استكشاف أهداف فشل القلب باستخدام العشوائية المندلية، والتزامن، والتوزيع العشوائي المندلي القائم على البيانات الملخصة، والتنبؤ بالأدوية

ملخص

حددت هذه الدراسة ثمانية أهداف دوائية محتملة لفشل القلب من خلال التحليل الجيني، واستكشفت المركبات العلاجية المرشحة المرتبطة بهذه الأهداف المحددة.

الملخص

فشل القلب (HF) هو مرض شائع في القلب والأوعية الدموية يؤثر بشكل كبير على جودة الحياة في مراحله المتقدمة. على الرغم من تنوع استراتيجيات العلاج الحالية، لا يزال عبء مرض الهيدرولين الهولودي كبيرا. لذلك، من الضروري استكشاف أهداف علاجية جديدة بشكل عاجل. استخدمت هذه الدراسة العشوائية المندلية (MR) لتقييم العلاقات السببية بين الجينات القابلة للتخدير وHF. تم إجراء تحليل التداخل المشترك، والعشوائية المندلية القائمة على البيانات الملخصة (SMR) لزيادة التحقق من صحة العلاقة بينهما. وأخيرا، تم تحديد 8 أهداف علاجية محتملة ل HF، بما في ذلك 4 عوامل خطر (CYP11A1، GALT، KCNH2، وMETRN) و4 عوامل وقائية (APOM، CHD4، IL11RA، وLPAR5). أظهر تحليل شبكات إثراء GO، وتخصيب KEGG، وتفاعل البروتين والبروتين (PPI) أن هذه الجينات كانت تشارك بشكل أساسي في تنظيم الأيض والعمليات الكهربائية الفيزيولوجية للقلب. علاوة على ذلك، تم تحديد الأدوية المحتملة التي تستهدف هذه الأهداف باستخدام التنبؤ بالأدوية والربط الجزيئي، بما في ذلك الميتوتان، أديل، البنزوفيران، 1,3-دي-أو-توليلغوانيدين، 96-69-5، ولاكتون بروموينول. علاوة على ذلك، أظهرت نتائج PCR أيضا أن الميتوتان قد يكون مرتبطا ب CYP11A1 وKCNH2. الأدوية المصممة بناء على هذه الأهداف العلاجية المحتملة قد تحقق معدلات نجاح أعلى وتحسن النتائج السريرية.

المقدمة

فشل القلب (HF) هو متلازمة وعائية وعائية شائعة تعرف بضعف في ملء البطين أو انقباض عضلة القلب، مما يؤدي إلى ضعف النتاج القلبي لتلبية المتطلبات الأيضية ^1,2,3. سريريا، يتميز HF بالاحتقان الرئوي والجهازي، نقص تروية الأنسجة، وأعراض مثل ضيق التنفس، والتعب، والوذمة الطرفية ^1,4,5. على الرغم من التقدم العلاجي، لا يزال التهاب الهيدرولين سببا رئيسيا للمراضة والوفاة على مستوى العالم، حيث يؤثر على أكثر من 64 مليون شخص وفقا لدراسة العبء العالمي للأمراض (GBD) ^6,7,8. يبرز العبء الكبير للمرض الحاجة الملحة إلى استراتيجيات علاجية جديدة.

التدخلات الدوائية والأجهزة الحالية لعلاج HF محدودة بسبب الفعالية غير المثالية والآثار الجانبية، مما يساهم في معدلات إعادة دخول مستمرة مرتفعة وضعف جودة الحياة 9,10,11,12. لذلك، فإن تحديد أهداف جزيئية جديدة ذات صلات سببية بتكوين مرض HF أمر بالغ الأهمية لتحسين النتائج السريرية. يمثل دمج الجينوم في اكتشاف الأدوية استراتيجية فعالة للغاية لتحسين الكفاءة، حيث تظهر العلاجات المثبتة وراثيا معدل نجاح أعلى بكثير في التجارب السريرية 13,14,15. علاوة على ذلك، تعد البروتينات المشفرة بواسطة هذه الجينات القابلة للتنفيذ أهدافا علاجية رئيسية لكل من الجزيئات الصغيرة والأجسام المضادة وحيدة النسيلة^16,17.

ساعدت التطورات الحديثة في علم الوراثة البشرية في إعطاء الأولوية لأهداف الأدوية من خلال التحليل التكاملي لدراسات الارتباط الجينومي (GWAS) وبيانات مواقع الصفات الكمية للتعبير (eQTL). يستخدم العشوائية المندلية (MR) المتغيرات الجينية كمتغيرات أداة لتقدير التأثيرات السببية، مما يقلل من السببية المشوهة والعكسية المتأصلة في الدراسات الرصدية^13,14. عند دمجها مع التنقل الداخلي والرنين المغناطيسي القائم على الملخص (SMR)، يمكن هذا النهج من تحديد أولويات قوية للجينات التي قد يؤثر تعديلها على مخاطر الأمراض، مقدما استراتيجية جينية لاكتشاف الأهداف 18,19,20. مقارنة بالدراسات التقليدية للارتباط، يتغلب دمج التصوير المغناطيسي والتحليل المغناطيسي والتعاطي على السببية المربكة والعكس لإثبات استنتاجات سببية قوية. علاوة على ذلك، يقوم هذا الإطار بتصفية الإشارات الإيجابية الكاذبة الناتجة عن اختلال التوازن بين الروابط من خلال ضمان أن تعبير الجينات وخطر فشل القلب يشتركان في نفس المتغير السببي الأساسي، مما يحسن أولوية الأهداف. ومن الجدير بالذكر أنه رغم أن أنسجة القلب والأوعية الدموية تظهر خصوصية عالية، إلا أن هذه الدراسة تستخدم بشكل أساسي بيانات cis-eQTL واسعة النطاق لتعظيم القوة الإحصائية. على الرغم من أن هذا النهج قد لا يلتقط الآليات الخاصة بالنسيج الكامنة في HF، إلا أن المتغيرات المشتقة من الدم تعمل كمؤشرات حيوية متاحة وتوفر رؤى قوية حول الدوافع الجينية الجهازية للمرض.

في هذه الدراسة، تم استخدام مجموعات بيانات GWAS وeQTL واسعة النطاق لتقييم التأثيرات السببية للجينات القابلة للدواء على خطر HF. تم التحقق من صحة الارتباطات المهمة بشكل أكبر من خلال تحليلات التجمع المكاني وتحليل SMR. لتوضيح الوظائف البيولوجية للأهداف ذات الأولوية، أجريت تحليلات تخصيب جينات (GO) وموسوعة كيوتو للجينات والجينومات (KEGG)، إلى جانب تحليل شبكات تفاعل البروتين والبروتين (PPI). تم تقييم الإمكانيات العلاجية لاحقا من خلال التنبؤ بالأدوية والربط الجزيئي. وأخيرا، تم التحقق من صحة الروابط بين الجينات المختارة القابلة للدواء والأدوية المرشحة من خلال تجارب مختبرية .

في الختام، تقدم هذه الدراسة رؤى مهمة لاكتشاف أهداف علاجية جديدة لالتهاب الهيدرولين. من خلال استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي، وتحليل التنقل المغناطيسي، وتحليل التداخل الجغرافي، وتحليل إثراء الجينات، وبناء شبكة مثبطات مضخة البروتون، والتنبؤ بالأدوية، والربط الجزيئي، والتجارب المختبرية ، قد تساهم هذه النتائج في تطوير استراتيجيات علاجية أكثر فعالية لعلاج الهيدرولون البشري.

البروتوكول

تم الحصول على جميع مجموعات البيانات المستخدمة في هذه الدراسة من دراسات منشورة سابقا مع موافقة أخلاقية. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تصميم الدراسة

يتم توضيح سير عمل هذه الدراسة في الشكل 1. أولا، تم الحصول على بيانات التعرض من الجينات القابلة للتخدير من القيم الجنسية (cis-eQTLs). ثانيا، أجري تحليل الرنين المغناطيسي لدراسة العلاقة السببية بين الجينات القابلة للدواء وHF. تم تحديد الأهداف العلاجية المرشحة ل HF لاحقا من خلال تحليلات التجمع المشترك وSMR. ثم تم إجراء تحليل إثراء الجينات وبناء شبكة مثبطات مضخة البروتون. وأخيرا، تم إجراء التنبؤ بالأدوية وربط الجزيئات لاستكشاف الألفة بين الأدوية والجينات.

2. مصدر البيانات

تم تحديد ما مجموعه 6,888 جينا قابلا للدواء من مصدرين. تضمنت مجموعة بيانات واحدة 4,463 جينا من دراسة منشورة سابقا دمجت مصادر بيانات متعددة¹⁷. أما مجموعة البيانات الأخرى فاحتوت على 5,012 جينا من قاعدة بيانات تفاعل الدواء والجين (DGIdb)²¹. تم توضيح المعلومات التفصيلية على الموقع الإلكتروني (https://www.dgidb.org/). بعد دمج وإزالة النسخ، تم الاحتفاظ ب 6,888 جينا فريدا قابلا للدواء للتحليل.

تم الحصول على بيانات Cis-eQTL من اتحاد eQTLGen (https://eqtlgen.org/cis-eqtls.html)، الذي يتضمن ملفات تعريف تعبير من 31,684 عينة دم ويغطي 16,987 جينا^{من 22}.

تم الحصول على إحصائيات ملخصة لفيروس HF من إصدار R12 لقاعدة بيانات FinnGen²³، والتي شملت 37,653 حالة و462,695 حالة ضابطة. استند تشخيص HF إلى التصنيف الدولي للأمراض (ICD)، بما في ذلك ICD-10—I11.0، I13.0، I13.2، I50، ICD-9—4029B|428، وICD-8—42700|42710|428|7824. كان جميع المشاركين من أصول أوروبية. المعلومات التفصيلية متوفرة على موقع فينجن والمقال الأصلي (https://www.finngen.fi/en/access_results).

3. تحليل العشوائية المندلية

تم اختيار المتغيرات الآلية (IVs) بناء على ثلاثة افتراضات أساسية للرنين المغناطيسي²⁴. أولا، الحقن الوريدية مرتبطة مباشرة بعوامل التعرض. ثانيا، لا ترتبط الحقن الوريدية بعوامل مربكة. وأخيرا، تؤثر الحقن الوريدية على النتائج فقط من خلال التعرض. نظرا لأن ال eQTLs القريبة تمارس سيطرة تنظيمية أكثر إلحاحا وقوة على الجينات المستهدفة، استخدم MR حصريا SNPs الموجودة ضمن مناطق 100 كيلو بايت من الجينات لتعظيم القرب البيولوجي. تم استخدام معايير صارمة لاختيار الحزب الوطني الاسكتلندي. جميع SNPs المختارة كانت ضمن 100 كيلوبايت أعلى موقع بدء النسخ و100 كيلوبايت أسفل موقع نهاية النسخ لكل جين قابل للتخدير. تم تضمين فقط SNPs ذات دلالة جينومية واسعة (p < 5×^10-8)²⁵. لتقليل اختلال التوازن في الربط (LD)، تم إجراء تجمع التوازن باستخدام عتبة^r2 تبلغ 0.001 ومسافة تجمع 10,000 كيلو بيت²⁶. تم الاحتفاظ ب SNPs مع إحصائيات F >10، وتم حسابها باستخدام الصيغة: F = [R²(N−k−1)]/[k(1−R²)]²⁷. معلومات SNP موفرة في الجدول التكميلي 1.

كانت الطرق التحليلية الأساسية هي الموزونة بالتباين العكسي (IVW) ونسبة والد. تم اعتبار قيمة p أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية^28,29. تم تطبيق معدل الاكتشاف الكاذب (FDR) لضبط قيمة p لتقليل النتائج الإيجابية الكاذبة³⁰. عندما كان هناك SNP واحد فقط متاح، تم استخدام طريقة نسبة والد؛ وإلا، كان يتم تطبيق IVW. شملت التحليلات MR-Egger، الوسيط الموزون، الوضع الموزون، والوضع البسيط عندما كان هناك عدد كاف من SNPs.

تم استخدام اختبار Q من كوكران وتحليل اعتراض MR-Egger لاختبار التغاير والتعدد البصري. أشارت قيمة Q-p أكبر من 0.05 إلى غياب التغاير³¹. أشارت قيمة p لاعتراض MR-Egger أقل من 0.05 إلى وجود تعدد الاتجاهات¹⁸. وأخيرا، تم إجراء اختبار ترك واحد خارج لاختبار ما إذا كان يمكن التأثير على النتائج بواسطة SNP واحد. أجريت تحليلات MR باستخدام حزمة TwoSampleMR (الإصدار 0.6.11) في R (الإصدار 4.4.2).

4. تحليل التداخل

تم إجراء تحليل التداخل باستخدام حزمة coloc R (الإصدار 6.0.1) لتحديد ما إذا كانت المتغيرات الجينية المشتركة تؤثر على كل من التعبير الجيني وخطر HF³². تم تعيين الاحتمالات السابقة لارتباط SNP بأي من الصفات، وكلا الصفتين إلى 1 × ^10-4 و1 × ^10-5 على التوالي. يمكن حساب الاحتمالات اللاحقة للفرضيات الخمس: (1) PPH0: SNPs غير مرتبطة بصفتين. (2) PPH1/PPH2: ترتبط SNPs بالتعبير الجيني أو HF. (3) PPH3: SNPs مرتبطة ب HF والتعبير الجيني، لكنها مدفوعة بأنواع مختلفة من SNPs. (4) PPH4: SNPs مرتبطة ب HF والتعبير الجيني، ويتم تحركها بواسطة SNPs الشائعة. اعتبر PPH4 > 0.8 دليلا على التوازن.

5. تحليل SMR

تم إجراء تحليل SMR لاستكشاف العلاقة بين الجين وHF باستخدام برنامج SMR (الإصدار 1.3.1)³³. تم إجراء اختبار التغاير في الأدوات التابعة (HEIDI) لتحديد ما إذا كانت الارتباطات الملحوظة ناتجة عن الارتباط. تم تفسير قيمة p ذات دلالة SMR (< 0.05) مع قيمة p في HEIDI > 0.05 كدليل يدعم علاقة سببية حقيقية بدلا من ارتباط ناتج عن سيناريو الارتباط. يمكن الوصول إلى بروتوكولات التشغيل التفصيلية والإعدادات الحاسوبية على الموقع الرسمي.

6. تحليل الإثراء

تم استخدام تحليل إثراء GO وKEGG لتوصيف الوظائف البيولوجية والمسارات لجينات الهدف العلاجي المحتمل التي تم فحصها³⁴. شمل إثراء GO العمليات البيولوجية (BP)، والوظائف الجزيئية (MF)، والمكونات الخلوية (CC). تم استخدام clusterProfiler لحزمة R (الإصدار 4.14.6) وPathview (الإصدار 1.46.0) لإجراء تحليل الإثراء^35,36.

7. التنبؤ الدوائي المرشح

لتحديد المركبات العلاجية المحتملة، تم إجراء تحليل التنبؤ بالأدوية باستخدام قاعدة بيانات توقيعات الأدوية (DSigDB) (http://dsigdb.tanlab.org/DSigD Bv1.0/)³⁷. تتضمن DSigDB 22,527 مجموعة جينية، بما في ذلك 17,389 مركبا فريدا تغطي 19,531 جينا. تم تحليل الارتباطات بين الجينات المرشحة والمركبات، تلاها تحليل إثراء لتحديد الأدوية المحتملة ذات الصلة التي تستهدف جينات HF.

8. بناء شبكة تفاعل البروتين

تم بناء شبكات تفاعل البروتين والبروتين (PPI) باستخدام GeneMANIA (https://genem ania.org/)³⁸. يمكن أن تساعد جينمانيا في توليد فرضيات وظيفة الجينات، وتحليل قوائم الجينات، وإعطاء الأولوية للجينات للاختبارات الوظيفية.

9. الالتحام الجزيئي

تم إجراء عملية ربط جزيئية للتحقق من قابلية الجينات للدواء وعلاقتها بالمرشحين للأدوية. تساعد محاكاة الالتحام في تقييم ألفة الارتباط وأنماط التفاعل بين المركبات والبروتينات المستهدفة، مما يوجه الأولوية للمرشحين وتحسينها. تم استرجاع هياكل البروتين من بنك بيانات البروتين (PDB) (http://www.rcsb.org/)، وتم الحصول على هياكل المركبات من PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)³⁹. تم تنفيذ الالتحام باستخدام CB-Dock2 (https://cadd.labshare.cn/cb-dock2/index.php)، الذي يستخدم اكتشاف التجويف لتوجيه الالتحام الأعمى^40,41. يمكن الحصول على معلومات مفصلة عن إجراءات التشغيل وإعدادات الحساب على الموقع الرسمي.

10. زراعة الخلايا

تم زراعة خلايا عضلة القلب البشرية الخالدة (AC16) في وسط زراعة خاص بخلايا AC16 تحت ظروف عقيمة. تم الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. تم استبدال وسط الزراعة كل يومين إلى ثلاثة أيام، وتم تمرير الخلايا عند التقاء حوالي 70٪–80٪ للحفاظ على ظروف نمو مثالية. تم مراقبة شكل الخلايا والتقاطعها بشكل روتيني باستخدام المجهر الضوئي قبل كل تجربة. تم إجراء جميع إجراءات زراعة الخلايا في خزانة السلامة البيولوجية لتقليل خطر التلوث. في تجارب العلاج، تم زرع خلايا AC16 في صفائح ذات 6 آبار وتركت للالتصاق طوال الليل قبل إعطاء العلاج.

11. PCR للنسخ العكسي الكمي (RT-PCR)

تمت معالجة خلايا AC16 بحمض البالميتك 200 ميكرومولار (PA) أو 20 ميكرومولار ميتوتان لمدة 24 ساعة بعد الوصول إلى حوالي 60٪–70٪ من التقاء القوام. تم إذابة الحمض النووي في ألبومين مصل البقر (BSA)، بينما تم إذابة الميتوتان في ثنائي ميثيل كبريتات الأكسجين (DMSO). تم التعامل مع جميع المواد المحتملة الخطرة وفقا لإجراءات السلامة المختبرية القياسية باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات والمعاطف المختبرية.

بعد العلاج، تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة استخراج RNA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة في ظروف خالية من RNase. تم إجراء إجراءات استخراج الحمض النووي الريبي على الجليد كلما أمكن ذلك لتقليل تحلل الحمض النووي الريبي. تم تقييم تركيز الحمض النووي الريبي ونقاء الحمض النووي الريبي قبل التجارب اللاحقة، ولم تستخدم سوى عينات بنسبة A260/A280 بين 1.8 و2.0 في التحليلات اللاحقة.

تم تصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة نسخ عكسي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تم إجراء RT-PCR الكمي لاحقا باستخدام SYBR Green Master Mix على نظام كشف PCR في الوقت الحقيقي. تم تحضير كل تفاعل في حجم نهائي من 10 ميكرولتر يحتوي على 5 ميكرولتر من خليط SYBR Green Master، و0.4 ميكرولتر برايمر أمامي، و0.4 ميكرولتر برايمر عكسي، و1 ميكرولتر قالب cDNA، و3.2 ميكرولتر ماء خال من النوكليز. تم إجراء التضخيم في ظروف الدورة التالية: إزالة الطبيعة الأولية عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، تلتها 40 دورة إزالة الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان، والتلدين/التمديد عند 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. أجريت كل تجربة باستخدام ثلاث نسخ بيولوجية، وأجريت جميع التفاعلات على شكل ثلاث نسخ.

تم استخدام GAPDH كجين مرجعي داخلي، وتم حساب مستويات تعبير mRNA النسبية ل CYP11A1 وKCNH2 باستخدام طريقة 2^−ΔΔCt. اعتبرت قمة واحدة في تحليل منحنى الصهر دلالة على تضخيم نوعي. تسلسلات البرايمر المستخدمة في RT-PCR مدرجة في الجدول التكميلي 2.

النتائج

العشوائية المندلية
تم عرض نتائج التصوير بالرنين المغناطيسي التي قيمت التأثيرات السببية بين التعبير الجيني الدوائي وHF في الجدول التكميلي 3. تم اعتبار قيمة P المعدلة ب FDR أقل من 0.05 ذات دلالة إحصائية. تم تحديد ما مجموعه 11 جينا ذات ارتباط سببي مهم ب HF (الشكل 2). من بينها، ارتبطت ستة جينات بزيادة خطر الإصابة ب HF، بما في ذلك CDKN1A (P_FDR: 0.03، OR: 1.293)، CYP11A1 (P_FDR: 0.034، OR: 1.494)، GALT

المناقشة

قامت هذه الدراسة بتقييم منهجي للتأثيرات السببية للجينات القابلة للدواء على مخاطر الهيدروفورد باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي، وحددت ثمانية أهداف علاجية محتملة. شملت هذه أربعة عوامل وقائية (APOM، CHD4، IL11RA، وLPAR5) وأربعة عوامل خطر (CYP11A1، GALT، KCNH2، وMETRN). وقد دعمت هذه الروابط بشكل أكبر من خلال تحليل التداخل التوطيني وSMR. أشارت التعليقات الوظيفية من خلال تحليلات GO وKEGG وشبكات PPI إلى أن هذه الجينات قد تؤثر على HF بشكل أساسي من خلال مسارات مرتبطة بالتمثيل الغذائي والفيزيول...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix	Abclonal	RK21203
AC16	HyCyte	TCH-C119
AC16 cell-specific culture medium	HyCyte	TCH-G119
cDNA reverse kit	Abclonal	RK20400
CFX96™ Real-Time system	Bio-Rad Laboratories
Mitotane	TargetMol	T1199
Palmitic acid	TargetMol	T2908
RNA extraction kit	Abclonal	RK30120