير الزيجوت - حيث تتفاعل القابلية الجينية مع التعرض للسيتوكينات. معا، تؤكد هذه الفروق أنه بينما يمثل LPS التنشيط المناعي العالمي، فإن حقن IL-6 المجهري يتيح تشريحا دقيقا لآليات السيتوكين الخاصة بالمخاطر التطورية العصبية.

تظهر النتائج التمثيلية المعروضة هنا تأثيرات IL-6 في خلفية من طفرات tsc2، لكن البروتوكول نفسه قابل للتطبيق بشكل واسع. يمكن تطبيق هذه الطريقة بسهولة في اليرقات البرية أو النماذج الجينية الأخرى للتحقيق في كيفية تقاطع الإشارات الالتهابية المحددة مع سياقات جينية متنوعة خلال التطور العصبي المبكر. بالنسبة للتطبيقات التي تتجاوز نموذج tsc2، نوصي بتحديد الجرعة المثلى من IL-6 تجريبيا، حيث قد تختلف حساسية السيتوكينات وعتبات الالتهاب بين الأنماط الجينية والأهداف التجريبية.

اعتبار تقني رئيسي في هذا البروتوكول هو اتساق حجم الحقن، حيث تعتمد التأثيرات البيولوجية ل IL-6 على توصيل دقيق يقارب 1 نانولتر لكل حقنة. غالبا ما ينشأ التفاوت في حجم القطرات من اختلافات في فتحة الإبر أو ضغط الحقن. إذا كانت القطرات صغيرة جدا، فإن زيادة الضغط تدريجيا أو توسيع طرف الإبرة قليلا تحت التكبير العالي عادة ما يعيد التدفق السليم. وعلى العكس، القطرات التي تتجاوز الحجم المقصود عادة ما تشير إلى أن فتحة الإبرة واسعة جدا، وفي هذه الحالة يكون من الضروري تقليل الضغط أو تجهيز إبرة جديدة بطرف أضيق. الحفاظ على حجم حقن دقيق أمر ضروري، لأن الانحرافات قد تغير الحمل الالتهابي وتؤثر على قابلية التكرار. أحيانا، قد يواجه المستخدمون مواقف لا يتم فيها إخراج أي حل من الإبرة. غالبا ما يكون ذلك بسبب فقاعات الهواء أو الحطام أو الانسدادات عند طرف الإبرة. عادة ما يؤدي فحص الإبرة تحت المجهر المجسم وفحص نظام الحقن بحثا عن تسربات أو وصلات مرتخية إلى حل المشكلة. ضمان وجود طرف إبرة نظيف وغير مسدودة أمر ضروري لضمان توصيل منتظم ولمنع تراكم الضغط الذي قد يضر اليرقات.

عامل مهم آخر هو تحمل الحجم المحقون بشكل فسيولوجي. تتحمل اليرقات عادة ~1 نانولتر جيدا، لكن الكميات الكبيرة قد تزيد من الوفيات، خاصة عند إجراء عدة حقن على مدار أيام متتالية. بالنسبة للتجارب التي تتطلب تكرار الجرعات، من الضروري تقليل الإجهاد الميكانيكي، والسماح بوقت كاف للتعافي بين الحقن، وضبط تركيز IL-6 بدلا من الحجم لتحقيق الجرعة المطلوبة. تساعد هذه الاعتبارات في ضمان أن الأنماط الظاهرية المرصودة تعكس التعرض للسيتوكين بدلا من الإصابة المرتبطة بالحقن.

أخيرا، يمكن أن تختلف معدلات الوفيات المرتبطة بالحقن بشكل كبير حسب تجربة المستخدم. بينما يحقق المستخدمون المهرة عادة معدلات وفيات تقارب 5٪، قد يلاحظ المستخدمون غير المتمرسين معدلات تصل إلى 50٪. معظم الخسائر ناتجة عن تلف ميكانيكي أثناء التثبيت، أو وضع الإبر بشكل خاطئ، أو ثقب كيس الصفار أو الأنسجة المحيطة بالعرض. ممارسة الإجراء على اليرقات البرية قبل بدء الحقن التجريبية يحسن بشكل كبير الاتساق ويقلل من الوفاة. وضع اليرقات بشكل صحيح لرؤية قناة كوفييه بوضوح، إلى جانب التعامل اللطيف أثناء التركيب والتعافي، يقلل من الضرر الإجرائي بشكل أكبر.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر كيفن إس وليليانا سولنيكا-كريزل (جامعة فاندربيلت) على صيد الأسماك tsc2vu242/+ وصندوق IIMCB ZCF على المساعدة مع الأسماك البالغة. وقد تم دعم هذا العمل بمنحة سوناتا BIS رقم 2023/50/E/NZ3/00252، وهي منحة لمركز العلوم الوطني في بولندا لصالح JZ.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Borosilicate Glass capillaries (Outer diameter 1.0 mm/ inner diameter 0.75 mm)Sutter InstrumentBF150-75-10
CaCl2 (calcium chloride)Chempur118748703
Callibration Slide (1/100 mm)Bresser5916710
Capillary holder (Grip head set 4 size 0)Fertilart Sp. z o.o5196082001
Flaming/Brown micropipette pullerSutter InstrumentP-1000
HClChempur115752837
Human IL6Thermo Fischer Scientific200-06-20UGتركيز المخزون: 10 µg/mL ، تركيز العمل: 2 pg/nL (مخفف في 0.9٪ NaCl)
Injector pump FemtoJet 4iEppendorfE5252000021
KCl (potassium chloride)Chempur117397402
MgCl2·6H2O (magnesium chloride hexahydrate)Chempur116120500
Femtotips Microloader Tips for Femtojet MicroinjectorEppendorfEPE 5242956003
Microscope Leica M165 FC 1983 magnificationLeica Microsysytemshttps://www.leica-microsystems.com/products/
light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/
Mineral oilSigma-AldrichM5904
NaCl (sodium chloride)Chempur117941206
PronaseSigma-AldrichP5147-1Gتركيز المخزون: 20 mg/mL (معد في ماء نقي للغاية)، تركيز العمل: 0.5 mg/mL (مخفف في E3)
TricaineSigma-Aldrich/MerckA-5040
Tris baseCarl Roth4855.3
Trypan BlueThermo Fischer Scientific15250061
UltraPure Low Melting Point AgaroseThermo Fischer Scientific16520050
ZebraBox extension - Photo Motor Response EZBPMRAnimalabhttps://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system
ZebraboxViewPointhttps://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebraboxحجرة تحليل آلي

المراجع

  1. Winden, K., et al. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 12, 11(2026).
  2. Ramani, R., et al. The clinical interface of tuberous sclerosis complex and autism spectrum disorder: insights and future directions. Neurol Sci. 46 (6), 2571-2580 (2025).
  3. Lyall, K., et al. The changing epidemiology of autism spectrum disorders. Annu Rev Public Health. 38, 81-102 (2017).
  4. Nazeer, A., Ghaziuddin, M. Autism spectrum disorders: clinical features and diagnosis. Pediatr Clin North Am. 59, 19-25 (2012).
  5. Kern, J. K., Geier, D. A., Sykes, L. K., Geier, M. R. Relevance of neuroinflammation and encephalitis in autism. Front Cell Neurosci. 9, 519(2016).
  6. Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biol Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
  7. Croonenberghs, J., Bosmans, E., Deboutte, D., Kenis, G., Maes, M. Activation of the inflammatory response system in autism. Neuropsychobiology. 45, 1-6 (2002).
  8. Girgis, R. R., Kumar, S. S., Brown, A. S. The cytokine model of schizophrenia: emerging therapeutic strategies. Biol Psychiatry. 75 (4), 292-299 (2014).
  9. Heuer, L. S., et al. An exploratory examination of neonatal cytokines and chemokines as predictors of autism risk: the early markers for autism study. Biol Psychiatry. 86 (4), 255-264 (2019).
  10. Sasayama, D., et al. Negative correlation between serum cytokine levels and cognitive abilities in children with autism spectrum disorder. J Intell. 5 (2), 19(2017).
  11. Banks, W. A., Kastin, A. J., Gutierrez, E. G. Penetration of interleukin-6 across the murine blood-brain barrier. Neurosci Lett. 179 (1-2), 53-56 (1994).
  12. Otkıran, G., Erdoğan, M. A., Uyanıkgil, Y., Erbaş, O. Prenatal interferon-alpha exposure induces autism-like neurobehavioral and neurochemical alterations in male offspring. J Neuroimmune Pharmacol. 21, 4(2026).
  13. Smith, S. E. P., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  14. Bedell, V. M., Meng, Q. C., Pack, M. A., Eckenhoff, R. G. A vertebrate model to reveal neural substrates underlying the transitions between conscious and unconscious states. Sci Rep. 10, 15789(2020).
  15. Belo, M. A. A., et al. Zebrafish as a model to study inflammation: a tool for drug discovery. Biomed Pharmacother. 144, 112310(2021).
  16. Ka, J., Pak, B., Han, O., Lee, S., Jin, S. -W. Comparison of transcriptomic changes between zebrafish and mice upon high fat diet reveals evolutionary convergence in lipid metabolism. Biochem Biophys Res Commun. 530 (4), 638-643 (2020).
  17. Li, Y., Hu, B. Establishment of multi-site infection model in zebrafish larvae for studying Staphylococcus aureus infectious disease. J Genet Genomics. 39 (9), 521-534 (2012).
  18. Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Res. 67 (7), 2927-2931 (2007).
  19. Cao, Z., et al. Carboxyl graphene oxide nanoparticles induce neurodevelopmental defects and locomotor disorders in zebrafish larvae. Chemosphere. 270, 128611(2021).
  20. Martini, D., Pucci, C., Gabellini, C., Pellegrino, M., Andreazzoli, M. Exposure to the natural alkaloid berberine affects cardiovascular system morphogenesis and functionality during zebrafish development. Sci Rep. 10, 17358(2020).
  21. Sun, M., et al. Robotic cardinal vein microinjection of zebrafish larvae based on 3D positioning. 2021 IEEE International Conference on Robotics and Automation (ICRA), Xi'an, China, , (2021).
  22. Kedra, M., et al. TrkB hyperactivity contributes to brain dysconnectivity, epileptogenesis, and anxiety in zebrafish model of tuberous sclerosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2170-2179 (2020).
  23. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Dis Model Mech. 4 (2), 255-267 (2011).
  24. Konadu, B., Cox, C. K., Gibert, Y. Protocol for the microinjection of free fatty acids and triacylglycerol in zebrafish embryos. STAR Protoc. 5 (2), 103086(2024).
  25. Evans, S. S., Repasky, E. A., Fisher, D. T. Fever and the thermal regulation of immunity: the immune system feels the heat. Nat Rev Immunol. 15 (6), 335-349 (2015).
  26. Zabegalov, K. N., et al. Abnormal repetitive behaviors in zebrafish and their relevance to human brain disorders. Behav Brain Res. 367, 101-110 (2019).
  27. Scheldeman, C., et al. mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebrafish: phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108, 225-237 (2017).
  28. Ilyin, N. P., et al. Effects of intracerebroventricular lipopolysaccharide administration on behavioral, neurochemical, and neurogenomic responses in adult zebrafish. Behav Brain Res. 493, 115676(2025).
  29. Luo, R., Yao, Y., Chen, Z., Sun, X. An examination of the LPS-TLR4 immune response through the analysis of molecular structures and protein-protein interactions. Cell Commun Signal. 23, 142(2025).
  30. Grebennikova, D. V., Shandilya, U. K., Karrow, N. A. Beyond TLR4 and its alternative lipopolysaccharide (LPS) sensing pathways in zebrafish. Genes. 16 (9), 1014(2025).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

232 232 JoVE TSC TANDs 6 IL 6 ASD MIA
حقن دقيق للإنترلوكين-6 في مجرى دم يرقات أسماك الزرد TSC لدراسة السلوكيات الشبيهة بالاضطرابات النفسية العصبية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.