بروتوكول مُحسَّن للنقل العكسي لمرسال الحمض الريبي (mRNA) الخاص بالتيلوميريز إلى الخلايا الليفية البشرية في مراحل الشيخوخة المبكرة

ملخص

تقدم هذه المقالة بروتوكولاً محسناً لعملية التعداء العكسي (reverse transfection) من أجل التوصيل الفعال للحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) لإنزيم تيلوميراز العكسي البشري (hTERT mRNA) المعدل النوكليوزيدي إلى الخلايا الليفية البشرية الهرمة. يؤدي التغليف المسبق لأسطح الزرع بمعقدات hTERT mRNA-lipid إلى تعزيز عملية الامتصاص، مما يسمح بتنشيط التيلوميراز، وتمديد التيلوميرات، وتجديد الخلايا جزئياً. وفي النهاية، تعود المزارع الخلوية إلى حالة الهرم أو الأزمة دون أن تتحول إلى خلايا خالدة.

الملخص

يرتبط الهرم الخلوي بتغيرات عميقة في الفسيولوجيا الخلوية، بما في ذلك انخفاض سيولة الغشاء، وضعف النقل الإندوسومي، وتضاؤل القدرة على الالتقام الخلوي، وزيادة نشاط إنزيم RNase خارج الخلية، وكل هذه العوامل تعيق التوصيل الفعال للـ mRNA. وقد حدت هذه العوائق من تطبيق النهج القائمة على الـ RNA في الخلايا الهرمة، لا سيما عند توصيل النسخ العلاجية الكبيرة. يصف هذا البروتوكول طريقة محسنة للترانسفكشن العكسي (reverse-transfection) للتوصيل الفعال للـ RNA المرسال (mRNA) المعدل إلى الخلايا الليفية البشرية الهرمة. وعلى الرغم من استخدام mRNA الخاص بإنزيم hTERT (نسخ عكس النسخ للتيلوميراز البشري) كنسخة نموذجية، إلا أن سير العمل قابل للتطبيق بشكل واسع على أنواع أخرى من mRNA. وخلافاً لطرق الترانسفكشن التقليدية، التي تُضاف فيها معقدات الـ RNA والليبيدات إلى وسط الزرع بعد التصاق الخلايا، يقوم الترانسفكشن العكسي بترسيب المعقدات على سطح الزرع قبل استزراع الخلايا، مما يتيح تفاعلاً مباشراً بين الخلايا الملتصقة ومعقدات الترانسفكشن. ولتحقيق أقصى قدر من كفاءة الترانسفكشن، يتضمن البروتوكول استخدام mRNA معدل النيوكليوزيدات يحتوي على pseudouridine و 5-methylcytidine، وذيول poly(A) ممددة، وتوقيتاً محسناً لتكوين المعقدات، وتثبيط إنزيم RNase، ورفعاً مؤقتاً لـ pH الإندوسوم باستخدام chloroquine، وزيادة كثافة استزراع الخلايا، وفترات حضانة ممددة. وباستخدام هذا النهج، تم تحقيق كفاءات ترانسفكشن تتراوح بين 50%–80% تقريباً في الخلايا الليفية الهرمة بعد توصيل نسخة hTERT mRNA بحجم 5 kb. وقد رُصد ذروة نشاط التيلوميراز بعد 24–48 h من الترانسفكشن. وأدت دورة ترانسفكشن واحدة إلى استطالة ملموسة في التيلوميرات، بينما أدى إجراء ثلاث عمليات ترانسفكشن متتالية إلى تمديد جوهري ولكن محدود للتيلوميرات. وكان من الممكن اكتشاف تراجع جزئي في الأنماط الظاهرية المرتبطة بالهرم في غضون 72–96 h، بما في ذلك انخفاض نشاط β-galactosidase المرتبط بالهرم، وانخفاض تعبير p16 و p21، واستعادة مورفولوجيا الخلايا، وتمديد العمر التكراري. وقد تحلل hTERT mRNA الموصل في غضون 72–96 h، ولم يُلاحظ حدوث تخليد للخلايا. يوفر هذا البروتوكول نهجاً عملياً للتوصيل المؤقت للـ mRNA إلى الخلايا الهرمة، ويمكن تكييفه مع مجموعة واسعة من أنواع الخلايا والأنواع البيولوجية.

المقدمة

يمثل نهج التعدي العكسي (reverse transfection) تكيفاً منهجياً حاسماً للخلايا الهرمة، حيث يتغلب على العوائق الأساسية التي تفرضها هذه الخلايا أمام طرق التعدي القياسية. وبخلاف التعدي الأمامي، حيث يتم زرع الخلايا مسبقاً وتركها لتلتصق قبل إضافة معقدات التعدي، يتضمن التعدي العكسي إضافة خلايا معلقة مباشرة فوق معقدات hTERT mRNA-lipid المكونة مسبقاً. وتزيد هذه التقنية بشكل كبير من كفاءة التعدي في الخلايا الهرمة من خلال زيادة التعرض لمعقدات التعدي إلى أقصى حد خلال مرحلة الالتصاق الحرجة، وهي المرحلة التي يكون فيها إعادة تشكيل الغشاء في أوج نشاطه.

يكمن التحول المفاهيمي الجوهري في هذا البروتوكول في التعامل مع الخلايا الهرمة كمشكلة توصيل متميزة، وليس مجرد نسخ يصعب نقل الجينات إليها من الخلايا الشابة. ففي حالة الهرم، تؤدي التغيرات الشاملة في تركيب ليبيدات الغشاء، بما في ذلك الفوسفوليبيدات، والليبيدات السفينجولينية، والكوليسترول، إلى تغيير سيولة الغشاء، وانحنائه، والتفاعلات بين البروتينات والليبيدات، بينما تساهم في النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالهرم^1,2,3. كما تظهر الخلايا الهرمة انخفاضاً في عملية إدخال المستقبلات الخلوية بوساطة الكلاثرين والكافيولاي، وتغيراً في مسارات الإدخال الخلوي، وهو ما يعود جزئياً إلى تثبيط تعبير amphiphysin-1 وتغيرات تعويضية في تعبير caveolin، مما يضعف الالتقاط والإشارات المعتمدة على المستقبلات^4,5,6. وبالتوازي مع ذلك، يصاب محور الجسيم الداخلي المتأخر-الليسوسوم الذي ينظمه Rab7 والشبكة الأوسع للجسيمات الداخلية والالتهام الذاتي والليسوسومات (EAL) بخلل وظيفي، حيث يعمل Rab7 كمتحكم رئيسي في نضج الجسيمات الداخلية الليسوسومية والاندماج بين الجسيم البلعمي الذاتي والليسوسوم، وهي عمليات تضطرب في حالات الشيخوخة والتنكس العصبي⁷.

عادةً ما تزيد الخلايا الهرمة من تنظيم مكونات متعددة في نظام المعالجة والتكيف الليزوزومي (LYPAS)، بما في ذلك التخليق الحيوي لليزوزومات الذي يحفزه TFEB/TFE3 والبلعمة الذاتية بوساطة المرافقات، مما يؤدي إلى زيادة الكتلة الليزوزومية. ومع ذلك، غالبًا ما تظهر الليزوزومات الفردية ارتفاعًا في الأس الهيدروجيني (pH) للتجويف الداخلي، وتلفًا في الغشاء، وتغيرًا في القدرة التحليلية للبروتينات، مما يساهم في حدوث خلل وظيفي ليزوزومي على الرغم من زيادة وفرتها^8,9,10,11. وبشكل جماعي، يمكن لهذه التغييرات أن توجه المواد التي يتم إدخالها إلى داخل الخلية بشكل أكثر كفاءة نحو مقصورات الاندوزوم-ليزوزوم التحللية، مما يزيد من احتمالية تحلل RNA أو البروتين المنقول قبل تحرره بفعالية في العصارة الخلوية^9,10,11. يستهدف التعداء العكسي مباشرةً النافذة الزمنية المبكرة التي تعيد فيها الأغشية تشكيل نفسها أثناء الالتصاق، مما يفرض تلامسًا مستدامًا وعالي الألفة بين الخلايا ومعقدات mRNA-الليبيد، وهو ما يتجاوز جزئيًا على الأقل عملية الالتقام الخلوي المتضررة في الحالة المستقرة في الخلايا الهرمة الملتصقة تمامًا^4,5,6,12.

من جانب تصميم الـ RNA، يفترض البروتوكول أنه في سياق الشيخوخة، لا تكفي خطوط الأساس البسيطة المكونة من غطاء (cap) وذيل (tail): ويُعتبر التعديل الكامل للنوكليوسيدات (على سبيل المثال، pseudouridine أو N1‑methylpseudouridine بالإضافة إلى 5‑methylcytidine) أمراً غير قابل للتفاوض لفصل الترجمة عن استشعار مستقبلات Toll-like الإندوزومية وتحفيز إنترفيرون النوع I. وقد أظهرت الأعمال التأسيسية أن دمج النوكليوسيدات المعدلة في الـ RNA يثبط تنشيط TLR3 وTLR8 وTLR7 ويقلل بشكل ملحوظ من إنتاج السيتوكينات في الخلايا التغصنية، مما يوفر أساساً ميكانيكياً لانخفاض المناعة الفطرية لمنصات mRNA المعدلة بالنوكليوسيدات الحالية¹³. وتؤكد المراجعات الحديثة للقاحات mRNA–LNP وأدوية mRNA على الهندسة المنسقة للغطاء 5′، والمناطق غير المترجمة (UTRs)، والتسلسل المشفر، وذيل poly(A) لزيادة الاستقرار والترجمة in vivo مع تقليل تنشيط المناعة الفطرية إلى أدنى حد¹⁴. وبوجه خاص، ظهر طول وبنية ذيل poly(A) كمحددات رئيسية لاستقرار mRNA المنسوخ in vitro ومخرجات الترجمة، مما دفع نحو تصميمات poly(A) ممتدة أو مهندسة في mRNA العلاجي¹⁵.

وبالإضافة إلى ذلك، يتضمن البروتوكول صراحةً توفير حماية ضد إنزيمات RNases خارج الخلوية والجسيمية خلال مرحلتي تكوين المعقد والامتصاص، إلى جانب تحديد نافذة للهروب من الجسيمات الداخلية باستخدام عامل مؤقت محب لليستوسومات مثل chloroquine^16,17. لقد استُخدم chloroquine لفترة طويلة كمسبار وظيفي للحواجز الجسيمية، ويمكنه زيادة الارتباط بالهدف وإسكات الجينات بشكل ملحوظ بواسطة siRNA أو قليلات النوكليوتيد المضادة للمعنى، وذلك عن طريق تعزيز تمزق غشاء الجسيمات الداخلية وهروب حمولة الحمض النووي إلى العصارة الخلوية¹⁸. وفي الوقت ذاته، أظهر التصوير فائق الدقة وتصوير الخلايا الحية لـ mRNA الذي يتم توصيله بواسطة LNPs أن التوصيل الفعال يواجه عائقًا شديدًا عند أحداث الهروب النادرة من الجسيمات الداخلية المبكرة/المعاد تدويرها، بدلاً من أن يكون العائق في عملية الامتصاص الأولية بحد ذاتها، مما يؤكد أهمية الهندسة المتعمدة لخطوة الهروب من الجسيمات الداخلية في العلاجات القائمة على mRNA¹⁹.

تخلق هذه التغيرات المرتبطة بالشيخوخة في ديناميكيات الغشاء، والاتجار الخلوي بالالتقام، والمعالجة الليزوزومية، وتنشيط المناعة الفطرية، مجتمعةً، عوائق كبيرة أمام التوصيل الفعال لـ mRNA. وقد طُورت استراتيجية عفك التعداء (reverse-transfection) الموصوفة هنا لمعالجة هذه القيود من خلال الجمع بين هندسة mRNA المحسّنة، وحماية RNase، وتعزيز الهروب الإندوسومي، والتعريض المباشر للخلايا الملتصقة لمركبات mRNA والليبيدات مسبقة التكوين. وعلى الرغم من استخدام hTERT mRNA كحموله نموذجية، فإن سير العمل هذا قابل للتطبيق على نطاق واسع لتوصيل نسخ mRNA علاجية كبيرة أخرى إلى المجموعات الخلوية الهرمة والتي يصعب تعداؤها^20,21,22.

البروتوكول

1. النسخ المختبري In vitro لـ mRNA الخاص بـ hTERT

1. النسخ In vitro (IVT) باستخدام ARCA و ΨUTP
   1. قم بتحضير تفاعل IVT بحجم 20 µL وفقاً لـ الجدول 1. يمكن زيادة حجم التفاعل خطياً إذا كانت هناك حاجة إلى إنتاجية أكبر.
   2. اجمع كافة مكونات التفاعل باستثناء T7 RNA polymerase في أنبوب خالٍ من RNase. أضف T7 RNA polymerase في النهاية، وامزج بلطف، ثم قم بطرد مركزي قصير للأنبوب.
   3. حضّن التفاعل عند 37 °C لمدة تتراوح بين 0.5–4 ساعات.
      ملاحظة: اضبط وقت الحضن وفقاً لطول القالب. حضّن التفاعلات التي تحتوي على قوالب قصيرة (حوالي 500 bp) لمدة 30 دقيقة تقريباً، والتفاعلات التي تحتوي على قوالب أكبر (حوالي 4 kb) لمدة 3–4 ساعات.
2. المعالجة بـ DNase
   1. أضف 1 µL من DNase I الخالي من RNase مباشرة إلى خليط تفاعل IVT.
   2. حضّن التفاعل عند 37 °C لمدة 15 دقيقة.
      ملاحظة: يجب إجراء المعالجة بـ DNase مباشرة في تفاعل IVT دون تنقية مسبقة لـ mRNA المُصنّع.
3. تنقية mRNA
   1. أضف 115 µL من H₂O الخالي من النيوكلييز لتخفيف خليط التفاعل.
   2. قم بتنقية mRNA باستخدام طقم تنقية RNA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
   3. استخلص mRNA المنقى في 20–30 µL من H₂O الخالي من النيوكلييز.
   4. قس نقاء mRNA باستخدام القياس الطيفي وتحقق من سلامة RNA عن طريق الرحلان الكهربائي على هلام أغاروز مُنـزِع للبروتينات بتركيز 1.0–1.5% أو هلام بولي أكريلاميد منخفض التركيز.
4. إضافة ذيل Poly(A)
   1. قم بتحضير تفاعل إضافة ذيل poly(A) بحجم 50 µL وفقاً لـ الجدول 2. امزج مكونات التفاعل بلطف وحضّنها عند 37 °C لمدة 30–60 دقيقة.
      ملاحظة: اضبط وقت الحضن وفقاً لكمية RNA المضافة.
   2. أنهِ التفاعل بإضافة 2 µL من 0.5 M EDTA (pH 8.0).
5. التنقية النهائية ومراقبة الجودة
   1. قم بتنقية mRNA ذو ذيل poly(A) باستخدام طقم تنقية RNA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
   2. استخلص mRNA المنقى في 20–30 µL من H₂O الخالي من النيوكلييز.
   3. قيّم جودة mRNA قبل الانتقال إلى عملية التعدي (transfection)
      1. قس تركيز mRNA عند 260 nm وحدد النقاء باستخدام نسب A260/A280 و A260/A230. استخدم تحضيرات mRNA التي تبلغ قيم A260/A280 فيها حوالي 2.0 وقيم A260/A230 أكبر من 2.0.
      2. قيّم سلامة mRNA باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام أو نظام تحليل RNA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
      3. أكد طول ذيل poly(A) عن طريق RT-PCR أو تحليل Bioanalyzer. تحقق من أن طول ذيل poly(A) يتراوح بين 120 و 200 نيوكليوتيد.
      4. قسم mRNA المنقى إلى حصص (aliquots) وخزّن هذه الحصص عند −80 °C لتقليل دورات التجميد والإذابة.

2. ترنسفكشن عكسي

1. اليوم -1: التحضير ما قبل عفن الخلية (Transfection)
   1. التحقق من النمط الظاهري للهرم
      1. إجراء صبغ β-galactosidase المرتبط بالهرم (SA-β-gal) على عينة خلوية ممثلة. والتحقق من أن أكثر من 70% من الخلايا إيجابية.
      2. تأكيد تعبير مؤشرات الهرم (p16 وp21) عن طريق qRT-PCR أو التألق المناعي.
      3. تحديد حيوية الخلايا والتحقق من أن الحيوية تتجاوز 90%.
   2. تحضير الكواشف
      1. تدفئة وسط الزرع الكامل مسبقاً إلى 37 °C.
      2. تدفئة المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) مسبقاً إلى 37 °C.
      3. تحضير وسط Opti-MEM I طازج.
         ملاحظة: لا تضف مثبط RNase إلى Opti-MEM I قبل الاستخدام.
2. اليوم 0: يوم عفن الخلية (Transfection)
   ملاحظة: اترك حوالي 3 h من تحضير الكواشف حتى حضانة الخلايا التي تم عفنها.
   1. تحضير mRNA الخاص بـ hTERT
      1. إذابة hTERT mRNA على الثلج. قياس تركيز mRNA واستخدام تحضيرات بتركيزات تتراوح بين 0.5 و1.0 µg/µL.
      2. تخفيف الكمية المطلوبة من hTERT mRNA في Opti-MEM I وفقاً لصيغة الزرع المستخدمة (الجدول 3). إضافة مثبط RNase ليصل التركيز النهائي إلى 0.5–1.0 U/µL والخلط بلطف.
      3. الحفاظ على mRNA المخفف على الثلج حتى تكوين المعقد.
         ملاحظة: أضف مثبط RNase مباشرة قبل الاستخدام. لا تخزن mRNA مع مثبط RNase، لأن نشاطه ينخفض بعد التجميد.
   2. تحضير كاشف عفن الخلية (Transfection reagent)
      1. دمج 6.0 µL من كاشف عفن الخلية مع 100 µL من Opti-MEM I في أنبوب معقم وخالٍ من RNase. الخلط بلطف عن طريق السحب والضخ بالممصّة.
      2. حضانة الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 min.
         ملاحظة: بالنسبة لبنى hTERT mRNA الكبيرة (~5 kb)، يتم تحسين نسب الكاشف إلى mRNA لتكون بين 0.4 و0.6 µL من الكاشف لكل 100 ng من mRNA.
   3. تكوين معقد mRNA-Lipid
      1. إضافة محلول hTERT mRNA المخفف (100 µL) إلى محلول كاشف عفن الخلية المخفف (106 µL). الخلط بلطف عن طريق السحب والضخ بالممصّة 5–6 مرات.
      2. حضانة الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15–20 min.
      3. يجب ألا تتجاوز مدة تكوين المعقد 30 min.
      4. التحقق من نجاح تكوين المعقد من خلال ظهور محلول عكر قليلاً.
         ملاحظة: قم بتحضير الخلايا خلال فترة تكوين المعقد.
   4. تحضير الخلايا لعفن الخلية العكسي (Reverse transfection)
      1. سحب وسط الزرع من مزارع الخلايا الهرمة.
      2. غسل الخلايا مرة واحدة بـ PBS المدفأ مسبقاً (2 mL لكل بئر في طبق ذو 6 آبار).
      3. إضافة 500 µL من trypsin-EDTA بتركيز 0.05% لكل بئر.
      4. حضانة الخلايا عند 37 °C لمدة 3–5 min.
      5. معادلة الـ trypsin باستخدام 3 mL من الوسط الكامل المحتوي على المصل.
      6. تفتيت الخلايا بلطف للحصول على معلق من الخلايا المفردة.
      7. تحديد عدد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) أو عداد خلايا آلي.
      8. تحضير معلق يحتوي على 2.0–2.5 × 10⁵ خلية لكل بئر في وسط كامل.
         ملاحظة: تجنب عملية الـ trypsinization المطولة لأن الخلايا الهرمة حساسة جداً للإجهاد الميكانيكي. حافظ على الخلايا في حالة معلق؛ ولا تقم بذرعها مسبقاً قبل عفن الخلية العكسي.
   5. عفن الخلية العكسي (Reverse transfection)
      1. تحضير طبق الزرع
         1. إضافة 500 µL من poly-L-lysine بتركيز 0.01% إلى كل بئر من طبق ذو 6 آبار والحضانة لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة.
         2. سحب محلول الطلاء مباشرة قبل الاستخدام.
         3. إضافة 200 µL من معقد hTERT mRNA-lipid إلى مركز كل بئر.
         4. حضانة الطبق عند 37 °C و5% CO₂ لمدة 30 min.
            ملاحظة: قم بطلاء الطبق بالتوازي مع تكوين المعقد وتحضير الخلايا.
      2. تحضير معلق الخلايا
         1. تعليق 2.0–2.5 × 10⁵ خلية في 1800 µL من وسط كامل خالٍ من المضادات الحيوية.
         2. إعادة تعليق الخلايا بلطف للحصول على معلق موحد من الخلايا المفردة.
            ملاحظة: استخدم وسطاً خالياً من المضادات الحيوية أثناء عملية عفن الخلية.
      3. بذر الخلايا فوق المعقدات
         1. إضافة 1800 µL من معلق الخلايا مباشرة فوق معقدات hTERT mRNA-lipid المكونة مسبقاً.
         2. إمالة الطبق بلطف 2–3 مرات في كل اتجاه لتوزيع الخلايا بالتساوي.
            ملاحظة: لا تستخدم الممصّة مع المعلق بعد إضافة الخلايا، لأن ذلك قد يؤدي إلى تفكيك معقدات mRNA-lipid.
      4. حضانة الخلايا
         1. حضانة الخلايا عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO₂ لمدة 6–8 h.
         2. مراقبة التصاق الخلايا بواسطة المجهر الضوئي بعد 2–3 h من عفن الخلية.
         3. التحقق من أن الخلايا موزعة بالتساوي وبدأت في الالتصاق بسطح الزرع.
            ملاحظة: قد يشير العدد المفرط من الخلايا العائمة أو الحطام الخلوي إلى سمية خلوية مرتبطة بعملية عفن الخلية.

3. التخفيف من السُمية الخلوية

1. قلل فترة التعرض لعملية عفن الخلية (transfection) إلى 48 h إذا تجاوز فقدان الخلايا 20%.
2. أضف 10 µM من مثبط ROCK Y-27632 إلى المزارع خلال فترة عفن الخلية لتحسين بقاء الخلايا على قيد الحياة.
3. بعد 6–8 h من عفن الخلية، اشفط وسط عفن الخلية بعناية مع تقليل إزعاج الخلايا الملتصقة جزئياً. اترك حوالي 100 µL من الوسط المتبقي في كل بئر.
4. أضف 1 mL من وسط نمو كامل طازج ومسخن مسبقاً ومدعم بـ 15% FBS إلى كل بئر.
5. أضف الكلوروكين (chloroquine) بتركيز نهائي يتراوح بين 10–20 µM فور استبدال الوسط.
6. حضن المزارع لمدة ساعتين إضافيتين عند 37 °C في حضانة رطبة تحتوي على 5% CO₂.
7. استبدل الوسط المحتوي على الكلوروكين بوسط نمو كامل طازج.
8. أعد المزارع إلى الحضانة لمواصلة النمو.
   ملاحظة: راقب شكل الخلايا وحيويتها طوال فترة التعافي. قد يشير انفصال الخلايا المفرط أو وجود الحطام الخلوي إلى سمية خلوية مرتبطة بعملية عفن الخلية.

4. تحليل ما بعد عفن التحول

1. قيّم تعبير بروتين TERT بعد 24–48 ساعة من عملية عفن الخلية (transfection).
2. قس مستويات بروتين TERT عن طريق لطخة ويسترن (western blotting) أو تلوين التألق المناعي وفقاً للإجراءات المختبرية القياسية.
3. قس نشاط التيلوميراز خلال الفترة الزمنية نفسها باستخدام مقايسة مناسبة لنشاط التيلوميراز.
   ملاحظة: ينخفض نشاط التيلوميراز عادةً بعد 48 ساعة بسبب تحلل mRNA الخاص بـ hTERT الذي تم إدخاله بشكل عابر.
4. قيّم طول التيلومير بعد 48–72 ساعة من عملية عفن الخلية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المتعدد أحادي اللون (MMqPCR) أو طريقة مكافئة لتحليل طول التيلومير.
   ملاحظة: يمكن ملاحظة استطالة ملموسة في التيلومير بعد الإيصال الناجح لـ mRNA الخاص بـ hTERT.
5. قيّم المظاهر المظهرية المرتبطة بالشيخوخة وتلك المرتبطة بتجدد الشباب بعد 7 أيام من عملية عفن الخلية
   1. قس نشاط β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-β-gal).
   2. قس مستويات تعبير p16 وp21.
   3. قيّم تعبير Ki67.
   4. افحص المورفولوجيا الخلوية باستخدام المجهر الضوئي.
      ملاحظة: قارن المزارع المعالجة مع ضوابط هرمة غير معالجة أو خضعت لعفن خلية وهمي (mock-transfected) لتقييم التغيرات في المظاهر المظهرية المرتبطة بالشيخوخة والخصائص التكاثرية.

5. بروتوكول الجرعات المتكررة (اختياري)

1. قم بإجراء عملية ترنسفكشن الأولية كما هو موضح في الأقسام 2-4.
2. كرر عمليات الترنسفكشن وفقاً للجدول الزمني التالي: اليوم 0: الترنسفكشن الأول؛ اليوم 5: الترنسفكشن الثاني؛ اليوم 10-12: الترنسفكشن الثالث.
3. حافظ على الخلايا كمزارع ملتصقة ولا تستخدم التريبسين قبل عمليات الترنسفكشن اللاحقة.
4. حضّر معقدات hTERT mRNA–lipid جديدة كما هو موضح في الأقسام 2.2.1-2.2.3.
5. اشفط وسط المزرعة من كل بئر.
6. أضف 200 µL من معقدات hTERT mRNA–lipid مباشرة إلى كل بئر.
7. أضف 800 µL من وسط F-10 الكامل الطازج فور إضافة المعقدات.
8. حضّن الخلايا لمدة 4-6 h عند 37 °C في حضانة رطبة تحتوي على 5% CO₂.
9. استبدل وسط الترنسفكشن بوسط كامل طازج.
   ملاحظة: اقتصر العلاج على ثلاث دورات ترنسفكشن كحد أقصى لتقليل السمية الخلوية التراكمية المرتبطة بالترنسفكشن.

6. بروتوكول عفن التعدي الأمامي (2 µg/mL، تنسيق 6 آبار)

1. اليوم −1: استزراع الخلايا
   1. فصل الخلايا الليفية الهرمة أو التي في بداية طور الهرم باستخدام 0.05% trypsin-EDTA.
   2. تعادل تأثير الـ trypsin باستخدام وسط استزراع كامل.
   3. تحديد عدد الخلايا ومدى حيويتها.
   4. استزراع الخلايا في أطباق ذات 6 آبار بكثافة 2.0–2.5 × 10⁵ خلية لكل بئر.
   5. تحضين الخلايا طوال الليل عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO₂ حتى تصل نسبة التلاقي إلى 60–80% تقريبًا.
2. اليوم 0: تحضير معقدات hTERT mRNA والكاشف
   1. إذابة جزء من hTERT mRNA المعدل بالنوكليوزيد على الثلج.
   2. تخفيف hTERT mRNA في Opti-MEM ليصل إلى تركيز نهائي قدره 2 µg/mL في أنبوب معقم خالٍ من RNase (الأنبوب A).
   3. إضافة مثبط RNase إلى الأنبوب A بتركيز نهائي يتراوح بين 0.5–1.0 U/µL والخلط برفق.
   4. تخفيف كاشف عفن الخلايا (transfection reagent) في Opti-MEM في أنبوب ثانٍ خالٍ من RNase (الأنبوب B) باستخدام 0.4–0.6 µL من الكاشف لكل 100 ng من mRNA.
   5. إضافة محتويات الأنبوب B قطرة بقطرة إلى الأنبوب A مع الخلط برفق.
   6. تحضين الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15–20 دقيقة.
3. اليوم 0: عملية عفن الخلايا الأمامي (Forward transfection)
   1. التأكد من أن نسبة تلاقي الخلايا تتراوح بين 60–80% وأنها تظهر شكلاً مورفولوجياً سليماً.
   2. سحب وسط الاستزراع.
   3. غسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 1–2 mL من PBS المُدفأ مسبقاً.
   4. إضافة 0.5 mL من وسط كامل أو وسط منخفض المصل المُدفأ مسبقاً إلى كل بئر.
   5. إمكانية إضافة chloroquine بتركيز نهائي يتراوح بين 10–20 µM.
   6. إضافة 0.5 mL من معقدات hTERT mRNA والكاشف التي تم تحضيرها في الخطوة 6.2.6 إلى كل بئر.
   7. هز الطبق برفق لتوزيع المعقدات بشكل متساوٍ.
   8. تحضين الخلايا لمدة 4–6 ساعات عند 37 °C في حاضنة رطبة تحتوي على 5% CO₂.
      ​ملاحظة: تمديد فترة التحضين إلى 6–8 ساعات للخلايا الهرمة إذا لزم الأمر.
   9. سحب وسط عملية العفن.
   10. إضافة 2.0 mL من وسط كامل طازج إلى كل بئر.
   11. إجراء تحليلات ما بعد عملية العفن كما هو موضح في القسم 4.
       ملاحظة: استخدم نفس دفعة hTERT mRNA، ونفس كاشف عفن الخلايا، والجرعة الاسمية عند مقارنة ظروف عفن الخلايا الأمامي والعكسي.

النتائج

تم هندسة modRNA d2EGFP-T2A-hTERT كإطار قراءة مفتوح هجين، حيث رُبط مراسل EGFP غير المستقر (d2EGFP) بـ TERT البشري عبر ببتيد T2A ذاتي الانقسام. تتوفر تتابعات النيوكليوتيدات والبروتينات الكاملة لجميع البنى في الملحق 1. وقد أُحيط تتابع الترميز بمنطقة 5′ غير مترجمة (UTR) اصطناعية ومنطقة 3′ UTR لـ β-globin البشري لتعزيز كفاءة الترجمة واستقرار mRNA (الشكل 1A). كما احتوت كاسيت التعبير على تتابع اصطناعي لمثبت الإنزيم (Es) وتتابع اصطناعي معزز للنسخ (TEs) مصمم لتحسين إنتاجية T7 polymerase وتقليل الإنهاء المبكر لعملية النسخ. وبعد الاستنساخ في اتجاه المصب من محفز T7، أُجري النسخ in vitro باستخدام نظير القبعة المضاد للعكس (ARCA) ونيوكليوتيدات معدلة (m5CTP و ΨUTP)، يليه إضافة ذيل poly(A) إنزيميًا (حوالي 120–200 nt) لإنتاج modRNA d2EGFP-T2A-hTERT ذو سلامة عالية، ومُتوج، ومُبولي مُذيل (الشكل 1A).

أكد التحليل الكهربائي الآلي لـ RNA كفاءة تخليق النسخة، حيث كشف عن وجود نوع سائد من RNA بالحجم المتوقع مع وجود حد أدنى من نواتج التحلل عبر كميات إدخال متعددة، مما يتوافق مع التوليد الناجح لـ modRNA كامل الطول (الشكل 1B). وبعد ترنسفكشن خلايا LF1 الليفية في مرحلة الشيخوخة المبكرة بـ 2 µg/mL من d2EGFP-T2A-hTERT modRNA، أصبح بروتين hTERT قابلاً للكشف خلال 24 h وظل مرتفعاً لمدة 48–96 h، مما يشير إلى ترجمة مستمرة للنسخة التخليقية (الشكل 1C). وأظهر تحليل مراسل d2EGFP المرتبط به فلورة قوية بعد الترنسفكشن العكسي، بينما لوحظت فلورة أقل بكثير بعد الترنسفكشن الأمامي (الشكل 1D,E). تشير هذه النتائج إلى تحسين توصيل وتعبير hTERT modRNA باستخدام نهج الترنسفكشن العكسي في خلايا LF1 الليفية في مرحلة الشيخوخة المبكرة.

أدى التعداء الأمامي (FT) المتكرر لخلايا ليفية من سلالة LF1 في مرحلة الشيخوخة المبكرة باستخدام modRNA الخاص بـ d2EGFP-T2A-hTERT على فترات زمنية مدتها 5 أيام إلى زيادة تدريجية في متوسط طول التيلومير (rT/S) مقارنة بمجموعات الضبط التي خضعت لتعداء وهمي، وذلك وفقاً لقياسات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المتعدد أحادي اللون (MMqPCR) (الشكل 2A). وقد ارتفعت نسبة rT/S بعد كل دورة تعداء أمامي، مع تحسن في الدلالة الإحصائية من *P < 0.05 إلى **P < 0.01.

أدى تطبيق جدول الجرعات نفسه باستخدام عفن التعدي العكسي (RT) إلى زيادة أكثر وضوحاً في طول التيلومير. حيث ارتفعت نسبة rT/S بعد كل دورة من دورات RT ووصلت إلى فروق ذات دلالة إحصائية عالية مقارنة بمجموعات الضبط التي خضعت لعفن تعدي وهمي (*P < 0.05 إلى ****P < 0.0001) (الشكل 2B). وقد أظهرت المقارنة المباشرة بين عفن التعدي الأمامي (FT) وعفن التعدي العكسي (RT) بعد ثلاث دورات علاجية أن كلا النهجين قد أديا إلى زيادة قيم rT/S بشكل ملحوظ مقارنة بمجموعات الضبط التي خضعت لعفن تعدي وهمي؛ ومع ذلك، حقق RT زيادة أكبر من FT في ظل ظروف الجرعات والتوقيت ذاتها (*P < 0.05, ***P < 0.001, ****P < 0.0001) (الشكل 2C).

أظهر تحليل النمو طويل الأمد أن التوصيل المتكرر لـ hTERT modRNA أدى إلى إطالة العمر التضاعفي (الشكل 2D). وقد أظهرت الخلايا التي تلقت دورة علاجية واحدة أو دورتين أو ثلاث دورات زيادة تدريجية في التضاعفات السكانية التراكمية مقارنة بمجموعات التحكم التي خضعت لعملية ترانسفكشن وهمية. وأظهرت المزارع التي تلقت ثلاث جولات من العلاج بـ hTERT modRNA، خاصة عن طريق RT، أكبر تباعد عن منحنيات نمو مجموعة التحكم على مدار 250 يومًا تقريبًا (حتى ****P < 0.0001). وتظهر حسابات التضاعف السكاني في الملف التكميلي 2.

أظهرت الخلايا الليفية LF1 في مرحلة الشيخوخة المبكرة والمعدلة وراثياً بـ d2EGFP-T2A-hTERT modRNA نمطاً قوياً من السلالم في مقايسة TRAP بعد 48 ساعة من عملية التعديل، بينما أظهرت الخلايا التي خضعت للمعالجة الوهمية أو المعالجة بـ eGFP-modRNA إشارات خلفية فقط، مما يشير إلى أن نشاط التيلوميراز ناتج عن التعبير الخارجي لـ hTERT (الشكل 3A). وقد أدى المعالجة المسبقة بالحرارة إلى إلغاء نمط السلالم، مما يؤكد خصوصية المقايسة (الشكل 3B).

أظهر تحليل المخطط الزمني أن نشاط التيلوميراز بلغ ذروته بين 24 و48 ساعة بعد عملية عفن الخلية (transfection)، ثم انخفض لاحقاً ليعود إلى مستويات قريبة من خط الأساس بحلول الساعة 72–96 (الشكل 3C). وقد أدى زيادة تركيز hTERT modRNA من 50 إلى 3,000 ng/mL إلى زيادة مقابلة في شدة إشارة TRAP، مما يثبت تنشيط التيلوميراز المعتمد على الجرعة (الشكل 3D).

أظهر التحليل الوظيفي باستخدام بنيات hTERT من النوع البري (wild-type)، والنوع غير النشط تحفيزياً (CI)، والنوع المفتقر لإشارة التوطين النووي (ΔNLS)، أن hTERT من النوع البري فقط هو الذي ولّد نشاطاً قوياً للتيلوميراز. وفشل كل من المتغيرين CI وΔNLS في تحفيز نشاط مماثل على الرغم من تماثل ظروف الإيصال (الشكل 3E). وتماشياً مع هذه النتائج، كشف تحليل MMqPCR عن زيادة ملحوظة في متوسط طول التيلومير (rT/S ≈ 1.4) فقط في الخلايا التي تلقت modRNA الخاص بـ hTERT من النوع البري. أما الخلايا التي تلقت CI-hTERT أو ΔNLS-hTERT أو المعالجة الوهمية فقد ظلت عند مستويات قريبة من الخط الأساسي (rT/S ≈ 0.3; ****P < 0.0001) (الشكل 3F).

أدت ثلاث جولات متتالية من عفن التحول العكسي باستخدام modRNA الخاص بـ hTERT بفواصل زمنية مدتها 5 أيام إلى تقليل نسبة الخلايا الموجبة لإنزيم β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة بشكل ملحوظ. حيث انخفضت نسبة الخلايا الموجبة من حوالي 85% في المزارع التي خضعت لمعاملة وهمية إلى حوالي 40% في المزارع المعالجة بـ hTERT بعد 15 يوماً من عملية التحول الأخيرة (***P < 0.001) (الشكل 4A).

كشف التلوين المناعي البؤري عن زيادة في تعبير Ki67 في الخلايا التي تلقت ثلاث جولات من ترانسفكشن hTERT العكسي مقارنة بمجموعات الضبط التي عولجت وهمياً، مما يشير إلى زيادة في النشاط التكاثري (الشكل 4B). كما أظهر تحليل RT-qPCR انخفاضاً في تعبير علامات الشيخوخة p16 وp21 عقب المعالجة بـ hTERT. وبالنسبة للخلايا في مرحلة الشيخوخة المبكرة المعالجة وهمياً، انخفض تعبير p16 من حوالي 2.3 ضعف إلى 0.7 ضعف، وانخفض تعبير p21 من حوالي 11 ضعف إلى 6 أضعاف (**P < 0.01; ****P < 0.0001) (الشكل 4C,D). ويوضح الشكل التكميلي 1 كذلك أن المعالجة بـ chloroquine (CQ) أو Y-27632 وحدهما لم تؤدِ إلى تغيير ملحوظ في تعبير p16 أو p21 في الخلايا التي أجري لها ترانسفكشن وهمي. وفي المقابل، أدى الجمع بين CQ وY-27632 خلال ثلاث جولات من ترانسفكشن hTERT العكسي إلى أكبر انخفاض في تعبير كل من p16 وp21 مقارنة بترانسفكشن hTERT العكسي وحده أو بأي من العاملين بشكل فردي، بينما أدت المعالجة بعامل واحد إلى تأثيرات متوسطة. وتشير هذه النتائج إلى أن الاستخدام المشترك لـ CQ وY-27632 عزز من خفض تعبير علامات الشيخوخة عقب ترانسفكشن hTERT mRNA العكسي. وتثبت هذه النتائج مجتمعة أن الترانسفكشن العكسي المتكرر لـ hTERT mRNA يعزز استطالة التيلومير، ويقلل من علامات الشيخوخة، ويعزز الخصائص التكاثرية في خلايا LF1 الليفية في مرحلة الشيخوخة المبكرة.

الشكل 1: تصميم وتخليق والتحقق الوظيفي من mRNA لـ d2EGFP‑T2A‑ hTERT في الخلايا الليفية LF1 في مرحلة الشيخوخة المبكرة. (A) تصميم تخطيطي لبنية hTERT mRNA الهجينة التي تحتوي على كاسيت d2EGFP المرتبط بببتيد T2A للتعبير المتزامن عن hTERT و EGFP غير المستقر. يحيط بإطار القراءة المفتوح (ORF) لـ d2EGFP-T2A-hTERT منطقة 3’ UTR من جين β globin البشري (HBB) ومنطقة 5’ UTR اصطناعية. تم تخليق mRNA باستخدام نيوكليوتيدات معدلة، وأضيف في النهاية ذيل poly (A). (B) التخليق الفعال لـ d2EGFP-T2A-hTERT mRNA عالي السلامة باستخدام النسخ in vitro كما تم تحليله بواسطة التحليل الكهربائي الآلي لـ RNA. (C) تحليل المسار الزمني للتعبير عن بروتين hTERT باستخدام مقايسة مناعية آلية قائمة على الشعيرات بعد تر transfection لـ 2 µg/mL من d2EGFP-T2A-hTERT mRNA. (D) تم فحص فعالية وتعبير تر transfection لـ d2EGFP-T2A-hTERT mRNA، كما تم تقييمه من خلال تعبير EGFP بين التر transfection الأمامي (FT) والتر transfection العكسي (RT)، في الخلايا الليفية ثنائية الصيغة الصبغية الأولية في مرحلة الشيخوخة المبكرة (LF1). شريط المقياس = 10 µm. (E) قياس متوسط شدة الفلورة (MFI) لإشارة eGFP بعد التر transfection الأمامي أو العكسي. تم تحليل إجمالي 20 صورة فردية لكل حالة، شملت 4 مناطق متميزة من 5 مكررات بيولوجية. تمثل البيانات المتوسطات ± SD. **P < 0.01؛ كما تم تقييمه بواسطة اختبار t غير المزدوج مع تصحيح Welch. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: ديناميكيات طول التيلومير وعمر التكاثر بعد عمليات عفن متكررة لـ mRNA الخاص بـ hTERT في الاتجاه الأمامي مقابل الاتجاه العكسي في الخلايا الليفية LF1 في مرحلة الشيخوخة المبكرة. (A) تم تحديد متوسط أطوال التيلومير (rT/S) باستخدام تقنية Telomere MMqPCR. خضعت الخلايا الليفية في مرحلة الشيخوخة المبكرة لعملية عفن أمامي (FT) باستخدام d2EGFP-T2A-hTERT mRNA ثلاث مرات متتالية على فترات زمنية مدتها 5 أيام، بدءاً من مضاعفة عدد السكان (PD) رقم 76. يشير شريط الخطأ إلى SEM؛ n = 5 مكررات بيولوجية؛ *P < 0.05، **P < 0.01 مقارنة بالخلايا التي عولجت بـ mock فقط. (B) على غرار (A)، تم تقييم rT/S عندما خضعت الخلايا في مرحلة الشيخوخة المبكرة لعملية عفن متكرر (RT) باستخدام d2EGFP-T2A-hTERT mRNA ثلاث مرات متتالية على فترات زمنية مدتها 5 أيام، بدءاً من مضاعفة عدد السكان (PD) رقم 76. يمثل شريط الخطأ SEM؛ n = 7 مكررات بيولوجية؛ *P < 0.05، ****P < 0.0001 مقارنة بالخلايا التي عولجت بـ mock فقط. (C) مقارنة متوسط طول التيلومير (rT/S) بعد 3 عمليات عفن أمامية وعكسية متتالية على فترات زمنية مدتها 5 أيام، أو mock فقط. يمثل شريط الخطأ SEM؛ n = 10 مكررات بيولوجية؛ *P < 0.05، ***P < 0.001، ****P < 0.0001. (D) منحنيات النمو للخلايا الليفية LF1 التي تم عفنها باستخدام 2 µg/ml من d2EGFP-T2A-hTERT mRNA أو mock فقط، مرة واحدة، أو مرتين، أو ثلاث مرات متتالية على فترات زمنية مدتها 5 أيام بدءاً من PD# 76. تشير الأسهم السوداء إلى توقيتات المعالجة. تم تكرار منحنيات النمو ثلاث مرات، مع زراعة كل مجموعة في ثلاث نسخ مكررة. 3 مكررات تقنية لكل عينة بيولوجية، والبيانات تمثل المتوسطات ± SD. *P < 0.05، **P < 0.01؛ ****P < 0.0001، وفقاً لتقييم اختبار Brown-Forsythe و Welch’s ANOVA يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: يؤدي mRNA لـ hTERT النشط تحفيزياً والمتموضع في النواة إلى زيادة عابرة ومعتمدة على الجرعة في نشاط التيلوميراز، وهو أمر كافٍ بمفرده لتعزيز استطالة ملموسة في التيلوميرات في خلايا LF1 الليفية في مرحلة الشيخوخة المبكرة. (A) تم ترانسفكشن خلايا في مرحلة الشيخوخة المبكرة بـ mock، أو eGFP، أو d2EGFP-T2A-hTERT mRNA. بعد 48 h من الترانسفكشن، تم تحضير مستخلص خلوي من 20,000 خلية وإخضاعه لمقايسة TRAP. تم تشغيل نواتج التفاعل على native PAGE وصيغت بـ SYBR Green. (B) تثبيط نشاط التيلوميراز بوساطة الحرارة كما تم قياسه باستخدام مقايسة TRAP. (C) أظهر تحليل نشاط التيلوميراز بمرور الوقت في خلايا LF1 في مرحلة الشيخوخة المبكرة بعد ترانسفكشن hTERT mRNA أن النشاط عاد إلى المستوى الأساسي في غضون 72 h، مما يشير إلى تنشيط إنزيمي عابر. (D) تلقت خلايا LF1 في مرحلة الشيخوخة المبكرة كميات متفاوتة من d2EGFP-T2A-hTERT mRNA (0–3,000 ng/mL)، مما أظهر زيادة في نشاط التيلوميراز تتناسب مع الجرعة. (E) أدى إيصال 2 µg/ml من TERT إلى زيادة نشاط التيلوميراز في خلايا LF1 في مرحلة الشيخوخة المبكرة. زاد ΔNLS من نشاط التيلوميراز جزئياً دون تحفيز استطالة التيلوميرات، حيث يعمل في السيتوبلازم ولكن لا ينتقل إلى النواة، بينما لم يؤدِ CI TERT mRNA إلى هذا التأثير، مما يشير إلى نتائج وظيفية متميزة. (F) تأثير الترانسفكشن العكسي لـ TERT الوظيفي، وTERT المفتقر إلى إشارة التموضع النووي (ΔNLS)، وTERT غير النشط تحفيزياً (CI) على متوسط أطوال التيلوميرات (rT/S) لخلايا LF1 في مرحلة الشيخوخة المبكرة، مما يشير إلى أهمية TERT النشط تحفيزياً والمتموضع في النواة في استطالة التيلوميرات. يمثل شريط الخطأ SD؛ n = 7 مكررات بيولوجية؛ ****P < 0.0001 مقارنة بالخلايا المعالجة بـ mocks فقط، كما تم تقييمه بواسطة one-way ANOVA مع تصحيح Welch. تم تدوين RTA%-نشاط التيلوميراز النسبي (% من الضابط) في أسفل كل مسار. تم حساب نسبة مستويات كثافة سلالم عينات TRAP ونطاق ITAS (الضابط الداخلي- IC) وفقاً للصيغة التالية لكل مسار: Activity _normalized = Ladder intensity/ IC intensity وتم تطبيع كل عينة نسبة إلى الضابط الموجب كنسبة مئوية (الضابط الموجب؛ 2,500 خلية H1299) باستخدام الصيغة التالية: Relative activity (%) =Activity _normalized (sample)/ Activity _normalized (reference). تم تطبيق طرح الخلفية في كل خطوة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 4: يؤدي التعديل الأمثل لعملية التعداء العكسي لـ hTERT mRNA إلى عكس جزئي للأنماط الظاهرية المرتبطة بالشيخوخة واستعادة علامات التكاثر في الخلايا الليفية LF1 في مرحلة الشيخوخة المبكرة. (A) صور ممثلة لخلايا LF1 في مرحلة الشيخوخة المبكرة التي تعبر عن β-gal بعد إجراء التعداء العكسي لـ hTERT mRNA المعدل 3 مرات متتالية بفواصل زمنية مدتها 5 أيام. شريط المقياس = 100 µm. تم تحليل تعبير β-gal بعد 15 يوماً من آخر عملية تعداء. أُجريت التجارب ثلاث مرات مع تقييم يدوي لـ >100 خلية لكل عينة. (B) صور مجهرية بؤرية ممثلة (تكبير 20x) لخلايا LF1 في مرحلة الشيخوخة المبكرة، مصبوغة بعلامة التكاثر Ki67. شريط المقياس = 100 µm. زيادة ملحوظة في تعبير Ki-67 بعد 3 جولات من التعداء العكسي لـ hTERT. تزداد نسبة النوى الإيجابية لـ Ki67 بشكل ملحوظ بعد 3× hTERT (RT). يمثل الرسم البياني المتوسط ± SD لعدد النوى الإيجابية لـ Ki67، مع تطبيعها بالنسبة لحالة التعداء الوهمي (Mock-transfected). لكل حالة، تم فحص إجمالي 18 صورة، حيث تم اختيار 6 حقول متميزة من كل مكرر بيولوجي، بإجمالي n = 3 مكررات بيولوجية. ****P < 0.0001. (C) تعبير علامات الشيخوخة بعد التجديد الجزئي بوساطة 3× hTERT كما تم تقييمه بواسطة RT-qPCR (n = 6). تمثل جميع البيانات المتوسطات ± SD. **P < 0.01؛ ****P < 0.0001، كما تم تقييمه بواسطة اختبار t غير المقترن مع تصحيح Welch. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المكوّن	الحجم/التركيز النهائي
DNA قالب لـ PCR	200 –1000 ng
10× IVT Buffer	2 μL
ATP (100 mM)	2 μL (التركيز النهائي 10 mM)
GTP (100 mM)	1.5 μL (التركيز النهائي 7.5 mM)
CTP (100 mM)	2 μL (التركيز النهائي 10 mM)
m1Ψ-5′-TP (100 mM)	2 μL (التركيز النهائي 10 mM) (يمكن زيادة دمج pseudo-UTP عن طريق دمج UTP العادي بنسبة 1:4-2:2 (m1Ψ-5′-TP:UTP).)
ARCA (10 mM)	4 μL (التركيز النهائي 2 mM)
RNase Inhibitor (40 U/μL)	0.5 μL (20 U)
T7 RNA Polymerase (50 U/μL)	2 μL (100 U)
H₂O خالية من النيوكلياز	20 μL

الجدول 1: تكوين تفاعل النسخ في المختبر (IVT) لتخليق mRNA لـ hTERT المعدل بالنوكليوزيد. تم إدراج مكونات التفاعل والكميات النهائية المستخدمة في تخليق IVT ذات الغطاء ARCA.

المكون	الحجم/التركيز النهائي
mRNA منقى حتى 5 μg	≤20 μL
10× Poly(A) Tailing Buffer	5 μL
ATP (10 mM	5 μL (1 mM نهائي) (على الرغم من وجوده بالفعل في المحلول المنظم، إلا أن الإضافة الإضافية تساعد في استقرار poly A.)
Poly(A) Polymerase (5 U/μL)	1 μL (5 U)
Nuclease-free H₂O	حتى إجمالي 50 μL

الجدول 2: تركيب تفاعل إضافة ذيل poly(A) المستخدم للتعديل ما بعد النسخي لـ mRNA الخاص بـ hTERT. يوضح الجدول أحجام الكواشف وظروف التفاعل اللازمة لتوليد ذيل poly(A) يتراوح طوله بين 120–200 نيوكليوتيد.

المَعلمة	تنسيق 12 بئراً	تنسيق 6 آبار
مساحة سطح النمو	~3.8 cm²	~9.5 cm²
الوسط الغذائي لكل بئر	1.0 mL	2.0 mL
عدد استزراع الخلايا	5× 104–6.5× 104 Cells/ml	2.0–2.5 × 10⁵
متوسط عدد الخلايا (عند تلاقي بنسبة 100%)	5.7× 104–7.2× 104 Cells/ml	2.9–3 × 10⁵
كمية ترنسفكشن mRNA	750 –1000ng	2000–3500 ng
عامل ترنسفكشن mRNA	1.5 – 3.0 µL	4.75 – 7 µL
الحجم النهائي لـ mRNA + عامل الترنسفكشن في Opti-MEM	50 µL	200 µL

الجدول 3: معاملات ترنسفكشن الموصى بها لتوصيل mRNA لـ hTERT في تنسيقات زراعة ذات 6 آبار و12 بئراً. تلخيص لكثافات استزراع الخلايا، وكميات mRNA، وأحجام كاشف الترنسفكشن، وأحجام تكوين المعقد المستخدمة في تجارب الترنسفكشن الأمامي والعكسي.

الشكل التكميلي 1: تأثير الكلوروكين وY-27632 على تعبير p16 وp21 المرتبط بالشيخوخة بعد عملية ترانسفكشن عكسية متكررة لـ mRNA الخاص بـ hTERT. (Aتحليل RT-PCR الكمي للتعبير عن mRNA لبروتين p16 في العينات المعالجة وهمياً وتلك المعالجة بـ 3× خلايا LF1 الليفية المنسوخة عكسياً (RT) لـ hTERT بعد المعالجة بالكلوروكين (CQ)، أو Y-27632، أو مزيجهما، كما هو موضح. (Bتحليل RT-PCR الكمي للتعبير عن mRNA لبروتين p21 تحت نفس الظروف التجريبية. تم توحيد مستويات النسخ بناءً على RpL13a، وعُبر عنها بالنسبة إلى الخلايا الضابطة الشابة (PD#12). تمثل نقاط البيانات الفردية مكررات بيولوجية. تمثل البيانات المتوسطات. ± الانحراف المعياري لـ n = 2 مكررات بيولوجية، مع 5 مكررات تقنية لكل مكرر بيولوجي. الدلالة الإحصائية موضحة في الشكل؛ ns، غير دال إحصائياً. *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001، وفقاً لما تم تحديده بواسطة اختبار Brown–Forsythe واختبار Welch's ANOVA. الاختصارات: CQ، كلوروكين؛ RT، ترانسفكشن عكسي؛ Y-27632، مثبط كيناز البروتين المرتبط بـ Rho (ROCK).يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: تسلسلات الحمض النووي DNA والبروتين لبنى تعبير hTERT.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: حساب تضاعف الجمهرة (PD).تم حساب تضاعفات الجمهرة (PD) باستخدام الصيغة PD = log₂ (Nf/N₀)، حيث تمثل N₀ عدد الخلايا المزروعة، وتمثل Nf عدد الخلايا الحية التي تم حصادها. وتم تحديد تضاعف الجمهرة التراكمي عن طريق جمع قيم PD عبر الممرات الخلوية.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تعيد هذه الدراسة صياغة الشيخوخة الخلوية باعتبارها مشكلة توصيل متميزة بدلاً من كونها مجرد تباين طفيف في الفسيولوجيا التكاثرية، وتطور استراتيجية لنقل mRNA الخاص بالتيلوميراز مصممة خصيصاً لتلائم القيود الفيزيائية الحيوية والمناعية للحالة الهرمة. تظهر الخلايا الهرمة أغشية صلبة وغنية بالكوليسترول مع انخفاض في نشاط الالتقام الخلوي، مما يخلق حاجزاً كبيراً أمام التوصيل الفعال للأحماض النووية. ومن خلال اعتماد نهج النقل العكسي، يستغل هذا البروتوكول فترة الالتصاق العابرة التي تخضع خلالها الخلايا الهرمة لإعادة تشكيل الغشاء وتظهر لديهما لدونة غشائية متزايدة، وبذلك يتم مزامنة تلامس المعقد الخلوي مع فترة تعزيز إمكانات الامتصاص^3,4. وتظهر النتائج التمثيلية أن هذه الاستراتيجية تحسن من توصيل وتعبير modRNA لـ hTERT مقارنة بالنقل الأمامي التقليدي، مما يؤدي إلى استطالة أكبر في التيلوميرات وظهور أنماط ظاهرية مرتبطة بتجديد الشباب بشكل أكثر وضوحاً.

تتمثل السمة المركزية لهذه الطريقة في استراتيجية هندسة mRNA متعددة الطبقات مصممة لمعالجة ثلاثة عوائق رئيسية في الخلايا الهرمة: ارتفاع إشارات المناعة الفطرية، وزيادة تحلل RNA، وضعف القدرة الترجمية^23,24,25. ويؤدي دمج pseudouridine و 5-methylcytidine إلى تقليل تنشيط مسارات إشارات TLR3 و TLR7/8 و RIG-I، مع تعزيز استقرار النسخ وكفاءة الترجمة في الوقت ذاته^13,26. كما يعمل استخدام ARCA capping وتحسين ذيل poly(A) على تحسين استقرار النسخ والناتج الترجمي بشكل أكبر، مما يتيح تعبيراً قوياً ولكن مؤقتاً لـ hTERT. وتماشياً مع الدراسات السابقة، تدعم هذه التعديلات التعبير الفعال عن التيلوميراز مع تقليل تنشيط المناعة الفطرية المرتبط بتوصيل RNA خارجي المنشأ.

يتناول البروتوكول أيضاً البيئة خارج الخلوية الغنية بـ RNase والتي تميز المزارع الهرمة²⁷. ويتم تعزيز حماية RNA من خلال تعديل النوكليوزيد، وتكوين مركبات ليبيدية، والإضافة الفورية لمثبط RNase قبل عملية عفن الخلايا (transfection). بالإضافة إلى ذلك، تم تعديل توقيت عفن الخلايا العكسي (reverse transfection) ليتناسب مع حركية الالتصاق الأبطأ للخلايا الهرمة، مما يسمح بتفاعل مطول بين الخلايا ومركبات mRNA-lipid أثناء التصاق الخلايا. وتعمل هذه التعديلات مجتمعة على تحسين احتمالية الامتصاص الناجح للحمولة في مجموعة خلوية يصعب إجراء عملية عفن الخلايا لها في الظروف العادية.

يمثل الهروب الإندوسومي عقبة حرجة ثانية أمام توصيل mRNA في الخلايا الهرمة. تظهر الخلايا الهرمة زيادة في المحتوى الليزوزومي وتعزيزاً في نقل الشحنات التي يتم إدخالها عبر الالتقام الخلوي نحو الحجيرات التحللية^17,28. يؤدي التعرض المؤقت للكلوروكين خلال الفترة المبكرة التي تلي عملية عفن الخلايا (transfection) إلى تحسين التوصيل الوظيفي من خلال تعزيز الهروب الإندوسومي وتقليل التحلل الليزوزومي لـ mRNA المُمتص داخلياً. وعلى الرغم من أن الجرعة المثلى ومدة التعرض قد تختلف باختلاف أنواع الخلايا، إلا أن النتائج المعروضة هنا تشير إلى أن تعزيز الهروب الإندوسومي يحسن بشكل كبير من كفاءة التوصيل في الخلايا الليفية الهرمة.

على المستوى الوظيفي، أدى الإعطاء المتكرر لـ hTERT modRNA إلى زيادات تراكمية في طول التيلومير النسبي، وإطالة العمر النسخي، وتقليل العديد من المظاهر المرتبطة بالشيخوخة. وأظهرت الخلايا التي تلقت علاج hTERT المتكرر انخفاضاً في نشاط SA-β-gal، وانخفاضاً في تعبير p16 وp21، وزيادة في تعبير Ki67، وتعزيزاً في القدرة التكاثرية مقارنة بمجموعات التحكم التي خضعت لعملية ترانسفكشن وهمية. ومن المهم ملاحظة أن نشاط التيلوميريز ظل عابراً، حيث عاد إلى مستويات قريبة من خط الأساس في غضون عدة أيام بعد عملية الترانسفكشن. ويتجنب ملف التعبير العابر هذا التعديل الجيني الدائم مع الاستمرار في توفير نشاط تيلوميريز كافٍ لتعزيز تأثيرات بيولوجية ملموسة. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن قياسات طول التيلومير النسبي التي تم الحصول عليها بواسطة MMqPCR لا تحدد كمياً وبشكل مباشر التمدد المطلق للتيلومير. وستوفر الدراسات المستقبلية التي تدمج تحليل قطعة التقييد النهائية، أو التهجين الموضعي الفلوري الكمي، أو Flow-FISH، أو منهجيات TeSLA تقييماً أكثر دقة لديناميكيات طول التيلومير بعد إيصال hTERT mRNA.

هناك عدة قيود تستوجب النظر. تتسم مجموعات الخلايا الهرمة بطبيعتها بالتغاير، وقد تختلف استجابتها لإيصال mRNA اعتماداً على طريقة تحفيز الهرم، ومصدر المتبرع، وتاريخ المزرعة الخلوية. وبناءً على ذلك، قد تختلف كفاءة عفن الخلية (transfection) ونتائج استعادة الشباب بين الأنظمة التجريبية. علاوة على ذلك، فإن إعادة تنشيط التيلوميراز تعالج بشكل أساسي الجوانب المعتمدة على التيلومير في الشيخوخة الخلوية ولا تصحح بشكل مباشر جميع سمات الهرم. وقد تستمر التغيرات المرتبطة بالشيخوخة مثل الانحراف فوق الجيني، والخلل الوظيفي في الميتوكوندريا، واختلال التوازن البروتيني، وإشارات الالتهاب المزمنة على الرغم من النجاح في إطالة التيلومير^29,30. لذا، يجب النظر إلى هذا البروتوكول كأداة مستهدفة لدراسة الهرم المدفوع بالتيلومير وعكسه جزئياً، وليس كاستراتيجية شاملة لاستعادة الشباب.

تعتبر المعايير الموضحة في هذا البروتوكول بمثابة إرشادات عملية للخلايا البشرية الهرمة، وقد تم تطويرها من خلال تحسين تكراري استناداً إلى الدراسات المنشورة والخبرة التجريبية. قد تتطلب العوامل التي تشمل كثافة الخلايا، ونسبة كاشف عفن الخلية إلى mRNA، ووقت تكوين المعقد، وظروف الهروب الإندوسومي، تعديلاً بما يتناسب مع أنواع الخلايا الفردية والإعدادات التجريبية. لذا، ينبغي للباحثين اعتبار الظروف المذكورة نقطة انطلاق لعملية التحسين بدلاً من كونها نتائج نهائية قابلة للتطبيق بشكل عام.

باختصار، يوفر هذا البروتوكول إطاراً قابلاً للتكرار لإيصال mRNA المعدل لـ hTERT إلى الخلايا البشرية الهرمة باستخدام استراتيجية عفك ترانسفكشن (reverse-transfection) محسّنة لتناسب الخصائص الفسيولوجية للهرم الخلوي. يتيح هذا النهج إعادة تنشيط مؤقتة للتيلوميراز، وإطالة ملموسة في التيلوميرات، وتمديد العمر التكراري، وعكساً جزئياً للأنماط الظاهرية المرتبطة بالهرم الخلوي. يجب أن تقيم الدراسات المستقبلية مدى إمكانية تطبيق هذه الاستراتيجية على أنواع إضافية من الخلايا الهرمة، واستقصاء نهج الدمج مع تدخلات تجديدية تكميلية، واستكشاف إمكانية نقلها إلى منصات إيصال in vivo. وبذلك، توفر هذه الطريقة أداة قيمة لاستقصاء بيولوجيا التيلوميرات، وتجديد الخلايا، وآليات الهرم الخلوي في أبحاث الشيخوخة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
مزيج هام الغذائي F-10	Thermo Fisher	11550043	أوساط زراعة الخلايا.
3´نظير بنية القبعة لـ RNA من نوع O-Me-m7G(5')ppp(5')G	New England Biolab	S1411L	بالنسبة لمعظم جزيئات الـ RNA، تعمل بنية القبعة (cap structure) على زيادة الاستقرار، وتقليل القابلية للتحلل بواسطة الإنزيمات الخارجية (exonuclease)، وتعزيز تكوين معقدات بدء ترجمة الـ mRNA.
5-ميثيل-سيتيدين-5´ثلاثي الفوسفات (5-ميثيل-CTP)	New England Biolab	N0432S	تُستخدم النوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (NTPs) المعدلة بشكل شائع لتقليل الاستمناع في الحمض النووي الريبوزي (RNA) الناتج عن النسخ في المختبر.
طبق بـ 6 عيون	Corning	351146	لإنماء ومعالجة أحجام متوسطة إلى كبيرة من الخلايا الملتصقة أو المعلقة في ظروف تجريبية مستقلة.
جسم مضاد لـ Ki67 (SP6)	abcam	ab16667	يُعبر عن Ki67 بشكل أساسي في الخلايا المتكاثرة.
طقم مقايسة الشيخوخة الخلوية (تلوين SA-beta-gal)	cellbiolabs	CBA-230	تحديد الخلايا الهرمة باستخدام تحليل SA-βمقايسة صبغ -gal
أنابيب DNA ذات الربط المنخفض سعة 0.5 مل	Eppendorf	022431005	لاستعادة الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) والحمض النووي الريبوزي (RNA) بكفاءة ودون أي فقدان
أنابيب DNA LoBind سعة 1.5 مل	Eppendorf	22431021	لاستعادة الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) والحمض النووي الريبوزي (RNA) بكفاءة دون أي فقدان
DNase I، خالٍ من RNase (1 وحدة/μل)	Thermo Fisher	EN0521	إن إنزيم DNase I الخالي من RNase هو إنزيم قطع داخلي (endonuclease) يقوم بهضم الحمض النووي DNA أحادي الخيط وثنائي الخيط.
إنزيم بولي (أ) بوليميراز لبكتيريا E. coli	New England Biolab	M0276S	تعمل إنزيم بولي (أ) بوليميراز 1 (PAP I) في بكتيريا Escherichia coli بشكل أساسي كمحفز لإضافة بقايا أحادي فوسفات الأدينوزين (AMP) إلى الطرف '3 لجزيئات RNA بشكل مستقل عن القالب.
مصل جنين البقر	Thermo Fisher	A5256701	مكمل المصل للمستنبتات الخلوية
طقم HiScribe T7 ARCA mRNA	New England Biolabs	E2065S	صُممت مجموعة HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (مع التذييل) للإنتاج السريع لـ mRNA ذي غطاء ARCA وذيل poly(A) في المختبر. ويتم تخليق mRNA المقنّع عن طريق دمج نظير الغطاء المضاد للعكس (ARCA) أثناء عملية النسخ باستخدام إنزيم T7 RNA Polymerase.
طقم HiScribe T7 mRNA مع كاشف CleanCap Reagent AG	New England Biolabs	E2080S	تتيح أطقم HiScribe T7 mRNA Kits مع كاشف CleanCap Reagent AG إنتاجاً سريعاً ومبسطاً لنسخة واحدة أو نسخ متعددة من الحمض الريبي النووي المرسال (mRNA)، بإنتاجية نموذجية تبلغ ≥90 μجم لكل تفاعل،
إنزيم LongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0534S	يوفر إنزيم LongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase أداءً استثنائيًا مع نواتج التضخيم الطويلة.
إنزيم النسخ العكسي لفيروس سرطان الدم لدى الفئران (M-MuLV Reverse Transcriptase)	New England Biolab	M0253L	يقوم إنزيم النسخ العكسي M-MuLV بتخليق شريط حمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين مكمل يبدأ من بادئ، باستخدام إما الحمض النووي الريبوزي (تخليق cDNA) أو الحمض النووي ريبوزي منقوص الأكسجين أحادي الشريط كقالب.
طقم تنقية الحمض النووي الريبوزي Monarch Spin (50 μز)	New England Biolabs	T2040L	الوظيفة الرئيسية لجهاز Monarch® طقم تنقية الحمض النووي الريبي بالدوران (50 μز) هي تنقية وتركيز ما يصل إلى 50 μغرام من الحمض النووي الريبوزي (RNA) عالي الجودة من التفاعلات الإنزيمية أو مخاليط الاستخلاص.
مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly الرئيسي	New England Biolabs	E2621L	يسمح مزيج NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix بالتجميع السلس لقطع متعددة من الحمض النووي (DNA)، بغض النظر عن طول القطعة أو توافق النهايات. وله فائدة كبيرة لمجتمع البيولوجيا التركيبية، وكذلك في الاستنساخ أحادي الخطوة لقطع متعددة، وذلك نظراً لسهولة استخدامه ومرونته وتنسيق المزيج الرئيسي البسيط.
Opti-MEM - وسط غذائي منخفض المصل	Thermo Fisher	31985070	لرفع كفاءة ترانسفكشن الخلايا إلى الحد الأقصى أثناء تكوين معقدات الليبيد والحمولات. حيث يعمل كبيئة محددة كيميائياً ومحسنة تحافظ على حيوية الخلايا الثديية بشكل عالٍ، مع تقليل الحاجة إلى المكملات المصلية القياسية.
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)، بدرجة حموضة 7.4	Thermo Fisher	10010023	يتمثل الاستخدام الوظيفي الأساسي للمحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) عند درجة حموضة 7.4 في الحفاظ على استقرار درجة الحموضة والتوازن الاسموزي للخلايا الثديية والجزيئات البيولوجية.
شرائط تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)	Thermo Fisher	AB0776	يتمثل الاستخدام الوظيفي الأساسي لأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الشريطية (والتي تكون عادةً بتنسيق 8 أنابيب أو 12 أنبوباً في الشريط الواحد) في احتواء تفاعلات سائلة ذات أحجام صغيرة أثناء عملية التدوير الحراري عالية الإنتاجية.
هيدروبروميد بولي-إل-لايسين	Millipore Sigma	P4707-50ML	يتمثل الاستخدام الوظيفي الأساسي لهيدروبروميد بولي-إل-لايسين (PLL) لالتصاق الخلايا في طلاء الأسطح الصلبة سالبة الشحنة (مثل الزجاج أو البلاستيك) لإنشاء ركيزة عالية الالتصاق وموجبة الشحنة.
بسودويوريدين-5´ثلاثي الفوسفات (سودو-UTP) Ψيوريدين ثلاثي الفوسفات (UTP)	New England Biolabs	N0433S	سودويوريدين-5´تُستخدم ثلاثي فوسفات النوكليوتيد المعدلة (Pseudo-UTP) بشكل شائع لتقليل الاستجابة المناعية للحمض النووي الريبي (RNA) الناتج عن عملية النسخ في المختبر.
مجموعة محلول الريبونوكليوتيدات	New England Biolabs	N0450L	أربعة محاليل منفصلة من ATP وGTP وCTP وUTP
مثبط ROCK Y-27632 (ثنائي هيدروكلوريد)	تقنيات الخلايا الجذعية	72302	يعتبر Y-27632 مثبطاً عالي الفعالية وانتقائياً ونفاذاً للخلايا لبروتين كيناز المرتبط بـ Rho والمحتوي على لولب ملفوف (ROCK). يثبط Y-27632 كلاً من ROCK1 (Ki = 220 nM) وROCK2 (Ki = 300 nM) عن طريق منافسة ATP على الارتباط بالموقع التحفيزي.
ماء بدرجة نقاء مناسبة لتفاعل البلمرة المتسلسل بالنسخ العكسي (RT-PCR Grade Water)	Thermo Fisher	AM9935	إن الاستخدام الوظيفي الأساسي للمياه بدرجة نقاوة RT-PCR (والتي غالباً ما تسمى مياه خالية من النوكلياز) هو أن تعمل كمذيب فائق النقاء للمقايسات الإنزيمية الحساسة، حيث يمكن لأي تلوث أن يؤدي إلى تحلل العينة أو تثبيط عملية التضخيم.
SUPERase·مثبط RNase	Thermo Fisher	AM2694	يعد مُثبط RNase من نوع SUPERase In مُثبطًا بروتينيًا من أصل غير بشري، يرتبط بشكل غير تساهمي بإنزيمات RNase الأكثر شيوعًا وإثارة للمشاكل ويثبطها، بما في ذلك RNase A وB وC و1 وT1.
صبغة SYBR Green I لهلام الأحماض النووية	Thermo Fisher	S7563	الاستخدام الوظيفي الأساسي لـ SYBR™ يُستخدم صبغ الأحماض النووية "Green I Nucleic Acid Gel Stain" لتصور وقياس كمية الحمض النووي مزدوج السلسلة (dsDNA) في هلامات الأجاروز أو البولي أكريلاميد.
طقم ترانسفيكشن TransIT-mRNA	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	كاشف ترنسفكشن (نقل جيني) عالي الكفاءة ومنخفض السمية للحمض النووي الريبوزي (RNA) كبير الحجم
طقم TRAPeze للكشف عن التيلوميريز	Millipore Sigma	S7700	يُعد مقايسة TRAP (بروتوكول تضخيم التكرارات التيلوميرية) طريقة حساسة وشائعة الاستخدام تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للكشف عن نشاط التيلوميراز وقياسه في الخلايا وعينات الأنسجة الثديية. وتتضمن هذه المقايسة ثلاث خطوات رئيسية: إطالة التكرارات التيلوميرية بواسطة إنزيم التيلوميراز، وتضخيم هذه النواتج باستخدام تفاعل PCR، ثم الكشف عنها لاحقاً.
تربسين-إيديتات ثنائي الصوديوم (0.05%)، أحمر الفينول	Thermo Fisher	25300054	لفصل الخلايا الثديية الملتصقة عن أوعية الزرع أثناء عمليات تمرير الخلايا الروتينية (الزراعة الفرعية) وحصادها.