يؤدي الإفراط في التعبير القسري عن miR-486-3p إلى تثبيط النشاط المرتبط بالتكاثر، والنمو المستنسخ، والتئام الجروح، واختراق مادة Matrigel في خلايا سرطان الرئة الغدي من طرازي A549 وH358. وتصاحب هذه التأثيرات انخفاض في تعبير WNT5B وDVL1 وβ-catenin وBCL-2، مما يشير إلى وجود ارتباط in vitro بتغيرات متعلقة بمسار Wnt دون إثبات استهداف مباشر أو سببية في المسار.
مقالة بحثية
miR-486-3p يثبط الأنماط الظاهرية الخبيثة ويرتبط بانخفاض تعبير WNT5B وDVL1 وβ-catenin في خلايا سرطان الرئة الغدي
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعد سرطان الرئة الغدي (LUAD) النوع النسيجي السائد من سرطان الرئة غير صغير الخلايا، ولا يزال مرتبطاً بمعدلات مراضة ووفيات كبيرة. وقد حددت الدراسات السابقة وظائف كابتة للأورام لـ miR-486-3p في LUAD، ولكن العلاقة بينه وبين التغيرات في تعبير WNT5B وDVL1 وβ-catenin لم يتم تحديدها بوضوح. هنا، تم فحص الوفرة الأساسية لـ miR-486-3p في خلايا LUAD من نوع A549 وH358 ومقارنتها بتلك الموجودة في خلايا Beas-2b الظهارية الشعبية التي تم الحفاظ عليها في ظروفها الروتينية المعتادة. تم إنشاء نماذج مستقرة تفرط في التعبير عن miR-486-3p عن طريق التنحي الفيروسي (lentiviral transduction). كما تم تقييم النشاط المرتبط بنمو الخلايا، والنمو المستنسخ، وإغلاق الجرح، واجتياز الأغشية المطلية بـ Matrigel باستخدام مجموعة عد الخلايا CCK-8، واختبار تكوين المستعمرات، واختبار التئام الجروح، واختبارات Transwell. كما تم تقييم وفرة بروتينات WNT5B وDVL1 وβ-catenin وBCL-2 عن طريق لطخة ويسترن (Western blotting)، وبالإضافة إلى ذلك تم فحص مستويات mRNA لكل من WNT5B وDVL1 وCTNNB1 وBCL2 بواسطة RT-qPCR. وفي ظل ظروف الزرع المستخدمة، كانت وفرة miR-486-3p في خلايا A549 وH358 أقل منها في خلايا Beas-2b، وأدى التنحي الفيروسي إلى فرط تعبير مستقر في كلا خطي خلايا LUAD. أدى الإفراط القسري في تعبير miR-486-3p إلى تقليل إشارة CCK-8، وتكوين المستعمرات، وإغلاق الجروح، واجتياز الأغشية المطلية بـ Matrigel، وصاحب ذلك انخفاض في وفرة بروتينات WNT5B وDVL1 وβ-catenin الكلي وBCL-2. علاوة على ذلك، أظهر RT-qPCR انخفاضاً في وفرة نسخ WNT5B وDVL1 وCTNNB1 وBCL2 في كلا خطي خلايا LUAD بعد الإفراط في تعبير miR-486-3p. تدعم هذه النتائج وجود ارتباط in vitro بين التعبير القسري لـ miR-486-3p، وتوهين عدة مؤشرات للخلايا الخبيثة، وتغير التعبير المرتبط بـ Wnt؛ ومع ذلك، فهي لا تثبت الارتباط المباشر بين miRNA وهدفه، أو نشاط المسار، أو آلية تأشير خطية سببية.
المقدمة
يُعد سرطان الرئة الغدي (LUAD) النوع النسيجي الأكثر شيوعاً من سرطان الرئة غير صغير الخلايا (NSCLC)، ويساهم بشكل كبير في معدلات المراضة والوفيات المرتبطة بسرطان الرئة في جميع أنحاء العالم1,2,3,4,5. وقد أدى التصنيف الجزيئي والعلاجات الموجهة إلى تحسين النتائج لمجموعات مختارة من المرضى، إلا أن سرطان LUAD المتقدم لا يزال من الصعب علاجه ويتسم بتغاير بيولوجي1,2,3,4,5. لذا، فإن تحديد العمليات التنظيمية التي تساهم في سلوك الخلايا الخبيثة يظل أمراً هاماً لتطوير فرضيات علاجية قابلة للاختبار.
يتكون مسار إشارات Wnt من فرعين، أحدهما يعتمد على β-catenin والآخر لا يعتمد عليه، واللذان ينظمان التكاثر والبقاء والقطبية والقدرة على الحركة6,7,8,9. ويرتبط WNT5B في أغلب الأحيان بالإشارات غير التقليدية، رغم أن تأثيراته البيولوجية تختلف باختلاف المستقبل والسياق الخلوي10,11. أما DVL1 فهو بروتين نقل إشارة سيتوبلازمي تشترك فيه عدة فروع من مسار Wnt، وقد رُبط بالسلوك المتعلق بـ β-catenin في سرطان الرئة12. وبناءً على ذلك، لا ينبغي تفسير التغيرات المتزامنة في WNT5B وDVL1 وβ-catenin في حد ذاتها كدليل على وجود مسار خطي واحد.
تُعد جزيئات MicroRNAs (miRNAs) حموضاً نووية ريبوزية قصيرة غير مشفرة تنظم التعبير الجيني من خلال تفاعلات تعتمد على التسلسل مع النسخ المستهدفة13,14,15. ونظراً لأن جزيء miRNA واحد قد يؤثر على عدة جزيئات RNA، فإن التغير في وفرة miRNA يمكن أن يؤثر على أنماط ظاهرية متنوعة مرتبطة بالأورام13,14,15,16,17,18. وقد رُبطت العديد من جزيئات miRNAs بنمو سرطان الرئة وحركته وإشاراته، كما وُصف التداخل بين miRNAs والشبكات المرتبطة بـ Wnt في سياقات سرطانية متعددة16,17,18,19,20.
ينتج عن موضع MIR486 السلسلتان الناضجتان miR-486-3p و miR-486-5p. وقد أظهر miR-486-3p نشاطاً مثبطاً للأورام في سرطان الفم والورم الأرومي الدبقي، بينما تم الإبلاغ عن تأثير محفز للأورام في سرطان الخلايا الحرشفية الجلدي21,22,23,24,25. تم اختيار miR-486-3p للدراسة الحالية من خلال استراتيجية قائمة على الفرضيات بناءً على انخفاض وفرته في البيانات العامة لسرطان الرئة الغدي (LUAD)، ونشاطه المثبط للأورام المبلغ عنه سابقاً في LUAD، والتنبؤات المعلوماتية الحيوية التي تربطه بنسخ مرشحة ذات صلة بـ WNT. وقد أثبت Tomioka وآخرون التأثيرات المثبطة للأورام لكل من سلسلتي miR-486 في LUAD وحددوا GINS4 من خلال فحص الأهداف على مستوى الجينوم كاملاً26. وبناءً على ذلك، لا تدعي الدراسة الحالية أنها أول إثبات لنمط ظاهري مضاد للأورام، بل تقيم ما إذا كان التعبير القسري لـ miR-486-3p مصحوباً بتغيرات في وفرة WNT5B و DVL1 و β-catenin وتغيرات نمطية ظاهرة قابلة للتكرار في خطين خلويين من LUAD. وتقيم هذه التحليلات الارتباطات ولا تثبت الاستهداف المباشر، أو نشاط المسار، أو وجود آلية خطية لـ WNT5B/DVL1/β-catenin.
البروتوكول
الكواشف والأجهزة المستخدمة مدرجة في جدول المواد.
زراعة الخلايا
تم استخدام خطوط خلايا سرطان الرئة الغدي البشري (LUAD) من نوع A549 وH358، وخط خلايا الظهارة القصبية المخلدة Beas-2b. وقد تم اختيار A549 (KRAS G12S) وH358 (KRAS G12C؛ وناقصة STK11) كنماذج شائعة الاستخدام لسرطان الرئة الغدي (LUAD) بخلفيات طفرية مختلفة لـ KRAS، بينما أُدرجت Beas-2b كمقارن ظهاري قصبي غير خبيث. حُفظت خلايا A549 وH358 في وسط RPMI-1640، بينما حُفظت خلايا Beas-2b في وسط DMEM؛ واحتوى كل وسط على 10% fetal bovine serum و1% penicillin-streptomycin. زُرعت الخلايا عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% CO₂. ونظرًا لأن خطوط خلايا الورم والمقارن الظهاري قد حُفظت في أوساط روتينية مختلفة، فقد تم تفسير مقارنات التعبير الأساسي بين خطوط الخلايا المختلفة بحذر.
النقل الجيني باستخدام الفيروسات البطيئة واختيار الخلايا المستقرة
استُخدمت ناقلات فيروسية بطيئة (Lentiviral vectors) تحمل السلف لـ hsa-miR-486-3p (LV-miR-486-3p) أو تسلسلاً عشوائياً للتحكم السلبي (LV-NC) في تصميم مستقر لزيادة الوظيفة. تم استزراع خلايا A549 وH358 في أطباق ذات 6 عيون بكثافة 5 × 104 خلية/عين وحُضنت طوال الليل. وفي اليوم التالي، عُرّضت الخلايا للفيروس البطيء بمضاعف عدوى (MOI) قدره 10 بوجود 8 µg/mL من polybrene. وبعد 24 h، استُبدل اللقاح الفيروسي بوسط غذائي كامل وطازج. ثم اختيرت الخلايا المنقولة باستخدام 2 µg/mL من puromycin لمدة 7 أيام. وبعد عملية الاختيار، تُرِكت الخلايا الناجية للتعافي وتم تكثيرها من أجل المقاييس الجزيئية والوظيفية اللاحقة. ولم يتم إدراج ذراع لتثبيط miR-486-3p لأن الدراسة الحالية صُممت خصيصاً لتقييم آثار الإفراط في التعبير القسري المستقر.
ملاحظة: يجب الحفاظ على تطابق كل من تعددية العدوى (MOI)، ووقت التعرض لـ polybrene، وظروف الانتقاء بـ puromycin بين مجموعتي LV-NC وLV-miR-486-3p لتقليل الاختلافات المتعلقة بالعلاج في حيوية الخلايا.
تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)
أُجري تفاعل RT-qPCR لتحديد مستويات تعبير miR-486-3p وللتأكد من كفاءة الإفراط في التعبير بواسطة الفيروسات البطيئة (lentiviral) في خلايا A549 وH358. تم عزل الحمض النووي الريبي (RNA) الكلي باستخدام كاشف TRIzol وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. وقُيم تركيز ونقاء RNA طيفياً، حيث اعتُبرت نسبة A260/A280 التي تتراوح بين 1.8–2.1 مقبولة. ولتحليل mRNA، تم تحويل 1 µg من RNA الكلي إلى cDNA عن طريق النسخ العكسي باستخدام مجموعة تجارية لتخليق cDNA وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة. أما بالنسبة لتحليل microRNA، فقد أُجري تخليق cDNA باستخدام بادئ نسخ عكسي متخصص بـ miRNA على شكل حلقة ساقية (stem-loop). نُفذ تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في حجم تفاعل كلي قدره 20 µL يحتوي على 10 µL من 2× SYBR Green Master Mix، و0.4 µM من كل بادئ، و2 µL من قالب cDNA. وتكون بروتوكول التضخيم من خطوة مسخ أولية عند 95 °C لمدة 5 min، تلتها 40 دورة من المسخ عند 95 °C لمدة 10 s والارتباط/التمديد عند 60 °C لمدة 30 s. بعد ذلك، أُجري تحليل منحنى الانصهار للتحقق من خصوصية التضخيم. استُخدم RNA النووي الصغير U6 كضابط داخلي لتقدير كمية miRNA، بينما استُخدم GAPDH كجين مرجعي لتقييس mRNA. وحُددت مستويات التعبير النسبي باستخدام طريقة 2−ΔΔCq.
كانت تتابعات بادئات miRNA كما يلي: بادئة النسخ العكسي ذات الحلقة الجذعية (stem-loop)، 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′؛ وبادئة miR-486-3p الأمامية، 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′؛ وبادئة عكسية عامة، 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′؛ وبادئة U6 الأمامية، 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′؛ وبادئة U6 العكسية، 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. كما تتوفر تتابعات البادئات لكل من WNT5B وDVL1 وCTNNB1 وBCL2 وGAPDH، جنباً إلى جنب مع أطوال النواتج التضخيمية وكفاءات التضخيم، في الجدول 1. تم تطبيع تعبير mRNA بالنسبة إلى GAPDH، بينما تم تطبيع تعبير miR-486-3p بالنسبة إلى U6. تضمنت كل تجربة ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة، مع ثلاث مكررات تقنية لكل مكرر بيولوجي.
لطخة ويسترن
بعد اكتمال عملية الانتقاء باستخدام puromycin لمدة 7 أيام وفترة التعافي، تم تحلل الخلايا في محلول RIPA المنظم الذي يحتوي على مثبطات البروتياز. تم تحديد تركيزات البروتين باستخدام مقايسة BCA للبروتين. فُصلت كميات متساوية من البروتين (20 µg لكل مسار) على هلام SDS-PAGE بتركيز 10%، ونُقلت إلى أغشية PVDF عن طريق النقل الرطب بتيار 300 mA لمدة 120 min. حُجبت الأغشية باستخدام حليب منزوع الدسم بتركيز 5% مُحضّر في محلول Tris-buffered saline يحتوي على 0.1% Tween-20 (TBST) لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة. حُضنت الأغشية طوال الليل عند 4 °C مع أجسام مضادة أولية ضد WNT5B (1:1,000)، أو DVL1 (1:1,000)، أو β-catenin (1:1,000)، أو BCL-2 (0.5 µg/mL)، أو β-actin (1:5,000). تتوفر أسماء الشركات المصنعة وأرقام الكتالوج لجميع الأجسام المضادة في جدول المواد. بعد ثلاث عمليات غسيل بـ TBST لمدة 10 min لكل منها، حُضنت الأغشية مع جسم مضاد ثانوي من الماعز مضاد لـ rabbit IgG مقترن بـ HRP ومخفف بنسبة 1:5,000 لمدة 1 h في درجة حرارة الغرفة. ثم غُسلت الأغشية ثلاث مرات بـ TBST، وتم تصور حزم البروتين باستخدام ركيزة ذات لومينيسنس كيميائي، وصُوّرت باستخدام نظام توثيق وتصوير الهلام. تم قياس كثافة الحزم باستخدام برنامج ImageJ. وتم تطبيع وفرة كل بروتين مستهدف بالنسبة لإشارة β-actin المقابلة من نفس العينة البيولوجية. استُخدمت فقط عمليات التعريض التي تقع ضمن نطاق الكشف الخطي غير المشبع للتحليل الكثافي. أُجريت ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة.
مقايسة طقم عد الخلايا-8
تم استزراع خلايا A549 وH358 التي تم نقلها بشكل مستقر باستخدام LV-NC أو LV-miR-486-3p في أطباق ذات 96 بئر بكثافة 1.5 × 104 خلية/بئر في 100 µL من الوسط الغذائي الكامل. وبعد الالتصاق طوال الليل، تم استبدال الوسط الغذائي، وقِيست الامتصاصية عند الساعة 0 مباشرة بعد إضافة كاشف Cell Counting Kit-8. وعند الساعات 0 و24 و48 و72 و96، أضيفت 10 µL من الكاشف لكل بئر وحُضنت لمدة 1 h عند 37 °C قبل قراءة الامتصاصية عند 450 nm. وبالنسبة لتحليل المدى الزمني المراجع، تم تطبيع كل مجموعة بناءً على قيمة الساعة 0 الخاصة بها قبل التمثيل البياني. أُجريت ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة، وتم حساب متوسط الآبار التقنية داخل كل تجربة قبل إجراء التحليل الإحصائي.
اختبار تكوين المستعمرات
تم تحضير خلايا A549 وH358 المختارة باستقرار على هيئة معلقات خلوية مفردة بتركيز 5 × 102 cells/mL. وتم استزراع 1 mL من المعلق الخلوي في كل بئر من أطباق زراعة خلوية ذات 6 آبار، ثم أضيف 3 mL من الوسط الغذائي الكامل. استمرت زراعة الخلايا لمدة 14 يوماً، مع استبدال الوسط الغذائي كل 5 أيام. غُسلت المستعمرات باستخدام PBS، ثم ثُبتت باستخدام 4% paraformaldehyde لمدة 20 min، وصُبغت بصبغة crystal violet لمدة 20 min، ثم غُسلت وتُرِكت لتجف في الهواء. تم عد المستعمرات التي تحتوي على 50 خلية على الأقل باستخدام برنامج ImageJ. وأُجريت ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة.
ملاحظة: يتطلب الأمر الحصول على معلق خلايا مفردة متجانس وتقليل اضطراب الأطباق أثناء تكوين المستعمرات لمنع التكتل الاصطناعي للخلايا.
مقايسة هجرة الخلايا
تم استزراع خلايا A549 وH358 التي تم نقل الجينات إليها بشكل مستقر في أطباق ذات 6 آبار، وتم تنميتها حتى تشكلت طبقة أحادية متصلة. تم إحداث خدش مستقيم باستخدام رأس ماصة معقم سعة 10 µL، ثم تمت إزالة الخلايا المنفصلة، وتم تصوير الحقول المحددة نفسها عند 0 h و24 h و48 h و72 h. قيست مساحة الجرح باستخدام برنامج ImageJ، وحُسب انغلاق الجرح وفق المعادلة: (المساحة عند 0 h − المساحة عند النقطة الزمنية المحددة) / المساحة عند 0 h × 100%. تم إجراء ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة. لم يتم استخدام أي مثبط دوائي للتكاثر؛ وبناءً على ذلك، فُسِّر هذا الاختبار على أنه قياس لانغلاق الجرح بدلاً من كونه قراءة خاصة بالهجرة الخلوية.
ملاحظة: يجب إنشاء الخدوش بعرض وضغط متسقين، كما يجب تتبع حقول متطابقة طوال المدى الزمني.
مقايسة غزو الخلايا
أُجريت اختبارات الغزو باستخدام نظام Transwell عبر إدراجات أغشية من البوليكربونات مكونة من 24 بئراً وبحجم مسام يبلغ 8 µm. طُلي السطح العلوي لكل إدراج بـ 100 µL من مصفوفة الغشاء القاعدي Matrigel المخففة بنسبة 1:8 في وسط DMEM خالٍ من المصل، ليصل التركيز البروتيني النهائي التقريبي إلى 1 mg/mL، ثم حُضنت عند 37 °C لمدة 4 h. أُعيد تعليق خلايا A549 وH358 في وسط RPMI-1640 خالٍ من المصل بكثافات بلغت 8 × 105 cells/mL و4 × 105 cells/mL، على التوالي. أُضيفت كمية 200 µL من معلق الخلايا إلى الغرفة العلوية، وهو ما يعادل 1.6 × 105 من خلايا A549 أو 8 × 104 من خلايا H358 لكل إدراج. مُلئت الغرفة السفلية بـ 500 µL من وسط RPMI-1640 المحتوي على 20% من مصل الجنين البقري ليعمل كعامل جذب كيميائي. وبعد التحضين عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% CO₂ لمدة 48 h، أُزيلت الخلايا غير الغازية المتبقية على السطح العلوي للغشاء برفق باستخدام مسحة قطنية. ثم ثُبتت الخلايا التي غزت الغشاء باستخدام 4% paraformaldehyde لمدة 20 min، وصُبغت بـ 0.1% crystal violet لمدة 20 min في درجة حرارة الغرفة. التُقطت صور لخمسة حقول مجهرية مختارة عشوائياً لكل إدراج، وقُدر عدد الخلايا الغازية باستخدام برنامج ImageJ. واعتُبر متوسط عدد الخلايا من الحقول الخمسة قيمة واحدة لكل إدراج، كما عومل الإدراج، وليس الحقل المجهري الفردي، كوحدة تجريبية. أُجريت ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة.
ملاحظة: يجب إزالة الخلايا غير الغازية برفق وبشكل متسق لتجنب إتلاف الغشاء أو إزاحة الخلايا التي هاجرت إلى سطحه السفلي.
التحليل الإحصائي
تُعرض البيانات كمتوسط ± SD، ويشير n إلى التجارب البيولوجية المستقلة ما لم يُنص على خلاف ذلك. تم حساب متوسط المكررات التقنية أو المجالات المجهرية المتعددة من نفس الوحدة التجريبية قبل إجراء الاختبارات الاستدلالية. وبالنسبة لمقارنة الخطوط الخلوية الثلاثة، استُخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way analysis of variance) متبوعاً بمقارنات زوجية معدلة حسب اختبار Tukey. أما بالنسبة للمسارات الزمنية لـ CCK-8 ووقت التئام الجرح، فقد استُخدم تحليل التباين للقياسات المتكررة ثنائي الاتجاه (two-way repeated-measures analysis of variance) لتقييم آثار العلاج، والزمن، والتفاعل بين العلاج والزمن، متبوعاً بمقارنات معدلة حسب اختبار Šídák عند نقاط زمنية فردية. كما حُللت مقارنات المجموعتين باستخدام اختبارات Student's t-tests غير المقترنة ثنائية الجانب. أُجريت التحليلات الإحصائية وتصور البيانات باستخدام برمجيات التحليل الإحصائي والرسم البياني. تم ذكر قيم p الدقيقة في لوحات الأشكال أو جداول البيانات المصدرية. حُددت الدلالة الإحصائية عند p < 0.05؛ حيث *p < 0.05، و**p < 0.01، و***p < 0.001، و****p < 0.0001.
النتائج
يُظهر تحليل TCGA/starBase انخفاض وفرة miR-486-3p في سرطان الرئة ذو الخلايا الحرشفية، ويحدد TargetScan مواقع ارتباط مرشحة
أظهرت بيانات التعبير المستمدة من مشروع الجينوم المسرّطِن (TCGA) والمستخرجة عبر starBase v3.0 أن وفرة miR-486-3p كانت أقل بشكل كبير في 512 عينة من سرطان الغُدّة الرئوية (LUAD) مقارنة بـ 20 عينة رئوية غير ورمية (اختبار ويلكوكسون للرتبة المجموعية، p = 3.2 × 10⁻5؛ الشكل 1). حدد برنامج TargetScanHuman موقعًا مرشحًا غير محفوظ جيدًا من نوع 7mer-m8 لـ miR-486-3p عند المواقع 468–474 في المنطقة غير المترجمة 3′ (3′ UTR) للجين DVL1، مع درجة سياق++ مقدارها −0.23 ونسبة مئوية لدرجة السياق++ تبلغ 80. كما تم تحديد موقع مرشح غير محفوظ جيدًا من نوع 8mer عند المواقع 913–920 في المنطقة غير المترجمة 3′ لـ WNT5B، مع درجة سياق++ مقدارها −0.46 ونسبة مئوية لدرجة السياق++ تبلغ 97 (الشكل 2). استُخدمت هذه المواقع المُتنبأ بها حاسوبيًا لتوليد الفرضية التجريبية، ولكنها لم تُعتبر دليلًا على الارتباط المباشر بين الـmiRNA والهدف. تُقدَّم عناوين المصادر (URLs) في الجدول 2.
ينخفض وفرة miR-486-3p في خطوط خلايا LUAD ويزداد بشكل ملحوظ بعد التحوير باستخدام فيرس ناقل عطري
أظهر تحليل RT-qPCR أن وفرة miR-486-3p كانت أقل في خلايا A549 وH358 مقارنة بخلايا Beas-2b الظهارية القصبية تحت ظروف الثقافة الروتينية الخاصة بكل منها. وأظهرت المقارنات المعدلة باستخدام اختبار تكي بعد تحليل التباين أحادي الاتجاه فروقًا ذات دلالة إحصائية بين خلايا A549 وBeas-2b (p < 0.01) وبين خلايا H358 وBeas-2b (p < 0.001؛ الشكل 3A).
أدى التعدية المستقرة باستخدام الفيروس البطيء LV-miR-486-3p إلى زيادة ملحوظة في وفرة miR-486-3p مقارنةً بمجموعات LV-NC المقابلة. وارتفع التعبير بنحو 1,470 ضعفًا في خلايا A549 و220 ضعفًا في خلايا H358، مع تحقيق دلالة إحصائية في كلا المقارنتين (p < 0.001؛ الشكل 3B،C). وقد أكدت هذه النتائج الإقامة الناجحة لنماذج خلوية مستقرة تُعبر بشكل مفرط عن miR-486-3p.
يرتبط التعبير القسري عن miR-486-3p بانخفاض التعبير عن WNT5B وDVL1 وβ-catenin وBCL-2
أظهر التحليل بالبلوت الغربي انخفاضًا في وفرة بروتينات WNT5B وDVL1 وβ-catenin الكلي وBCL-2 في الخلايا المُعدَّلة باستخدام LV-miR-486-3p مقارنةً بالضوابط LV-NC المقابلة (الشكل 4A–E). في خلايا A549، ارتبط التعبير الإ принي عن miR-486-3p بانخفاض وفرة بروتين β-catenin (p = 0.022) وWNT5B (p = 0.0008) وDVL1 (p = 0.019) وBCL-2 (p = 0.0017). كما لُوحظت انخفاضات مماثلة في خلايا H358 بالنسبة لبروتين β-catenin (p = 0.001) وWNT5B (p = 0.0002) وDVL1 (p = 0.0003) وBCL-2 (p = 0.0018).
تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي لاحقًا لتحديد ما إذا كانت التغيرات على مستوى النسخ ترافق نتائج البروتين (الشكل 4F–I). في خلايا A549، أدّى التعبير القسري عن miR-486-3p إلى تقليل mRNA لـ CTNNB1 إلى 0.226 ضعفًا مقارنةً بمجموعة LV-NC (p = 0.004)، وmRNA لـ WNT5B إلى 0.180 ضعفًا (p = 0.004)، وmRNA لـ DVL1 إلى 0.278 ضعفًا (p = 0.006)، وmRNA لـ BCL2 إلى 0.259 ضعفًا (p = 0.003).
تم اكتشاف تغيرات مماثلة على مستوى النسخ في خلايا H358. انخفض mRNA الجين CTNNB1 إلى 0.288 ضعفًا مقارنةً بمجموعة LV-NC (p = 0.028)، وانخفض mRNA الجين WNT5B إلى 0.250 ضعفًا (p = 0.019)، وانخفض mRNA الجين DVL1 إلى 0.271 ضعفًا (p = 0.020)، وانخفض mRNA الجين BCL2 إلى 0.534 ضعفًا (p = 0.003). وبالتالي، كانت اتجاهات التغيرات على مستوى النسخ متسقة مع النتائج المقابلة على مستوى البروتين في كلا خطَّي الخلايا. تُظهر هذه النتائج تغيرات منسقة في التعبير الجيني، ولكنها لا تثبت الاستهداف المباشر أو نشاط آلية إشارية خطية تتضمن WNT5B/DVL1/β-catenin.
يقلل التعبير القسري عن miR-486-3p من إشارة CCK-8 المرتبطة بالنمو
تم تسوية قياسات CCK-8 بالنسبة للقيمة المقابلة عند الزمن 0 ساعة لكل مجموعة تجريبية. وقد زاد إشارة CCK-8 المُسَوَّاة بمرور الوقت في كل من الخلايا المُعَرَّضة للفيروسات البطيئة LV-NC والخلايا المُعَرَّضة للفيروسات البطيئة LV-miR-486-3p، ولكن لوحظت قيم أقل بشكل عام بعد التعبير القسري عن miR-486-3p (الشكل 5).
في الخلايا A549، أظهرت المقارنات المعدلة باستخدام طريقة شيداك بعد تحليل التباين الثنائي للقياسات المتكررة انخفاضًا كبيرًا في إشارات CCK-8 في مجموعة LV-miR-486-3p عند 24 و48 و96 ساعة مقارنةً بمجموعة LV-NC (p < 0.05)، في حين لم يكن الفرق عند 72 ساعة دالًا إحصائيًا (الشكل 5A). وفي الخلايا H358، كانت إشارة CCK-8 أقل بشكل كبير في مجموعة LV-miR-486-3p عند 24 و48 و72 و96 ساعة (p < 0.05؛ الشكل 5B). تشير هذه النتائج إلى أن التعبير القسري عن miR-486-3p قلل من النشاط الأيضي المرتبط بالنمو، مع تأثير أكثر اتساقًا عبر مدة الزمن في خلايا H358.
يقلل التعبير القسري عن miR-486-3p من النمو الكлонوجيني
أُجريت تجارب تكوين المستعمرات لتقييم النمو التكاثري طويل المدى. وكونت خلايا A549 التي تم إدخال جزيء LV-miR-486-3p إليها عددًا أقل بشكل ملحوظ من المستعمرات مقارنة بالخلايا LV-NC المقابلة (p = 0.013؛ الشكل 6A). كما لوحظ انخفاض كبير في عدد المستعمرات في خلايا H358 (p = 0.006؛ الشكل 6B). وكان الانخفاض أكثر وضوحًا في خلايا H358 مقارنة بخلايا A549، مما يشير إلى أن مدى التأثير التكاثري يختلف بين نموذجي سرطان الرئة ذو الخلايا الحرشفية (LUAD) هذين.
يقلل التعبير القسري عن miR-486-3p من إغلاق الجرح
تم تكميم إغلاق الجرح عند 24 ساعة، و48 ساعة، و72 ساعة بعد الخدش (الشكل 7). في محضرات خلايا A549، أظهرت مجموعة LV-miR-486-3p إغلاق جرح أقل بشكل ملحوظ مقارنةً بمجموعة LV-NC عند 24 و48 و72 ساعة (p < 0.05 لكل مقارنة؛ الشكل 7A،C).
وبالمثل، انخفض إغلاق الجرح في محافل خلايا H358 التي تم إدخال الجزيء الصغير الميكروي miR-486-3p إليها باستخدام فيرس اللنتي (LV-miR-486-3p-transduced) عند 24 و48 ساعة (p < 0.05) وعند 72 ساعة (p < 0.01؛ الشكل 7B،D). وبما أن الاختبار أُجري دون استخدام مثبط دوائي للانقسام الخلوي، تُفسَّر هذه النتائج على أنها انخفاض في إغلاق الجرح وليس دليلاً على تأثير محدد حصريًا على الهجرة الخلوية.
يقلل التعبير القسري لـ miR-486-3p من اجتياز الأغشية المغلفة بمادة ماتريجيل
تم تقييم قدرة الخلايا على اجتياز أغشية ترانسويل المغلفة بمادة ماتريجيل بعد 48 ساعة. وتم اكتشاف عدد أقل بشكل ملحوظ من الخلايا الملونة بالبلورات البنفسجية على السطح السفلي للغشاء في مجموعة A549 LV-miR-486-3p مقارنةً بمجموعة A549 LV-NC (p = 0.0001؛ الشكل 8A). وتم ملاحظة انخفاض مشابه في خلايا H358 (p = 0.0007؛ الشكل 8B).
تم أخذ متوسط خمس حقول مجهرية لكل إدخال، واعتُبر الإدخال وحدة التجربة. تُظهر هذه النتائج انخفاضًا في اجتياز الأغشية المغلفة بمادة ماتريجيل بعد التعبير القسري عن miR-486-3p في الظروف المستخدمة في هذا الفحص.
توفر البيانات:
تتضمن جميع بيانات المصدر الكامنة وراء الأشكال التوضيحية الملف التكميلي 1، بما في ذلك ملفات مصدر قاعدة البيانات، وبيانات تفاعل البلمرة المتسلسلة الكمي العكسي (RT-qPCR)، وصور النشافات الغربية غير المقصوصة، وقيم الكثافة الضوئية، وصور المجهر، وسجلات العد، وقياسات CCK-8، وملفات التحليل الإحصائي.
الشكل 1: وفرة miR-486-3p في عينات سرطان الغدد الرئوي (LUAD) والرئة الطبيعية من قاعدة بيانات TCGA/starBase. تم استرجاع بيانات التعبير المشتقة من TCGA عبر starBase الإصدار 3.0 في مايو 2026، وشملت 512 عينة من سرطان الغدد الرئوي (LUAD) و20 عينة من أنسجة الرئة الطبيعية. تمت مقارنة المجموعات باستخدام اختبار رتب ويلكوكسون (p = 3.2 × 10⁻5). LUAD، سرطان الغدد الرئوي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: مواقع ارتباط miR-486-3p المرشحة المتنبأ بها باستخدام TargetScan في مناطق الطرف غير المترجم 3′ لـ DVL1 وWNT5B. حدد برنامج TargetScanHuman موقعًا مرشحًا من نوع 7mer-m8 عند المواضع 468–474 في المنطقة غير المترجمة 3′ (3′ UTR) لـ DVL1 وموقعًا مرشحًا من نوع 8mer عند المواضع 913–920 في منطقة 3′ UTR لـ WNT5B. تُوفر عناوين المصادر (URLs) في الجدول 2. استُخدمت هذه التنبؤات الحاسوبية لتوليد الفرضيات، ولا تمثل دليلاً تجريبيًا على الارتباط المباشر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: وفرة miR-486-3p الأساسية والتحقق من الإفراط في التعبير باستخدام فيرس لاينتي (Aتحليل RT-qPCR miR-486-3p الوفرة في الخلايا A549 وH358 وBeas-2b المحفوظة في وسائط الثقافة الروتينية الخاصة بكل منها. (ب، ج) التحقق باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي (RT-qPCR miR-486-3p الإفراط في التعبير في A549 (B) وH358 (جالخلايا المُعالجة بفيروس لنتيفيروسي يحمل تسلسل تحكم (LV-NC) أو فيروس لنتيفيروسي يحمل الـmiR-486-3p. تم تسوية التعبير الجيني بالنسبة إلى U6. تُعرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري من ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة. (Aتم تحليل النتائج باستخدام تحليل التباين الأحادي الاتجاه (ANOVA)، يليه مقارنات متعددة مُعدَّلة باستخدام اختبار تكي. (ب، جتم تحليلها باستخدام اختبار "ستودنت" غير المزدوج ذي الطرفين ت-اختبارات. *p < 0.01; **p < 0.001. LV-NC، فيرس لنتيفيروسي وصمة تحكم سالبة؛ RT-qPCR، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مع عكس النسخ؛ SD، الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: يرتبط التعبير القسري لـ miR-486-3p بانخفاض التعبير عن الجينات المرشحة. (Aنماذج تمثيلية لنتائج تحليل ويسترن بلوت تُظهر وفرة β-catenin، WNT5B، DVL1، BCL-2، وβ-actin في خلايا A549 وH358 التي تم إصداها بـ LV-NC أو LV-miR-486-3p. تُشار الكتل الجزيئية بالكيلو دالتون.ب–هـالقياس الكثافي للكتلة لبروتين β-catenin (B)، WNT5B (ج)، DVL1 (د، وBCL-2 (هـ)، مُعدَّلًا بالنسبة إلى β-actin. (F–Iتحليل RT-qPCR CTNNB1 (ف), WNT5B (ج), DVL1 (هـ)، و BCL2 (Iوفرة النسخ، مُعدَّلة بالنسبة إلى GAPDH. تُعرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري من ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة؛ حيث تمثل النقاط الفردية تكرارات بيولوجية مستقلة. تمت مقارنة المجموعات باستخدام اختبار ستيودنت الثنائي الطرف وغير المزدوج ت-اختبارات. بالضبط pتُقدَّم القيم وقيم التغير الطيّاري في اللوحات المقابلة. كيلو دالتون (kDa)، فيرس اللنتي المُتحكّم السلبي (LV-NC)، تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي للنسخ (RT-qPCR)، الانحراف المعياري (SD). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: يؤدي التعبير الإ принудي لـ miR-486-3p إلى تقليل إشارات CCK-8 المرتبطة بالنمو مع مرور الوقت. تم تحليل خلايا A549 (أ) وH358 (ب) التي تم إدخال فيروس لنتي فيروسي حامل لـ LV-NC أو LV-miR-486-3p إليها عند الزمن 0 ساعة، 24 ساعة، 48 ساعة، 72 ساعة، و96 ساعة. تم تسوية قيم الامتصاصية عند 450 نانومتر (OD450) بالنسبة للقيمة عند الزمن 0 ساعة ضمن كل مجموعة. تُعرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري من ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة. تم تحليل تأثيرات المعالجة، الزمن، وتفاعل المعالجة مع الزمن باستخدام تحليل التباين الثنائي الاتجاه مع القياسات المتكررة (ANOVA)، يليه مقارنات معدّلة حسب شيداك بين المجموعات عند كل نقطة زمنية. *p < 0.05. CCK-8، كيت عد الخلايا-8؛ LV-NC، فيروس لنتي فيروسي تحكم سلبي؛ OD450، الكثافة البصرية عند 450 نانومتر؛ SD، الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: يؤدي التعبير الإجباري لـ miR-486-3p إلى تقليل النمو الكولوني. تُظهر الصور التمثيلية لآبار كاملة ونتائج العد الكمي للمستعمرات لخلايا A549 (أ) وH358 (ب) التي تم إدخال فيروس لنتي فيروسي يحتوي على LV-NC أو LV-miR-486-3p إليها. تم تكمية المستعمرات باستخدام برنامج ImageJ مع إعدادات تحليل متطابقة لجميع المجموعات. تُعرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري من ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة، وتم تحليلها باستخدام اختبارات t للطلاب غير المزدوجة ذات الطرفين. تُقدَّم قيم p الدقيقة في الأقسام المقابلة. LV-NC، فيروس لنتي فيروسي ضابط سلبي؛ SD، الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7التعبير القسري عن miR-486-3p يقلل من إغلاق الجرح. تُعرض صور تمثيلية وقياسات كمية لإغلاق الجرح لخلايا A549 (أ، ج) وH358 (ب، دالخلايا عند 0 ساعة، 24 ساعة، 48 ساعة، و72 ساعة بعد الخدش. وتم حساب إغلاق الجرح بالطريقة التالية: (مساحة الجرح عند 0 ساعة − مساحة الجرح عند الزمن المحدد) / مساحة الجرح عند 0 ساعة × 100%. تُعرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري من ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة. تم تحليل تأثيرات المعالجة، والزمن، وتفاعل المعالجة مع الزمن باستخدام تحليل التباين الثنائي الاتجاه مع القياسات المتكررة (Two-way repeated-measures ANOVA)، يليه مقارنات معدّلة حسب شيداك (Šídák-adjusted) بين المجموعات عند كل نقطة زمنية. شرائح المقياس، 200 µm. *p < 0.05; **p < 0.01. فيرس لنتي فيروسي سلبي كضابط (LV-NC)؛ الانحراف المعياري (SD). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8التعبير القسري عن miR-486-3p يقلل من قدرة الخلايا على اجتياز أغشية ترانسويل المغلفة بمادة ماتريجيل. مجالات ميكروسكوبية نموذجية ملطخة بالبلور البنفسجي ونتائج العد الكمي للخلايا على مستوى الإدراج تُعرض لخلايا A549 (A) وH358 (Bالخلايا المُعدَّلة باستخدام الفيروس البطيء LV-NC أو LV-miR-486-3p. أقراص ترانسويل ذات فتحة بقطر 8-µm تم استخدام أحجام فتحات معينة. تم أخذ متوسط خمسة مجالات مجهرية لكل قطعة، واعتبرت كل قطعة وحدة تجريبية واحدة. تُعرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري من ثلاث تجارب بيولوجية مستقلة، وتم تحليلها باستخدام اختبار طالب الثنائي غير المزدوج ت-اختبارات. شرائط المقياس، 200 µm. دقيق pتُقدَّم القيم في الألواح المقابلة. LV-NC، فيرس لنتيفيروسي تحكم سلبي؛ SD، الانحراف المعياري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
| الجين | تسلسلات البداءات | أطوال النواتج المضخّمة | كفاءات التضخيم | |
| WNT5B | البداء الأمامي: 5'-AAATGCCACGGCGTCTCG-3', | 118 زوج قاعدي | 101% | |
| البداء العكسي: 5'-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3' | ||||
| DVL1 | البداء الأمامي: 5'-GAGGGTGCTCACTCGGATG-3', | 158 زوج قاعدي | 95.60% | |
| البداء العكسي: 5'-GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' | ||||
| CTNNB1 | البداء الأمامي: 5'- GCGCCATTTTAAGCCTCTCG -3', | 140 زوج قاعدي | 96.30% | |
| البداء العكسي: 5'-AAATACCCTCAGGGGAACAGG-3' | ||||
| BCL2 | البداء الأمامي: 5'- GTCATGTGTGTGGAGAGCGT-3', | 139 زوج قاعدي | 97.20% | |
| البداء العكسي: 5'-ATAGTTCCACAAAGGCATCC-3' | ||||
| GAPDH | البداء الأمامي: 5'-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3', | 107 زوج قاعدي | 98.30% | |
| البداء العكسي: 5'-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3' | ||||
الجدول 1: تسلسلات البدائل المستخدمة لـ RT-qPCR.
| هدف | معلومات التنبؤ | مصدر | ||
| DVL1 | 7mer-m8، المواقع 468–474 | رابط تارغيتسكان (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000397196.2&taxid=9606&الأعضاء=miR-486-3p&عرض سي إن سي=1& موضحن=1&مُبينc_nc=1&موضحن cf1=1&موضحن cf2=1&مجموعة فرعية=1 | ||
| WNT5B | 8 مير، المواقع 913–920 | رابط تارغيتسكان (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST00000378891.5&taxid=9606&الأعضاء=miR-486-3p&عرض سي إن سي=1& موضحن=1&مُظهَرc_نc=1&مُبينcf1=1&موضحن cf2=1&مجموعة فرعية=1 | ||
الجدول 2: قاعدة بيانات TargetScan والرابط المقابل.
الملف التكميلي 1: بيانات تدعم نتائج هذه الدراسة.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.
المناقشة
قيمت دراسة اكتساب الوظيفة الحالية تأثيرات التعبير القسري والمستقر لـ miR-486-3p في خلايا سرطان الرئة الغدي (LUAD) من سلالتي A549 وH358. وفي كلا النموذجين، ارتبط الإفراط في تعبير miR-486-3p بانخفاض إشارات CCK-8 المرتبطة بالنمو، وتراجع النمو الاستنساخي، وانخفاض معدل انغلاق الجروح، وقلة عدد الخلايا التي عبرت أغشية Transwell المغطاة بـ Matrigel. وقد صاحبت هذه التغيرات المظهرية انخفاض في وفرة بروتينات WNT5B وDVL1 وβ-catenin الكلي وBCL-2، إلى جانب انخفاض مستويات نسخ WNT5B وDVL1 وCTNNB1 وBCL2. وبشكل جماعي، تدعم هذه النتائج وجود ارتباط بين التعبير القسري لـ miR-486-3p، وتخفيف العديد من المظاهر الخلوية الخبيثة، والتغيرات المنسقة في جزيئات مختارة مرتبطة بمسار Wnt. ومع ذلك، فإن هذه النتائج لا تثبت الارتباط المباشر بين الـ miRNA وهدفه، أو نشاط المسار، أو تسلسل إشارات سببي.
يتوافق النمط الظاهري العام المثبط للأورام الذي لوحظ في هذه الدراسة مع التقارير السابقة، ولا ينبغي تفسيره على أنه الاكتشاف الجديد الرئيسي. فقد أثبت Tomioka et al. سابقاً أن كلاً من miR-486-3p و miR-486-5p يثبطان الأنماط الظاهرية الخبيثة في خلايا LUAD، وحددا GINS4 من خلال استراتيجية غير منحازة لفحص الأهداف26. وتعد مساهمة الدراسة الحالية أكثر تحديداً: حيث صاحب التعبير القسري لـ miR-486-3p انخفاض في وفرة WNT5B و DVL1 و β-catenin في نموذجين من خلايا LUAD. بالإضافة إلى ذلك، تقدم الدراسة سير عمل تجريبياً متكاملاً يجمع بين ترنسدكشن فيروسي لينتي (lentiviral transduction) مستقر، و RT-qPCR، و Western blotting، وتحليل CCK-8، وتكوين المستعمرات، وإغلاق الجرح، ومقايسات Transwell المغطاة بـ Matrigel. ويعد هذا التمييز مهماً لأن العمل الحالي يوسع الملاحظات الجزيئية المرتبطة بفرط تعبير miR-486-3p دون ادعاء السبق في إثبات نشاطه المضاد للأورام في LUAD.
تتطلب النتائج المتعلقة بـ Wnt تفسيراً حذراً. يُوصف WNT5B عادةً بأنه ربيطة Wnt غير تقليدية، وقد ينشط مسارات إشارات القطبية الخلوية المستوية (planar-cell-polarity) أو Wnt/Ca2⁺ بطريقة تعتمد على المستقبل والسياق. وفي بعض البيئات الخلوية، قد تعمل إشارات Wnt غير التقليدية أيضاً على تضاد الإشارات المعتمدة على β-catenin10,11. أما DVL1 فهو وسيط داخل خلوي مشترك يمكنه المشاركة في كل من إشارات Wnt التقليدية وغير التقليدية، وقد ارتبط بأنماط ظاهرة متعلقة بـ β-catenin في سرطان الرئة غير صغير الخلايا12. وبناءً على ذلك، فإن الانخفاض المتزامن في WNT5B وDVL1 وإجمالي β-catenin لا يثبت وجود مسار خطي WNT5B→DVL1→β-catenin. وبدلاً من ذلك، تشير البيانات الحالية إلى انخفاضات متزامنة في تعبير WNT5B وفي وفرة DVL1 وβ-catenin بعد التعبير القسري لـ miR-486-3p.
كانت النتائج على مستوى النسخ متسقة من حيث الاتجاه مع نتائج تحليل Western blot. أدى التعبير القسري لـ miR-486-3p إلى تقليل وفرة نسخ WNT5B وDVL1 وCTNNB1 في كل من خلايا A549 وH358. ويشير هذا التطابق إلى أن التغيرات الملحوظة في البروتين قد تكون مصحوبة بتغير في وفرة النسخ بدلاً من أن تكون ناتجة حصراً عن تغيرات في استقرار البروتين. ومع ذلك، فإن انخفاض مستويات النسخ والبروتين لا يثبت الارتباط المباشر لـ miR-486-3p بالمناطق غير المترجمة 3′ المتوقعة. ومن ثم، فإن الأمر يتطلب إجراء مقايسات مراسل اللوسيفيراز المزدوج (Dual-luciferase reporter assays) باستخدام مواقع ارتباط برية ونمطية، جنباً إلى جنب مع تجارب الإنقاذ، لتحديد ما إذا كان WNT5B أو DVL1 يتم تنظيمهما بشكل مباشر بواسطة miR-486-3p. وبالمثل، يشير الانخفاض في وفرة BCL-2 إلى حدوث تغير في بروتين مرتبط بالبقاء، ولكن لا يمكن تفسير ذلك كدليل على زيادة الاستماتة في غياب مقايسات مثبتة لموت الخلايا.
تتضمن المقايسات الوظيفية أيضاً قيوداً خاصة بكل مقايسة. حيث يقيس CCK-8 النشاط الأيضي الخلوي بدلاً من تحديد عدد الخلايا بشكل مباشر، وقد تعكس التغيرات في الامتصاصية تبدلات في التكاثر، أو الأيض، أو الحيوية. ويوفر تكوين المستعمرات مقياساً طويل الأمد للقدرة على تكوين المستعمرات، إلا أن حجم التأثير اختلف بين الخطين الخلويين، حيث حدث انخفاض طفيف في خلايا A549 وانخفاض أكبر في خلايا H358. ويشير هذا الاختلاف إلى أن الاستجابة للتعبير القسري عن miR-486-3p قد تعتمد على السياق الجزيئي والخلوي.
لوحظ انخفاض في التئام الجروح في كلا الخطين الخلويين، ولكن لم يتم استخدام أي مثبط للتكاثر أثناء الاختبار. ونظراً لأن التعبير القسري لـ miR-486-3p أثر أيضاً على القياسات المرتبطة بالنمو، فقد يكون انخفاض التكاثر قد ساهم في نمط التئام الجروح. لذا، ينبغي تفسير النتائج على أنها انخفاض في التئام الجروح بدلاً من كونها تأثيراً خاصاً بالهجرة. وبالمثل، قد يتأثر اختبار Transwell المغطى بـ Matrigel لمدة 48 h بالاختلافات في عبور الغشاء، أو التكاثر، أو البقاء، أو الالتصاق. وبناءً على ذلك، فإن الانخفاض الملحوظ في الخلايا على سطح الغشاء السفلي يدعم ضعف العبور في ظل الظروف المختبرة، ولكنه لا يعزل آلية غزو محددة.
ثمة اعتبار إضافي يتمثل في مقدار الإفراط في تعبير miR-486-3p. فقد أدى النقل الفيروسي البطيء (Lentiviral transduction) إلى زيادة وفرة miR-486-3p بنحو 1,470 ضعفاً في خلايا A549 و220 ضعفاً في خلايا H358 مقارنة بمجموعات التحكم المقابلة. وقد يؤدي هذا التعبير فوق الفسيولوجي إلى زيادة الكبح غير المستهدف المعتمد على التسلسل البذري (seed-dependent off-target repression)، أو التأثير على توفر مكونات معقد إسكات الحمض النووي الريبي المحفز (RNA-induced silencing complex)، أو تحفيز إجهاد خلوي غير نوعي. ونظراً لعدم إجراء سلسلة من استجابات الجرعة، تعذر تحديد العلاقة بين وفرة miR-486-3p والأنماط الظاهرية الملحوظة. علاوة على ذلك، فإن غياب تجربة فقدان الوظيفة القائمة على المثبطات يمنع استخلاص استنتاجات بشأن الدور الفسيولوجي الداخلي لـ miR-486-3p في خلايا LUAD. وبناءً على ذلك، يجب تفسير النتائج الحالية تحديداً على أنها عواقب الإفراط القسري المستقر في التعبير.
يجب مراعاة عدة قيود في هذه الدراسة. فقد تم فحص خطين خلويين فقط من خلايا LUAD الطافرة في جين KRAS، كما أن استخدام أوساط نمو روتينية مختلفة يحد من تفسير المقارنات مع خلايا Beas-2b. ولم يتم إجراء التحقق من صحة الخطوط الخلوية واختبار الميكوبلازما أثناء الدراسة، واستُخدم U6 كمرجع وحيد لقياس miR-486-3p. كما افتقرت الدراسة إلى مقايسات فقدان الوظيفة، والاستجابة للجرعة، والمراسل، والإنقاذ، ومقايسات مسار Wnt الوظيفية. علاوة على ذلك، قد تكون نتائج إغلاق الجرح وTranswell قد تأثرت بالاختلافات في التكاثر أو الحيوية أو الالتصاق. وأخيرًا، لم يتم تضمين أي نماذج حيوانية أو عينات مرضى أو مجموعات تحقق سريرية. وبناءً على ذلك، تقتصر النتائج على نظام التعبير القسري هذا in vitro ولا تثبت الاستهداف المباشر، أو سببية المسار، أو الفائدة السريرية.
وفي الختام، أدى التعبير القسري المستقر لـ miR-486-3p إلى خفض العديد من القياسات المرتبطة بالنمو والحركية في خلايا LUAD من نوع A549 وH358، وصاحب ذلك انخفاض في تعبير WNT5B وDVL1 وtotal β-catenin وBCL-2. توفر هذه النتائج أساساً لمزيد من الاستقصاءات الميكانيكية، ولكنها لا تثبت أن WNT5B أو DVL1 أهداف مباشرة، أو وجود مسار خطي WNT5B/DVL1/β-catenin، أو القيمة السريرية لـ miR-486-3p.
الإفصاحات
يصرح المؤلفون بعدم وجود أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
قدمت خطة تشجيي جيانغ الإقليمية للعلوم والتكنولوجيا الطبية والصحية (2025KY349) والتخصصات الداعمة الرئيسية بمدينة جياشينغ (2023-zc-014) الدعم المالي لهذه الدراسة.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | تحضير هلام التكديس لـ SDS-PAGE |
| 1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) | Solarbio | T1010 | تحضير هلام الفصل لـ SDS-PAGE |
| منظم TBS بتركيز 20× | Solarbio | 71080 | المنظم المخزون لغسل لطخة ويسترن وتخفيف الأجسام المضادة |
| محلول أكريلاميد/بيس-أكريلاميد بتركيز 30% (29:1) | Solarbio | A1010 | تحضير هلامات SDS-PAGE |
| مثبت بارافورمالدهيد بتركيز 4% | Servicebio | G1101 | التثبيت لمقايسات تكوين المستعمرات ومقايسات Transwell |
| منظم تحميل البروتين بتركيز 5× | Beyotime | P0015 | تحضير عينات البروتين لـ SDS-PAGE |
| برسلفات الأمونيوم | Solarbio | 427A038 | بادئ بلمرة هلام SDS-PAGE |
| طقم مقايسة بروتين BCA | Beyotime | P0009-1 | تحديد تركيز البروتين |
| الجسم المضاد BCL-2 | Boster Biological Technology | A00040-2 | جسم مضاد متعدد النسائل من الأرنب؛ لطخة ويسترن بنسبة 1:5,000 |
| طقم عد الخلايا-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | مقايسة النشاط الأيضي المرتبط بنمو الخلايا؛ 10 μL لكل 100 μL من وسط الزرع |
| نظام التصوير بالتلألؤ الكيميائي | Bio-Rad | ChemiDoc MP | تصوير لطخة ويسترن |
| كلوروفورم | Servicebio | G3005 | فصل الأطوار أثناء استخلاص RNA القائم على TRIzol |
| محلول صبغ البنفسج البلوري | Servicebio | G1014 | صبغ المستعمرات وغشاء Transwell |
| DMEM | Servicebio | G4511 | وسط زرع روتيني لخلايا Beas-2b |
| الجسم المضاد DVL1 | Signalway Antibody | 53180 | جسم مضاد أولي من الأرنب؛ لطخة ويسترن بنسبة 1:5,000 |
| مصل جنين البقر (FBS) | Biosharp | BL203B | مكمل بنسبة 10% (حجم/حجم) لزراعة الخلايا الروتينية؛ 20% (حجم/حجم) في الحجرة السفلية لـ Transwell |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Version 8 | إعداد الرسوم البيانية والتحليل الإحصائي |
| مزيج Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي القائم على SYBR Green |
| مزيج Hifair III لتخليق الشريط الأول من cDNA لـ qPCR (gDNA digester plus) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | النسخ العكسي لـ mRNA RT-qPCR |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 22.0 | التحليل الإحصائي |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.53 | قياس الكثافة الضوئية للطخة ويسترن، وقياس مساحة الجرح، وعد المستعمرات، وعد خلايا Transwell |
| مجهر مقلوب | Olympus | CKX53 | تصوير مقايسات التئام الجروح ومقايسات Transwell |
| إيزوبروبانول | Servicebio | G3006 | ترسيب RNA أثناء الاستخلاص القائم على TRIzol |
| تحضيرات فيروسية من نوع LV-miR-486-3p و LV-NC | GenePharma | Custom synthesis | ناقل للتعبير المفرط المستقر لـ miR-486-3p وناقل تحكم سلبي عشوائي |
| مصفوفة الغشاء القاعدي Matrigel | Corning | 354234 | مخففة بنسبة 1:8 في DMEM خالي من المصل؛ تركيز بروتين نهائي يقارب 1 mg/mL |
| ميثانول | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | تنشيط غشاء PVDF |
| قارئ الأطباق الدقيقة | BioTek | ELx800 | قياس الامتصاصية عند 450 nm |
| مقياس طيف ضوئي للأحجام الدقيقة UV-Vis | Allsheng | Nano-600 | تقييم تركيز RNA ونقاوة A260/A280 |
| بنسلين-ستربتومايسين | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | مكمل بنسبة 1% (حجم/حجم) لزراعة الخلايا الروتينية |
| محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS) | Servicebio | G0002 | غسل الخلايا والأغشية |
| مزيج مثبطات البروتياز | APExBIO | K1007 | يضاف إلى منظم تحلل RIPA |
| سلم البروتين | Biosharp | BL712A | مرجع للوزن الجزيئي للطخة ويسترن |
| غشاء PVDF | Millipore | K2MA8350E | غشاء نقل البروتين للطخة ويسترن |
| نظام QuantStudio 5 Real-Time PCR | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | جمع بيانات RT-qPCR |
| منظم تحلل RIPA | Beyotime | P0013B | استخلاص البروتين الخلوي الكلي |
| كاشف استخلاص RNA (من نوع TRIzol) | Servicebio | G3013 | استخلاص RNA الكلي |
| وسط RPMI 1640 | Servicebio | G4510 | وسط زرع روتيني لخلايا A549 و H358 ومعلق خلايا Transwell خالي من المصل |
| SDS | Solarbio | S8010 | كاشف SDS-PAGE |
| مسحوق حليب منزوع الدسم | BD | 2271470 | محلول غلق بتركيز 5% للطخة ويسترن |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | تحليل تعبير miR-486-3p المشتق من TCGA |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | التنبؤ بمواقع ارتباط miR-486-3p المرشحة |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | محفز بلمرة هلام SDS-PAGE |
| إضافات Transwell، 24 بئر، حجم مسام 8 μm | Corning | 3428 | مقايسة عبور الغشاء المطلي بـ Matrigel |
| تريبسين | Servicebio | G4000 | فصل الخلايا |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | تحضير منظم غسل لطخة ويسترن |
| نظام الرحلان الكهربائي العمودي | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE |
| كاشف لومينول لركيزة Western HRP | Affinity Biosciences | KF001 | كشف لطخة ويسترن بالتلألؤ الكيميائي |
| نظام النقل الرطب | Bio-Rad | 1703930 | نقل البروتين إلى غشاء PVDF |
| الجسم المضاد WNT5B | Signalway Antibody | 56808 | جسم مضاد أولي من الأرنب؛ لطخة ويسترن بنسبة 1:5,000 |
| الجسم المضاد β-actin | Abcam | ab8227 | ضابط تحميل؛ لطخة ويسترن بنسبة 1:5,000 |
| الجسم المضاد β-catenin | Signalway Antibody | 21725 | جسم مضاد أولي من الأرنب؛ لطخة ويسترن بنسبة 1:5,000 |
المراجع
- Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359(13):1367-1380.
- Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34.
- Han B, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022. J Natl Cancer Cent. 2024;4(1):47-53.
- Lin JJ, et al. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs. J Thorac Oncol. 2016;11(4):556-565.
- She J, Yang P, Hong Q, Bai C. Lung cancer in China: challenges and interventions. Chest. 2013;143(4):1117-1126.
- Barker N, Clevers H. Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(12):997-1014.
- Komiya Y, Habas R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 2008;4(2):68-75.
- Stewart DJ. Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 2014;106(1):djt356.
- Zhang Z, et al. Wnt/β-catenin signaling in the development and therapeutic resistance of non-small cell lung cancer. J Transl Med. 2024;22(1):565.
- Zhang Q, et al. WNT5B exerts oncogenic effects and is negatively regulated by miR-5587-3p in lung adenocarcinoma progression. Oncogene. 2020;39(7):1484-1497.
- Suthon S, et al. WNT5B in physiology and disease. Front Cell Dev Biol. 2021;9:667581.
- Ji H, et al. SPATA2 suppresses epithelial-mesenchymal transition to inhibit metastasis and radiotherapy sensitivity in non-small cell lung cancer via. impairing DVL1/β-catenin signaling. Thorac Cancer. 2023;14(11):969-982.
- Wang Y, Wang L, Chen C, Chu X. New insights into the regulatory role of microRNA in tumor angiogenesis and clinical implications. Mol Cancer. 2018;17(1):22.
- Iqbal MA, Arora S, Prakasam G, Calin GA, Syed MA. MicroRNA in lung cancer: role, mechanisms, pathways and therapeutic relevance. Mol Aspects Med. 2019;70:3-20.
- Lee YS, Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol. 2009;4:199-227.
- Lin G, et al. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3β in human lung cancer cells. Exp Cell Res. 2017;352(2):364-374.
- Jiang W, et al. MicroRNA-1258 suppresses tumor progression via. GRB2/Ras/Erk pathway in non-small-cell lung cancer. Cell Prolif. 2018;51(6):e12502.
- Xie Y, Xue C, Guo S, Yang L. MicroRNA-520a suppresses pathogenesis and progression of non-small-cell lung cancer through targeting the RRM2/Wnt axis. Anal Cell Pathol (Amst). 2021;2021:9652420.
- Peng Y, Zhang X, Feng X, Fan X, Jin Z. The crosstalk between microRNAs and the Wnt/β-catenin signaling pathway in cancer. Oncotarget. 2017;8(8):14089-14106.
- Wang X, et al. MiR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of β-catenin. Biochem Biophys Res Commun. 2012;428(4):525-531.
- Lulli V, et al. MicroRNA-486-3p regulates γ-globin expression in human erythroid cells by directly modulating BCL11A. PLoS One. 2013;8(4):e60436.
- Chou ST, et al. MicroRNA-486-3p functions as a tumor suppressor in oral cancer by targeting DDR1. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):281.
- Wu H, et al. Overexpression of miR-486-3p promoted by allicin enhances temozolomide sensitivity in glioblastoma via. targeting MGMT. Neuromolecular Med. 2020;22(3):359-369.
- Garajei A, et al. Evaluation of the expression of miR-486-3p, miR-548-3p, miR-561-5p and miR-509-5p in tumor biopsies of patients with oral squamous cell carcinoma. Pathogens. 2022;11(2):211.
- Li X, et al. MicroRNA-486-3p promotes the proliferation and metastasis of cutaneous squamous cell carcinoma by suppressing flotillin-2. J Dermatol Sci. 2022;105(1):18-26.
- Tomioka Y, et al. The molecular pathogenesis of tumor-suppressive miR-486-5p and miR-486-3p target genes: GINS4 facilitates aggressiveness in lung adenocarcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(13):3408.