عزل وتنقية وتوصيف الميتوكوندريا الوظيفية المشتقة من عضلة الفئران العظمية لزراعة الميتوكوندريا

Summary

تم إنشاء بروتوكول موحد يجمع بين هضم التربسين والطرد المركزي التفاضلي لعزل وتنقية وتوصيف وظيفي للميتوكوندريا من عضلات الهيكل العظمي للفأر، وكذلك لتقييم تطبيقها في زراعة الميتوكوندريا.

Abstract

الميتوكوندريا هي عضيات أساسية تنظم أيض الطاقة، ونقل الإشارات، والتوازن الخلوي في الخلايا حقيقية النواة. يساهم خلل الميتوكوندريا في نشوء العديد من الأمراض وقد دفع إلى تطوير زراعة الميتوكوندريا كاستراتيجية علاجية تجديدية. يعتمد التطبيق الناجح لزراعة الميتوكوندريا على توفر ميتوكوندريا عالية التنقية وسليمة وظيفيا. تعد العضلات الهيكلية مصدرا مناسبا للمانح بسبب محتواها الميتوكوندري المرتفع، ونشاطها الأيضي، وسهولة الوصول إليها. وضعت هذه الدراسة بروتوكولا موحدا وقابلا للتكرار لعزل وتنقية وتوصيف الميتوكوندريا الوظيفية من عضلة الفئران العظمية وقيمت استخدامها في زراعة الميتوكوندريا. تكون الإجراء من مرحلتين رئيسيتين. أولا، تم عزل الميتوكوندريا من العضلة العظمية لفئران C57BL/6 باستخدام هضم التربسين تلاها الطرد المركزي التفريقي. ثانيا، تم تصنيف الميتوكوندريا المعزولة لتقييم النقاء، والبنية الفائقة، والنشاط الوظيفي. تم تقييم نقاء الميتوكوندريا من خلال قياس كمية البروتين بحمض البيسينكونينيك (BCA) وتحليل البلوت الغربي. تم فحص السلامة الفائقة البنية بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل. تم تقييم النشاط الوظيفي باستخدام JC-1 وتصنيف الفلورية الميتوكوندرية مع قياسات استهلاك الأكسجين، وقدرة إنتاج ATP، ونسبة التحكم في التنفس باستخدام نظام قياس التنفس عالي الدقة. أظهرت الميتوكوندريا المعزولة إمكانات غشائية محفوظة، وبنية فائقة سليمة، ونشاطا تنفسيا مستقرا، مما يشير إلى ملاءمة للدراسات الوظيفية اللاحقة وتطبيقات زراعة الميتوكوندريا.

Introduction

الميتوكوندريا هي المواقع الرئيسية لإنتاج الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP) وتلعب أدوارا مركزية في الاستماتة، وتوازن الكالسيوم، واستقلاب أنواع الأكسجين التفاعلي (ROS). لذلك، فإن السلامة الوظيفية للميتوكوندريا أمر بالغ الأهمية للحفاظ على التوازن الخلوي وتحديد مصير الخلية ^1,2. تؤدي خلل وظيفة الميتوكوندريا، بما في ذلك طفرات الحمض النووي الميتوكوندري (mtDNA) واضطرابات سلسلة نقل الإلكترونات (ETC)، إلى ضعف أيض الطاقة، والإجهاد التأكسدي، وخلل في الموت المبرمج ^3,4. ترتبط هذه الشذوذات بمجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك اضطرابات الميتوكوندريا الوراثية، والأمراض التنكسية العصبية،^{وأمراض القلب} والأوعية الدموية^. الاستراتيجيات العلاجية التقليدية لخلل وظيفة الميتوكوندريا، مثل مضادات الأكسدة والعوامل الأيضية، توفر فعالية محدودة عموما لأنها تخفف الأعراض دون استعادة وظيفة الميتوكوندريا مباشرة ^7,8. وبالتالي، برز زراعة الميتوكوندريا كنهج علاجي واعد في الطب التجديدي. تتضمن هذه الاستراتيجية توصيل الميتوكوندريا الخارجية سليمة إلى الخلايا التالفة أو غير المتضررة لاستعادة نشاط الميتوكوندريا واستقلاب الطاقة الخلوية ^9,10. أظهرت دراسات سابقة أن الميتوكوندريا الخارجية يمكن أن تستوعب بواسطة الخلايا المستقبلة وتدمج في شبكة الميتوكوندريا الداخلية، مما يؤدي إلى تحسين الوظائف الحيوية وزيادة بقاء الخلايا 11,12,13.

تعتبر العضلة العظمية متبرعا مناسبا لعزل الميتوكوندريا بسبب محتواها العالي من الميتوكوندريا، ونشاطها الأيضي، وسهولة الوصول إليها 14,15,16. تتطلب زراعة الميتوكوندريا عدة خطوات حاسمة، بما في ذلك عزل الميتوكوندريا، والتنقية، والتوصيف الوظيفي، والتوصيل الفعال إلى الخلايا المستقبلة. ومع ذلك، لا تزال هناك تباينات منهجية كبيرة بين البروتوكولات المبلغ عنها حتى الآن، خاصة في الإجراءات المتعلقة بتجانس الأنسجة، والهضم الإنزيمي، والتحكم في درجة الحرارة، والتنقية. يمكن أن يؤثر هذا التغير على العائد الميتوكوندري، ونقائه، وسلامة الوظيفة، مما يحد من قابلية التكرار التجريبي.

لتحسين الاتساق المنهجي وقابلية التكرار، تقدم هذه الدراسة بروتوكولا موحدا لعزل وتوصيف الميتوكوندريا الوظيفية من عضلات الهيكل العظمي للفأر باستخدام هضم التربسين والطرد المركزي التفريقي. تم تقييم الميتوكوندريا المعزولة من حيث النقاء والسلامة الفائقة البنية والنشاط الوظيفي باستخدام قياس كمية بروتين حمض البيسينكونينيك (BCA)، والبلتينغ الغربي، والمجهر الإلكتروني النفاذ، واختبارات جهد الغشاء المعتمدة على الفلورة، وقياس التنفس عالي الدقة. بالإضافة إلى ذلك، تم تقييم امتصاص الميتوكوندريا المعزولة من قبل الخلايا المستقبلة لتقييم مدى ملاءمتها لتطبيقات زراعة الميتوكوندريا. يوفر هذا البروتوكول سير عمل قابل للتكرار للحصول على الميتوكوندريا الوظيفية المشتقة من العضلات الهيكلية للدراسات التجريبية اللاحقة.

Protocol

أجريت جميع التجارب على الحيوانات في منشأة خالية من مسببات الأمراض (SPF) محددة وتمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات واستخدام الحيوانات في المستشفى الثالث التابع لجامعة القوات الجوية الطبية (رقم الموافقة: IACUC-2024kq-065).

تم شراء فئران ذكور C57BL/6 (عمرها 6-8 أسابيع، وزنها 18-20 جرام) من مركز الحيوانات المختبرية في جامعة القوات الجوية الطبية (رخصة الإنتاج: SCXK (شنشي) 2024-002). تم وضع الفئران في أقفاص مهواة بشكل فردي تحت ضغط إيجابي وظروف نظيفة، بدرجة حرارة تتراوح بين 20-26 درجة مئوية، ورطوبة نسبية بين 40٪-70٪، ودورة ضوء وظلام مدتها 12 ساعة، وعلى الأقل 15 تغييرات هواء في الساعة. تم توفير نظام غذائي معقم، ومياه شرب، وإثراء بيئي.

الكواشف والمواد الكيميائية والأدوات التجريبية المستخدمة في البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. التضحية بالحيوانات وجمع الأنسجة

1. ضع الفأر في غرفة قتل رحيم محكمة الإغلاق وقم بالقتل الرحيم عبر استنشاق ثاني أكسيد الكربون تدريجيا (CO₂)، بحجم حجرة 30٪-70٪ في الدقيقة.
2. تأكيد الوفاة عن طريق توقف التنفس التلقائي وضربات القلب، فقدان ردود فعل الحدقة، وعدم الاستجابة للتحفيز الميكانيكي.
3. اغمر الفئران المزيفة C57BL/6 في إيثانول 75٪ لمدة 5 دقائق للتعقيم.
   ملاحظة: لتجنب تثبيت الأنسجة الناتج عن الكحول وتلف الخلية، حدد وقت الغمر إلى 10 دقائق. استخدم الأنسجة الطازجة طوال البروتوكول لأن التجميد يضر بصلاحية الميتوكوندريا وسلامة وظيفتها.
4. ضع الفأر في طبق بتري معقم داخل غطاء تدفق طبقي بحيث يكون البطن مواجها للأعلى لكشف مناطق البطن والطرف الخلفي بالكامل.
5. ارفع جلد أسفل البطن بالقرب من المنطقة التناسلية باستخدام الملقط وقم بعمل شق صغير. قم بإجراء تشريح غير حاد لفصل الجلد عن الأنسجة الأساسية. قم بتمديد الشق للأعلى على طول الخط الأوسط إلى الكاحل وجانبيا نحو كلا الأطراف الخلفية لكشف مجموعات عضلات الطرف الخلفي بالكامل.
6. حدد عضلة الفخذ الرباعية في الجانب الأمامي من الفخذ وفصل العضلة بعناية على طول اتجاه ألياف العضلة باستخدام تشريح غير حاد. اقطع الرباط البعيد للرضفة والوتر القريب لعزل نسيج العضلة تماما.
   ملاحظة: اغسل النسيج ثلاث مرات في محلول ملحي مبرد مسبقا بالفوسفات (PBS) مع إضافة 2٪ من البنسلين-ستريبتوميسين باستخدام طبق بتري جديد لكل غسول لتقليل التلوث.
7. ضع نسيج العضلات المعزول فورا في PBS المبرد مسبقا وشطفها جيدا لإزالة الشعر والدم من سطح النسيج.
8. قم بمسح الرطوبة الزائدة من الأنسجة بلطف باستخدام شاش معقم. قسم النسيج إلى أنابيب طرد مركزي دقيق بحجم 1.5 مل ووزن العينات. استخدم حوالي 100 ملغ من النسيج لكل عينة للحفاظ على التناسق بين التحضيرات.

2. تقطيع الأنسجة وتجانسها

1. ضع أنبوب الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على الأنسجة من الخطوة 1.8 على الثلج. قم بتقطيع الأنسجة إلى شظايا صغيرة بحجم حوالي 1-2 مم³ باستخدام مقص معقم.
2. أضف 8 مجلدات من التربسين المبرد مسبقا بنسبة 0.25٪ واهضم شظايا الأنسجة على الثلج لمدة 15 دقيقة.
   ملاحظة: احسب حجم التريبسين المطلوب حسب كتلة الأنسجة (1 ملغ ≈ 1 ميكرولتر). على سبيل المثال، أضف 640 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين إلى 80 ملغ من الأنسجة.
3. قم بطرد المركزي بالخليط عند 1000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة واحتفظ بحبيبات الأنسجة. أعد تعليق الحبيبات في محلول عزل ميتوكوندريا مبرد مسبقا بحجم 1 مل يحتوي على D-مانيتول (215 ملم)، السكروز (75 ملم)، HEPES (20 ملم)، EGTA (1 ملم)، وألبومين مصل البقري الخالي من الأحماض الدهنية (0.5٪ مع الضرب/الولت).
4. انقل التعليق إلى جهاز تجانس زجاجي مثبت على الثلج. قم بتجانس النسيج باستخدام 10-12 حركة لطيفة صعود وهبوط حتى يصبح التعليق عكرا.
   ملاحظة: تجنب تدوير المدقة الزجاجية جانبيا في أسفل المدمج لأن القوة الميكانيكية الزائدة قد تضر أغشية الميتوكوندريا وتؤثر سلبا على وظيفة الميتوكوندريا.

3. الطرد المركزي التفاضلي

1. انقل التجانس إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي بحرارة 1000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
2. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 12,000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على الحبيبات الميتوكوندرية الخام.
   ملاحظة: اجمع المادة الفائقة بعناية باستخدام حقنة بسعة 1 مل مع تجنب اضطراب الحبيبات وبقايا الأنسجة.

4. تنقية وتخزين الميتوكوندريا

1. أعد تعليق الحبيبات الميتوكوندرية الخام بلطف في محلول غسيل مبرد مسبقا يحتوي على السكروز (250 ملليم)، HEPES (10 ملميول، الرقم الهيدروجيني 7.4)، EGTA (1 ملم)، وألبومين مصل البقري (0.15٪ w/v). قم بعمل جهاز التعليق المركزي عند 1000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
2. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي جديد وجهاز طرد مركزي بقوة 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على الحبيبات الميتوكوندرية المنقية.
   ملاحظة: استخدم الميتوكوندريا المعزولة حديثا فورا كلما أمكن. التخزين قصير الأمد عند 4 درجات مئوية أو التخزين طويل الأمد عند −80 درجة مئوية في مخزن الميتوكوندريا الذي يحتوي على السكروز (0.25 م)، تريس-MOPS (10 مللي مو، رقم الهيدروجيني 7.4)، وEGTA (0.1 ميليم) ممكن. ومع ذلك، قد يؤثر التجمد على النشاط الإنزيمي للميتوكوندريا ووظائف الجهاز التنفسي. استخدم العينات المجمدة بشكل أساسي لتحليل البروتين.

5. استخراج البروتينات الميتوكوندرية والسيتوسولية وقياس كمية BCA

1. استخراج البروتين الميتوكوندري
   1. أعد تعليق الحبيبات الميتوكوندرية المنقاة في 50 ميكرولتر من محلول تحلل RIPA لكل 100 ملغ من الأنسجة الابتدائية وحضن التعليق على الجليد لمدة 15 دقيقة.
   2. قم بعمل الطرد المركزي للليزات عند حوالي 14,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد بسعة 1.5 مل للحصول على نسبة البروتين الميتوكوندري.
2. استخراج البروتين السيتوسولي
   1. الطرد المركزي هو الفائق السيتوصولي الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.2 عند 12,000 × جرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الفائقة واحتفظ بالحبيبة كجزء سيتوصولي مخصي.
   2. أعد تعليق الحبيبة السيتوسولية في 50 ميكرولتر من مخزن تحلل RIPA ومعالجة العينة كما هو موضح في الخطوات 5.1.1-5.1.2.
      ملاحظة: جهز محلول التحلل طازجا باستخدام مثبطات البروتياز، وقم بجميع الإجراءات على الثلج لتقليل تحلل البروتين. الميتوكوندريا المستخدمة في هذه الخطوة يمكن أن تكون طازجة أو مجمدة.
3. قياس كمية بروتين BCA
   1. تحضير محلول BCA العامل عن طريق خلط الكاشف A والكاشف B بنسبة 50:1 (v/v). أضف 200 ميكرولتر من محلول العمل إلى كل بئر من صفيحة تحتوي على 96 بئرا.
      ملاحظة: جهز محلول BCA العامل مباشرة قبل الاستخدام واستخدمه خلال ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
   2. قم بتخفيف محلول ألبومين مصل البقري (BSA) (2 ملغ/مل) إلى 0.5 ملغ/مل واحتفظ بالمحلول على التجميد حتى الاستخدام.
   3. جهز المنحنى القياسي بإضافة 20، 19، 18، 16، 12، 8، 4، أو 0 ميكرولتر من محلول BSA إلى آبار منفصلة. اضبط الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر باستخدام محلول NaCl.
   4. أضف 4 ميكرولتر من بروتين الميتوكوندريا و16 ميكرولتر من محلول NaCl إلى مجموعة واحدة من الآبار. أضف 4 ميكرولتر من بروتين السيتوسوليك و16 ميكرولتر من محلول NaCl إلى مجموعة أخرى من الآبار.
   5. أضف 200 ميكرولتر من محلول BCA العامل إلى كل بئر وحضن اللوحة عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 30 دقيقة. قس الامتصاص عند 562 نانومتر باستخدام قارئ ميكروبلايت.
   6. قم بإنشاء منحنى بروتين معياري بمعامل ارتباط (R²) ≥ 0.999. حساب تركيزات البروتينات (ميكروغرام/ميكرولتر) عن طريق استيفاء قيم الامتصاص من المنحنى القياسي.

6. تقييم نقاء الميتوكوندريا المشتقة من العضلات العظمية

1. قم بتخفيف عينات البروتين الميتوكوندري والبروتيني السيتوسولي إلى تركيز نهائي 1.5 ميكروغرام/ميكرولتر. تحضير 20 ميكرولتر من خلطات تفاعلية تحتوي على 30 ميكروغرام من البروتين و4 × من محلول التحميل. اضبط الحجم المتبقي باستخدام محلول NaCl. اغلي العينات لمدة 10 دقائق واحتزنها عند −80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
2. افصل عينات البروتين باستخدام جل مسبقا التدرج 4٪-20٪. قم بالرحلان الكهربائي عند 140-150 فولت لمدة 50 دقيقة.
3. فعل غشاء PVDF (0.22 ميكرومتر) في الميثانول لمدة دقيقة واحدة. البروتينات المنتقلة باستخدام مخزن النقل السريع عند 400 مللي أمبير لمدة 30 دقيقة.
4. أزل غشاء PVDF من شطيرة النقل واغسله في TBST لمدة 5 دقائق. قم بسد الغشاء بحليب خالي الدسم بنسبة 5٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة مع هز لطيف.
5. تخفيف الأجسام المضادة الأولية (COX IV، السيتوكروم c، β-الأكتين) بنسبة 1:1,000 في مخزن تخفيف الأجسام المضادة. حضن الغشاء بالأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية.
6. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة 10 دقائق في كل غسل.
7. حضن الغشاء بالأجسام المضادة الثانوية المخففة بمقدار 1:10,000 في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
8. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBST لمدة 10 دقائق لكل مرة. طور البقعة والتقط الصور.

7. صبغ MitoTracker للميتوكوندريا المشتقة من العضلات العظمية

1. قم بتخفيف محلول التلوين إلى تركيز نهائي 200 نانومتر في وسط مسخن مسبقا قبل الاستخدام مباشرة.
2. أعد تعليق الحبيبات الميتوكوندرية في 100 ميكرولتر من محلول العمل وحضن الحبيبات عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 20 دقيقة.
3. أضف خمسة مجلدات من مخزن التخزين المبرد مسبقا بعد الحضانة. قم بطرد المركزي بنظام التعليق عند 12,000 × جرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وتخلص من المادة الفائقة التي تحتوي على صبغة غير مرتبطة.
4. انقل قطعة من تعليق الميتوكوندريا الملون إلى شريحة زجاجية وغط العينة بغطاء داخلي.
5. التقاط صور الفلورة باستخدام مجهر كونفوكلي ليزر مع إعدادات مناسبة للإثارة والانبعاث لاكتشاف صبغة الميتوكوندريا الفلورية الحمراء.

8. تقييم جهد غشاء الميتوكوندريا باستخدام تلوين JC-1

1. مجموعة معالجة CCCP (سيانيد الكربونيل m-كلوروفينيل هيدرازون)
   1. عالج التعليق الميتوكوندري ب CCCP بتركيز نهائي 10 ميكرومولار واحتضن لمدة 20 دقيقة لتبدد جهد غشاء الميتوكوندريا.
   2. حضن تعليق الميتوكوندريا المعالج ب CCCP مع محلول تلوين JC-1 بسعة 250 ميكرولتر عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة مع تحريك لطيف.
2. مجموعة علاج JC-1
   1. أعد تعليق الحبيبات الميتوكوندرية في محلول JC-1 العامل بسعة 100 ميكرولتر وحضن على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة محمية من الضوضاء.
   2. جهز محلول تلوين 1× JC-1 عن طريق تخفيف محلول المخزون 5× بالماء المقطر بنسبة 2:8 (v/v) والحفاظ على المخزن على الثلج.
   3. أزل محلول التلوين واغسل الحبيبات الميتوكوندرية مرتين باستخدام محلول تلوين مبرد مسبقا 1× JC-1.
   4. أعد تعليق الميتوكوندريا الملونة في PBS وصورها باستخدام مجهر كونفوكالي بالليزر الماسح. استخدم إعدادات الإثارة والانبعاث المناسبة للكشف عن مونومرات JC-1 الفلورية الخضراء ومجموعات JC-1 الفلورية الحمراء.

9. التحليل فوق البنيوي للميتوكوندريا العضلية المعزولة في الهيكل العظمي باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل

1. تثبيت الميتوكوندريا المعزولة حديثا في غلوتارالديهيد 2.5٪ محضر في محلول فوسفات بعمق 0.2 متر (درجة حموضة 7.4) وحضن العينات طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
2. غسل العينات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات بسعة 0.1 مليون (PBS، pH 7.4) ثم ثبتها لاحقا في رباعي أكسيد الأوزميوم 1٪ لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.
3. قم بتجفيف العينات عبر سلسلة إيثانول متدرجة تليها التسرب، والغرس، والبلمرة في راتنج الإيبوكسي.
4. قم بتقسيم العينات المدمجة بسماكة 50-70 نانومتر باستخدام ميكروتوم فائق الميكرو.
5. صبغ الأقسام مرتين بأسيتات اليورانيل وسيترات الرصاص. راقب وصور العينات باستخدام مجهر إلكتروني ناقل.

10. امتصاص الخلايا للميتوكوندريا المشتقة من العضلات الهيكلية

1. الثقافة NCTC نسخة 929 (L929؛ RRID: CVCL_0462) الخلايا التي تم الحصول عليها من مورد تجاري في وسط كامل يحتوي على MEM ألفا مع 10٪ مصل أبقار جنيني و1٪ بنسلين-ستريبتومايسين.
2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء بنسبة 80٪-90٪، استنشق الوسط واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS المسخن مسبقا. أضف تريبسين-إيدتا وقم بالحضانة حتى تنفصل الخلايا.
3. أضف وسط كامل لإنهاء الهضم وتوليد تعليق خلية واحدة عن طريق التوصيل اللطيف بالماصات. قم بعمل جهاز تعليق مركزي على 1000 × جرام لمدة 5 دقائق ثم تخلص من السوبرناتان.
4. أعد تعليق حبيبات الخلية في وسط كامل طازج وازرع الخلايا في أطباق زراعة جديدة بكثافة مناسبة. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ CO₂.
5. تمر الخلايا 5 (P5) بداخل أطباق زجاجية بحجم 35 مم وتزرع الخلايا طوال الليل.
6. قم بوضع علامة على الميتوكوندريا المعزولة بصبغة فلورية حمراء خاصة بالميتوكوندريا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في الظلام لمدة 20 دقيقة وغسل الميتوكوندريا ب PBS لإزالة الصبغة غير المرتبطة.
7. أضف الميتوكوندريا الموسومة بالصبغة الفلورية الحمراء (20 ميكروغرام بروتين ميتوكوندريا لكل طبق) إلى الخلايا وحضن الخلايا لمدة 24 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ CO₂.
8. صبغ الخلايا بمسبار أكتين فلوري لمدة 30 دقيقة لرؤية هيكل خلوي الأكتين وصبغ النوى بصبغة نووية فلورية.
   ملاحظة: تحكم في تركيز المصل بعناية أثناء الحضانة المشتركة لأن الإفراط في المصل قد يقلل من كفاءة امتصاص الميتوكوندريا. الميتوكوندريا المستخدمة في هذه الخطوة طازجة.

11. قياس وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندريا باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

1. تحضير الآلات
   1. نظف غرف التنفس، وحجرات الأقطاب الكهربائية، والسدادات.
   2. ضع قضيب تحريك مغناطيسي في كل غرفة وتحقق من سلامة غشاء قطب الأكسجين.
2. معايرة الأجهزة
   1. أضف 2.1 مل من حاجز التنفس الميتوكوندري (MiR05، pH 7.10) في كل غرفة تنفسية وتأكد من عدم وجود فقاعات هواء.
   2. توازن نظام قياس التنفس عالي الدقة عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وإجراء معايرة هوائية يومية بعد تثبيت خط الأكسجين الأساسي.
      ملاحظة: تجنب إدخال فقاعات الهواء إلى غرفة التنفس، لأنها تتداخل مع إشارات أقطاب الأكسجين وتؤثر على جودة البيانات. الميتوكوندريا المستخدمة في هذه الخطوة طازجة.
3. تحميل العينات والتوازن
   1. أضف الميتوكوندريا المعزولة حديثا التي تحتوي على حوالي 30 ميكروغرام من البروتين إلى حجرة التنفس وأغلق الحجرة.
   2. اضبط الحجرة لمدة 5-8 دقائق وسجل استهلاك الأكسجين القاعدي.
      ملاحظة: حافظ على الميتوكوندريا على الجليد وقم بقياسات التنفس فور العزل للحفاظ على النشاط.
4. بروتوكول SUIT
   1. أضف 5 ميكرولتر بيروفات (2 م)، و10 ميكرولتر جلوتامات (2 م)، و10 ميكرولتر مالات (400 م) بالتتابع. ثبت التفاعل لمدة 5 دقائق وسجل تسرب التنفس في الحقل.
   2. أضف 10 ميكرولتر ADP (500 ملليمتر) لتحفيز الفسفرة التأكسدية وتسجيل تنفس CI OXPHOS. أضف 10 ميكرولتر من كلوريد المغنيسيوم (0.3 م).
   3. أضف 20 ميكرولتر سوكسينات (1 م) وسجل تنفس أكسفوس CI+CII بعد التثبيت.
   4. أضف 2 ميكرولتر من مثبط ATP سينثاز (0.01 ملليمتر) وسجل تنفس تسرب البروتون.
   5. أضف CCCP (1 ميليمول) تدريجيا في ثلاث إضافات بحجم 2 ميكرولتر بفواصل زمنية كل دقيقتين حتى يصل استهلاك الأكسجين إلى هبوطة. سجل أقصى سعة لنظام نقل الإلكترون.
   6. أضف 1 ميكرولتر روتينون (1 مللي مول) لتثبيط نشاط العقدة I.
   7. أضف 1 ميكرولتر مضاد ميسين A (5 ملليمو) لتثبيط نشاط السائل الثالث المركب وتسجيل استهلاك الأكسجين المتبقي.
   8. أضف 5 ميكرولتر الأسكوربات (800 ملم مول) و5 ميكرولتر من نترا ميثيل-ب فينيل إلينيديامين (200 ملميول). سجل أقصى نشاط تنفسي مركب في الوريد بعد الاستقرار.
      ملاحظة: قم بإزالة جميع الكواشف قبل التجميد لتجنب تكرار دورات التجمد والذوبان. أضف CCCP تدريجيا، حيث أن الانفصال المفرط يثبط التنفس الميتوكوندري.
5. تحليل البيانات
   1. احصل على معلمات التنفس الميتوكوندري، بما في ذلك تسريب CI، CI OXPHOS، CI+CII OXPHOS، CI+CII Leak، CI+CII et، CII et وCIV، باستخدام برنامج تحليل البيانات.
   2. حساب نسبة التحكم في التنفس (RCR؛ تنفس الحالة 3/التنفس في الحالة 4) وقدرة إنتاج ATP. احتفظ بجميع القيم حتى ثلاثة أرقام ذات دلالة للتحليل الإحصائي. كان البرنامج المستخدم لتحليل البيانات هو أوروبوروس داتلاب 8 (أجهزة أوروبوروس).

Results

يظهر الشكل 1 نظرة عامة تخطيطية لسير عمل عزل وتنقية الميتوكوندريا. تم إجراء جميع الإجراءات عند 4 درجات مئوية للحفاظ على سلامة الميتوكوندريا ونشاطها الوظيفي. تم تفريغ ودمج نسيج العضلات العظمية المعزول حديثا وهضمه بالتريبسين لتسهيل تفكك الأنسجة، ثم تم توحيده في عازل إيزوتونيك باستخدام متجانس زجاجي. تم إجراء الطرد المركزي التفريقي لاحقا لفصل الميتوكوندريا عن حطام الأنسجة والملوثات السيتوسولية. أزال الطرد المركزي الأولي عند 1,000 × جم النوى والحطام الكبير، بينما أسفر الطرد المركزي اللاحق عند 12,000 × جرام عن حبيبات ميتوكوندرية بدائية. أدت خطوات إضافية للغسل والطرد المركزي إلى تقليل التلوث السيتوصولي، مما أدى إلى إنتاج ميتوكوندريا منقاة مناسبة للتحليلات الهيكلية والوظيفية في المراحل اللاحقة (الشكل 1).

الشكل 1: مخطط تخطيطي لعزل وتنقية الميتوكوندريا. تم عزل الميتوكوندريا عالية النقاء من خلال نهج مشترك من الهضم المنظم بالتربسين والطرد المركزي التفريقي. تم إجراء جميع الإجراءات عند 4 درجات مئوية للحفاظ على سلامة الميتوكوندريا الهيكلية والوظيفية. تم تعريض نسيج العضلات العظمية المعزولة حديثا للهضم الإنزيمي، والتجانس، وخطوات الطرد المركزي المتسلسلة للحصول على ميتوكوندريا منقاة مناسبة للتحليلات الوظيفية والبنيوية في مراحل لاحقة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم تقييم النشاط الوظيفي للميتوكوندريا المعزولة باستخدام تلوين JC-1 ووضع العلامات الفلورية للميتوكوندريا (الشكل 2). أظهر تلوين JC-1 فلورة حمراء قوية في الميتوكوندريا المعزولة حديثا تحت ظروف قاعدية، مما يدل على الحفاظ على جهد غشاء الميتوكوندريا. بعد العلاج بهيدرازون الكلوروفينيل الكربونيل الكاربونيل (CCCP)، انخفض التألق الأحمر، وزاد التألق الأخضر، بما يتوافق مع إزالة استقطاب الغشاء الميتوكوندري. أكدت هذه النتائج أن الميتوكوندريا المعزولة احتفظت باستجابة الأغشية المحتملة وظلت نشطة وظيفيا بعد العزل. أظهرت الوسم الفلوري أيضا أن الميتوكوندريا ظهرت كهياكل متقطعة متقطعة موزعة بشكل منتظم في جميع أنحاء الحقل، دون تجمع واضح أو ترسيب صبغي. أشارت الفلورة المنخفضة في الخلفية ونمط التلوين الموحد إلى الحفاظ على سلامة الميتوكوندريا وإمكانات الغشاء بعد العزل.

الشكل 2: توصيف النشاط الوظيفي للميتوكوندريا المعزولة. (أ) تقييم جهد غشاء الميتوكوندريا من خلال تلوين JC-1. تم صبغ الميتوكوندريا المنقاة ب JC-1 وتمت ملاحظتها تحت المجهر الفلوري. لوحظت تجمعات فلورية حمراء مميزة في مجموعة الميتوكوندريا الضابطة، مما يشير إلى الحفاظ على جهد غشاء الميتوكوندريا. بعد العلاج بجهاز الفصل CCCP، تحول الفلورة بشكل رئيسي نحو مونومرات JC-1 الخضراء، مما يشير إلى إزالة استقطاب الغشاء وانهيار جهد الغشاء (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). (ب) وضع العلامات الفلورية الميتوكوندرية للميتوكوندريا المنقاة. ظهرت الميتوكوندريا الموسومة بالفلورية كهياكل متناثرة ومنقطقة بدون تجمع واضح وبفلورة خلفية قليلة، مما يشير إلى سلامة الميتوكوندريا المحفوظة وإمكانات غشائية مستقرة (شريط المقياس = 100 ميكرومتر). (ج) التحليل الكمي لنسب شدة الفلورة في JC-1 في مجموعات مختلفة بعد تلوين JC-1. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM (n = 3). تم تحليل الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t غير مزدوج (****P < 0.0001). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم فحص السلامة الفائقة البنية للميتوكوندريا المعزولة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل (الشكل 3). كشف التصوير منخفض التكبير عن ميتوكوندريا منقاء ذات شكل بيضاوي في الغالب، بينما أظهر التصوير عالي التكبير أغشية خارجية سليمة وهياكل كريستي محددة بوضوح. لم يلاحظ أي تورم واضح أو تمزق أو تعطل هيكلي. للتقييم الكمي، تم تحليل خمسة حقول عشوائية تحتوي على حوالي 40-60 ميتوكوندريا في كل حقل. أظهرت هذه الملاحظات أن إجراء العزل حافظ بشكل فعال على البنية الفائقة للميتوكوندريا وأنتج ميتوكوندريا مناسبة للدراسات الوظيفية في المرحلة اللاحقة.

الشكل 3: السلامة فوق الهيكلية لميتوكوندريا العضلات العظمية المعزولة التي تم تقييمها بواسطة المجهر الإلكتروني الناقل. (يسار) صورة TEM ممثلة عند تكبير منخفض (4000×؛ شريط مقياس = 2 ميكرومتر) تظهر الميتوكوندريا المنقاة ذات الشكل البيضاوي في الغالب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

(يمين) صورة TEM عالية التكبير (40,000×؛ شريط مقياس = 200 نانومتر) تظهر أغشية ميتوكوندرية خارجية ناعمة ومستمرة وهياكل كريستية محددة بوضوح. تشير الأسهم الصفراء إلى وجود أغشية ميتوكوندرية خارجية سليمة، بينما تشير الأسهم البيضاء إلى تنظيم الميتوكوندريا الكريستي بشكل جيد. لم تلاحظ أي علامات على تورم أو تمزق أو اضطراب هيكلي. تم تحليل خمسة حقول مختارة عشوائيا تحتوي على حوالي 40-60 ميتوكوندريا في كل حقل. تظهر هذه النتائج أن بروتوكول العزل حافظ على سلامة الميتوكوندريا فوق البنية وقدم أساسا هيكليا موثوقا للاختبارات الوظيفية في المراحل النهائية.

تم تقييم إنتاجية ونقاء الميتوكوندريا لاحقا من خلال قياس البروتين وتحليل القطع المناعية (الشكل 4). أظهرت المقارنة بين طرق هضم التريبسين (TD) والاستخلاص الطبيعي (NE) أن طريقة TD أعطت حوالي 2.3-2.4 ميكروغرام بروتين ميتوكوندريا لكل ملغ من النسيج، بينما أعطت طريقة NE حوالي 1.7-1.8 ميكروغرام/ملغ نسيج. أظهر تحليل القطع المناعية إثراء قويا لمؤشرات الميتوكوندريا، مثل السيتوكروم c أوكسيداز وCOX IV، في الكسور الميتوكوندرية، مع اكتشاف ضئيل في الكسور السيتوصولية. على النقيض من ذلك، أظهر المؤشر الخلوي β-أكتين إشارات ضعيفة فقط في الكسور الميتوكوندرية، مما يشير إلى تلوث محدود بالسيتوسول. أشارت المقارنة بين مجموعتي TD وNE إلى أن هضم التريبسين حسن من إنتاج ونقاء الميتوكوندريا. بشكل مجتمع، أظهرت هذه النتائج أن البروتوكول يولد ميتوكوندريا مناسبة للتحليلات الجزيئية والوظيفية في المرحلة اللاحقة.

الشكل 4: مقارنة العائد والنقاء للميتوكوندريا المنقاة. (أ) مقارنة إنتاج البروتين الميتوكوندري لكل وحدة كتلة نسيج تم الحصول عليها باستخدام طرق هضم التربسين (TD) والاستخراج الطبيعي (NE). أنتجت مجموعة TD حوالي 2.3-2.4 ميكروغرام/ملغ، بينما أنتجت مجموعة NE حوالي 1.7-1.8 ميكروغرام/ملغ. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM (n = 3). تم تحليل الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t غير مقترن (*P < 0.05). (ب) تحليل القطع المناعية لبروتينات الميتوكوندريا والمؤشرات الخلوية في الكسور الميتوكوندرية المعزولة باستخدام طريقتي TD و NE. (C-D) تحليل كمي لبروتينات العلامة الميتوكوندرية مثل السيتوكروم سي أوكسيداز وCOX IV. كانت علامات الميتوكوندريا غنية بقوة في الكسور الميتوكوندرية لكنها أظهرت تعبيرا ضئيلا في الكسور السيتوصولية. أظهر العلامة السيتوسولية β-أكتين تعبيرا ضعيفا فقط في الكسور الميتوكوندرية، مما يشير إلى إزالة فعالة للملوثات السيتوصولية. مقارنة بمجموعة NE، أظهرت مجموعة TD تحسنا في نقاء الميتوكوندريا. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM (n = 3). تم تحليل الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t غير مقترن (*P < 0.05؛ **P < 0.01). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لتقييم وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندري بشكل أعمق، تم قياس استهلاك الأكسجين باستخدام قياس التنفس عالي الدقة (الشكل 5). أظهرت الميتوكوندريات المعزولة باستخدام طريقة TD قيم نسبة التحكم التنفسي (RCR) تتراوح بين 9-10، بينما أظهرت الميتوكوندريات المعزولة باستخدام طريقة NE قيم RCR تقريبا بين 8-9. نظرا لأن قيم RCR التي تزيد عن 4 تعتبر عموما دلالة على حفظ النشاط التنفسي الميتوكوندري، أظهرت هذه النتائج أن الميتوكوندريا المعزولة باستخدام كلا الطريقتين احتفظت بسلامة وظيفية. أشارت قيم RCR الأعلى التي لوحظت في مجموعة TD إلى الحفاظ الأفضل على وظيفة الجهاز التنفسي الميتوكوندري مقارنة بمجموعة NE. كما تم تقييم كفاءة الاقتران الكيميائي الحيوي باستخدام المعادلة 1 − (معدل تنفس التسرب/معدل نقل الإلكترونات)، مع القيم التي تقترب من 1 تشير إلى اقتران تنفسي أكثر إحكاما وإنتاج ATP أكثر كفاءة. أظهرت كلتا المجموعتين كفاءة اقتران تقترب من 1، مما يشير إلى أن الوظيفة الحيوية للطاقة الميتوكوندرية تم الحفاظ عليها بعد العزل.

الشكل 5: اختبار وظيفة الجهاز التنفسي في الميتوكوندريا المنقاة. (أ) مقارنة نسبة التحكم التنفسي الميتوكوندري (RCR) بين مجموعتي هضم التربسين (TD) والاستخلاص الطبيعي (NE). كانت قيم RCR في كلا المجموعتين أكبر من 4، مما يشير إلى الحفاظ على نشاط الميتوكوندريا التنفسي بعد العزل. أظهرت مجموعة TD قيم RCR أعلى قليلا من مجموعة NE، مما يشير إلى الحفاظ الأفضل على وظائف الجهاز التنفسي. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM (n = 3). تم تحليل الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t غير مقترن (**P < 0.01). (ب) مقارنة كفاءة الاقتران الكيميائي الحيوي للميتوكوندريا وقدرة تخليق ATP بين مجموعتي TD وNE. اقتربت قيم كفاءة الاقتران من 1 في كلتا المجموعتين، مما يشير إلى تنفس مترابط عالي وإنتاج فعال لATP. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM (n = 3). تم تحليل الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار t غير مقترن (*P < 0.05). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تم تقييم امتصاص الميتوكوندريا المعزولة من قبل الخلايا المستقبلة باستخدام خلايا L929 (الشكل 6). تم حضان الخلايا معا مع ميتوكوندريا العضلات الهيكلية المشتقة من الصبغة الفلورية الحمراء، وتم رؤية هيكل الأكتين الخلوي باستخدام مسبار الأكتين الفلوري. كشف المجهر الكونفوكالي عن هياكل فلورية حمراء متفرقة موزعة في جميع أنحاء السيتوبلازم، مما يشير إلى أن خلايا L929 قد استوعبت الميتوكوندريا الخارجية. أظهر التحليل الكمي زيادة تعتمد على الوقت في امتصاص الميتوكوندريا عند 12 و24 و48 ساعة. ومع ذلك، لوحظ زيادة طفيفة فقط بين 24 ساعة و48 ساعة، مما يشير إلى أن كفاءة الامتصاص اقتربت من التشبع بعد 24 ساعة. بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الخلايا المستقبلة L929 زيادة في جهد غشاء الميتوكوندريا بعد امتصاص الميتوكوندريا، مما يشير إلى تحسن في وظيفة الميتوكوندريا. أظهرت هذه النتائج أن الميتوكوندريا المشتقة من العضلات العظمية المعزولة باستخدام هذا البروتوكول يمكن أن تستوعب بفعالية من قبل الخلايا المستقبلة مع الحفاظ على النشاط الوظيفي.

الشكل 6: امتصاص الخلايا للميتوكوندريا المشتقة من العضلات العظمية بواسطة خلايا L929. (أ) امتصاص الميتوكوندريا المنقاء بواسطة خلايا L929 في أوقات حضانة مختلفة (12 ساعة، 24 ساعة، و48 ساعة). تم اكتشاف الميتوكوندريا الموسومة بصبغة الفلورية (الأحمر) داخل السيتوبلازم للخلايا المستقبلة، بينما تم استخدام صبغة الفالويدين (باللون الأخضر) لرؤية هيكل خلوي الأكتين. تم إجراء التلوين النووي باستخدام DAPI (الأزرق). أكد المجهر الكونفوكلي استبطان الميتوكوندريا الخارجية بواسطة خلايا L929 (شريط المقياس = 50 ميكرومتر). (ب) التحليل الكمي لكفاءة امتصاص الميتوكوندريا بواسطة خلايا L929 في نقاط زمنية مختلفة. (ج) تحليل تلوين JC-1 لجهد غشاء الميتوكوندريا في خلايا L929 بعد امتصاص الميتوكوندريا المشتقة من العضلات العظمية. (د) التحليل الكمي لنسب الفلورة المجمعة إلى الأحادية في JC-1 في خلايا L929 المستقبلة بعد امتصاص الميتوكوندريا. زاد جهد غشاء الميتوكوندريا بشكل ملحوظ بعد استيعاب الميتوكوندريا النشطة المشتقة من العضلات الهيكلية. تعرض البيانات كمتوسط ± SEM (n = 3). تم تحليل الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل ANOVA أحادي الاتجاه (*P < 0.05؛ **P < 0.01؛ ***P < 0.001). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

زراعة الميتوكوندريا هي استراتيجية ناشئة في علاج الخلايا والطب التجديدي تستعيد الوظيفة الفسيولوجية في الخلايا التي تعاني من ضعف في أيض الطاقة من خلال توصيل ميتوكوندريا سليمة وظيفيا. بالإضافة إلى تنظيم استقلاب الطاقة الخلوية، يمكن لهذه التقنية تعديل العمليات البيولوجية الرئيسية مثل الاستماتة المبرمجة والإجهاد التأكسدي، مما يوفر فرصا علاجية جديدة لمجموعة متنوعة من الأمراض ^4,17,18,19. ومع ذلك، لا تزال الترجمة السريرية لزراعة الميتوكوندريا تواجه عدة تحديات، من بينها نقص بروتوكولات عزل الميتوكوندريا الموحدة والفعالة والقابلة للتكرار، والتي لا تزال عنق زجاجة رئيسي.

لمعالجة هذه المشكلة، أنشأت هذه الدراسة بروتوكولا تجريبيا موحدا ومرئيا يعتمد على الطرد المركزي التفاضلي لعزل الميتوكوندريا الحرة الوظيفية من عضلة الفئران العظمية C57BL/6. من خلال تحسين عملية التنقية ودمج خطوات الهضم المسبق والغسل والتنقية باستخدام التربسين، تحسن هذه الطريقة تفكك الأنسجة بشكل فعال، وتحافظ على سلامة الميتوكوندريا الهيكلية، وتقلل من التلوث من المكونات الخلوية غير المستهدفة.

يحقق البروتوكول المقترح توازنا جيدا بين نقاء الميتوكوندريا والإنتاجية. مقارنة بطرق الاستخراج التقليدية القائمة على الطحن، فإن الطريقة الحالية أسرع وأكثر عملية وأكثر فعالية من حيث التكلفة، مما يجعلها مناسبة للتطبيقات المخبرية الروتينية وتحضير الميتوكوندريا المتبرعة. كل منها يحتوي على حدود معينة من طرق عزل الميتوكوندريا. على سبيل المثال، يمكن أن تحقق الطرد المركزي بتدرج الكثافة وتنقية المناعة نقاء أعلى لكنها تستغرق وقتا طويلا ومكلفة، في حين أن الأساليب القائمة على المجسات النانوية لا تزال غير متطورة بما يكفي للاستخدام الروتيني^20,21. بالنسبة للأنسجة الكثيفة مثل العضلات الهيكلية، فإن خطوة الهضم المسبق للتربسين المحسنة (0.25٪ تريبسين عند 37 درجة مئوية لمدة 10-15 دقيقة)، مع التجانس اللطيف، تحافظ بشكل أفضل على سلامة الميتوكوندريا مقارنة بالطرد المركزي التفاضلي التقليدي وحده.

في هذه الدراسة، تم استخدام مجموعة طرد مركزي تفاضلي متاحة تجاريا تحت ظروف درجات حرارة منخفضة طوال العملية واتباع سير عمل موحد، مما أتاح الحصول السريع على الميتوكوندريا السليمة هيكليا. لمعالجة المشكلات المحتملة التي تواجهها أثناء عملية الاستخلاص، بما في ذلك انخفاض الإنتاجية، وتلوث البروتين، وعدم طبيعية الجهد الغشائي، تم اقتراح عدة استراتيجيات لحل المشكلة.

عادة ما يكون انخفاض الإنتاج الميتوكوندري ناتجا عن عدم كفاية التجانس، أو نقص كمية الأنسجة، أو فقدان الطرد المركزي. يمكن تقليل هذه المشاكل من خلال ضمان هضم مسبق كاف، وإجراء توحيد لطيف (10-15 تمريرة باستخدام مجانس ضيق)، واستخدام ما لا يقل عن 100-150 ملغ من نسيج العضلات الهيكلية الطازج، والسيطرة الصارمة على حالات الطرد المركزي (1,000 × جرام لإزالة الحطام و10,000-12,000 جرام × لتكوين حبيبات الميتوكوندريا)، وإعادة تعليق العينات باستخدام رؤوس ماصة عريضة التجويف. ينتج تلوث البروتين بشكل رئيسي عن إزالة غير كاملة للحطام أو تداخل الدهون؛ لذلك، ينصح بتكرار خطوة الطرد المركزي بمقدار 1,000 × جرام ، مع إضافة خطوتين إضافيتين بغسيل بسعة 12,000 جرام × جرام، وإزالة الأنسجة الدهنية بعناية. غالبا ما يرتبط جهد غشاء الميتوكوندريا غير الطبيعي بالتلف الميكانيكي أو تقلبات درجة الحرارة. لذلك يجب تجنب التجانس المفرط، ويجب إجراء العملية بالكامل على الثلج وإكمالها خلال 60-90 دقيقة، ويجب استكمال مخازن العزل ب EGTA و0.5٪ BSA. يمكن تحسين التجانس غير الكامل من خلال ضمان الهضم الإنزيمي الكافي، واختيار متجانس مناسب، وإجراء ترشيح بعد التجانس.

على الرغم من أن البروتوكول الحالي يحسن بشكل كبير كفاءة ونقاء عزل الميتوكوندريا، إلا أن هناك عدة قيود قائمة. أولا، تعتمد العملية بشكل كبير على نضارة الأنسجة؛ من الناحية المثالية، يجب معالجة عينات الأنسجة خلال ساعة واحدة بعد الوفاة. ثانيا، قد يؤدي التريبسين المتبقي إلى تحلل بروتينات سطح الميتوكوندريا، بما في ذلك البروتينات المرتبطة بالنقل الداخلي، إذا لم يتم إزالته بشكل كاف أثناء الغسيل، مما قد يؤثر على كفاءة امتصاص الخلايا لاحقا. ثالثا، يظل وقت تخزين الميتوكوندريا محدودا، حيث أن التخزين المطول عند 4 درجات مئوية أو الحفظ بالتبريد يقلل بشكل كبير من نشاط الميتوكوندريا.

على المستوى الانتقالي، لا تزال هناك تحديات إضافية، منها تحسين كفاءة التوصيل في الجسم الحي ، وفهم آليات تكامل الميتوكوندريا طويلة الأمد، وتوضيح التفاعلات المحتملة بين الميتوكوندريا المزروعة والجينوم المضيف. مع التقدم المستمر في تقنيات عزل وتنقية الميتوكوندريا، من المتوقع أن تسرع المزيد من الابتكارات المنهجية الترجمة السريرية لعلاج زراعة الميتوكوندريا.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	توصيف الميتوكوندريا
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	تقليل تلاشي الأصباغ الفلورية
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	اختبار تركيز البروتين
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	استخدمت مضادات بيتا أكتين للكشف عن نقاء الميتوكوندريا المعزولة
BSA	Sigma	A6003	خلال العزل، يربط الأحماض الدهنية الحرة لحماية نشاط الميتوكوندريا.
Centrifuge	Eppendorf	5418R	ترسيب 4 °C
CCCP	Solarbio	C6700	لفصل الفسفرة المؤكسدة للميتوكوندريا وتحفيظ تسرب البروتونات القصوى
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	مراقبة التلطيخ بالإفلورescence
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	توصيف الميتوكوندريا
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	للتلطيخ المضاد النووي
D-mannitol	Solarbio	IM00402	الحفاظ على التوازن الأسموزي ومنع انتفاخ الميتوكوندريا أثناء العزل
EGTA	Sigma	E4378	يستخدم عادة في مخازن عزل الميتوكوندريا لحماية وظيفة الميتوكوندريا عن طريق الارتباط المحدد بالكالسيوم2+
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	زراعة خلايا L929
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	يستخدم للإمساك، الاحتفاظ ورفع الأنسجة
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	يستخدم لتجانس الأنسجة وعزل الميتوكوندريا
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	يثبت ويثبت بسرعة البنية التحتية الخلوية الدقيقة عن طريق الترابط بين البروتينات، ومنع التحلل الذاتي للحفاظ على الشكل الطبيعي للأعضاء الخلوية.
HEPES	Thermo Fisher	J67485	يوفر بيئة pH مستقرة.
Incubator	Thermo Fisher	51032874	زراعة خلايا L929
JC-1	Solarbio	M8650	كشف التغييرات في الجهد الغشائي للميتوكوندريا المنقى.
L929 cell line	Procell	CL-0137	لاختبار استيعاب الميتوكوندريا
Lead citrate	Sigma	15326	لصبغ الشرائح الرقيقة لمراقبة البنية التحتية تحت الخلوية الدقيقة.
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	زراعة خلايا L929
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	كجزء من حافظة النقل، يتم استخدامه لإزالة SDS وتسهيل نقل البروتينات من الهلام إلى الغشاء الصلب.
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	قياس الامتصاص للميتوكوندريا الملطخة بـ JC-1
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	كشف الجهد الغشائي للميتوكوندريا في العضلات الهيكلية
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	مجموعات الاستخراج القائمة على الترسيب التفاضلي
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	للحفاظ على الميتوكوندريا
Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	توصيف الميتوكوندريا
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	كحافظة في تحضير المحلول
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001 يستهدف IgG الفأري (H+L) في Western blot
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001 يستهدف IgG الأرنبي (H+L) في ELISA و Western blot
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	يستخدم بشكل رئيسي كعامل حجب لتقليل الإشارة الخلفية عن طريق شغل مواقع الارتباط غير المحددة على الغشاء.
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	تحديد وظيفة التنفس الميتوكوندريا واستقلاب الأكسجين.
Osmium tetroxide	Sigma	75633	أو ما بعد التثبيت للحفاظ على الدهون وتعزيز تباين الغشاء في عينات TEM.
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	تنظيف الأنسجة العضلية
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	زراعة خلايا L929
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	تسمى F-actin السيتوبلازمي للتصوير المجهري الفلوري
Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane	Millipore (Merck)	IPVH00010	Western blotting
PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050	لفصال البروتين بواسطة SDS-PAGE الكهربائي
Precast gradient polyacrylamide gel (4–12%)	ACE Bioscience	ET12412LGel	يستخدم لفصل SDS-PAGE للميتوكوندريا والبروتينات الكلية الخلوية
Protease inhibitor	Shaanxi Zhonghui Hecai Biomedical Technology	PL032	يثبط نشاط البروتياز الذاتية والخارجية، مما يمنع تحلل البروتينات المستهدفة أثناء معالجة العينة.
RIPA lysis buffer	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PL001-2A	يستخدم لاستخراج البروتين الكلي للأنسجة الحيوانية والخلوية
Sodium Chloride Injection (0.9%)	Xi’an Jingshuang Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd.	Approval No. H61020014	مخزن سائل للخلايا/الأنسجة، والغسل والحفاظ على الضغط الأسموزي
Sterile gloves	Jiangsu Yangzi Lide Medical Devices Co., Ltd.	YMZ000-1	عزلة التلوث وحماية المشغلين والعينات التجريبية
Sucrose	Sucrose	S818048	توفير الدعم الأسموزي والحفاظ على مورفولوجيا الميتوكوندريا وسلامة وظيفتها.
TBST	NCM Biotech	WB20500	الغسل لتقليل الخلفية، وخدمة كمخفف للأجسام المضادة وحلول الحجب، بينما تحمي استقرار ارتباط المستضد-الجسم المضاد عن طريق الحفاظ على بيئة pH وثابتة أيونية.
Tissue Homogenate Assay