يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول مُحسَّن للنقل العكسي لمرسال الحمض الريبي (mRNA) الخاص بالتيلوميريز إلى الخلايا الليفية البشرية في مراحل الشيخوخة المبكرة

126 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71538

⸱

أغسطس 18, 2026

 , 
1Center on the Biology of Aging, and Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه المقالة بروتوكولاً محسناً لعملية التعداء العكسي (reverse transfection) من أجل التوصيل الفعال للحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) لإنزيم تيلوميراز العكسي البشري (hTERT mRNA) المعدل النوكليوزيدي إلى الخلايا الليفية البشرية الهرمة. يؤدي التغليف المسبق لأسطح الزرع بمعقدات hTERT mRNA-lipid إلى تعزيز عملية الامتصاص، مما يسمح بتنشيط التيلوميراز، وتمديد التيلوميرات، وتجديد الخلايا جزئياً. وفي النهاية، تعود المزارع الخلوية إلى حالة الهرم أو الأزمة دون أن تتحول إلى خلايا خالدة.

الملخص

يرتبط الهرم الخلوي بتغيرات عميقة في الفسيولوجيا الخلوية، بما في ذلك انخفاض سيولة الغشاء، وضعف النقل الإندوسومي، وتضاؤل القدرة على الالتقام الخلوي، وزيادة نشاط إنزيم RNase خارج الخلية، وكل هذه العوامل تعيق التوصيل الفعال للـ mRNA. وقد حدت هذه العوائق من تطبيق النهج القائمة على الـ RNA في الخلايا الهرمة، لا سيما عند توصيل النسخ العلاجية الكبيرة. يصف هذا البروتوكول طريقة محسنة للترانسفكشن العكسي (reverse-transfection) للتوصيل الفعال للـ RNA المرسال (mRNA) المعدل إلى الخلايا الليفية البشرية الهرمة. وعلى الرغم من استخدام mRNA الخاص بإنزيم hTERT (نسخ عكس النسخ للتيلوميراز البشري) كنسخة نموذجية، إلا أن سير العمل قابل للتطبيق بشكل واسع على أنواع أخرى من mRNA. وخلافاً لطرق الترانسفكشن التقليدية، التي تُضاف فيها معقدات الـ RNA والليبيدات إلى وسط الزرع بعد التصاق الخلايا، يقوم الترانسفكشن العكسي بترسيب المعقدات على سطح الزرع قبل استزراع الخلايا، مما يتيح تفاعلاً مباشراً بين الخلايا الملتصقة ومعقدات الترانسفكشن. ولتحقيق أقصى قدر من كفاءة الترانسفكشن، يتضمن البروتوكول استخدام mRNA معدل النيوكليوزيدات يحتوي على pseudouridine و 5-methylcytidine، وذيول poly(A) ممددة، وتوقيتاً محسناً لتكوين المعقدات، وتثبيط إنزيم RNase، ورفعاً مؤقتاً لـ pH الإندوسوم باستخدام chloroquine، وزيادة كثافة استزراع الخلايا، وفترات حضانة ممددة. وباستخدام هذا النهج، تم تحقيق كفاءات ترانسفكشن تتراوح بين 50%–80% تقريباً في الخلايا الليفية الهرمة بعد توصيل نسخة hTERT mRNA بحجم 5 kb. وقد رُصد ذروة نشاط التيلوميراز بعد 24–48 h من الترانسفكشن. وأدت دورة ترانسفكشن واحدة إلى استطالة ملموسة في التيلوميرات، بينما أدى إجراء ثلاث عمليات ترانسفكشن متتالية إلى تمديد جوهري ولكن محدود للتيلوميرات. وكان من الممكن اكتشاف تراجع جزئي في الأنماط الظاهرية المرتبطة بالهرم في غضون 72–96 h، بما في ذلك انخفاض نشاط β-galactosidase المرتبط بالهرم، وانخفاض تعبير p16 و p21، واستعادة مورفولوجيا الخلايا، وتمديد العمر التكراري. وقد تحلل hTERT mRNA الموصل في غضون 72–96 h، ولم يُلاحظ حدوث تخليد للخلايا. يوفر هذا البروتوكول نهجاً عملياً للتوصيل المؤقت للـ mRNA إلى الخلايا الهرمة، ويمكن تكييفه مع مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والأنواع البيولوجية.

المقدمة

يمثل نهج التعدي العكسي (reverse transfection) تكيفاً منهجياً حاسماً للخلايا الهرمة، حيث يتغلب على العوائق الأساسية التي تفرضها هذه الخلايا أمام طرق التعدي القياسية. وبخلاف التعدي الأمامي، حيث يتم زرع الخلايا مسبقاً وتركها لتلتصق قبل إضافة معقدات التعدي، يتضمن التعدي العكسي إضافة خلايا معلقة مباشرة فوق معقدات hTERT mRNA-lipid المكونة مسبقاً. وتزيد هذه التقنية بشكل كبير من كفاءة التعدي في الخلايا الهرمة من خلال زيادة التعرض لمعقدات التعدي إلى أقصى حد خلال مرحلة الالتصاق الحرجة، وهي المرحلة التي يكون فيها إعادة تشكيل الغشاء في أوج نشاطه.

يكمن التحول المفاهيمي الجوهري في هذا البروتوكول في التعامل مع الخلايا الهرمة كمشكلة توصيل متميزة، وليس مجرد نسخ يصعب نقل الجينات إليها من الخلايا الشابة. ففي حالة الهرم، تؤدي التغيرات الشاملة في تركيب ليبيدات الغشاء، بما في ذلك الفوسفوليبيدات، والليبيدات السفينجولينية، والكوليسترول، إلى تغيير سيولة الغشاء، وانحنائه، والتفاعلات بين البروتينات والليبيدات، بينما تساهم في النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالهرم1,2,3. كما تظهر الخلايا الهرمة انخفاضاً في عملية إدخال المستقبلات الخلوية بوساطة الكلاثرين والكافيولاي، وتغيراً في مسارات الإدخال الخلوي، وهو ما يعود جزئياً إلى تثبيط تعبير amphiphysin-1 وتغيرات تعويضية في تعبير caveolin، مما يضعف الالتقاط والإشارات المعتمدة على المستقبلات4,5,6. وبالتوازي مع ذلك، يصاب محور الجسيم الداخلي المتأخر-الليسوسوم الذي ينظمه Rab7 والشبكة الأوسع للجسيمات الداخلية والالتهام الذاتي والليسوسومات (EAL) بخلل وظيفي، حيث يعمل Rab7 كمتحكم رئيسي في نضج الجسيمات الداخلية الليسوسومية والاندماج بين الجسيم البلعمي الذاتي والليسوسوم، وهي عمليات تضطرب في حالات الشيخوخة والتنكس العصبي7.

عادةً ما تزيد الخلايا الهرمة من تنظيم مكونات متعددة في نظام المعالجة والتكيف الليزوزومي (LYPAS)، بما في ذلك التخليق الحيوي لليزوزومات الذي يحفزه TFEB/TFE3 والبلعمة الذاتية بوساطة المرافقات، مما يؤدي إلى زيادة الكتلة الليزوزومية. ومع ذلك، غالبًا ما تظهر الليزوزومات الفردية ارتفاعًا في الأس الهيدروجيني (pH) للتجويف الداخلي، وتلفًا في الغشاء، وتغيرًا في القدرة التحليلية للبروتينات، مما يساهم في حدوث خلل وظيفي ليزوزومي على الرغم من زيادة وفرتها8,9,10,11. وبشكل جماعي، يمكن لهذه التغييرات أن توجه المواد التي يتم إدخالها إلى داخل الخلية بشكل أكثر كفاءة نحو مقصورات الاندوزوم-ليزوزوم التحللية، مما يزيد من احتمالية تحلل RNA أو البروتين المنقول قبل تحرره بفعالية في العصارة الخلوية9,10,11. يستهدف التعداء العكسي مباشرةً النافذة الزمنية المبكرة التي تعيد فيها الأغشية تشكيل نفسها أثناء الالتصاق، مما يفرض تلامسًا مستدامًا وعالي الألفة بين الخلايا ومعقدات mRNA-الليبيد، وهو ما يتجاوز جزئيًا على الأقل عملية الالتقام الخلوي المتضررة في الحالة المستقرة في الخلايا الهرمة الملتصقة تمامًا4,5,6,12.

من جانب تصميم الـ RNA، يفترض البروتوكول أنه في سياق الشيخوخة، لا تكفي خطوط الأساس البسيطة المكونة من غطاء (cap) وذيل (tail): ويُعتبر التعديل الكامل للنوكليوسيدات (على سبيل المثال، pseudouridine أو N1‑methylpseudouridine بالإضافة إلى 5‑methylcytidine) أمراً غير قابل للتفاوض لفصل الترجمة عن استشعار مستقبلات Toll-like الإندوزومية وتحفيز إنترفيرون النوع I. وقد أظهرت الأعمال التأسيسية أن دمج النوكليوسيدات المعدلة في الـ RNA يثبط تنشيط TLR3 وTLR8 وTLR7 ويقلل بشكل ملحوظ من إنتاج السيتوكينات في الخلايا التغصنية، مما يوفر أساساً ميكانيكياً لانخفاض المناعة الفطرية لمنصات mRNA المعدلة بالنوكليوسيدات الحالية13. وتؤكد المراجعات الحديثة للقاحات mRNA–LNP وأدوية mRNA على الهندسة المنسقة للغطاء 5′، والمناطق غير المترجمة (UTRs)، والتسلسل المشفر، وذيل poly(A) لزيادة الاستقرار والترجمة in vivo مع تقليل تنشيط المناعة الفطرية إلى أدنى حد14. وبوجه خاص، ظهر طول وبنية ذيل poly(A) كمحددات رئيسية لاستقرار mRNA المنسوخ in vitro ومخرجات الترجمة، مما دفع نحو تصميمات poly(A) ممتدة أو مهندسة في mRNA العلاجي15.

وبالإضافة إلى ذلك، يتضمن البروتوكول صراحةً توفير حماية ضد إنزيمات RNases خارج الخلوية والجسيمية خلال مرحلتي تكوين المعقد والامتصاص، إلى جانب تحديد نافذة للهروب من الجسيمات الداخلية باستخدام عامل مؤقت محب لليستوسومات مثل chloroquine16,17. لقد استُخدم chloroquine لفترة طويلة كمسبار وظيفي للحواجز الجسيمية، ويمكنه زيادة الارتباط بالهدف وإسكات الجينات بشكل ملحوظ بواسطة siRNA أو قليلات النوكليوتيد المضادة للمعنى، وذلك عن طريق تعزيز تمزق غشاء الجسيمات الداخلية وهروب حمولة الحمض النووي إلى العصارة الخلوية18. وفي الوقت ذاته، أظهر التصوير فائق الدقة وتصوير الخلايا الحية لـ mRNA الذي يتم توصيله بواسطة LNPs أن التوصيل الفعال يواجه عائقًا شديدًا عند أحداث الهروب النادرة من الجسيمات الداخلية المبكرة/المعاد تدويرها، بدلاً من أن يكون العائق في عملية الامتصاص الأولية بحد ذاتها، مما يؤكد أهمية الهندسة المتعمدة لخطوة الهروب من الجسيمات الداخلية في العلاجات القائمة على mRNA19.

تخلق هذه التغيرات المرتبطة بالشيخوخة في ديناميكيات الغشاء، والاتجار الخلوي بالالتقام، والمعالجة الليزوزومية، وتنشيط المناعة الفطرية، مجتمعةً، عوائق كبيرة أمام التوصيل الفعال لـ mRNA. وقد طُورت استراتيجية عفك التعداء (reverse-transfection) الموصوفة هنا لمعالجة هذه القيود من خلال الجمع بين هندسة mRNA المحسّنة، وحماية RNase، وتعزيز الهروب الإندوسومي، والتعريض المباشر للخلايا الملتصقة لمركبات mRNA والليبيدات مسبقة التكوين. وعلى الرغم من استخدام hTERT mRNA كحموله نموذجية، فإن سير العمل هذا قابل للتطبيق على نطاق واسع لتوصيل نسخ mRNA علاجية كبيرة أخرى إلى المجموعات الخلوية الهرمة والتي يصعب تعداؤها20,21,22.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. النسخ المختبري In vitro لـ mRNA الخاص بـ hTERT

  1. النسخ In vitro (IVT) باستخدام ARCA و ΨUTP
    1. قم بتحضير تفاعل IVT بحجم 20 µL وفقاً لـ الجدول 1. يمكن زيادة حجم التفاعل خطياً إذا كانت هناك حاجة إلى إنتاجية أكبر.
    2. اجمع كافة مكونات التفاعل باستثناء T7 RNA polymerase في أنبوب خالٍ من RNase. أضف T7 RNA polymerase في النهاية، وامزج بلطف، ثم قم بطرد مركزي قصير للأنبوب.
    3. حضّن التفاعل عند 37 °C لمدة تتراوح بين 0.5–4 ساعات.
      ملاحظة: اضبط وقت الحضن وفقاً لطول القالب. حضّن التفاعلات التي تحتوي على قوالب قصيرة (حوالي 500 bp) لمدة 30 دقيقة تقريباً، والتفاعلات التي تحتوي على قوالب أكبر (حوالي 4 kb) لمدة 3–4 ساعات.
  2. المعالجة بـ DNase
    1. أضف 1 µL من DNase I الخالي من RNase مباشرة إلى خليط تفاعل IVT.
    2. حضّن التفاعل عند 37 °C لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يجب إجراء المعالجة بـ DNase مباشرة في تفاعل IVT دون تنقية مسبقة لـ mRNA المُصنّع.
  3. تنقية mRNA
    1. أضف 115 µL من H₂O الخالي من النيوكلييز لتخفيف خليط التفاعل.
    2. قم بتنقية mRNA باستخدام طقم تنقية RNA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
    3. استخلص mRNA المنقى في 20–30 µL من H₂O الخالي من النيوكلييز.
    4. قس نقاء mRNA باستخدام القياس الطيفي وتحقق من سلامة RNA عن طريق الرحلان الكهربائي على هلام أغاروز مُنـزِع للبروتينات بتركيز 1.0–1.5% أو هلام بولي أكريلاميد منخفض التركيز.
  4. إضافة ذيل Poly(A)
    1. قم بتحضير تفاعل إضافة ذيل poly(A) بحجم 50 µL وفقاً لـ الجدول 2. امزج مكونات التفاعل بلطف وحضّنها عند 37 °C لمدة 30–60 دقيقة.
      ملاحظة: اضبط وقت الحضن وفقاً لكمية RNA المضافة.
    2. أنهِ التفاعل بإضافة 2 µL من 0.5 M EDTA (pH 8.0).
  5. التنقية النهائية ومراقبة الجودة
    1. قم بتنقية mRNA ذو ذيل poly(A) باستخدام طقم تنقية RNA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. استخلص mRNA المنقى في 20–30 µL من H₂O الخالي من النيوكلييز.
    3. قيّم جودة mRNA قبل الانتقال إلى عملية التعدي (transfection)
      1. قس تركيز mRNA عند 260 nm وحدد النقاء باستخدام نسب A260/A280 و A260/A230. استخدم تحضيرات mRNA التي تبلغ قيم A260/A280 فيها حوالي 2.0 وقيم A260/A230 أكبر من 2.0.
      2. قيّم سلامة mRNA باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام أو نظام تحليل RNA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
      3. أكد طول ذيل poly(A) عن طريق RT-PCR أو تحليل Bioanalyzer. تحقق من أن طول ذيل poly(A) يتراوح بين 120 و 200 نيوكليوتيد.
      4. قسم mRNA المنقى إلى حصص (aliquots) وخزّن هذه الحصص عند −80 °C لتقليل دورات التجميد والإذابة.

2. ترنسفكشن عكسي

  1. اليوم -1: التحضير ما قبل عفن الخلية (Transfection)
    1. التحقق من النمط الظاهري للهرم
      1. إجراء صبغ β-galactosidase المرتبط بالهرم (SA-β-gal) على عينة خلوية ممثلة. والتحقق من أن أكثر من 70% من الخلايا إيجابية.
      2. تأكيد تعبير مؤشرات الهرم (p16 وp21) عن طريق qRT-PCR أو التألق المناعي.
      3. تحديد حيوية الخلايا والتحقق من أن الحيوية تتجاوز 90%.
    2. تحضير الكواشف
      1. تدفئة وسط الزرع الكامل مسبقاً إلى 37 °C.
      2. تدفئة المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) مسبقاً إلى 37 °C.
      3. تحضير وسط Opti-MEM I طازج.
        ملاحظة: لا تضف مثبط RNase إلى Opti-MEM I قبل الاستخدام.
  2. اليوم 0: يوم عفن الخلية (Transfection)
    ملاحظة: اترك حوالي 3 h من تحضير الكواشف حتى حضانة الخلايا التي تم عفنها.
    1. تحضير mRNA الخاص بـ hTERT
      1. إذابة hTERT mRNA على الثلج. قياس تركيز mRNA واستخدام تحضيرات بتركيزات تتراوح بين 0.5 و1.0 µg/µL.
      2. تخفيف الكمية المطلوبة من hTERT mRNA في Opti-MEM I وفقاً لصيغة الزرع المستخدمة (الجدول 3). إضافة مثبط RNase ليصل التركيز النهائي إلى 0.5–1.0 U/µL والخلط بلطف.
      3. الحفاظ على mRNA المخفف على الثلج حتى تكوين المعقد.
        ملاحظة: أضف مثبط RNase مباشرة قبل الاستخدام. لا تخزن mRNA مع مثبط RNase، لأن نشاطه ينخفض بعد التجميد.
    2. تحضير كاشف عفن الخلية (Transfection reagent)
      1. دمج 6.0 µL من كاشف عفن الخلية مع 100 µL من Opti-MEM I في أنبوب معقم وخالٍ من RNase. الخلط بلطف عن طريق السحب والضخ بالممصّة.
      2. حضانة الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 min.
        ملاحظة: بالنسبة لبنى hTERT mRNA الكبيرة (~5 kb)، يتم تحسين نسب الكاشف إلى mRNA لتكون بين 0.4 و0.6 µL من الكاشف لكل 100 ng من mRNA.
    3. تكوين معقد mRNA-Lipid
      1. إضافة محلول hTERT mRNA المخفف (100 µL) إلى محلول كاشف عفن الخلية المخفف (106 µL). الخلط بلطف عن طريق السحب والضخ بالممصّة 5–6 مرات.
      2. حضانة الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15–20 min.
      3. يجب ألا تتجاوز مدة تكوين المعقد 30 min.
      4. التحقق من نجاح تكوين المعقد من خلال ظهور محلول عكر قليلاً.
        ملاحظة: قم بتحضير الخلايا خلال فترة تكوين المعقد.
    4. تحضير الخلايا لعفن الخلية العكسي (Reverse transfection)
      1. سحب وسط الزرع من مزارع الخلايا الهرمة.
      2. غسل الخلايا مرة واحدة بـ PBS المدفأ مسبقاً (2 mL لكل بئر في طبق ذو 6 آبار).
      3. إضافة 500 µL من trypsin-EDTA بتركيز 0.05% لكل بئر.
      4. حضانة الخلايا عند 37 °C لمدة 3–5 min.
      5. معادلة الـ trypsin باستخدام 3 mL من الوسط الكامل المحتوي على المصل.
      6. تفتيت الخلايا بلطف للحصول على معلق من الخلايا المفردة.
      7. تحديد عدد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) أو عداد خلايا آلي.
      8. تحضير معلق يحتوي على 2.0–2.5 × 105 خلية لكل بئر في وسط كامل.
        ملاحظة: تجنب عملية الـ trypsinization المطولة لأن الخلايا الهرمة حساسة جداً للإجهاد الميكانيكي. حافظ على الخلايا في حالة معلق؛ ولا تقم بذرعها مسبقاً قبل عفن الخلية العكسي.
    5. عفن الخلية العكسي (Reverse transfection)
      1. تحضير طبق الزرع
        1. إضافة 500 µL من poly-L-lysine بتركيز 0.01% إلى كل بئر من طبق ذو 6 آبار والحضانة لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة.
        2. سحب محلول الطلاء مباشرة قبل الاستخدام.
        3. إضافة 200 µL من معقد hTERT mRNA-lipid إلى مركز كل بئر.
        4. حضانة الطبق عند 37 °C و5% CO₂ لمدة 30 min.
          ملاحظة: قم بطلاء الطبق بالتوازي مع تكوين المعقد وتحضير الخلايا.
      2. تحضير معلق الخلايا
        1. تعليق 2.0–2.5 × 105 خلية في 1800 µL من وسط كامل خالٍ من المضادات الحيوية.
        2. إعادة تعليق الخلايا بلطف للحصول على معلق موحد من الخلايا المفردة.
          ملاحظة: استخدم وسطاً خالياً من المضادات الحيوية أثناء عملية عفن الخلية.
      3. بذر الخلايا فوق المعقدات
        1. إضافة 1800 µL من معلق الخلايا مباشرة فوق معقدات hTERT mRNA-lipid المكونة مسبقاً.
        2. إمالة الطبق بلطف 2–3 مرات في كل اتجاه لتوزيع الخلايا بالتساوي.
          ملاحظة: لا تستخدم الممصّة مع المعلق بعد إضافة الخلايا، لأن ذلك قد يؤدي إلى تفكيك معقدات mRNA-lipid.
      4. حضانة الخلايا
        1. حضانة الخلايا عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO₂ لمدة 6–8 h.
        2. مراقبة التصاق الخلايا بواسطة المجهر الضوئي بعد 2–3 h من عفن الخلية.
        3. التحقق من أن الخلايا موزعة بالتساوي وبدأت في الالتصاق بسطح الزرع.
          ملاحظة: قد يشير العدد المفرط من الخلايا العائمة أو الحطام الخلوي إلى سمية خلوية مرتبطة بعملية عفن الخلية.

3. التخفيف من السُمية الخلوية

  1. قلل فترة التعرض لعملية عفن الخلية (transfection) إلى 48 h إذا تجاوز فقدان الخلايا 20%.
  2. أضف 10 µM من مثبط ROCK Y-27632 إلى المزارع خلال فترة عفن الخلية لتحسين بقاء الخلايا على قيد الحياة.
  3. بعد 6–8 h من عفن الخلية، اشفط وسط عفن الخلية بعناية مع تقليل إزعاج الخلايا الملتصقة جزئياً. اترك حوالي 100 µL من الوسط المتبقي في كل بئر.
  4. أضف 1 mL من وسط نمو كامل طازج ومسخن مسبقاً ومدعم بـ 15% FBS إلى كل بئر.
  5. أضف الكلوروكين (chloroquine) بتركيز نهائي يتراوح بين 10–20 µM فور استبدال الوسط.
  6. حضن المزارع لمدة ساعتين إضافيتين عند 37 °C في حضانة رطبة تحتوي على 5% CO₂.
  7. استبدل الوسط المحتوي على الكلوروكين بوسط نمو كامل طازج.
  8. أعد المزارع إلى الحضانة لمواصلة النمو.
    ملاحظة: راقب شكل الخلايا وحيويتها طوال فترة التعافي. قد يشير انفصال الخلايا المفرط أو وجود الحطام الخلوي إلى سمية خلوية مرتبطة بعملية عفن الخلية.

4. تحليل ما بعد عفن التحول

  1. قيّم تعبير بروتين TERT بعد 24–48 ساعة من عملية عفن الخلية (transfection).
  2. قس مستويات بروتين TERT عن طريق لطخة ويسترن (western blotting) أو تلوين التألق المناعي وفقاً للإجراءات المختبرية القياسية.
  3. قس نشاط التيلوميراز خلال الفترة الزمنية نفسها باستخدام مقايسة مناسبة لنشاط التيلوميراز.
    ملاحظة: ينخفض نشاط التيلوميراز عادةً بعد 48 ساعة بسبب تحلل mRNA الخاص بـ hTERT الذي تم إدخاله بشكل عابر.
  4. قيّم طول التيلومير بعد 48–72 ساعة من عملية عفن الخلية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المتعدد أحادي اللون (MMqPCR) أو طريقة مكافئة لتحليل طول التيلومير.
    ملاحظة: يمكن ملاحظة استطالة ملموسة في التيلومير بعد الإيصال الناجح لـ mRNA الخاص بـ hTERT.
  5. قيّم المظاهر المظهرية المرتبطة بالشيخوخة وتلك المرتبطة بتجدد الشباب بعد 7 أيام من عملية عفن الخلية
    1. قس نشاط β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal).
    2. قس مستويات تعبير p16 وp21.
    3. قيّم تعبير Ki67.
    4. افحص المورفولوجيا الخلوية باستخدام المجهر الضوئي.
      ملاحظة: قارن المزارع المعالجة مع ضوابط هرمة غير معالجة أو خضعت لعفن خلية وهمي (mock-transfected) لتقييم التغيرات في المظاهر المظهرية المرتبطة بالشيخوخة والخصائص التكاثرية.

5. بروتوكول الجرعات المتكررة (اختياري)

  1. قم بإجراء عملية ترنسفكشن الأولية كما هو موضح في الأقسام 2-4.
  2. كرر عمليات الترنسفكشن وفقاً للجدول الزمني التالي: اليوم 0: الترنسفكشن الأول؛ اليوم 5: الترنسفكشن الثاني؛ اليوم 10-12: الترنسفكشن الثالث.
  3. حافظ على الخلايا كمزارع ملتصقة ولا تستخدم التريبسين قبل عمليات الترنسفكشن اللاحقة.
  4. حضّر معقدات hTERT mRNA–lipid جديدة كما هو موضح في الأقسام 2.2.1-2.2.3.
  5. اشفط وسط المزرعة من كل بئر.
  6. أضف 200 µL من معقدات hTERT mRNA–lipid مباشرة إلى كل بئر.
  7. أضف 800 µL من وسط F-10 الكامل الطازج فور إضافة المعقدات.
  8. حضّن الخلايا لمدة 4-6 h عند 37 °C في حضانة رطبة تحتوي على 5% CO₂.
  9. استبدل وسط الترنسفكشن بوسط كامل طازج.
    ملاحظة: اقتصر العلاج على ثلاث دورات ترنسفكشن كحد أقصى لتقليل السمية الخلوية التراكمية المرتبطة بالترنسفكشن.

6. بروتوكول عفن التعدي الأمامي (2 µg/mL، تنسيق 6 آبار)

  1. اليوم −1: استزراع الخلايا
    1. فصل الخلايا الليفية الهرمة أو التي في بداية طور الهرم باستخدام 0.05% trypsin-EDTA.
    2. تعادل تأثير الـ trypsin باستخدام وسط استزراع كامل.
    3. تحديد عدد الخلايا ومدى حيويتها.
    4. استزراع الخلايا في أطباق ذات 6 آبار بكثافة 2.0–2.5 × 105 خلية لكل بئر.
    5. تحضين الخلايا طوال الليل عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO₂ حتى تصل نسبة التلاقي إلى 60–80% تقريبًا.
  2. اليوم 0: تحضير معقدات hTERT mRNA والكاشف
    1. إذابة جزء من hTERT mRNA المعدل بالنوكليوزيد على الثلج.
    2. تخفيف hTERT mRNA في Opti-MEM ليصل إلى تركيز نهائي قدره 2 µg/mL في أنبوب معقم خالٍ من RNase (الأنبوب A).
    3. إضافة مثبط RNase إلى الأنبوب A بتركيز نهائي يتراوح بين 0.5–1.0 U/µL والخلط برفق.
    4. تخفيف كاشف عفن الخلايا (transfection reagent) في Opti-MEM في أنبوب ثانٍ خالٍ من RNase (الأنبوب B) باستخدام 0.4–0.6 µL من الكاشف لكل 100 ng من mRNA.
    5. إضافة محتويات الأنبوب B قطرة بقطرة إلى الأنبوب A مع الخلط برفق.
    6. تحضين الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15–20 دقيقة.
  3. اليوم 0: عملية عفن الخلايا الأمامي (Forward transfection)
    1. التأكد من أن نسبة تلاقي الخلايا تتراوح بين 60–80% وأنها تظهر شكلاً مورفولوجياً سليماً.
    2. سحب وسط الاستزراع.
    3. غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1–2 mL من PBS المُدفأ مسبقاً.
    4. إضافة 0.5 mL من وسط كامل أو وسط منخفض المصل المُدفأ مسبقاً إلى كل بئر.
    5. إمكانية إضافة chloroquine بتركيز نهائي يتراوح بين 10–20 µM.
    6. إضافة 0.5 mL من معقدات hTERT mRNA والكاشف التي تم تحضيرها في الخطوة 6.2.6 إلى كل بئر.
    7. هز الطبق برفق لتوزيع المعقدات بشكل متساوٍ.
    8. تحضين الخلايا لمدة 4–6 ساعات عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO₂.
      ​ملاحظة: تمديد فترة التحضين إلى 6–8 ساعات للخلايا الهرمة إذا لزم الأمر.
    9. سحب وسط عملية العفن.
    10. إضافة 2.0 mL من وسط كامل طازج إلى كل بئر.
    11. إجراء تحليلات ما بعد عملية العفن كما هو موضح في القسم 4.
      ملاحظة: استخدم نفس دفعة hTERT mRNA، ونفس كاشف عفن الخلايا، والجرعة الاسمية عند مقارنة ظروف عفن الخلايا الأمامي والعكسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم هندسة modRNA d2EGFP-T2A-hTERT كإطار قراءة مفتوح هجين، حيث تم ربط مراسل EGFP غير مستقر (d2EGFP) بـ TERT البشري عبر ببتيد T2A ذاتي الانشطار. تتوفر التسلسلات النكليوتيدية والبروتينية الكاملة لجميع البنى في الملف التكميلي 1. وقد أُحيط التسلسل المشفّر بمنطقة غير مترجمة (UTR) اصطناعية عند الطرف '5 ومنطقة 3′ UTR لـ β-globin البشري لتعزيز كفاءة الترجمة واستقرار mRNA (الشكل 1A). كما احتوت كاسيت التعبير على تسلسل اصطناعي لمثبت الإنزيم (Es) وتسلسل اصطناعي ومعزز للنسخ (TEs) صُمما لتح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تعيد هذه الدراسة صياغة الشيخوخة الخلوية باعتبارها مشكلة توصيل متميزة بدلاً من كونها مجرد تباين طفيف في الفسيولوجيا التكاثرية، وتطور استراتيجية لنقل mRNA الخاص بالتيلوميراز مصممة خصيصاً لتلائم القيود الفيزيائية الحيوية والمناعية للحالة الهرمة. تظهر الخلايا الهرمة أغشية صلبة وغنية بالكوليسترول مع انخفاض في نشاط الالتقام الخلوي، مما يخلق حاجزاً كبيراً أمام التوصيل الفعال للأحماض النووية. ومن خلال اعتماد نهج النقل العكسي، يستغل هذا البروتوكول فترة الالتصاق العابرة التي تخضع خلالها الخلايا الهرمة لإعادة تشكيل الغشاء وتظهر لدي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يُعد J.M.S. مؤسسًا مشاركًا ورئيسًا للمجلس الاستشاري العلمي لشركة Transposon Therapeutics.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة (NIH) رقم P01 AG051449، وR01 AG016694، وR01 AG078925 الممنوحة لـ JS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مزيج هام الغذائي F-10Thermo Fisher11550043أوساط زراعة الخلايا.
3´نظير بنية القبعة لـ RNA من نوع O-Me-m7G(5')ppp(5')GNew England BiolabS1411Lبالنسبة لمعظم جزيئات الـ RNA، تعمل بنية القبعة (cap structure) على زيادة الاستقرار، وتقليل القابلية للتحلل بواسطة الإنزيمات الخارجية (exonuclease)، وتعزيز تكوين معقدات بدء ترجمة الـ mRNA.
5-ميثيل-سيتيدين-5´ثلاثي الفوسفات (5-ميثيل-CTP)New England BiolabN0432Sتُستخدم النوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (NTPs) المعدلة بشكل شائع لتقليل الاستمناع في الحمض النووي الريبوزي (RNA) الناتج عن النسخ في المختبر.
طبق بـ 6 عيونCorning351146لإنماء ومعالجة أحجام متوسطة إلى كبيرة من الخلايا الملتصقة أو المعلقة في ظروف تجريبية مستقلة.
جسم مضاد لـ Ki67 (SP6)abcamab16667يُعبر عن Ki67 بشكل أساسي في الخلايا المتكاثرة.
طقم مقايسة الشيخوخة الخلوية (تلوين SA-beta-gal) cellbiolabsCBA-230 تحديد الخلايا الهرمة باستخدام تحليل SA-βمقايسة صبغ -gal
أنابيب DNA ذات الربط المنخفض سعة 0.5 ملEppendorf 022431005لاستعادة الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) والحمض النووي الريبوزي (RNA) بكفاءة ودون أي فقدان
أنابيب DNA LoBind سعة 1.5 ملEppendorf22431021لاستعادة الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) والحمض النووي الريبوزي (RNA) بكفاءة دون أي فقدان
DNase I، خالٍ من RNase (1 وحدة/μل)Thermo FisherEN0521إن إنزيم DNase I الخالي من RNase هو إنزيم قطع داخلي (endonuclease) يقوم بهضم الحمض النووي DNA أحادي الخيط وثنائي الخيط. 
إنزيم بولي (أ) بوليميراز لبكتيريا E. coliNew England BiolabM0276Sتعمل إنزيم بولي (أ) بوليميراز 1 (PAP I) في بكتيريا Escherichia coli بشكل أساسي كمحفز لإضافة بقايا أحادي فوسفات الأدينوزين (AMP) إلى الطرف '3 لجزيئات RNA بشكل مستقل عن القالب.
مصل جنين البقرThermo FisherA5256701مكمل المصل للمستنبتات الخلوية 
طقم HiScribe T7 ARCA mRNANew England BiolabsE2065Sصُممت مجموعة HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (مع التذييل) للإنتاج السريع لـ mRNA ذي غطاء ARCA وذيل poly(A) في المختبر. ويتم تخليق mRNA المقنّع عن طريق دمج نظير الغطاء المضاد للعكس (ARCA) أثناء عملية النسخ باستخدام إنزيم T7 RNA Polymerase.
طقم HiScribe T7 mRNA مع كاشف CleanCap Reagent AGNew England BiolabsE2080Sتتيح أطقم HiScribe T7 mRNA Kits مع كاشف CleanCap Reagent AG إنتاجاً سريعاً ومبسطاً لنسخة واحدة أو نسخ متعددة من الحمض الريبي النووي المرسال (mRNA)، بإنتاجية نموذجية تبلغ ≥90 μجم لكل تفاعل،
إنزيم LongAmp Hot Start Taq DNA PolymeraseNew England BiolabsM0534Sيوفر إنزيم LongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase أداءً استثنائيًا مع نواتج التضخيم الطويلة.
إنزيم النسخ العكسي لفيروس سرطان الدم لدى الفئران (M-MuLV Reverse Transcriptase)New England BiolabM0253Lيقوم إنزيم النسخ العكسي M-MuLV بتخليق شريط حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين مكمل يبدأ من بادئ، باستخدام إما الحمض النووي الريبوزي (تخليق cDNA) أو الحمض النووي ريبوزي منقوص الأكسجين أحادي الشريط كقالب.
طقم تنقية الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin (50 μز)New England BiolabsT2040Lالوظيفة الرئيسية لجهاز Monarch® طقم تنقية الحمض النووي الريبي بالدوران (50 μز) هي تنقية وتركيز ما يصل إلى 50 μغرام من الحمض النووي الريبوزي (RNA) عالي الجودة من التفاعلات الإنزيمية أو مخاليط الاستخلاص.
مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly الرئيسيNew England BiolabsE2621Lيسمح مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix بالتجميع السلس لقطع متعددة من الحمض النووي (DNA)، بغض النظر عن طول القطعة أو توافق النهايات. وله فائدة كبيرة لمجتمع البيولوجيا التركيبية، وكذلك في الاستنساخ أحادي الخطوة لقطع متعددة، وذلك نظراً لسهولة استخدامه ومرونته وتنسيق المزيج الرئيسي البسيط. 
Opti-MEM - وسط غذائي منخفض المصلThermo Fisher31985070لرفع كفاءة ترانسفكشن الخلايا إلى الحد الأقصى أثناء تكوين معقدات الليبيد والحمولات. حيث يعمل كبيئة محددة كيميائياً ومحسنة تحافظ على حيوية الخلايا الثديية بشكل عالٍ، مع تقليل الحاجة إلى المكملات المصلية القياسية.
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)، بدرجة حموضة 7.4Thermo Fisher10010023يتمثل الاستخدام الوظيفي الأساسي للمحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) عند درجة حموضة 7.4 في الحفاظ على استقرار درجة الحموضة والتوازن الاسموزي للخلايا الثديية والجزيئات البيولوجية.
شرائط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)Thermo FisherAB0776يتمثل الاستخدام الوظيفي الأساسي لأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الشريطية (والتي تكون عادةً بتنسيق 8 أنابيب أو 12 أنبوباً في الشريط الواحد) في احتواء تفاعلات سائلة ذات أحجام صغيرة أثناء عملية التدوير الحراري عالية الإنتاجية.
هيدروبروميد بولي-إل-لايسينMillipore SigmaP4707-50MLيتمثل الاستخدام الوظيفي الأساسي لهيدروبروميد بولي-إل-لايسين (PLL) لالتصاق الخلايا في طلاء الأسطح الصلبة سالبة الشحنة (مثل الزجاج أو البلاستيك) لإنشاء ركيزة عالية الالتصاق وموجبة الشحنة.
بسودويوريدين-5´ثلاثي الفوسفات (سودو-UTP) Ψيوريدين ثلاثي الفوسفات (UTP)New England BiolabsN0433Sسودويوريدين-5´تُستخدم ثلاثي فوسفات النوكليوتيد المعدلة (Pseudo-UTP) بشكل شائع لتقليل الاستجابة المناعية للحمض النووي الريبي (RNA) الناتج عن عملية النسخ في المختبر.
مجموعة محلول الريبونوكليوتيداتNew England BiolabsN0450Lأربعة محاليل منفصلة من ATP وGTP وCTP وUTP
مثبط ROCK Y-27632 (ثنائي هيدروكلوريد)تقنيات الخلايا الجذعية72302يعتبر Y-27632 مثبطاً عالي الفعالية وانتقائياً ونفاذاً للخلايا لبروتين كيناز المرتبط بـ Rho والمحتوي على لولب ملفوف (ROCK). يثبط Y-27632 كلاً من ROCK1 (Ki = 220 nM) وROCK2 (Ki = 300 nM) عن طريق منافسة ATP على الارتباط بالموقع التحفيزي. 
ماء بدرجة نقاء مناسبة لتفاعل البلمرة المتسلسل بالنسخ العكسي (RT-PCR Grade Water)Thermo FisherAM9935إن الاستخدام الوظيفي الأساسي للمياه بدرجة نقاوة RT-PCR (والتي غالباً ما تسمى مياه خالية من النوكلياز) هو أن تعمل كمذيب فائق النقاء للمقايسات الإنزيمية الحساسة، حيث يمكن لأي تلوث أن يؤدي إلى تحلل العينة أو تثبيط عملية التضخيم.
SUPERase·مثبط RNase Thermo FisherAM2694يعد مُثبط RNase من نوع SUPERase In مُثبطًا بروتينيًا من أصل غير بشري، يرتبط بشكل غير تساهمي بإنزيمات RNase الأكثر شيوعًا وإثارة للمشاكل ويثبطها، بما في ذلك RNase A وB وC و1 وT1.
صبغة SYBR Green I لهلام الأحماض النوويةThermo FisherS7563الاستخدام الوظيفي الأساسي لـ SYBR™ يُستخدم صبغ الأحماض النووية "Green I Nucleic Acid Gel Stain" لتصور وقياس كمية الحمض النووي مزدوج السلسلة (dsDNA) في هلامات الأجاروز أو البولي أكريلاميد.
طقم ترانسفيكشن TransIT-mRNAMirusbio/ Millipore SigmaMIR 2250كاشف ترنسفكشن (نقل جيني) عالي الكفاءة ومنخفض السمية للحمض النووي الريبوزي (RNA) كبير الحجم
طقم TRAPeze للكشف عن التيلوميريزMillipore Sigma S7700 يُعد مقايسة TRAP (بروتوكول تضخيم التكرارات التيلوميرية) طريقة حساسة وشائعة الاستخدام تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للكشف عن نشاط التيلوميراز وقياسه في الخلايا وعينات الأنسجة الثديية. وتتضمن هذه المقايسة ثلاث خطوات رئيسية: إطالة التكرارات التيلوميرية بواسطة إنزيم التيلوميراز، وتضخيم هذه النواتج باستخدام تفاعل PCR، ثم الكشف عنها لاحقاً.
تربسين-إيديتات ثنائي الصوديوم (0.05%)، أحمر الفينولThermo Fisher25300054لفصل الخلايا الثديية الملتصقة عن أوعية الزرع أثناء عمليات تمرير الخلايا الروتينية (الزراعة الفرعية) وحصادها.

المراجع

  1. Millner A, Atilla-Gokcumen GE. Lipid players of cellular senescence. Metabolites. 2020;10(9):339.
  2. Hamsanathan S, Gurkar AU. Lipids as regulators of cellular senescence. Front Physiol. 2022;13:796850.
  3. Das UN. Cell membrane theory of senescence and the role of bioactive lipids in aging and aging-associated diseases and their therapeutic implications. Biomolecules. 2021;11(2):241.
  4. Shin EY, Soung NK, Schwartz MA, Kim EG. Altered endocytosis in cellular senescence. Ageing Res Rev. 2021;68:101332.
  5. Park JS, et al. Down-regulation of amphiphysin-1 is responsible for reduced receptor-mediated endocytosis in senescent cells. FASEB J. 2001;15(9):1625-1627.
  6. Park SC. Functional recovery of senescent cells through restoration of receptor-mediated endocytosis. Mech Ageing Dev. 2002;123(8):917-926.
  7. Stroupe C. This is the end: regulation of Rab7 nucleotide binding in endolysosomal trafficking and autophagy. Front Cell Dev Biol. 2018;6:129.
  8. Curnock R, et al. TFEB-dependent lysosome biogenesis is required for senescence. EMBO J. 2023;42(9):e111241.
  9. Guerrero-Navarro L, Jansen-Durr P, Cavinato M. Age-related lysosomal dysfunctions. Cells. 2022;11(12):1977.
  10. Tan JX, Finkel T. Lysosomes in senescence and aging. EMBO Rep. 2023;24(11):e57265.
  11. Rovira M, et al. The lysosomal proteome of senescent cells contributes to the senescence secretome. Aging Cell. 2022;21(10):e13707.
  12. Kilroy G, Burk DH, Floyd ZE. High-efficiency lipid-based siRNA transfection of adipocytes in suspension. PLoS One. 2009;4(9):e6940.
  13. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
  14. Freund I, Eigenbrod T, Helm M, Dalpke AH. RNA modifications modulate activation of innate Toll-like receptors. Genes (Basel). 2019;10(2):92.
  15. Chen H, et al. Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA. Nat Biotechnol. 2025;43(2):194-203.
  16. Alshehri A, Grabowska A, Stolnik S. Pathways of cellular internalisation of liposome-delivered siRNA and effects on siRNA engagement with target mRNA and silencing in cancer cells. Sci Rep. 2018;8(1):3748.
  17. Paramasivam P, et al. Endosomal escape of delivered mRNA from endosomal recycling tubules visualized at the nanoscale. J Cell Biol. 2022;221(2):e202110137.
  18. Pandey E, Harris EN. Chloroquine and cytosolic galectins affect endosomal escape of antisense oligonucleotides after Stabilin-mediated endocytosis. Mol Ther Nucleic Acids. 2023;33:430-443.
  19. Bettinger T, et al. Peptide-mediated RNA delivery: a novel approach for enhanced transfection of primary and post-mitotic cells. Nucleic Acids Res. 2001;29(18):3882-3891.
  20. Granados-Riveron JT, Aquino-Jarquin G. Engineering of the current nucleoside-modified mRNA-LNP vaccines against SARS-CoV-2. Biomed Pharmacother. 2021;142:111953.
  21. Hou X, Shi J, Xiao Y. mRNA medicine: recent progresses in chemical modification, design, and engineering. Nano Res. 2024;17(10):9015-9030.
  22. Ramunas J, et al. Transient delivery of modified mRNA encoding TERT rapidly extends telomeres in human cells. FASEB J. 2015;29(5):1930-1939.
  23. Majewska J, Krizhanovsky V. Immune surveillance of senescent cells in aging and disease. Nat Aging. 2025;5(8):1415-1424.
  24. Ajoolabady A, et al. Hallmarks and mechanisms of cellular senescence in aging and disease. Cell Death Discov. 2025;11(1):364.
  25. Lin J, et al. RNA and protein degradation in the aging process. Cell Signal. 2025;136:112166.
  26. Anderson BR, et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res. 2010;38(17):5884-5892.
  27. Sugawara S, et al. RNaseH2A downregulation drives inflammatory gene expression via genomic DNA fragmentation in senescent and cancer cells. Commun Biol. 2022;5(1):1420.
  28. Chatterjee S, Kon E, Sharma P, Peer D. Endosomal escape: a bottleneck for LNP-mediated therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(11):e2307800120.
  29. Li YY, Tay FR. The epigenetic rejuvenation promise: partial reprogramming as a therapeutic strategy for aging and disease. Ageing Res Rev. 2026;115:103009.
  30. Zhang W, Qu J, Liu GH, Belmonte JCI. The ageing epigenome and its rejuvenation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(3):137-150.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الأرومات الليفية الهرمةmRNA لـ hTERTmRNA المعدل النوكليوزيديتثبيط RNaseتعديل الأس الهيدروجيني الإندوسوميإطالة التيلوميرالعمر التكراري
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.