يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة بحثية

miR-486-3p يثبط الأنماط الظاهرية الخبيثة ويرتبط بانخفاض تعبير WNT5B وDVL1 وβ-catenin في خلايا سرطان الرئة الغدي

44 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71545

⸱

أغسطس 21, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jiaxing

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يؤدي الإفراط في التعبير القسري عن miR-486-3p إلى تثبيط النشاط المرتبط بالتكاثر، والنمو المستنسخ، والتئام الجروح، واختراق مادة Matrigel في خلايا سرطان الرئة الغدي من طرازي A549 وH358. وتصاحب هذه التأثيرات انخفاض في تعبير WNT5B وDVL1 وβ-catenin وBCL-2، مما يشير إلى وجود ارتباط in vitro بتغيرات متعلقة بمسار Wnt دون إثبات استهداف مباشر أو سببية في المسار.

الملخص

يعد سرطان الرئة الغدي (LUAD) النوع النسيجي السائد من سرطان الرئة غير صغير الخلايا، ولا يزال مرتبطاً بمعدلات مراضة ووفيات كبيرة. وقد حددت الدراسات السابقة وظائف كابتة للأورام لـ miR-486-3p في LUAD، ولكن العلاقة بينه وبين التغيرات في تعبير WNT5B وDVL1 وβ-catenin لم يتم تحديدها بوضوح. هنا، تم فحص الوفرة الأساسية لـ miR-486-3p في خلايا LUAD من نوع A549 وH358 ومقارنتها بتلك الموجودة في خلايا Beas-2b الظهارية الشعبية التي تم الحفاظ عليها في ظروفها الروتينية المعتادة. تم إنشاء نماذج مستقرة تفرط في التعبير عن miR-486-3p عن طريق التنحي الفيروسي (lentiviral transduction). كما تم تقييم النشاط المرتبط بنمو الخلايا، والنمو المستنسخ، وإغلاق الجرح، واجتياز الأغشية المطلية بـ Matrigel باستخدام مجموعة عد الخلايا CCK-8، واختبار تكوين المستعمرات، واختبار التئام الجروح، واختبارات Transwell. كما تم تقييم وفرة بروتينات WNT5B وDVL1 وβ-catenin وBCL-2 عن طريق لطخة ويسترن (Western blotting)، وبالإضافة إلى ذلك تم فحص مستويات mRNA لكل من WNT5B وDVL1 وCTNNB1 وBCL2 بواسطة RT-qPCR. وفي ظل ظروف الزرع المستخدمة، كانت وفرة miR-486-3p في خلايا A549 وH358 أقل منها في خلايا Beas-2b، وأدى التنحي الفيروسي إلى فرط تعبير مستقر في كلا خطي خلايا LUAD. أدى الإفراط القسري في تعبير miR-486-3p إلى تقليل إشارة CCK-8، وتكوين المستعمرات، وإغلاق الجروح، واجتياز الأغشية المطلية بـ Matrigel، وصاحب ذلك انخفاض في وفرة بروتينات WNT5B وDVL1 وβ-catenin الكلي وBCL-2. علاوة على ذلك، أظهر RT-qPCR انخفاضاً في وفرة نسخ WNT5B وDVL1 وCTNNB1 وBCL2 في كلا خطي خلايا LUAD بعد الإفراط في تعبير miR-486-3p. تدعم هذه النتائج وجود ارتباط in vitro بين التعبير القسري لـ miR-486-3p، وتوهين عدة مؤشرات للخلايا الخبيثة، وتغير التعبير المرتبط بـ Wnt؛ ومع ذلك، فهي لا تثبت الارتباط المباشر بين miRNA وهدفه، أو نشاط المسار، أو آلية تأشير خطية سببية.

المقدمة

يُعد سرطان الرئة الغدي (LUAD) النوع النسيجي الأكثر شيوعاً من سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)، ويساهم بشكل كبير في معدلات المراضة والوفيات المرتبطة بسرطان الرئة في جميع أنحاء العالم1,2,3,4,5. وقد أدى التصنيف الجزيئي والعلاجات الموجهة إلى تحسين النتائج لمجموعات مختارة من المرضى، إلا أن سرطان LUAD المتقدم لا يزال من الصعب علاجه ويتسم بتغاير بيولوجي1,2,3,4,5. لذا، فإن تحديد العمليات التنظيمية التي تساهم في سلوك الخلايا الخبيثة يظل أمراً هاماً لتطوير فرضيات علاجية قابلة للاختبار.

يتكون مسار إشارات Wnt من فرعين، أحدهما يعتمد على β-catenin والآخر لا يعتمد عليه، واللذان ينظمان التكاثر والبقاء والقطبية والقدرة على الحركة6,7,8,9. ويرتبط WNT5B في أغلب الأحيان بالإشارات غير التقليدية، رغم أن تأثيراته البيولوجية تختلف باختلاف المستقبل والسياق الخلوي10,11. أما DVL1 فهو بروتين نقل إشارة سيتوبلازمي تشترك فيه عدة فروع من مسار Wnt، وقد رُبط بالسلوك المتعلق بـ β-catenin في سرطان الرئة12. وبناءً على ذلك، لا ينبغي تفسير التغيرات المتزامنة في WNT5B وDVL1 وβ-catenin في حد ذاتها كدليل على وجود مسار خطي واحد.

تُعد جزيئات MicroRNAs (miRNAs) حموضاً نووية ريبوزية قصيرة غير مشفرة تنظم التعبير الجيني من خلال تفاعلات تعتمد على التسلسل مع النسخ المستهدفة13,14,15. ونظراً لأن جزيء miRNA واحد قد يؤثر على عدة جزيئات RNA، فإن التغير في وفرة miRNA يمكن أن يؤثر على أنماط ظاهرية متنوعة مرتبطة بالأورام13,14,15,16,17,18. وقد رُبطت العديد من جزيئات miRNAs بنمو سرطان الرئة وحركته وإشاراته، كما وُصف التداخل بين miRNAs والشبكات المرتبطة بـ Wnt في سياقات سرطانية متعددة16,17,18,19,20.

ينتج عن موضع MIR486 السلسلتان الناضجتان miR-486-3p و miR-486-5p. وقد أظهر miR-486-3p نشاطاً مثبطاً للأورام في سرطان الفم والورم الأرومي الدبقي، بينما تم الإبلاغ عن تأثير محفز للأورام في سرطان الخلايا الحرشفية الجلدي21,22,23,24,25. تم اختيار miR-486-3p للدراسة الحالية من خلال استراتيجية قائمة على الفرضيات بناءً على انخفاض وفرته في البيانات العامة لسرطان الرئة الغدي (LUAD)، ونشاطه المثبط للأورام المبلغ عنه سابقاً في LUAD، والتنبؤات المعلوماتية الحيوية التي تربطه بنسخ مرشحة ذات صلة بـ WNT. وقد أثبت Tomioka وآخرون التأثيرات المثبطة للأورام لكل من سلسلتي miR-486 في LUAD وحددوا GINS4 من خلال فحص الأهداف على مستوى الجينوم كاملاً26. وبناءً على ذلك، لا تدعي الدراسة الحالية أنها أول إثبات لنمط ظاهري مضاد للأورام، بل تقيم ما إذا كان التعبير القسري لـ miR-486-3p مصحوباً بتغيرات في وفرة WNT5B و DVL1 و β-catenin وتغيرات نمطية ظاهرة قابلة للتكرار في خطين خلويين من LUAD. وتقيم هذه التحليلات الارتباطات ولا تثبت الاستهداف المباشر، أو نشاط المسار، أو وجود آلية خطية لـ WNT5B/DVL1/β-catenin.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الكواشف والأجهزة المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

زراعة الخلايا

تم استخدام خطوط خلايا سرطان الرئة الغدي البشري (LUAD) من نوع A549 وH358، وخط خلايا الظهارة القصبية المخلدة Beas-2b. وقد تم اختيار A549 (KRAS G12S) وH358 (KRAS G12C؛ وناقصة STK11) كنماذج شائعة الاستخدام لسرطان الرئة الغدي (LUAD) بخلفيات طفرية مختلفة لـ KRAS، بينما أُدرجت Beas-2b كمقارن ظهاري قصبي غير خبيث. حُفظت خلايا A549 وH358 في وسط RPMI-1640، بينما حُفظت خلايا Beas-2b في وسط DMEM؛ واحتوى كل وسط على 10% fetal bovine serum و1% penicillin-streptomycin. زُرعت الخلايا عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% CO₂. ونظرًا لأن خطوط خلايا الورم والمقارن الظهاري قد حُفظت في أوساط روتينية مختلفة، فقد تم تفسير مقارنات التعبير الأساسي بين خطوط الخلايا المختلفة بحذر.

النقل الجيني باستخدام الفيروسات البطيئة واختيار الخلايا المستقرة

استُخدمت ناقلات فيروسية بطيئة (Lentiviral vectors) تحمل السلف لـ hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) أو تسلسلاً عشوائياً للتحكم السلبي (LV-NC) في تصميم مستقر لزيادة الوظيفة. تم استزراع خلايا A549 وH358 في أطباق ذات 6 عيون بكثافة 5 × 104 خلية/عين وحُضنت طوال الليل. وفي اليوم التالي، عُرّضت الخلايا للفيروس البطيء بمضاعف عدوى (MOI) قدره 10 بوجود 8 µg/mL من polybrene. وبعد 24 h، استُبدل اللقاح الفيروسي بوسط غذائي كامل وطازج. ثم اختيرت الخلايا المنقولة باستخدام 2 µg/mL من puromycin لمدة 7 أيام. وبعد عملية الاختيار، تُرِكت الخلايا الناجية للتعافي وتم تكثيرها من أجل المقاييس الجزيئية والوظيفية اللاحقة. ولم يتم إدراج ذراع لتثبيط miR-486-3p لأن الدراسة الحالية صُممت خصيصاً لتقييم آثار الإفراط في التعبير القسري المستقر.

ملاحظة: يجب الحفاظ على تطابق كل من تعددية العدوى (MOI)، ووقت التعرض لـ polybrene، وظروف الانتقاء بـ puromycin بين مجموعتي LV-NC وLV-miR-486-3p لتقليل الاختلافات المتعلقة بالعلاج في حيوية الخلايا.

تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)

أُجري تفاعل RT-qPCR لتحديد مستويات تعبير miR-486-3p وللتأكد من كفاءة الإفراط في التعبير بواسطة الفيروسات البطيئة (lentiviral) في خلايا A549 وH358. تم عزل الحمض النووي الريبي (RNA) الكلي باستخدام كاشف TRIzol وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وقُيم تركيز ونقاء RNA طيفياً، حيث اعتُبرت نسبة A260/A280 التي تتراوح بين 1.8–2.1 مقبولة. ولتحليل mRNA، تم تحويل 1 µg من RNA الكلي إلى cDNA عن طريق النسخ العكسي باستخدام مجموعة تجارية لتخليق cDNA وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. أما بالنسبة لتحليل microRNA، فقد أُجري تخليق cDNA باستخدام بادئ نسخ عكسي متخصص بـ miRNA على شكل حلقة ساقية (stem-loop). نُفذ تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في حجم تفاعل كلي قدره 20 µL يحتوي على 10 µL من 2× SYBR Green Master Mix، و0.4 µM من كل بادئ، و2 µL من قالب cDNA. وتكون بروتوكول التضخيم من خطوة مسخ أولية عند 95 °C لمدة 5 min، تلتها 40 دورة من المسخ عند 95 °C لمدة 10 s والارتباط/التمديد عند 60 °C لمدة 30 s. بعد ذلك، أُجري تحليل منحنى الانصهار للتحقق من خصوصية التضخيم. استُخدم RNA النووي الصغير U6 كضابط داخلي لتقدير كمية miRNA، بينما استُخدم GAPDH كجين مرجعي لتقييس mRNA. وحُددت مستويات التعبير النسبي باستخدام طريقة 2−ΔΔCq.

كانت تتابعات بادئات miRNA كما يلي: بادئة النسخ العكسي ذات الحلقة الجذعية (stem-loop)، 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′؛ وبادئة miR-486-3p الأمامية، 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′؛ وبادئة عكسية عامة، 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′؛ وبادئة U6 الأمامية، 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′؛ وبادئة U6 العكسية، 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. كما تتوفر تتابعات البادئات لكل من WNT5B وDVL1 وCTNNB1 وBCL2 وGAPDH، جنباً إلى جنب مع أطوال النواتج التضخيمية وكفاءات التضخيم، في الجدول 1. تم تطبيع تعبير mRNA بالنسبة إلى GAPDH، بينما تم تطبيع تعبير miR-486-3p بالنسبة إلى U6. تضمنت كل تجربة ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة، مع ثلاث مكررات تقنية لكل مكرر بيولوجي.

لطخة ويسترن

بعد اكتمال عملية الانتقاء باستخدام puromycin لمدة 7 أيام وفترة التعافي، تم تحلل الخلايا في محلول RIPA المنظم الذي يحتوي على مثبطات البروتياز. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام مقايسة BCA للبروتين. فُصلت كميات متساوية من البروتين (20 µg لكل مسار) على هلام SDS-PAGE بتركيز 10%، ونُقلت إلى أغشية PVDF عن طريق النقل الرطب بتيار 300 mA لمدة 120 min. حُجبت الأغشية باستخدام حليب منزوع الدسم بتركيز 5% مُحضّر في محلول Tris-buffered saline يحتوي على 0.1% Tween-20 (TBST) لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة. حُضنت الأغشية طوال الليل عند 4 °C مع أجسام مضادة أولية ضد WNT5B (1:1,000)، أو DVL1 (1:1,000)، أو β-catenin (1:1,000)، أو BCL-2 (0.5 µg/mL)، أو β-actin (1:5,000). تتوفر أسماء الشركات المصنعة وأرقام الكتالوج لجميع الأجسام المضادة في جدول المواد. بعد ثلاث عمليات غسيل بـ TBST لمدة 10 min لكل منها، حُضنت الأغشية مع جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد لـ rabbit IgG مقترن بـ HRP ومخفف بنسبة 1:5,000 لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة. ثم غُسلت الأغشية ثلاث مرات بـ TBST، وتم تصور حزم البروتين باستخدام ركيزة ذات لومينيسنس كيميائي، وصُوّرت باستخدام نظام توثيق وتصوير الهلام. تم قياس كثافة الحزم باستخدام برنامج ImageJ. وتم تطبيع وفرة كل بروتين مستهدف بالنسبة لإشارة β-actin المقابلة من نفس العينة البيولوجية. استُخدمت فقط عمليات التعريض التي تقع ضمن نطاق الكشف الخطي غير المشبع للتحليل الكثافي. أُجريت ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة.

مقايسة طقم عد الخلايا-8

تم استزراع خلايا A549 وH358 التي تم نقلها بشكل مستقر باستخدام LV-NC أو LV-miR-486-3p في أطباق ذات 96 بئر بكثافة 1.5 × 104 خلية/بئر في 100 µL من الوسط الغذائي الكامل. وبعد الالتصاق طوال الليل، تم استبدال الوسط الغذائي، وقِيست الامتصاصية عند الساعة 0 مباشرة بعد إضافة كاشف Cell Counting Kit-8. وعند الساعات 0 و24 و48 و72 و96، أضيفت 10 µL من الكاشف لكل بئر وحُضنت لمدة 1 h عند 37 °C قبل قراءة الامتصاصية عند 450 nm. وبالنسبة لتحليل المدى الزمني المراجع، تم تطبيع كل مجموعة بناءً على قيمة الساعة 0 الخاصة بها قبل التمثيل البياني. أُجريت ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة، وتم حساب متوسط الآبار التقنية داخل كل تجربة قبل إجراء التحليل الإحصائي.

اختبار تكوين المستعمرات

تم تحضير خلايا A549 وH358 المختارة باستقرار على هيئة معلقات خلوية مفردة بتركيز 5 × 102 cells/mL. وتم استزراع 1 mL من المعلق الخلوي في كل بئر من أطباق زراعة خلوية ذات 6 آبار، ثم أضيف 3 mL من الوسط الغذائي الكامل. استمرت زراعة الخلايا لمدة 14 يوماً، مع استبدال الوسط الغذائي كل 5 أيام. غُسلت المستعمرات باستخدام PBS، ثم ثُبتت باستخدام 4% paraformaldehyde لمدة 20 min، وصُبغت بصبغة crystal violet لمدة 20 min، ثم غُسلت وتُرِكت لتجف في الهواء. تم عد المستعمرات التي تحتوي على 50 خلية على الأقل باستخدام برنامج ImageJ. وأُجريت ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة.

ملاحظة: يتطلب الأمر الحصول على معلق خلايا مفردة متجانس وتقليل اضطراب الأطباق أثناء تكوين المستعمرات لمنع التكتل الاصطناعي للخلايا.

مقايسة هجرة الخلايا

تم استزراع خلايا A549 وH358 التي تم نقل الجينات إليها بشكل مستقر في أطباق ذات 6 آبار، وتم تنميتها حتى تشكلت طبقة أحادية متصلة. تم إحداث خدش مستقيم باستخدام رأس ماصة معقم سعة 10 µL، ثم تمت إزالة الخلايا المنفصلة، وتم تصوير الحقول المحددة نفسها عند 0 h و24 h و48 h و72 h. قيست مساحة الجرح باستخدام برنامج ImageJ، وحُسب انغلاق الجرح وفق المعادلة: (المساحة عند 0 h − المساحة عند النقطة الزمنية المحددة) / المساحة عند 0 h × 100%. تم إجراء ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة. لم يتم استخدام أي مثبط دوائي للتكاثر؛ وبناءً على ذلك، فُسِّر هذا الاختبار على أنه قياس لانغلاق الجرح بدلاً من كونه قراءة خاصة بالهجرة الخلوية.

ملاحظة: يجب إنشاء الخدوش بعرض وضغط متسقين، كما يجب تتبع حقول متطابقة طوال المدى الزمني.

مقايسة غزو الخلايا

أُجريت اختبارات الغزو باستخدام نظام Transwell عبر إدراجات أغشية من البوليكربونات مكونة من 24 بئراً وبحجم مسام يبلغ 8 µm. طُلي السطح العلوي لكل إدراج بـ 100 µL من مصفوفة الغشاء القاعدي Matrigel المخففة بنسبة 1:8 في وسط DMEM خالٍ من المصل، ليصل التركيز البروتيني النهائي التقريبي إلى 1 mg/mL، ثم حُضنت عند 37 °C لمدة 4 h. أُعيد تعليق خلايا A549 وH358 في وسط RPMI-1640 خالٍ من المصل بكثافات بلغت 8 × 105 cells/mL و4 × 105 cells/mL، على التوالي. أُضيفت كمية 200 µL من معلق الخلايا إلى الغرفة العلوية، وهو ما يعادل 1.6 × 105 من خلايا A549 أو 8 × 104 من خلايا H358 لكل إدراج. مُلئت الغرفة السفلية بـ 500 µL من وسط RPMI-1640 المحتوي على 20% من مصل الجنين البقري ليعمل كعامل جذب كيميائي. وبعد التحضين عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% CO₂ لمدة 48 h، أُزيلت الخلايا غير الغازية المتبقية على السطح العلوي للغشاء برفق باستخدام مسحة قطنية. ثم ثُبتت الخلايا التي غزت الغشاء باستخدام 4% paraformaldehyde لمدة 20 min، وصُبغت بـ 0.1% crystal violet لمدة 20 min في درجة حرارة الغرفة. التُقطت صور لخمسة حقول مجهرية مختارة عشوائياً لكل إدراج، وقُدر عدد الخلايا الغازية باستخدام برنامج ImageJ. واعتُبر متوسط عدد الخلايا من الحقول الخمسة قيمة واحدة لكل إدراج، كما عومل الإدراج، وليس الحقل المجهري الفردي، كوحدة تجريبية. أُجريت ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة.

ملاحظة: يجب إزالة الخلايا غير الغازية برفق وبشكل متسق لتجنب إتلاف الغشاء أو إزاحة الخلايا التي هاجرت إلى سطحه السفلي.

التحليل الإحصائي

تُعرض البيانات كمتوسط ± SD، ويشير n إلى التجارب البيولوجية المستقلة ما لم يُنص على خلاف ذلك. تم حساب متوسط المكررات التقنية أو المجالات المجهرية المتعددة من نفس الوحدة التجريبية قبل إجراء الاختبارات الاستدلالية. وبالنسبة لمقارنة الخطوط الخلوية الثلاثة، استُخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way analysis of variance) متبوعاً بمقارنات زوجية معدلة حسب اختبار Tukey. أما بالنسبة للمسارات الزمنية لـ CCK-8 ووقت التئام الجرح، فقد استُخدم تحليل التباين للقياسات المتكررة ثنائي الاتجاه (two-way repeated-measures analysis of variance) لتقييم آثار العلاج، والزمن، والتفاعل بين العلاج والزمن، متبوعاً بمقارنات معدلة حسب اختبار Šídák عند نقاط زمنية فردية. كما حُللت مقارنات المجموعتين باستخدام اختبارات Student's t-tests غير المقترنة ثنائية الجانب. أُجريت التحليلات الإحصائية وتصور البيانات باستخدام برمجيات التحليل الإحصائي والرسم البياني. تم ذكر قيم p الدقيقة في لوحات الأشكال أو جداول البيانات المصدرية. حُددت الدلالة الإحصائية عند p < 0.05؛ حيث *p < 0.05، و**p < 0.01، و***p < 0.001، و****p < 0.0001.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يُظهر تحليل TCGA/starBase انخفاض وفرة miR-486-3p في سرطان الرئة ذو الخلايا الحرشفية، ويحدد TargetScan مواقع ارتباط مرشحة

أظهرت بيانات التعبير المستمدة من مشروع الجينوم المسرّطِن (TCGA) والمستخرجة عبر starBase v3.0 أن وفرة miR-486-3p كانت أقل بشكل كبير في 512 عينة من سرطان الغُدّة الرئوية (LUAD) مقارنة بـ 20 عينة رئوية غير ورمية (اختبار ويلكوكسون للرتبة المجموعية، p = 3.2 × 10⁻5؛ الشكل 1). حدد برنامج TargetScanHuman موق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

قيمت دراسة اكتساب الوظيفة الحالية تأثيرات التعبير القسري والمستقر لـ miR-486-3p في خلايا سرطان الرئة الغدي (LUAD) من سلالتي A549 وH358. وفي كلا النموذجين، ارتبط الإفراط في تعبير miR-486-3p بانخفاض إشارات CCK-8 المرتبطة بالنمو، وتراجع النمو الاستنساخي، وانخفاض معدل انغلاق الجروح، وقلة عدد الخلايا التي عبرت أغشية Transwell المغطاة بـ Matrigel. وقد صاحبت هذه التغيرات المظهرية انخفاض في وفرة بروتينات WNT5B وDVL1 وβ-catenin الكلي وBCL-2، إلى جانب انخفاض مستويات نسخ WNT5B وDVL1 وCTNNB1 وBCL2...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

قدمت خطة تشجيي جيانغ الإقليمية للعلوم والتكنولوجيا الطبية والصحية (2025KY349) والتخصصات الداعمة الرئيسية بمدينة جياشينغ (2023-zc-014) الدعم المالي لهذه الدراسة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 M Tris-HCl (pH 6.8)SolarbioT1020تحضير هلام التكديس لـ SDS-PAGE
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8)SolarbioT1010تحضير هلام الفصل لـ SDS-PAGE
منظم TBS بتركيز 20×Solarbio71080المنظم المخزون لغسل لطخة ويسترن وتخفيف الأجسام المضادة
محلول أكريلاميد/بيس-أكريلاميد بتركيز 30% (29:1)SolarbioA1010تحضير هلامات SDS-PAGE
مثبت بارافورمالدهيد بتركيز 4%ServicebioG1101التثبيت لمقايسات تكوين المستعمرات ومقايسات Transwell
منظم تحميل البروتين بتركيز 5×BeyotimeP0015تحضير عينات البروتين لـ SDS-PAGE
برسلفات الأمونيومSolarbio427A038بادئ بلمرة هلام SDS-PAGE
طقم مقايسة بروتين BCABeyotimeP0009-1تحديد تركيز البروتين
الجسم المضاد BCL-2Boster Biological TechnologyA00040-2جسم مضاد متعدد النسائل من الأرنب؛ لطخة ويسترن بنسبة 1:5,000
طقم عد الخلايا-8 (CCK-8)TargetMolC0005مقايسة النشاط الأيضي المرتبط بنمو الخلايا؛ 10 μL لكل 100 μL من وسط الزرع
نظام التصوير بالتلألؤ الكيميائيBio-RadChemiDoc MPتصوير لطخة ويسترن
كلوروفورمServicebioG3005فصل الأطوار أثناء استخلاص RNA القائم على TRIzol
محلول صبغ البنفسج البلوريServicebioG1014صبغ المستعمرات وغشاء Transwell
DMEMServicebioG4511وسط زرع روتيني لخلايا Beas-2b
الجسم المضاد DVL1Signalway Antibody53180جسم مضاد أولي من الأرنب؛ لطخة ويسترن بنسبة 1:5,000
مصل جنين البقر (FBS)BiosharpBL203Bمكمل بنسبة 10% (حجم/حجم) لزراعة الخلايا الروتينية؛ 20% (حجم/حجم) في الحجرة السفلية لـ Transwell
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareVersion 8إعداد الرسوم البيانية والتحليل الإحصائي
مزيج Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox)Yeasen Biotechnology11201ES08تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي القائم على SYBR Green
مزيج Hifair III لتخليق الشريط الأول من cDNA لـ qPCR (gDNA digester plus)Yeasen Biotechnology11141ES60النسخ العكسي لـ mRNA RT-qPCR
IBM SPSS StatisticsIBMVersion 22.0التحليل الإحصائي
ImageJNational Institutes of HealthVersion 1.53قياس الكثافة الضوئية للطخة ويسترن، وقياس مساحة الجرح، وعد المستعمرات، وعد خلايا Transwell
مجهر مقلوبOlympusCKX53تصوير مقايسات التئام الجروح ومقايسات Transwell
إيزوبروبانولServicebioG3006ترسيب RNA أثناء الاستخلاص القائم على TRIzol
تحضيرات فيروسية من نوع LV-miR-486-3p و LV-NCGenePharmaCustom synthesisناقل للتعبير المفرط المستقر لـ miR-486-3p وناقل تحكم سلبي عشوائي
مصفوفة الغشاء القاعدي MatrigelCorning354234مخففة بنسبة 1:8 في DMEM خالي من المصل؛ تركيز بروتين نهائي يقارب 1 mg/mL
ميثانولXilong ScientificGB/T 683-2006تنشيط غشاء PVDF
قارئ الأطباق الدقيقةBioTekELx800قياس الامتصاصية عند 450 nm
مقياس طيف ضوئي للأحجام الدقيقة UV-VisAllshengNano-600تقييم تركيز RNA ونقاوة A260/A280
بنسلين-ستربتومايسينGibco, Thermo Fisher Scientific15240062مكمل بنسبة 1% (حجم/حجم) لزراعة الخلايا الروتينية
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)ServicebioG0002غسل الخلايا والأغشية
مزيج مثبطات البروتيازAPExBIOK1007يضاف إلى منظم تحلل RIPA
سلم البروتينBiosharpBL712Aمرجع للوزن الجزيئي للطخة ويسترن
غشاء PVDFMilliporeK2MA8350Eغشاء نقل البروتين للطخة ويسترن
نظام QuantStudio 5 Real-Time PCRThermo Fisher ScientificQuantStudio 5جمع بيانات RT-qPCR
منظم تحلل RIPABeyotimeP0013Bاستخلاص البروتين الخلوي الكلي
كاشف استخلاص RNA (من نوع TRIzol)ServicebioG3013استخلاص RNA الكلي
وسط RPMI 1640ServicebioG4510وسط زرع روتيني لخلايا A549 و H358 ومعلق خلايا Transwell خالي من المصل
SDSSolarbioS8010كاشف SDS-PAGE
مسحوق حليب منزوع الدسمBD2271470محلول غلق بتركيز 5% للطخة ويسترن
StarBase v3.0Sun Yat-sen Universityhttps://rnasysu.com/encori/تحليل تعبير miR-486-3p المشتق من TCGA
TargetScanHumanWhitehead Institute for Biomedical Researchhttps://www.targetscan.org/vert_80/التنبؤ بمواقع ارتباط miR-486-3p المرشحة
TEMEDSigma-AldrichT8090محفز بلمرة هلام SDS-PAGE
إضافات Transwell، 24 بئر، حجم مسام 8 μmCorning3428مقايسة عبور الغشاء المطلي بـ Matrigel
تريبسينServicebioG4000فصل الخلايا
Tween-20Solarbio815A043تحضير منظم غسل لطخة ويسترن
نظام الرحلان الكهربائي العموديLiuyi BiotechnologyDYCZ-24DNفصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE
كاشف لومينول لركيزة Western HRPAffinity BiosciencesKF001كشف لطخة ويسترن بالتلألؤ الكيميائي
نظام النقل الرطبBio-Rad1703930نقل البروتين إلى غشاء PVDF
الجسم المضاد WNT5BSignalway Antibody56808جسم مضاد أولي من الأرنب؛ لطخة ويسترن بنسبة 1:5,000
الجسم المضاد β-actinAbcamab8227ضابط تحميل؛ لطخة ويسترن بنسبة 1:5,000
الجسم المضاد β-cateninSignalway Antibody21725جسم مضاد أولي من الأرنب؛ لطخة ويسترن بنسبة 1:5,000

المراجع

  1. Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359(13):1367-1380.
  2. Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34.
  3. Han B, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022. J Natl Cancer Cent. 2024;4(1):47-53.
  4. Lin JJ, et al. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs. J Thorac Oncol. 2016;11(4):556-565.
  5. She J, Yang P, Hong Q, Bai C. Lung cancer in China: challenges and interventions. Chest. 2013;143(4):1117-1126.
  6. Barker N, Clevers H. Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(12):997-1014.
  7. Komiya Y, Habas R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 2008;4(2):68-75.
  8. Stewart DJ. Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 2014;106(1):djt356.
  9. Zhang Z, et al. Wnt/β-catenin signaling in the development and therapeutic resistance of non-small cell lung cancer. J Transl Med. 2024;22(1):565.
  10. Zhang Q, et al. WNT5B exerts oncogenic effects and is negatively regulated by miR-5587-3p in lung adenocarcinoma progression. Oncogene. 2020;39(7):1484-1497.
  11. Suthon S, et al. WNT5B in physiology and disease. Front Cell Dev Biol. 2021;9:667581.
  12. Ji H, et al. SPATA2 suppresses epithelial-mesenchymal transition to inhibit metastasis and radiotherapy sensitivity in non-small cell lung cancer via. impairing DVL1/β-catenin signaling. Thorac Cancer. 2023;14(11):969-982.
  13. Wang Y, Wang L, Chen C, Chu X. New insights into the regulatory role of microRNA in tumor angiogenesis and clinical implications. Mol Cancer. 2018;17(1):22.
  14. Iqbal MA, Arora S, Prakasam G, Calin GA, Syed MA. MicroRNA in lung cancer: role, mechanisms, pathways and therapeutic relevance. Mol Aspects Med. 2019;70:3-20.
  15. Lee YS, Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol. 2009;4:199-227.
  16. Lin G, et al. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3β in human lung cancer cells. Exp Cell Res. 2017;352(2):364-374.
  17. Jiang W, et al. MicroRNA-1258 suppresses tumor progression via. GRB2/Ras/Erk pathway in non-small-cell lung cancer. Cell Prolif. 2018;51(6):e12502.
  18. Xie Y, Xue C, Guo S, Yang L. MicroRNA-520a suppresses pathogenesis and progression of non-small-cell lung cancer through targeting the RRM2/Wnt axis. Anal Cell Pathol (Amst). 2021;2021:9652420.
  19. Peng Y, Zhang X, Feng X, Fan X, Jin Z. The crosstalk between microRNAs and the Wnt/β-catenin signaling pathway in cancer. Oncotarget. 2017;8(8):14089-14106.
  20. Wang X, et al. MiR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of β-catenin. Biochem Biophys Res Commun. 2012;428(4):525-531.
  21. Lulli V, et al. MicroRNA-486-3p regulates γ-globin expression in human erythroid cells by directly modulating BCL11A. PLoS One. 2013;8(4):e60436.
  22. Chou ST, et al. MicroRNA-486-3p functions as a tumor suppressor in oral cancer by targeting DDR1. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):281.
  23. Wu H, et al. Overexpression of miR-486-3p promoted by allicin enhances temozolomide sensitivity in glioblastoma via. targeting MGMT. Neuromolecular Med. 2020;22(3):359-369.
  24. Garajei A, et al. Evaluation of the expression of miR-486-3p, miR-548-3p, miR-561-5p and miR-509-5p in tumor biopsies of patients with oral squamous cell carcinoma. Pathogens. 2022;11(2):211.
  25. Li X, et al. MicroRNA-486-3p promotes the proliferation and metastasis of cutaneous squamous cell carcinoma by suppressing flotillin-2. J Dermatol Sci. 2022;105(1):18-26.
  26. Tomioka Y, et al. The molecular pathogenesis of tumor-suppressive miR-486-5p and miR-486-3p target genes: GINS4 facilitates aggressiveness in lung adenocarcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(13):3408.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تعبير WNT5Bتعبير DVL1بيتا-كاتينينترانسدكشن فيروسي عدسيتكوين المستعمراتمقايسة التئام الجروحلطخة ويسترنRT-qPCR
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.