قياس معدل الموت الجنيني في Caenorhabditis elegans

ملخص

يوفر هذا البروتوكول إجراء بسيطا ومنخفض التكلفة لقياس معدل الوفيات الجنينية في Caenorhabditis elegans. يتيح الكشف المباشر عن التشوهات الجنينية عبر مجموعات سكانية دون الحاجة إلى معدات متخصصة أو خبرة في انتقاء الديدان. يمكن استخدام البروتوكول لقياس تأثيرات الطفرات الجينية، وتدمير الجينات الناتج عن تدخل الحمض النووي الريبي، والنظام الغذائي.

الملخص

الفتنة الجنينية هي نمط ظاهري أساسي يستخدم في أبحاث Caenorhabditis elegans لتوصيف العيوب التطورية الناتجة عن عوامل مثل التعرض السامة والطفرات الجينية. لذلك، فإن قياس اختراق الفتة الجنينية بدقة أمر بالغ الأهمية لفهم آليات وتأثير هذه الاضطرابات على تطور الحيوانات. على الرغم من وجود منصات تسجيل النقاط الآلية، إلا أن هذه الأساليب غالبا ما تتطلب استثمارا ماليا كبيرا وأجهزة أو برمجيات متخصصة. تصف هذه المقالة اختبارا منخفض التقنية ومنخفض التكلفة يقيس الوفيات الجنينية من خلال قياس نسبة الأجنة التي تفشل في الفقس بنجاح. ومن الجدير بالذكر أن هذا الإصدار من الاختبار يلغي الحاجة إلى أداة الديدان، مما يجعله مناسبا جدا للمبتدئين. ميزة إضافية لهذا النهج هي أن كل اختبار تقني يكرر أحفاد عدة حيوانات، متجنبا التحيزات المحتملة لاختبارات الدودة الواحدة. يتضمن هذا البروتوكول مناقشة للمعلمات الحرجة، مثل الحد الأدنى لعدد النسل المطلوب لالتقاط اختراق النمط الظاهري بدقة والمنطق وراء المنهجية. وأخيرا، نقدم إرشادات حول تكييف الاختبار لتقييم تأثيرات الانهيار الجيني عبر تداخل الحمض النووي الريبي، أو العلاجات الدوائية، أو المكملات الغذائية، مضيفين أداة متعددة الاستخدامات وسهلة الوصول إلى أدوات باحثي C. elegans .

المقدمة

تعد الفتة الجنينية نموذجا ظاهريا حيويا لتقييم أدوار الجينات والعوامل البيئية في التطور المبكر. يعد C. elegans نموذجا قويا لدراسة العمليات التطورية بسبب نسبه الخلوي الثابت، وجسمه الشفاف، ودورة حياته السريعة¹. يمكن استخدام الفتنة الجنينية في C. elegans لتقييم سلامة النمو تحت الاضطرابات الكيميائية والدوائية والتغذوية والوراثية^2،3،4،5. لذلك، فإن الطرق المتاحة والمتعددة لقياس معدل وفاة الأجنة بدقة ستعود بالنفع على مجتمع الأبحاث.

تعتمد الطرق المتقدمة عالية الإنتاجية وعالية المحتوى التي تدرس تكوين الأجنة على أنظمة تصوير وبرمجيات متخصصة، وغالبا ما تتطلب استثمارا ماليا كبيرا ^4,6,7، بينما توفر الأساليب البسيطة عالية الإنتاجية قراءات نوعية بشكل أساسي ^8,9. أما الطرق الكلاسيكية، فتستخدم نهجا يدويا منخفض التكلفة يتضمن عادة نقل متكرر للخنثى الفردي باستخدام أداة الدودة لتقييم الموت الجنيني للحضنة ^{بأكملها.} ومع ذلك، يمكن أن تكون هذه الطريقة صعبة تقنيا للمبتدئين ولديها قابلية توسع محدودة. بالإضافة إلى ذلك، تقوم الاختبارات الكلاسيكية القائمة على حجم الحضنة بقياس القدرة على بقاء الأجنة في نسل الأم الوحيدة، مما قد يسبب تحيزا غير مقصود.

الهدف العام من هذه الطريقة هو تقديم نهج بديل، بسيط، فعال من حيث التكلفة، ومتعدد الاستخدامات لقياس مدى بقاء الأجنة عند متوسط الإنتاجية. تقيس هذه الطريقة معدلات الموت الجنيني في نسل عدة حيوانات في كل نسخة، ولا تتطلب استخدام معول دود، وتتجنب أي معدات متخصصة أو مكلفة. تظهر الدراسة أيضا كيف يمكن تطبيق هذه الطريقة على الاضطرابات الشائعة، مثل تداخل الحمض النووي الريبي واختبار الأدوية أو العناصر الغذائية.

البروتوكول

1. صيانة C. elegans

ملاحظة: يمكن العثور على إرشادات مفصلة حول تربية C. elegans في WormBook¹¹.

1. جهز صفائح وسيط نمو الديدان الخيطية (NGM) الصيانة.
   1. لصنع 1 لتر من الغاز الطبيعي السميك، اجمع 3 جرام NaCl، 2.5 جرام بيبتون بكتيريا، و17 جرام أجار في زجاجة 2 لتر. أضف 975 مل من الماء المقطر وقضيب تحريك، ثم استخدم المعقم لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
   2. اترك الوسط ليبرد إلى 55 درجة مئوية في حمام مائي. ضع الزجاجة على طبق تحريك وباستخدام تقنية المعقم أضف 25 مل من محلول فوسفات البوتاسيوم 1 مل، و1 مل لكل من الأنواع التالية: 1 ملغ سوليوم₄، 1 ملغ CaCl₂، و5 ملغ/ملليتر كوليسترول. صب حوالي 25 مل في كل صفيحة بحجم 100 مم.
2. حضر مزرعة الإشريكية القولونية OP50 ليلا.
   1. باستخدام تقنية المعقم، املأ قارورة إيرلنماير بسعة 1 لتر حتى خمس حجمها (200 مل) بوسط LB. قم بتطعيم الوسط بمستعمرة واحدة من الإشريكية القولونية OP50 باستخدام حلقة تلقيح معقمة. الحضانة طوال الليل عند 37 درجة مئوية على جهاز هزاز مداري عند 200 دورة في الدقيقة.
3. ألواح صيانة NGM البذور مع E. coli OP50 (الشكل 1A).
   1. انقل مزرعة الإشريكية القولونية OP50 إلى زجاجات طرد مركزي وجهاز طرد مركزي لمدة 30 دقيقة على حرارة 3,500 × جرام في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في واحد من عشرين من الحجم الأصلي. استخدم 1–1.5 مل من الزراعة المركزة لزرع كل صفيحة بحجم 100 مم NGM.
   2. حضن الصحون طوال الليل في درجة حرارة الغرفة للسماح للبكتيريا بالنمو.
      ملاحظة: تحتوي هذه الألواح الصيانة على كثافة عالية من البكتيريا لدعم ما يصل إلى 4000 دودة في كل طبق، وهو أمر مرغوب فيه عند إجراء عدد كبير من الفحوصات أو العمل مع سلالة بطيئة النمو من C. elegans. يمكن تخزين أطباق الصيانة المبذورة في الثلاجة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
4. تأسيس ثقافة أولية لعائلة C. elegans (الشكل 1A).
   1. استخدم رأس ماصة معقمة لقص قطعة صغيرة من الأجار تحتوي على ~1,000 دودة من صفيحة صيانة جائعة. ضع قطعة الأجار على طبق NGM مزروع.
   2. ضع الطبق الجديد في وعاء بلاستيكي وحضنه على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 3 أيام حتى تحمل الديدان وتضع البيض. تأكد من أن العشب البكتيري كاف، وأن عدد الديدان لا يموت جوعا. في هذه المرحلة، أصبح عدد الديدان جاهزا للتجربة.

2. تحضير الأوساط التجريبية والمزارع البكتيرية

ملاحظة: في هذه الخطوة، تابع إما الطريقة 1 لاختبار تأثير إسقاط الجين الذي يبوساه RNAi أو الطريقة 2 لدراسة المكملات الغذائية.

1. الطريقة 1: تحضير ألواح NGM تجريبية للRNAi عن طريق التغذية.
   1. جهز 1 لتر من NGM كما هو موضح في الخطوة 1.1، ثم باستخدام تقنية المعقم أضف 1 مل من 1 M IPTG و1 مل من 50 ملغ/مل أمبيسيلين. صب حوالي 5 مل في كل صفيحة بحجم 35 مم.
   2. تلقيح العدد المطلوب من نسخ تغذية الإشريكية القولونية HT115 RNAi التي تحمل بلازميدات L4440 وتستهدف جينات C. elegans المعنية، مع التحكم الناقل الفارغ. اختر مستعمرة واحدة بها حلقة تلقيح وانقلها إلى 1.5 مل من LB يحتوي على 50 ميكروغرام/مل أمبيسيلين. حضانه لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية على جهاز هزاز مداري بسرعة 200 دورة في الدقيقة.
   3. زرع صفائح NGM بقطر 35 مم تحتوي على الأمبيسيلين وIPTG مع 100 ميكرولتر من زراعة الإشريكية القولونية HT115 الليلية، مع تحضير نسختين تقنيتين لكل حالة. حضن الصفائح طوال الليل في درجة حرارة الغرفة للسماح بنمو البكتيريا وتحفيز إنتاج RNA مزدوج السلسلة. تخزين عدد مماثل من الأطباق غير المزروعة عند 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا في نقل البيض.
2. الطريقة 2: تحضير أطباق NGM تجريبية مع مكمل غذائي أو دوائي.
   1. حضر 1.5 مليون ميل مركزة من الماء المقطر باتباع التعليمات في الخطوة 1.1، لكن أضف 642 مل من الماء المقطر بدلا من 975 مل. احتفظ بالوسط المحضر في حمام ماء بدرجة حرارة 55 درجة مئوية.
   2. جهز مخزونا مائيا من المكمل المورد اهتمامه بتركيز 3 أضعاف التركيز المستهدف (على سبيل المثال، لتحضير ألواح تحتوي على فورمات الصوديوم 40 ملليمولار، اصنع مخزونا بحجم 120 ملليمولار). احسب حجم المخزون المطلوب عن طريق ضرب عدد الألواح التجريبية في 1.666 مل (ثلث حجم اللوحة). استخدم فلتر الحقنة لتعقيم المرق بالفلترة، ثم سخنه إلى 55 درجة مئوية في حمام ماء.
   3. في أنبوب مخروطي بسعة 50 مل، اخلط جزئين 1.5x NGM مع جزء واحد من مكمل المكمل. لتجنب التحكم في المكملات، اخلط جزئين 1.5x NGM مع جزء واحد من الماء المعقم الساخن. اخلط بلطف عن طريق قلب الأنبوب 10 مرات، ثم باستخدام تقنية المعقم سكب بسرعة حوالي 5 مل من الوسط في كل صفيحة بحجم 35 مم.
      ملاحظة: يستخدم 1.5x NGM لتعويض التخفيف المتوسط عند إضافة كميات كبيرة من المكملات. ومع ذلك، إذا تم تركيز الدواء أو مخزون المستقبات إلى 100× أو أكثر من التركيز النهائي، يمكن استخدام NGM العادي بدلا من 1.5× NGM. عند تناول حمض عضوي، فإن استخدام ملح الصوديوم الخاص به يساعد في منع انخفاض درجة الحموضة المتوسطة.
   4. باستخدام تقنية المعهر، املأ قارورة إيرلنماير بسعة 50 مل حتى خمس حجمها (10 مل) بوسط LB. التلقيح بمستعمرة من الإشريكية القولونية OP50 واحتضن الحوض طوال الليل عند حرارة 37 درجة مئوية على جهاز هزاز مداري عند 200 دورة في الدقيقة.
   5. زرع ألواح NGM بقطر 35 مم مع 100 ميكرولتر من زراعة الإشريكية القولونية OP50 الليلية، مع تحضير نسختين تقنيتين لكل حالة. حضن الصحون طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. تخزين عدد مماثل من الأطباق غير المزروعة عند 4 درجات مئوية لاستخدامها لاحقا في نقل البيض.

3. الحصول على مجموعة متزامنة من يرقات L1

1. تحضير محلول مبيض قلوي بدمج 7 مل من الماء المعقم، و2 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 5٪، و1 مل من 5 نيوتن NaOH.
2. تحضير مخزن M9 عن طريق إذابة 3 جرام من KH₂PO₄، و6 جرام من Na₂HPO₄، و5 جرام من NaCl في 1 لتر من الماء المقطر، ثم ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.5. استخدم المعقم لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية، ثم أترك المحلول يبرد، ثم أضف معقم 1 مل من 1 M MgSO4.
3. اغسل الديدان البالغة الحاملة (الخطوة 1.4.2) من اللوح باستخدام مخزن M9 وانقلها إلى أنبوب مخروطي بحجم 15 مل. قم بجهاز الطرد المركزي بقوة 350 x g لمدة دقيقتين، ثم استنشق السوبرناتان، واملأ الأنبوب بمخزن M9 جديد. كرر الغسيل مرتين.
4. أضف 2 مل من محلول M9 و2 مل من محلول التبييض القلوي إلى حبيبة الدودة. الدوامة والهز بقوة، مع فحص تحت المجهر بشكل دوري حتى تذوب معظم الديدان.
5. املأ الأنبوب بمخزن M9 وجهاز طرد مركزي بقوة 350 × g لمدة دقيقتين. قم بإزالة المادة الفائقة عن طريق قلب الأنبوب، ثم اغسلها أربع مرات باستخدام مخزن M9. تأكد من إجراء أول غسل فورا بعد تحلل الديدان لمنع التبييض الزائد. بعد آخر غسل، املأ الأنبوب ب 8 مل من محلول M9 واحتضن على جهاز هزاز لمدة 18–20 ساعة حتى تفقس البيوض.

4. زراعة السكان الأمهات

1. ضع خمس قطرات من تعليق الدودة بحجم 3 ميكرولتر على شريحة زجاجية وعد عدد يرقات L1 التي فقست تحت المجهر. اقسم العدد الكلي على 15 للحصول على التركيز لكل ميكرولتر.
2. ضع صفيحة بحجم 30 يرقة L1 على كل صفيحة مزروعة بطول 35 مم وحضن عند 20 درجة مئوية لمدة 72 ساعة. إذا سببت الظروف التجريبية تأخر في التطور، قم بتمديد وقت الحضانة حتى تصبح الديدان حاملة وتبدأ في وضع البيض (الشكل 1B).

5. نقل الأجنة إلى ألواح الفقس

1. أزل الألواح غير المزروعة بحجم 35 مم من الثلاجة واتركها تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
2. افحص صفائح الديدان تحت المجهر وتأكد من أنها تحتوي على أكثر من 100 جنين، دون وجود يرقات L1 مفقسة.
3. املأ الطبق بعناية بمخزن M9. استخدم خط تفريغ لسحب السائل وإزالة النسيج الأمهي. تأكد من عدم بقاء أي ديدان بالغة على الطبق.
4. املأ رأس الميكروبايبت ب 200 ميكرولتر من محلول M9 واستخدم الماصة صعودا وهبوطا بقوة لفصل الأجنة عن العشب البكتيري. أثناء المشاهدة من خلال المجهر، وجه طرف الماصة نحو المناطق الكثيفة من الأجنة.
5. خذ صفيحة غير مزروعة وقم بوضع ماصة قطرة من تعليق الجنين في المنتصف. افحص القطرة تحت المجهر. إذا لم يحتوي على 100–300 جنين، أضف المزيد من تعليق الأجنة حتى يصل إلى هذا النطاق. تأكد من عدم نقل أي ديدان من السكان الأصليين مع الأجنة.
6. اترك السائل ليجف، ثم حضن ألواح النقل عند 20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 24 ساعة.
   ملاحظة: إذا كانت يرقات L1 موجودة بالفعل على اللوحة التجريبية، استخدم خط تفريغ بدلا من غسول M9 لإزالة كامل مجموعة الأمهات واحدة تلو الأخرى. هذا يمنع غسل الصغار L1، الذين لا يلتصقون بالعشب البكتيري كما تفعل الأجنة. تابع نقل النسل، والذي سيشمل الآن كلا من الأجنة ويرقات L1. تأكد من تطبيق نفس النهج على جميع الحالات.

الشكل 1: الجدول الزمني التجريبي والمخطط للخطوات الرئيسية في اختبار الموت الجنيني. (أ) جدول زمني لمخطط التدفق يمثل المدة الكاملة للبروتوكول التجريبي، من تحضير وسائط الصيانة إلى تسجيل ألواح الفقس. يتم تحديد الإجراءات الرئيسية للأيام المقابلة من التجربة. (ب) مخطط اختبار الموت الجنيني (الخطوات 4–6). في اليوم الرابع، تضاف يرقات L1 المتزامنة إلى الحمض النووي الريبي التجريبي أو صفائح المكملات لتحديد مجموعة أمهات. بعد 72 ساعة، في اليوم السابع، وبعد أن تضع الديدان بيضها، يتم غسل السكان الأمومي بينما تبقى الأجنة ملتصقة بالعشب البكتيري. ثم تغسل الأجنة من العشب باستخدام ماصة وتنقل إلى لوحة فقس، تحتوي على ما لا يقل عن 100 جنين في كل طبق. بعد 24 ساعة من الحضانة، يتم عد اليرقات المفقسة والأجنة غير المفقسة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

6. لوحات التسجيل

1. استخدم قلم تحديد دائم لرسم شبكة بحجم حوالي 4 مم × 4 مم على غطاء طبق بتري بحجم 35 مم، ثم ضع الغطاء تحت اللوحة. استخدم الشبكة كدليل، وتحت المجهر، عد عدد يرقات L1 والأجنة غير المفقسة باستخدام عداد نقرات محمول.
2. قم بعد الكومبينز من النسخ التقنية لضمان الوزن المناسب لكل نسخة بناء على عدد ذريتها. تحديدا، اجمع أعداد الأجنة واليرقات غير المفقوسة عبر النسخ التقنية.
3. احسب معدل موت جنيني واحد لكل نسخة بيولوجية عن طريق قسمة عدد الأجنة (الديدان غير المفقسة) على إجمالي عدد الديدان والأجنة، ثم اضرب في 100 للتعبير عن القيمة كنسبة مئوية.
   ملاحظة: إذا كانت الصفيحة تحتوي فقط على يرقات فقسة أو أجنة فقط، يمكن تخطي هذه الخطوة العدية، حيث أن معدل الموت الجنيني هو 0 (0٪) أو 1 (100٪) على التوالي.

7. التحليل الإحصائي

1. كرر التجربة كاملة ثلاث مرات على الأقل للحصول على نسخ بيولوجية مستقلة. لكل نسخة بيولوجية، استخدم لوحين تقنيين من النسخ لكل حالة، مع حد أدنى 100 جنين لكل نسخة تقنية.
2. تحديد ما إذا كانت معدلات الموت الجنيني تختلف بشكل كبير بين الحالات باستخدام تحليل النوم الباهظ الأحادي الاتجاه، تليها اختبارات t الزوجية اللاحقة مع تصحيح متعدد الاختبارات، مثل طريقة بنجاميني-هوشبرغ.
   ملاحظة: الجمع بين نسختين تقنيتين ينتج ما لا يقل عن 200 جنين لكل نسخة بيولوجية. هذا يفي بمتطلب حجم العينة (~184 جنين/حالة) المقدرة بواسطة اختبار دالة القاعدة R power.prop.test لاكتشاف فرق 15٪ في الموت (مثلا، 20٪ مقابل 35٪) مع قوة 90٪ ومستوى دلالة α = 0.05.

النتائج

تم إجراء اختبار الموت الجنيني في سلالتين: النوع البري N2 والسلالة شديدة الحساسية ل RNAi rrf-3(pk1426). باستخدام RNAi عن طريق التغذية، قمنا بإسقاط جينات تم الإبلاغ سابقا عن أنها تسبب فتك جنيني في شاشات عالية الإنتاجية ^9,12. يوفر الشكل 2 عرضا تمثيليا لأداء الاختبار. أدى القضاء على T04G9.4 إلى إنتاج فتك جنيني شبه كامل الاختراق في كل من حيوانات rrf-3(pk1426) وN2 (الشكل 2A,B...

المناقشة

تعد هناك عدة خطوات حاسمة لقابلية تكرار الاختبار ودقته. أولا، يجب توقيت خطوة التبييض بعناية لإذابة الديدان البالغة دون إتلاف الأجنة. نقطة مهمة أخرى هي نقل عدد كاف من الأجنة للعد: القليل جدا يقلل من الدقة، بينما الكثير منها يجعل العد مملا بلا داع. بعد ذلك، يجب إجراء نقل الجنين قبل بدء الفقس. وإلا، فإن الفقس سيغسل مع البالغين، مما قد يغير معدلات الفقس نحو زيادة الفتك الجنني. وأخيرا، للحفاظ على اتساق في عداد الأجنة ومستوى L1، يجب تدريب المجربين المبتدئين على تحديد الأجنة بدقة واكتشاف جميع ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Bacteriological peptone	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center	N2	wild type
C. elegans NL2099	Caenorhabditis Genetics Center	NL2099	rrf-3(pk1426) II. RNAi hypersensitive
Calcium chloride, anhydrous	Sigma-Aldrich	746495
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045
Conical tubes, 15 mL	VWR	60818-725
Culture tubes, 14 mL	VWR	470150-966
Diaphragm vacuum pump	Amazon	TC-100
Dissecting microscope	AmScope	SM-2
Escherichia coli HT115	Caenorhabditis Genetics Center		RNAse III-deficient, used for RNAi by feeding experiments
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Granulated agar	Fischer Scientific	BP97445
Handheld tally counter	LabDepot	HTCP01
IPTG, dioxane free (Isopropyl-b-D-thiogalactoside)	US Biological	I8500
LB Broth (Miller)	US Biological	L1520	لصنع وسط LB، قم بإذابة 25 جرام من مسحوق LB في 1 لتر من الماء المقطر. قم بالمعقم لمدة 20 دقيقة عند 121.1 درجة مئوية.
Luer Lok disposable syringe	BH Supplies	BH20LL
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	M2643
Microscopy slides	Sail Brand	7101
Petri dishes, 100 mm	Tritech Research	T3371
Petri dishes, 35 mm	Tritech Research	T3501
Potassium Phosphate Buffer (PPB)			لصنع بوتاسيوم فوسفات العازلة (1 م)، قم بإذابة 98 جرام من بوتاسيوم فوسفات أحادي القاعدة و48 جرام من بوتاسيوم فوسفات ثنائي القاعدة في 1 لتر من الماء المقطر. اضبط درجة الحموضة إلى 6. معقم لمدة 20 دقيقة عند 121 درجة مئوية.
Potassium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	795496
Potassium phosphate monobasic	Sigma-Aldrich	529568
Rocker (nutating mixer)	Corning LSE	6720
Serological pipettes, 25 mL	Corning	4489
Serological pipettes, 5 mL	Celltreat	229235
Shaking incubator Infors Multitron	INFORS HT	NA
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888
Sodium hydroxide solution, 5 N	Fisher Scientific	SS256-500
Sodium hypochlorite, 5%	LabDepot	LC246302
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763
Sorvall ST1 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	75016030
Stir plate	ONilab	ONi28-S
Syringe filters	Semmerfeld	JQP033022QE1
Water bath	FOUR E's Scientific	WB401