يصف هذا البروتوكول طريقة LAMP تعتمد على شريحة مائعية دقيقة متكاملة تماماً، تتيح الكشف في نقطة الرعاية عن 15 مسبباً للأمراض المسببة لعدوى الجهاز التنفسي السفلي لدى مرضى وحدة العناية المركزة في غضون ساعة واحدة.
مقالة منهجية
الكشف السريع في نقطة الرعاية عن مسببات الأمراض الخاصة بعدوى الجهاز التنفسي السفلي لدى مرضى وحدة العناية المركزة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تعد عدوى الجهاز التنفسي السفلي (LRTIs) من الأسباب الرئيسية للتدهور السريري والوفاة لدى المرضى في الحالات الحرجة. وفي وحدة العناية المركزة (ICU)، يعد التعرف السريع على المسبب المرضي أمراً ضرورياً لتحديد العلاج المناسب بمضادات الميكروبات؛ ومع ذلك، تستغرق طرق المزرعة التقليدية من 3 إلى 5 أيام وتتميز بمعدلات إيجابية دون المستوى الأمثل، لا سيما بالنسبة للفطريات. وبالرغم من أن النهج الجزيئية مثل PCR تقلل من وقت الحصول على النتائج، إلا أنها لا تزال تعتمد على الاستخلاص اليدوي للأحماض النووية والدورات الحرارية، مما يحد من ملاءمتها للاستخدام بجانب سرير المريض. يصف هذا البروتوكول سير عمل لنقطة الرعاية يعتمد على شريحة مائعية دقيقة مدمجة بالكامل على شكل قرص (CD chip) تجمع بين تنقية الأحماض النووية القائمة على الخرز المغناطيسي والتضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP). فبعد خطوة مبسطة من الإسالة والتحلل اليدوي، يتم تحميل العينة المعالجة على الشريحة جنباً إلى جنب مع قارورتين من الكواشف المعبأة مسبقاً. ومن ثم يقوم الجهاز ذاتياً بعمليات الاستخلاص، والتضخيم عند 65 °C، وقراءة الفلورة في الوقت الفعلي، ليعطي نتائج نوعية لـ 15 هدفاً، وهي 1 نوعاً من البكتيريا، و3 أنواع من الفطريات، ومسبب مرضي غير نمطي واحد، وذلك في غضون 45 min من وقت تشغيل الجهاز (حوالي 1 h لسير العمل الكامل من العينة إلى النتيجة، بما في ذلك خطوة المعالجة المسبقة اليدوية). ونقدم هنا بيانات الكشف من 10 عينات من وحدة العناية المركزة، بما في ذلك البلغم، والشفاطات الشعبية، وسوائل غسيل القصبات والأسناخ، والتي شملت عدوى بمسبب مرضي واحد وعدوى مشتركة متعددة الميكروبات تضم ما يصل إلى 7 كائنات حية على شريحة واحدة. ويقلل تصميم الخرطوشة المغلق من خطر التلوث بالرذاذ، كما أن خطوة التحميل الواحدة لا تتطلب تدريباً متخصصاً، مما يجعل هذا النظام أداة تشخيصية عملية بجانب السرير لفرق العمل في وحدة العناية المركزة.
المقدمة
تظل عدوى الجهاز التنفسي السفلي بين المرضى الذين يعانون من حالات حرجة في وحدة العناية المركزة، وعلى رأسها الالتهاب الرئوي المرتبط بجهاز التنفس الاصطناعي (VAP)، محركًا مستمرًا للمراضة، وإطالة مدة التهوية الميكانيكية، وزيادة معدلات الوفيات1,2. ويختلف المشهد الميكروبيولوجي لعدوى الجهاز التنفسي السفلي (LRTIs) المكتسبة في وحدة العناية المركزة بشكل ملحوظ عن الأمراض المكتسبة من المجتمع؛ حيث تسود البكتيريا سالبة الجرام المقاومة للأدوية المتعددة (Klebsiella pneumoniae، وPseudomonas aeruginosa، وAcinetobacter baumannii)، وغالبًا ما تظهر في مجموعات متعددة الميكروبات مما يربك الأنظمة العلاجية التجريبية3,4. كما تضيف الفطريات الانتهازية طبقة أخرى من التعقيد، إذ أصبح داء الرشاشيات الرئوي الغازي، الذي كان يُعتبر سابقًا سمة مميزة للتثبيط المناعي الشديد، يُشخص الآن بوتيرة متزايدة لدى مرضى وحدة العناية المركزة غير المصابين بنقص العدلات، ولا سيما بعد الإصابة بالإنفلونزا الشديدة وكوفيد-195. وتجمع خوارزميات التشخيص الحالية لداء الرشاشيات بين المزارع ذات العائد المنخفض واختبار مستضد الجالاكتومانان (GM)، ومع ذلك، فإن فحص GM مقيد بنوافذ تشخيصية موثقة جيدًا وحساسية متغيرة في المضيفين غير المصابين بنقص العدلات6. وترتبط كل ساعة تأخير في بدء العلاج المناسب بمضادات الميكروبات لحالات تسمم الدم بزيادة ملموسة في معدل الوفيات7. وبناءً على ذلك، فإن سرعة وتعقيد عدوى وحدة العناية المركزة تتطلب أدوات تشخيصية يمكنها مواكبة الاستعجال السريري.
تعد المزارع الميكروبيولوجية القياسية، رغم أنها لا غنى عنها لاختبارات الحساسية، محدودة السرعة بشكل أساسي؛ حيث تتراوح فترة ظهور النتائج من 3 إلى 5 أيام، وتُفقد الكائنات الدقيقة صعبة النمو، كما تظل نسبة إيجابية المزارع الفطرية منخفضة8. ويوفر تسلسل الجيل التالي الميتاجينومي (mNGS) بديلاً غير متحيز، إلا أن اعتماده السريري يحده التكلفة، وأوقات المعالجة التي تتراوح من 24 إلى 48 ساعة، والاعتماد على خطوط تحليل المعلوماتية الحيوية، ومحدودية الجدوى عند نقطة الرعاية9. وقد ساهمت اللوحات المعتمدة على تقنية PCR في تقليص الفجوة الزمنية، ولكنها لا تزال تتطلب استخلاصاً للأحماض النووية متعدد الخطوات، وأجهزة للدورات الحرارية، وبالنسبة للتنسيقات التقليدية، تتطلب الفصل الكهربائي بعد التضخيم10. ولا يلبي أي من هذه الأنظمة المتطلبات المتلازمة لوحدة العناية المركزة (ICU): سرعة تقل عن ساعة واحدة، وأقل قدر من الوقت للتنفيذ اليدوي، وتغطية متعددة لمسببات الأمراض بما في ذلك الفطريات، وبساطة تشغيلية كافية لغير المتخصصين في المختبرات.
يعالج التضخيم متساوي الحرارة بوساطة الحلقة (LAMP) العديد من هذه القيود. تضخم هذه الطريقة، التي وصفها Notomi وزملاؤه لأول مرة، الحمض النووي المستهدف عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 65 °C باستخدام مجموعة من أربعة إلى ستة بادئات تتعرف على ست مناطق متميزة، بدفع من بوليميراز إزاحة السلاسل1. ويولد التفاعل تراكيب تضخيم مميزة على شكل حلقة ساقية وأخرى تشبه القرنبيط يمكن الكشف عنها عبر الفلورة في الوقت الحقيقي، مما ينتج منحنيات على شكل حرف S في غضون دقائق من تجاوز العتبة. وتكون الحساسية عالية عند التركيزات المنخفضة للقالب، كما يمنح تصميم البادئات المتعددة انتقائية تحد من النتائج الإيجابية الكاذبة12,13. وعند ربطها بمنصات شرائح الموائع الدقيقة، يمكن تنفيذ تقنية LAMP بشكل متوازٍ عبر أهداف متعددة من حمولة عينة واحدة14. وقد أظهرت أعمال سابقة أنظمة شرائح LAMP تكشف عن الممرضات التنفسية في وقت استجابة يقل بكثير عن ثلاث ساعات15. ومع ذلك، فإن القيد الرئيسي لهذه الأنظمة هو اعتمادها على استخلاص يدوي ومنفصل للحمض النووي، مما يزيد من الوقت والتعقيد التشغيلي وخطر التلوث.
يقضي النظام الموصوف هنا على تلك العقبة. حيث يعتمد النظام على شريحة مائعية دقيقة (microfluidic chip) قرصية الشكل تستخدم لمرة واحدة (بقطر 86 mm)، وهي تدمج عمليات تحميل العينة، وتنقية الأحماض النووية القائمة على الحبيبات المغناطيسية، وتضخيم LAMP متعدد (16-plex) في خرطوشة واحدة محكمة الإغلاق (الشكل 1). يقوم المشغل فقط بخطوة يدوية وجيزة للإسالة والتحلل باستخدام أنبوب معالجة مصمم لهذا الغرض، ثم يقوم بتحميل ناتج التحلل (lysate) وقارورتين من الكواشف على الشريحة (الشكل 2). ومن تلك النقطة فصاعداً، يتولى الجهاز عمليات الاستخلاص، والتضخيم المتساوي الحرارة عند 65 °C، واكتساب الفلورية بشكل ذاتي، مما يقدم نتائج نوعية لـ 15 هدفاً ذات صلة سريرياً، وهي 1 نوعاً من البكتيريا، و3 أنواع من الفطريات (Aspergillus spp.، وCandida albicans، وPneumocystis jirovecii)، وممرض غير نمطي واحد (Mycoplasma pneumoniae)، وذلك في غضون 45 min. ويُستخدم جين عائلة نقطة انكسار الورم الأرومي العصبي (NBPF) كضابط داخلي للتحقق من كفاية العينة وسلامة التفاعل في كل مقايسة. يوفر هذا البروتوكول تعليمات خطوة بخطوة لسير العمل الكامل، بدءاً من جمع العينات من وحدة العناية المركزة (ICU) مروراً بالمعالجة المسبقة، وتحميل الشريحة، والكشف الآلي، وتفسير النتائج، وهو موجه لكل من كوادر المختبرات السريرية وفرق العمل بجانب سرير المريض في وحدة العناية المركزة.
البروتوكول
جُمعت جميع العينات وفقاً لبروتوكول معتمد من لجنة مراجعة الأخلاقيات في مستشفى كلية بكين الطبية المتحدة التابعة للأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (رقم الموافقة I-24PJ178). وتم الحصول على موافقة كتابية مستنيرة من كل مشارك أو ممثله القانوني المفوض قبل جمع العينات. وتظهر قائمة مسببات الأمراض المستهدفة وتوزيعات آبار التفاعل في الجدول 1، بينما تظهر المواد الاستهلاكية المستخدمة أثناء المعالجة الأولية للعينات في الجدول 2.
1. جمع العينات السريرية من الجهاز التنفسي السفلي في وحدة العناية المركزة
- جمع البلغم
- مضمضة تجويف الفم بالماء النظيف أو بالمحلول الملحي الفسيولوجي المعقم ثلاث مرات لإزالة بقايا الطعام والنبيت الجرثومي الفموي المتعايش.
- توجيه المريض لأخذ نفسين إلى ثلاثة أنفاس عميقة، ثم السعال بقوة لطرد البلغم التنفسي العميق مباشرة في كوب جمع معقم.
ملاحظة: تكون العينة المقبولة من مادة لزجة أو قيحية أو مخططة بالدم من أسفل الرغامي؛ أما اللعاب الشفاف أو التنقيط الأنفي الخلفي فلا يعد كافياً وقد يؤثر سلباً على دقة الكشف لاحقاً.
- جمع نضحة القصبات (BAS)
- بالنسبة للمرضى غير الخاضعين للتنبيب، يتم إدخال قسطرة شفط معقمة (قسطرة 10–12 Fr، مع ضبط مصدر الشفط على ضغط −0.0267 MPa، وهو ما يعادل −20 mmHg) عبر الطريق الأنفي أو الفموي إلى عمق 30 cm تقريباً.
- يتم تطبيق الشفط مع تدوير القسطرة وسحبها ببطء. تُجمع الإفرازات المشفوطة في مصيدة عينات معقمة.
ملاحظة: إذا كانت الإفرازات شحيحة، يتم غرس حوالي 5 mL من المحلول الملحي المعقم عبر القسطرة قبل عملية الشفط. - بالنسبة للمرضى الذين يخضعون للتهوية الميكانيكية، يتم اختيار قسطرة الشفط وفقاً لحجم الأنبوب الرغامي: تُستخدم قسطرة 10 Fr للأنبوب بحجم 7.0–7.5 mm وقسطرة 12 Fr للأنبوب بحجم 8.0 mm.
- يتم إعطاء المريض أكسجين مسبق بنسبة 10% لمدة 30–60 s قبل الشفط. يتم فصل دائرة جهاز التنفس الصناعي وإدخال القسطرة المختارة عبر المجرى التنفسي الاصطناعي حتى يتم مواجهة مقاومة.
- يتم تطبيق ضغط سلبي قدره −0.0267 MPa (ما يعادل −20 mmHg)، مع تحديد كل عملية شفط، وبالتالي وقت فصل جهاز التنفس، بما لا يزيد عن 15 s لتقليل فقدان تهوية الحويصلات (derecruitment) ونقص أكسجة الدم، ثم إعادة أكسجة المريض بنسبة 100% لمدة 30–60 s بعد الشفط.
- يتم غرس 1–2 mL من المحلول الملحي المعقم عبر القسطرة والانتظار لمدة 3 s.
- يتم تطبيق الشفط وسحب القسطرة. تُجمع الإفرازات المشفوطة في مصيدة عينات معقمة. يتم إعادة توصيل دائرة جهاز التنفس الصناعي فوراً بعد جمع العينة.
ملاحظة: يعد الالتزام الصارم بتقنيات التعقيم أمراً ضرورياً طوال العملية لتجنب التلوث المكتسب في المستشفى للعينة.
- جمع سائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF)
- تحديد الجزء المستهدف عبر تصوير الصدر. يتم دفع المنظار القصبوي وتثبيته في الشعبة القصبية القطعية أو تحت القطعية المناسبة.
- يتم غرس كميات من 20–50 mL من المحلول الملحي المعقم بسرعة، لعدد 3–5 كميات (بإجمالي 60–120 mL). يُطبق شفط خفيف بعد كل كمية، ثم يُجمع السائل المسترجع في وعاء معقم ومحكم الغلق.
تنبيه: يعد الرصد المستمر للديناميكا الدموية والتهوية إلزامياً أثناء عملية غسيل القصبات والأسناخ (BAL) لمرضى وحدة العناية المركزة (ICU). يتم ضبط إعدادات جهاز التنفس الصناعي حسب الحاجة للحالات الخاضعة للتهوية الميكانيكية.
ملاحظة: يتراوح الاسترجاع النموذجي بين 40–60% من الحجم المغرس. قد يتطلب الاسترجاع الضعيف إعادة وضع طرف المنظار القصبوي.
2. الإسالة وتحلل الممرضات
- باستخدام الماصة disposable pipette رقم 2، اسحب العينة حتى الخط المحدد (حوالي 1 mL) ثم فرغها في أنبوب الإسالة. اضغط على بصلة الماصة بشكل متكرر لنقل جميع المواد اللزجة، ثم أغلق الأنبوب بالغطاء.
ملاحظة: بالنسبة لسائل غسيل القصبات والأسناخ (BALF) أو البلغم المائي، يتم تحميل حجمين من الماصة لضمان إدخال كمية كافية من الممرضات. - رج أنبوب الإسالة بقوة يدويًا لمدة 1 min. افحص العينة بصريًا واستمر في الرج حتى تختفي جميع تكتلات المخاط المرئية وتتدفق العينة بحرية عبر الماصة disposable pipette رقم 1 دون مقاومة (قوام متجانس يشبه الماء). استمر في الرج لمدة 1 min على الأقل، مع تمديد الوقت حسب الحاجة للعينات شديدة اللزوجة حتى تتحقق هذه المعايير.
- افتح غطاء الإغلاق الخاص بأنبوب التحلل.
- اسحب حوالي 0.5 mL من العينة المتجانسة باستخدام الماصة disposable pipette رقم 1 ثم فرغ العينة في أنبوب التحلل.
- أغلق غطاء الإغلاق وتأكد من إحكام ربط غطاء الطرف.
- ضع أنبوب التحلل في جهاز المعالجة المسبقة للعينة (SP device)، مع الضغط لأسفل حتى يستقر بإحكام. اضغط على Start.
- اترك جهاز SP device ليكمل دورة الإسالة والتحلل الآلية (المعاملات موضحة في Table 3) والتي تستغرق حوالي 15 min.
ملاحظة: لا تفتح الأنبوب أو تنزعه أثناء المعالجة.
3. تحميل الشريحة والكشف الآلي
- تحميل الكواشف والعينة
- أخرج شريحة الـ CD من التخزين في درجة حرارة 4 °C واتركها لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 25 °C) لمدة 10 min.
ملاحظة: تُستخدم قوارير الكواشف O و B والمحلل المسبق المعالجة في درجة حرارة الغرفة؛ بينما يتم إجراء تضخيم LAMP على الشريحة عند 65 °C (راجع الخطوة 3.2.3 والجدول 3). - افتح الكيس الرقائقي وضع الشريحة على سطح مستوٍ.
- أدر الغطاء عكس اتجاه عقارب الساعة لفتح الشريحة.
- هز القارورة O لتجميع السائل في قاع القارورة.
- افتح غطاء القارورة O، وأدخل الفوهة في المنفذ O، ثم فرغ المحتويات بالكامل في المنفذ.
- تخلص من القارورة O. كرر الإجراء باستخدام القارورة B والمنفذ B.
- أخرج أنبوب التحلل المعالج من جهاز SP وأزل غطاء الطرف.
- قم بمحاذاة طرف الأنبوب مع المنفذ S وفرغ حجم المحلل بالكامل في الشريحة.
- تخلص من أنبوب التحلل المستخدم.
- أدر غطاء الشريحة في اتجاه عقارب الساعة حتى تسمع طقتين تؤكدان الإغلاق التام.
ملاحظة: قد يؤدي التحميل غير المكتمل لأي منفذ إلى فشل القنوات الفردية. تأكد من التفريغ الكامل قبل الإغلاق. لتجنب الإغلاق غير المكتمل ومخاطر التلوث، لا ترتدِ قفازات PE عند إغلاق الغطاء؛ ويُنصح بدلاً من ذلك باستخدام قفازات اللاتكس أو النيتريل.
- أخرج شريحة الـ CD من التخزين في درجة حرارة 4 °C واتركها لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 25 °C) لمدة 10 min.
- تشغيل الجهاز
- قم بتشغيل محلل الحمض النووي الآلي. اضغط على Detect، وامسح الرمز الشريطي الموجود على الكيس الرقائقي للشريحة، وأدخل البيانات الديموغرافية للمريض ومعرف العينة.
- ثبت الشريحة على المغزل الدوار واضغط للأسفل حتى تؤكد طقة واحدة إتمام التثبيت.
- اضغط على Start. يقوم الجهاز بشكل ذاتي بتوزيع الكواشف بالطرد المركزي، واستخلاص الخرز المغناطيسي، وتضخيم LAMP عند 65 °C، والالتقاط الفلوري. تستغرق مدة التشغيل حوالي 45 min (يتم تلخيص عملية تحميل الكواشف/العينات وسير عمل الجهاز في الشكل 3).
ملاحظة: لا تفتح الغطاء أثناء التشغيل.
- تفسير النتائج
- يحدد البرنامج نقطة الانقلاب لكل منحنى تضخيم على شكل حرف S عن طريق تحليل الحد الأقصى للمشتقة الثانية، ويبلغ عن قيمة TP المقابلة (الوقت اللازم للإيجابية).
- قارن كل قيمة TP بالعتبة المقابلة المدرجة في الجدول 4. تُصنف القنوات التي تكون قيم TP فيها عند العتبة أو أقل منها كإيجابية، والقنوات التي تكون قيم TP فيها أعلى من العتبة كسلبية.
- تحقق من أن قناة التحكم الداخلية (البئر 16) تظهر منحنى تضخيم على شكل حرف S مع قيمة TP أقل من 12 min.
- ارفض نتيجة التشغيل في حال فشل التحكم الداخلي. كرر الاختبار باستخدام شريحة جديدة أو أعد جمع العينة.
النتائج
بعد اكتمال تشغيلة صالحة، عرض الجهاز منحنيات الفلورة في الزمن الحقيقي لجميع القنوات الـ 16. أظهرت القنوات الإيجابية ديناميكية التضخيم على شكل حرف S كما هو متوقع، مع قيم TP المحددة تلقائيًا، في حين بقيت القنوات السلبية عند مستوى القاعدة. أعطت قناة IC (الحفرة 16) منحنى على شكل حرف S مع قيمة TP < 12 دقيقة في جميع التشغيلات الصالحة.
كاختبار تجريبي أولي لإثبات مفهوم البروتوكول، تم اختيار 10 عينات تمثيلية لتوضيح نطاق السيناريوهات السريرية التي تُصادف في ممارسة وحدة العناية المركزة، بما في ذلك 6 عينات من البلغم القصبي (BAS)، وعينتان من سائل غسل القصبات الرئوية (BALF)، وعينتان من البلغم العميق (Spt). وقد تم اختيار هذه العينات عمداً لتغطية حالات أحادية الميكروبات وحالات متعددة الميكروبات المعقدة، وليس لتقدير انتشار مسببات الأمراض؛ حيث كانت 8 من أصل 10 عينات متعددة الميكروبات (بمعدل 2 إلى 7 أهداف لكل عينة)، واثنتان منها أحاديتا الميكروبات. ترد بيانات الإيجابية الحقيقية الكاملة في الجدول 5، وتُعرض منحنيات التضخيم التمثيلية في الشكل 4.
في أحد طرفي طيف التعقيد، أنتج العينة S1 (BAS) إشارة إيجابية واحدة لـ Aspergillus spp. (TP = 8 دقيقة)، في حين ظلت جميع القنوات البكتيرية سلبية. كان هذا النمط متسقًا مع داء الفطريات العارضة المعزولة، وهو تشخيص يفشل التحليل التقليدي في الكشف عنه بسرعة. وبالمثل، أظهرت العينة S10 (Spt) نتيجة إيجابية واحدة لـ Streptococcus pneumoniae (TP = 5.5 دقيقة). وقد أظهرت هذه النتائج قدرة الفحص على تحديد العدوى الأحادية الميكروبية في ظل خلفية تضم 15 هدفًا ممرضًا.
تم ملاحظة عدوى متعددة الميكروبات في العينات المتبقية، بما يتماشى مع علم الأوبئة للعدوى التنفسية لدى مرضى وحدة العناية المركزة. احتوت كل من العينات S2–S5 على أنواع من Aspergillus مع ممرض بكتيري واحد أو أكثر، وفي عينتين، مع Candida albicans. أنتجت العينة الأكثر تعقيدًا، S5 (سائل الحنجرة والقصبة الهوائية)، سبعة إشارات إيجابية متزامنة، تضمنت أنواع Aspergillus، وBurkholderia cepacia، وCorynebacterium striatum، وEscherichia coli، وPseudomonas aeruginosa، وStaphylococcus aureus، وStenotrophomonas maltophilia. أظهرت هذه النتائج قدرة شريحة الميكروفلوديك المكونة من 16 بئرًا على الكشف المتعدد في ظروف الاختبار السريري.
تراوحت العينات S6–S9، التي احتوت على عدوى بكتيرية مشتركة دون تورط فطري، من الكشف عن ممرضين معًا (S6: B. cepacia وE. coli) إلى الكشف عن أربعة ممرضات (S8: Acinetobacter baumannii، B. cepacia، Klebsiella pneumoniae، وS. maltophilia). وفي جميع العينات العشر، تراوحت قيم TP للقنوات الإيجابية بين 3.5–9 دقيقة، وحققت جميع قنوات التحكم الداخلية معيار الصلاحية المحدد مسبقًا وهو TP < 12 دقيقة.
تم في هذه المجموعة التجريبية مقارنة نتائج الشريحة مع طريقتين مرجعيتين نُفّذتا بالتوازي على نفس العينات العشر: تسلسل الجيل التالي المستهدف الميتاجينومي (tNGS) والزراعة التقليدية للبلغم. ويُلخّص الجدول 6 اتفاق كل هدف على حدة بالنسبة لقنوات العوامل الممرضة الخمسة عشر. بالمقارنة مع tNGS، أظهرت الفحص اتفاقًا موجبًا بنسبة 100% (PPA) واتفاقًا سالبًا بنسبة 100% (NPA) عبر جميع الأهداف في هذه العينات. وبالنسبة للزراعة من البلغم، كان الاتفاق الموجب 100% لكل هدف أظهرت الزراعة إيجابيته، في حين تراوح الاتفاق السالب بين 44.4% و100%؛ وتعكس القيم المنخفضة للاتفاق السالب الأهداف التي كشفتها الشريحة (وأيضًا tNGS) ولكن لم تُكتشف بواسطة الزراعة، وهو ما يتماشى مع الحساسية التحليلية الأعلى لتكبير الحمض النووي مقارنةً بالزراعة، وليس مع وجود نتائج إيجابية كاذبة. وبما أن العينة صغيرة ومختارة بشكل متعمد، فإن هذه النتائج تمثل تقديرات وصفية لدرجة الاتفاق ضمن هذه المجموعة التجريبية، ولا تهدف إلى أن تكون مقاييس رسمية لدقة التشخيص. وبما أن tNGS نفسه طريقة تعتمد على الحمض النووي، فإن الاتفاق معه يؤكد التوافق على مستوى الحمض النووي، وليس تحديد الحالة السريرية لكل كائن حي؛ ولا تُميّز أي من الطريقتين، بحد ذاتها، بين العدوى الحقيقية والاستعمار.
الشكل 1: هيكل شريحة الميكروفلويديك والمستهلكات المرتبطة بها. (أ) نظرة عامة على شريحة القرص بقطر 86 مم، تُظهر ثلاث مناطق متداخلة: منطقة تحميل، ومنطقة وسطى لتنقية الحبيبات المغناطيسية، ومنطقة خارجية للتكبير والكشف. (ب) الحلقة الخارجية للتكبير التي تحتوي على 16 بئر تفاعل (تم تحديد المواقع 1، 4، 8، 12، و16). (ج) مكونات أنبوب التحلل (غطاء الطرف، غطاء الإغلاق، وجسم الأنبوب). (د) قوارير الكواشف ذات الجرعة الفردية "O" و"B". (هـ) منطقة التحميل تُظهر البئر "S" للعينة والبئر "O" و"B" للكواشف. الاختصارات: O = الكاشف O؛ B = الكاشف B؛ S = العينة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مجموعة المعالجة المسبقة وتدفق عمل المعالجة المسبقة للعينة. (أ) تُنقل العينة إلى أنبوب السيولة وتُخلط يدويًا بالهز. (ب) تُنقل العينة المتجانسة من أنبوب السيولة إلى أنبوب التحلل. (ج) يُوضع أنبوب التحلل في جهاز المعالجة المسبقة للعينة (SP) لدورة السيولة-التحليل الآلية. (د) مستهلكات المعالجة المسبقة: الماصات المتقطعة رقم 1 و2 (تشير الأسهم الحمراء إلى علامات تحميل العينة)، وأنبوب التحلل، وأنبوب السيولة. الاختصار: SP = المعالجة المسبقة للعينة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: تحميل الشريحة وسير عمل الكشف الآلي. (أ) يتم تحميل قارورة الكاشف O، وقارورة الكاشف B، والعينة المعالجة في المنافذ المقابلة للشريحة (O، B، وS). (ب) يتم تجميع الشريحة وإغلاقها بإحكام. (ج) يتم تركيب الشريحة على جهاز تحليل الأحماض النووية الآلي، ومسح الباركود. (د) يتم بدء التشغيلة من شاشة اللمس، وبعد ذلك تتم عملية استخلاص الحمض النووي، وتضخيمه، وكشف الفلورة تلقائيًا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: منحنيات التضخيم النموذجية التي تم الحصول عليها من 10 عينات من الجهاز التنفسي السفلي جُمعت من مرضى العناية المركزة. يمثل كل لوحة عينة واحدة (S1–S10). تشير منحنيات التضخيم على شكل حرف S إلى الأهداف الإيجابية مع قيم TP الموضحة، في حين تشير المنحنيات المسطحة إلى الأهداف السلبية. تحتوي العينة S1 فقط على Aspergillus spp.؛ وتحتوي العينات S2–S5 على Aspergillus spp. مع مسببات أمراض بكتيرية و/أو Candida albicans؛ وتحتوي العينات S6–S9 على عدوى بكتيرية متعددة الميكروبات؛ بينما تحتوي العينة S10 فقط على Streptococcus pneumoniae. ترد قيم TP المقابلة في الجدول 5. الاختصارات: Aba = Acinetobacter baumannii; Asp = Aspergillus spp.; Bcc = Burkholderia cepacia; Cal = Candida albicans; Cst = Corynebacterium striatum; Eco = Escherichia coli; Hin = Haemophilus influenzae; IC = المراقب الداخلي; Kpn = Klebsiella pneumoniae; Lpn = Legionella pneumophila; Mpn = Mycoplasma pneumoniae; Pae = Pseudomonas aeruginosa; Pji = Pneumocystis jirovecii; Sau = Staphylococcus aureus; Sma = Stenotrophomonas maltophilia; Spn = Streptococcus pneumoniae. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| البئر | الهدف | الاختصار | الفئة | النوع |
| 1 | Acinetobacter baumannii | Aba | بكتيريا | بكتيريا |
| 2 | Aspergillus spp. | Asp | فطريات | فطر |
| 3 | Burkholderia cepacia | Bcc | بكتيريا | بكتيريا |
| 4 | Candida albicans | Cal | فطريات | فطر |
| 5 | Corynebacterium striatum | Cst | بكتيريا | بكتيريا |
| 6 | Escherichia coli | Eco | بكتيريا | بكتيريا |
| 7 | Haemophilus influenzae | Hin | بكتيريا | بكتيريا |
| 8 | Klebsiella pneumoniae | Kpn | بكتيريا | بكتيريا |
| 9 | Legionella pneumophila | Lpn | بكتيريا | بكتيريا |
| 10 | Mycoplasma pneumoniae | Mpn | غير نمطي | بكتيريا غير نمطية |
| 11 | Pseudomonas aeruginosa | Pae | بكتيريا | بكتيريا |
| 12 | Pneumocystis jirovecii | Pji | فطريات | فطر |
| 13 | Staphylococcus aureus | Sau | بكتيريا | بكتيريا |
| 14 | Stenotrophomonas maltophilia | Sma | بكتيريا | بكتيريا |
| 15 | Streptococcus pneumoniae | Spn | بكتيريا | بكتيريا |
| 16 | NBPF (internal control) | IC | مصدر تحكم داخلي | مصدر تحكم داخلي |
الجدول 1: قائمة الكائنات الممرضة المستهدفة وتخصيصات الآبار للتفاعل.
| قابل للاستهلاك | المواصفات / الحجم | وظيفة |
| أنبوب السيولة | 2 مل/أنبوب | استلام العينة؛ التماثل اليدوي |
| أنبوب التحلل | 0.5 مل/أنبوب | جسم سيليكون قابل للانضغاط مع 200 µm غشاء تصفية؛ كواشف تحلل مسبقة التحميل |
| الماصة المتخلصة رقم 1 | 0.5 ملليمتر | ينقل العينة المُموهَة إلى أنبوب التحلل |
| الماصة المتخلص منها #2 | 2 ملليمتر مكعب | امتصاص العينة إلى الخط المحدد في الأنبوب المخصص للإذابة |
الجدول 2: مواصفات المواد الاستهلاكية المستخدمة أثناء المعالجة الأولية للعينة.
| الخطوة | درجة الحرارة | المدة |
| التحلل | 50 °C | 10 min |
| تحطيم مسببات الأمراض | 95 °C | 5 min |
| الدورة الكاملة | — | ~15 min |
الجدول 3: المعلمات التشغيلية لدورة جهاز المعالجة المسبقة للعينة (SP).
| الهدف | الحد الأدنى لعمر التضخيم (TP) (دقيقة) | قاعدة التصنيف |
| Acinetobacter baumannii | 13 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Aspergillus spp. | 15.5 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Burkholderia cepacia | 12.5 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Candida albicans | 13.5 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Corynebacterium striatum | 13 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Escherichia coli | 12 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Haemophilus influenzae | 13.5 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Klebsiella pneumoniae | 15.5 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Legionella pneumophila | 14.5 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Mycoplasma pneumoniae | 14 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Pseudomonas aeruginosa | 12 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Pneumocystis jirovecii | 14.5 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Staphylococcus aureus | 15.5 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Stenotrophomonas maltophilia | 12 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| Streptococcus pneumoniae | 14.5 | TP ≤ الحد = إيجابي |
| NBPF (التحكم الداخلي) | 12 | تعتبر التجربة صالحة إذا كان TP < 12 دقيقة |
الجدول 4: قيم العتبة TP المستخدمة لتصنيف الهدف.
| عينة | نوع | الهدف المُكتَشف | نقطة الغليان (دقيقة) | الزراعة / تي.إن.جي.إس (قراءات) |
| S1 | باص | أسبرجيلس سب. | 8 | + / 1,253 |
| إس 2 | بَس | أسبرجيلس سب. | 7.5 | – / 3,877 |
| بكتيريا الزوائف الزرقاء | 4 | + / 55,039 | ||
| ستينوتروفوموناس مالتوفيليا | 6.5 | – / 3,087 | ||
| S3 | باص | أسبرجيللس spp. | 5.5 | + / 6,145 |
| بركهولديرا سيباسيا | 6 | – / 3,221 | ||
| كانديدا ألبيكانس | 7.5 | – / 3,280 | ||
| ستينوتروفوموناس مالتوفيليا | 6 | + / 13,189 | ||
| S4 | سائل الحنجرة والقصبة الهوائية | أسينيتوباكتر باومانِيّ | 6.5 | + / 10,485 |
| أسبرجيلس سب. | 7.5 | – / 4,432 | ||
| بركهولديا سباثيا | 5.5 | – / 1,676 | ||
| كانديدا ألبِكانس | 8.5 | – / 576 | ||
| S5 | سائل الحنجرة والقصبة الهوائية | أسبرجيللس spp. | 7.5 | + / 2,869 |
| بركهولديا سباثيا | 4 | – / 6,532 | ||
| كورينيباكترียม ستراتيوم | 5.5 | – / 71,839 | ||
| إيشيريشيا كولاي | 7 | – / 1,891 | ||
| الزائفة الزنجارية | 4 | + / 31,386 | ||
| ستافيلوكوكوس أوريوس | 6.5 | – / 26,683 | ||
| ستينوتروفوموناس مالتوفيليا | 4 | + / 21,467 | ||
| س6 | باص | بركهولديرا سيباسيا | 5.5 | – / 1,984 |
| إيشيريشيا كولاي | 5.5 | + / 8,005 | ||
| S7 | باص | أسينيتوباكتر بومانى | 5.5 | + / 28,007 |
| بركهولديا سباثيا | 4 | + / 3,585 | ||
| النوعية المستدمية (هيموفيلوس إنفلونزا) | 6.5 | – / 8,912 | ||
| ستينوتروفوموناس مالتوفيليا | 6 | – / 8,865 | ||
| S8 | باص | أسينيتوباكتر بومانِيّ | 5.5 | – / 43,721 |
| بركهولديرا سيباسيا | 4 | – / 53,796 | ||
| كليبسيلا نيمونياي | 3.5 | + / 23,757 | ||
| ستينوتروفوموناس مالتوفيليا | 4 | – / 26,898 | ||
| S9 | Spt | هيموفيلوس أنفلونزا | 9 | – / 3,636 |
| ستافيلوكوكوس أوريوس | 8.5 | + / 1,918 | ||
| ستينوتروفوموناس مالتوفيليا | 8.5 | – / 872 | ||
| S10 | Spt | Streptococcus pneumoniae | 5.5 | – / 29,893 |
الجدول 5: نتائج الكشف والقيم الإيجابية الحقيقية لـ 10 عينات تمثيلية من الجهاز التنفسي السفلي جُمعت من مرضى وحدة العناية المركزة.
| الهدف | tNGS + | نقطة الرعاية + | tNGS − | نقطة الرعاية للتحليل (POCT) − | PPA | ن.ب.أ | (خ) ب.ف.أ./ن.ف.أ. |
| أسينيتوباكتر باومانِيّ | 3 | 3 | 7 | 7 | 100% | 100% | 100% / 87.5% |
| أسبرجيلس spp. | 5 | 5 | 5 | 5 | 100% | 100% | 100% / 71.4% |
| بركهولديا سباثيا | 6 | 6 | 4 | 4 | 100% | 100% | 100% / 44.4% |
| كانديدا ألبِكانس | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | – / 80.0% |
| كوريني بكتيريوم ستراتيوم | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| إيشيريشيا كولاي | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 88.9% |
| العدوى النزلية المستدمية | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | – / 80.0% |
| كليبسيلا نيمونياي | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| ليجيونيلا بنيوموفيليا | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| ميكوبلازما النيومونياي | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| بكتيريا الزوائف الزنجارية | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 100% |
| بلاسما الرئة جيروفيتشيي | 0 | 0 | 10 | 10 | – | 100% | – / 100% |
| ستافيلوكوكوس أوريوس | 2 | 2 | 8 | 8 | 100% | 100% | 100% / 88.9% |
| ستينوتروفوموناس مالتوفيليا | 6 | 6 | 4 | 4 | 100% | 100% | 100% / 50.0% |
| Streptococcus pneumoniae | 1 | 1 | 9 | 9 | 100% | 100% | – / 90.0% |
الجدول 6: التوافق حسب المستهدف للتحليل مقارنة بالتخليق الجيل التالي المستهدف للبيوم الجيني (tNGS) والزراعة التقليدية للبلغم لـ 10 عينات تمثيلية. بالنسبة لكل واحد من الـ 15 مستهدفاً ممرضًا، يُعرض عدد النتائج الإيجابية والسلبية وفق كل طريقة، بالإضافة إلى نسبة التوافق المئوية الموجبة (PPA) ونسبة التوافق المئوية السالبة (NPA). الاختصارات: PPA = نسبة التوافق المئوية الموجبة؛ NPA = نسبة التوافق المئوية السالبة؛ tNGS = التخليق الجيل التالي المستهدف للبيوم الجيني؛ تُعرض PPA/NPA كـ "/" في الحالات التي لا تتوفر فيها نتائج مرجعية إيجابية (أو سالبة).
| رقم | ممرض | حد الكشف (نسخ/مل) |
| 1 | أسينيتوباكتر باومانِيّ | 1,000 |
| 2 | أسبرجيلس سب. | 2,000 |
| 3 | بركهولديرا سيباسيا | 2,000 |
| 4 | كانديدا ألبِكانس | 1,000 |
| 5 | كوريني بكتيريوم ستراتيوم | 1,000 |
| 6 | إيشيريشيا كولاي | 4,000 |
| 7 | هيموفيلوس أنفلونزا | 2,000 |
| 8 | كليبسيلا نيمونياي | 4,000 |
| 9 | ليجيونيلا بنيوموفيليا | 2,000 |
| 10 | ميكوبلازما ذاتية التكاثر | 1,000 |
| 11 | بسيودوموناس الزئبقية | 2,000 |
| 12 | بكتيريا البنيوموسيستيس جيروفيتشي | 1,000 |
| 13 | ستافيلوكوكوس أوريوس | 2,000 |
| 14 | ستينوتروفوموناس مالتوفيليا | 2,000 |
| 15 | المكورات العقدية الرئوية | 4,000 |
| 16 | التحكم الداخلي (NBPF) | غير معمول (ضابط داخلي) |
الجدول 7: الحد التحليلي للكشف (LoD) لكل هدف من الأهداف في اللوحة. تم تحديد الحد الأدنى للكشف من خلال إضافة حمض نووي جينومي كميّن باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي إلى مصفوفة سائل من غسول القصبات الهوائية الحويصلية سالبة، ثم تخفيفه متسلسلاً واختباره بثلاثة نسخ، وعُرّف بأنه أدنى تركيز تم الكشف عنه في 95% على الأقل من النسخ. تعبر القيم بوحدة النسخ/مل. الاختصار: LoD = حد الكشف.
| البعد | الاختبار السريري الميداني (هذا الفحص) | زراعة البلغم | تفاعل البلمرة المتسلسل التقليدي | mNGS |
| مدة الإنجاز | ~1 h | 2–5 days | 4–8 h | > 24 h |
| المهارة المطلوبة من المشغل | منخفضة | عالية | عالية | عالية |
| متطلبات المختبر | منخفضة؛ عند سرير المريض | عالية؛ مختبر البكتيريا | عالية؛ مختبر تفاعل البلمرة المتسلسل | عالية؛ منشأة متخصصة |
| استثمار المعدات | منخفض إلى معتدل | منخفض | معتدل | عالي |
| تكلفة كل اختبار | معتدلة | منخفضة | معتدلة | عالي |
| الحساسية التحليلية | عالية | منخفضة | عالية | عالية |
| الميزة الرئيسية | متكامل بالكامل، عينة-داخل/نتيجة-خارج، لا يتطلب تشغيلًا متخصصًا | المعيار المرجعي؛ يوفر المعلومات حول الحساسية | حساسية عالية؛ كمي | غير متحيز؛ يكشف عن مسببات الأمراض النادرة أو غير المتوقعة؛ يحل الحالات الصعبة |
الجدول 8: المقارنة النوعية بين فحص نقطة الرعاية الحالي وزراعة البلغم وتفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي والتسلسل الشامل الجيني. يتم مقارنة الطرق من حيث زمن الإنجاز، ومستوى المهارة المطلوبة من المشغل، ومتطلبات البنية التحتية المخبرية، واستثمار المعدات، وتكلفة كل فحص، والحساسية التحليلية، والمزايا الأساسية. الاختصارات: POCT = اختبارات نقطة الرعاية؛ PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل؛ mNGS = التسلسل الشامل الجيني من الجيل التالي.
المناقشة
يُعد التعرف السريع على المسببات المرضية أمراً بالغ الأهمية في إدارة العدوى داخل وحدة العناية المركزة (ICU). يقلل النظام الموصوف هنا الوقت اللازم للتعرف على المسبب المرضي من 3 إلى 5 أيام، وهي المدة المطلوبة عادةً للمزرعة، إلى أقل من ساعة واحدة، وهو الإطار الزمني الذي تُتخذ خلاله غالباً قرارات استخدام مضادات الميكروبات كخط علاج أول7. ومن خلال دمج عمليات استخلاص الحمض النووي وتنقيته وتضخيمه باستخدام تقنية LAMP بـ 16 تفاعلاً متعدداً (16-plex) داخل شريحة واحدة محكمة الإغلاق، يلغي مسار العمل هذا خطوة استخلاص الحمض النووي (DNA) يدوياً، والتي كانت تشكل العائق التشغيلي الرئيسي في منصات شرائح LAMP السابقة15. والنتيجة هي إجراء تحميل واحد يمكن القيام به من قبل موظفين لا يملكون تدريباً متخصصاً في البيولوجيا الجزيئية.
تستوجب عدة جوانب إجرائية اهتماماً خاصاً؛ حيث تعد جودة العينة أمراً أساسياً. وتُفضل عينات الجهاز التنفسي العميقة، مثل الشفط القصبي أو سائل غسيل القصبات والأسناخ، على البلغم المطرود لدى المرضى الذين يخضعون للتنفس الاصطناعي، والذين قد يؤدي التلوث الفموي البلعومي لديهم إلى حجب الإشارة الحقيقية للعامل الممرض. ويعد التسييل غير المكتمل السبب الأكثر شيوعاً للتحلل غير المثالي، لذا يجب الاستمرار في الرج اليدوي حتى تصل العينة بوضوح إلى قوام مائي. أما أثناء تحميل الشريحة، فإن التفريغ غير المكتمل سواء لعبوة الكاشف أو لأنبوب التحلل قد يحرم الآبار اللاحقة من المواد المدخلة المطلوبة، مما يؤدي إلى إخفاقات محددة في القنوات قد يتم تفسيرها بشكل خاطئ على أنها نتائج سلبية. بالإضافة إلى ذلك، فإن إغلاق غطاء الشريحة بنقرتين ليس مجرد ميزة ميكانيكية، بل هو أمر ضروري للحفاظ على الفراغ العلوي المحكم المطلوب للتضخيم متساوي الحرارة ومنع الفقد الناتج عن التبخر.
تعد عملية استكشاف الأخطاء وإصلاحها مباشرة نسبيًا. فقد يتطلب البلغم عالي اللزوجة من وحدة العناية المركزة رجًا يدويًا لمدة أطول من الدقيقة 1 الموصى بها. أما العينات المخففة، وخاصة سائل غسيل القصبات والأسناخ الرئوية، فقد تتطلب تحميل ضعف حجم الماصة القياسي للتعويض عن انخفاض كثافة المسببات المرضية. ويشير فشل التحكم الداخلي، والذي يُعرَّف بغياب منحنى التضخيم الذي يتخذ شكل حرف S أو قيمة TP أكبر من 12 min، إما إلى عدم كفاية الخلايا في العينة أو وجود خلل في تدفق السوائل داخل الشريحة. وفي مثل هذه الحالات، يكون الإجراء المناسب هو جمع عينة جديدة أو تكرار الاختبار باستخدام شريحة جديدة، بدلاً من إعادة تفسير القنوات الفردية.
توجد أيضاً قيود مهمة على هذه الطريقة؛ إذ تقتصر اللوحة على 15 هدفاً محدداً مسبقاً، ولا يمكن الكشف عن الكائنات التي تقع خارج هذه القائمة، بما في ذلك العديد من محددات المقاومة للمضادات الميكروبية. وتستهدف كل مجموعة من البادئات منطقة محفوظة وخاصة بنوع معين من الكائنات المستهدفة، باستثناء اختبار جنس Aspergillus؛ وبناءً على ذلك، لا يتم الكشف عن الأنواع أو السلالات غير الممثلة في اللوحة، كما أن اللوحة لا ترصد التباين على مستوى السلالات داخل النوع الواحد. ونظراً لأن كل بئر من الآبار الستة عشر يحتوي على مجموعة بادئات مجففة بالتجميد مخصصة، فإن اللوحة تعتبر وحداتية ويمكن إعادة تكوينها في الإصدارات المستقبلية لإضافة أهداف أخرى.
تعتبر مخرجات المقايسة نوعية. وعلى الرغم من أن قيم TP قد تظهر علاقة فضفاضة مع العبء الممرض، إلا أنها لا يمكن أن تحل محل نتائج المزارع الكمية أو التقديرات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) المستمدة من قيم عتبة الدورة. وكما هو الحال مع أي اختبار تضخيم للحمض النووي يتم إجراؤه على عينات الجهاز التنفسي، لا يمكن للمقايسة التمييز بين الاستعمار والعدوى الحقيقية بمفردها. لذا، يجب أن يدمج التفسير السريري نتائج الرقاقة مع المؤشرات الالتهابية مثل البروتين التفاعلي C والبروكالسيتونين، ونتائج التصوير، والمؤشرات الحيوية الفطرية بما في ذلك الجالاكتومانان و(1,3)-β-D-glucan، والمسار السريري العام. بالإضافة إلى ذلك، لا يوفر النظام بيانات حول الحساسية لمضادات الميكروبات، وتظل المزارع التقليدية لا غنى عنها لهذا الغرض.
وأخيراً، تم الحصول على جميع العينات المشمولة في هذه الدراسة من وحدة عناية مركزة ثالثية واحدة، وقد تختلف معدلات انتشار المسببات المرضية وأنماط العدوى المشتركة باختلاف المؤسسات ومجموعات المرضى. لذا، ينبغي اعتبار العمل الحالي بمثابة دراسة استطلاعية لإثبات المبدأ للبروتوكول على مجموعة صغيرة ومختارة بعناية من العينات التمثيلية؛ حيث لم يتم تصميمه لتقدير الدقة التشخيصية. وسيتم تحديد الحساسية والنوعية السريرية لكل هدف، بالإضافة إلى التوافق المنهجي مع المزارع التقليدية وتسلسل الجيل التالي الميتاجينومي (mNGS)، في دراسة مستقبلية مخططة تشمل مراكز متعددة ومشاركين يتم تسجيلهم بالتتابع.
كإجراء أولي لقياس الأداء التحليلي، تم تقدير حد الكشف (LoD) لكل هدف باستخدام حمض نووي جينومي تم قياس كميته بواسطة تقنية digital-PCR وتم تطعيمه في مصفوفة سائلة من غسيل القصبات والأسناخ سلبية النتيجة. تم تخفيف العينات تسلسلياً واختبارها في ثلاث مكررات. وعُرّف حد الكشف (LoD) بأنه أدنى تركيز تم اكتشافه في 95% على الأقل من المكررات. وتراوحت قيم حد الكشف (LoD) الناتجة من 1,0 إلى 4,0 copies/mL عبر اللوحة (الجدول 7). ونظراً لأن التحديد الكمي لكل كائن حي بناءً على عدد المستعمرات لم يكن متاحاً في هذه الدراسة الاستطلاعية، فسيتم تنقيح تقديرات حد الكشف (LoD) هذه باستخدام سلالات مرجعية معدودة رسمياً في الأعمال المستقبلية.
يوضح المقارنة مع النهج التشخيصية الحالية مكانة هذه المنصة بشكل أكبر. تظل المزارع التقليدية، رغم بطئها، هي المعيار المرجعي وتوفر معلومات عن الحساسية. يوفر تسلسل الجيل القادم الميتاجينومي تغطية أوسع بكثير للكائنات الحية، ولكن بتكلفة أعلى بكثير، وفترات زمنية أطول لإتمام الفحص (عادةً 24–48 h)، مع متطلبات في المعلوماتية الحيوية لا تستطيع العديد من وحدات العناية المركزة دعمها في الموقع9. تعمل لوحات PCR القياسية متعددة الإرسال على تقصير الوقت اللازم للوصول إلى النتيجة، ولكنها لا تزال تتطلب بشكل عام استخلاصاً منفصلاً للأحماض النووية، واعتماداً على المنصة، معالجة على شكل دفعات يمكن أن تتسبب في تأخير إضافي10.
من منظور التكلفة، وعلى الرغم من أن تحليل فعالية التكلفة الرسمي كان خارج نطاق هذه الدراسة التجريبية، إلا أن المنصة تعالج محركات التكلفة الرئيسية في العالم الحقيقي داخل وحدة العناية المركزة (ICU)، بما في ذلك كل من المزرعة و PCR التقليدي أو المتعدد (ويوجد مقارنة نوعية بين الطرق في الجدول 8). فهي تعطي النتائج في غضون ساعة 1 تقريباً، مقارنة بـ 2-5 أيام لمزرعة البلغم، و 4-8 ساعات لـ PCR التقليدي (الذي يتطلب عادةً معالجة دفعية)، و >24 ساعة للتسلسل الميتاجينومي. ونظراً لأن سير العمل متكامل تماماً (من العينة إلى النتيجة)، فإنه يتطلب خطوة تحميل يدوية واحدة فقط دون استخلاص منفصل للأحماض النووية، ويمكن إجراؤه بجانب سرير المريض دون الحاجة إلى مختبر بكتيريا أو مختبر جزيئي متخصص أو طاقم متخصص في البيولوجيا الجزيئية، كما يستخدم خرطوشة مغلقة أحادية الاستخدام تقلل من إعادة الاختبار المرتبطة بالتلوث. كما أن تكاليف المعدات متواضعة أيضاً، مما يغني عن الحاجة إلى جهاز PCR كمي في الوقت الحقيقي أو منصة تسلسل. وبالنسبة للمرضى الذين يعانون من حالات حرجة في وحدة العناية المركزة (ICU)، فإن هذا الدوران السريع للنتائج قد يقصر مدة العلاج التجريبي غير المناسب ويقلل من فترة الإقامة في المستشفى، مما يوفر فائدة مالية غير مباشرة ولكنها قد تكون جوهرية.
يشغل النظام الحالي مكانة متميزة تحددها سرعة الإنجاز، والبساطة التشغيلية، والسلامة الحيوية بفضل الخراطيش المغلقة، وهي خصائص تجعل من تنفيذ الفحص بجانب سرير المريض أمراً ممكناً. ويعد إدراج ثلاثة أهداف فطرية ميزة مهمة بشكل خاص؛ حيث تم الكشف عن أنواع Aspergillus في 5 من أصل 10 عينات (نطاق TP: 5.5–8 min). ونظراً للقيود المعروفة للمزارع المخبرية والنافذة التشخيصية المحدودة لاختبار الجالاكتومانان للكشف عن Aspergillus5,6، فإن توفر إشارة جزيئية خلال 45 min قد يسمح بالنظر المبكر في العلاج المستهدف بمضادات الفطريات، على الرغم من أن القيمة السريرية لهذه الإشارة المبكرة ستحتاج إلى إثباتها في دراسات مستقبلية.
هناك عدة توجهات مستقبلية واضحة؛ إذ إن توسيع اللوحة لتشمل محددات المقاومة الرئيسية، وبحد أدنى جينات الكاربابينيميز (carbapenemase) وmecA، من شأنه أن يساعد في سد الفجوة بين تحديد الممرض والاختيار التجريبي لمضادات الميكروبات. بالإضافة إلى ذلك، ومع نمو مجموعات بيانات TP، قد تساعد نماذج التعلم الآلي المدربة على ملفات التضخيم المقترنة والبيانات السريرية الوصفية في النهاية في التمييز بين الاستعمار والعدوى الحقيقية، على الرغم من أن مثل هذه التطبيقات ستتطلب تحققاً استشرافياً دقيقاً. وبشكل أوسع، سيكون التقييم متعدد المراكز عبر مجموعات متنوعة جغرافياً من مرضى وحدات العناية المركزة (ICU) ضرورياً قبل اعتبار الأداء التشخيصي لهذه المنصة قابلاً للتعميم.
الإفصاحات
يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
المشروع الوطني الرئيسي للعلوم والتكنولوجيا للأمراض المزمنة غير المعدية (رقم 2023ZD051650)، وتمويل البحوث السريرية في المستشفيات ذات المستوى العالي الوطني (2026-PUMCH-A-103)، وبرنامج المنافسة المفتوحة لـ CMB (24-561)، وبرنامج تنمية المواهب في مستشفى كلية بكين الطبية المتحدة (رقم UGG1571).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| محلل أحماض نووية آلي | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-T80-01 | TurboFlow T؛ يقوم بتوزيع الكواشف عن طريق الطرد المركزي، والاستخلاص بالخرز المغناطيسي، وتفاعل LAMP عند 65 °C، والكشف عن الفلورة في الوقت الحقيقي (زمن التشغيل ~45 min) |
| ماصة باستور رقم #1 تستخدم لمرة واحدة | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | مستهلك يستخدم لمرة واحدة؛ 0.5 mL؛ لنقل العينة المتجانسة إلى أنبوب التحلل |
| ماصة باستور رقم #2 تستخدم لمرة واحدة | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | مستهلك يستخدم لمرة واحدة؛ 2 mL; لسحب العينة حتى الخط المحدد إلى أنبوب الإسالة |
| قرص CD | Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd | Custom-made | مستهلك يستخدم لمرة واحدة؛ قرص بقطر 86 mm يحتوي على منطقة تحميل مركزية (المنافذ O وB وS)، ومنطقة تنقية بالخرز المغناطيسي، وحلقة خارجية بها 16 بئراً للتفاعل (15 هدفاً لمسببات الأمراض + ضابط داخلي NBPF) |
| كواشف تفاعل LAMP | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 16730ES80 | كواشف تفاعل LAMP مخزنة مسبقاً في قرص CD على شكل خرز مجف بالتجميد |
| أنبوب إسالة | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | مستهلك يستخدم لمرة واحدة؛ 2 mL/tube؛ يستقبل العينة من أجل التجانس اليدوي |
| أنبوب تحلل | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | مستهلك يستخدم لمرة واحدة؛ 0.5 mL/tube؛ جسم من السيليكون قابل للضغط مع غشاء ترشيح 20 µm؛ يحتوي مسبقاً على كواشف التحلل |
| بادئات | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | Custom-made | خليط بادئات مدمج في غرفة تفاعل قرص CD |
| جهاز المعالجة المسبقة للعينات | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-R10-02 | TS-20؛ دورة آلية من الإسالة–التحلل (زمن التشغيل ~15 min) |
| قارورة جرعة واحدة “B” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | مستهلك يستخدم لمرة واحدة؛ كاشف معبأ مسبقاً على الشريحة؛ قارورة واحدة لكل اختبار؛ تُخزن عند 4 °C وتُترك لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (~25 °C) قبل التحميل |
| قارورة جرعة واحدة “O” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | مستهلك يستخدم لمرة واحدة؛ كاشف معبأ مسبقاً على الشريحة؛ قارورة واحدة لكل اختبار؛ تُخزن عند 4 °C وتُترك لتصل إلى درجة حرارة الغرفة (~25 °C) قبل التحميل |
المراجع
- GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect Dis. 2018;18(11):1191-1210.
- Niederman MS, Torres A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220150.
- Weiser JN, Ferreira DM, Paton JC. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 2018;16(6):355-367.
- Reynolds D et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: another pandemic. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220068.
- Schauwvlieghe AFAD et al. Invasive aspergillosis in patients admitted to the intensive care unit with severe influenza: a retrospective cohort study. Lancet Respir Med. 2018;6(10):782-792.
- Meersseman W et al. Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid: a tool for diagnosing aspergillosis in intensive care unit patients. Am J Respir Crit Care Med. 2008;177(1):27-34.
- Seymour CW et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 2017;376(23):2235-2244.
- Noviello S, Huang DB. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 2019;9(2):37.
- Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019;20(6):341-355.
- Hanson KE et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: clinical and diagnostic recommendations from the IDSA's diagnostics committee. Clin Infect Dis. 2020;71(10):2744-2751.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells. 2021;10(8):1931.
- Parida M et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008;18(6):407-421.
- Ou H et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 2021;10(10):11053-11066.
- Lai JX et al. Rapid detection of bacterial pathogens causing lower respiratory tract infections via microfluidic-chip-based loop-mediated isothermal amplification. J Vis Exp. 2024;(205):e66677.
إعادة الطباعة والأذونات
تم نشر هذه المقالة
الفيديو قريباً