برنامج رسم المعلمات الدقيقة الدبقية (MMPS): أداة مفتوحة المصدر وسهلة الاستخدام لتحليل شكل الخلايا الدبقية الصغيرة الكمية

ملخص

برنامج تحويل المعلمات الدقيقة الدبقية (MMPS) هو خط تحليل سهل الاستخدام لا يتطلب خبرة في الترميز ويقوم بشبه أتمتة تحليل مورفولوجيا الميكروغليالا أحادية الخلية من صور الفلورية المناعية. تم التحقق منه في نموذج التهاب عصبي ناتج عن دهون السكريات الدهنية القوارض، يكتشف MMPS بشكل متكرر التغيرات الشكلية المرتبطة بالتنشيط ويتيح التنمذج الدقيق الدبقي الموحد والقابل للتوسع.

الملخص

الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا مناعية مشتقة من النخاع في الجهاز العصبي المركزي تتوسط تدهور الأنسجة وإعادة تشكيلها بعد الإصابة العصبية، وقد ظهرت كأهداف علاجية واعدة في عدة أمراض تنكسية عصبية. يمكن للتحليل الكمي لشكل الخلايا الدبقية أن يكشف عن فروق دقيقة بين مجموعات الخلايا الدبقية مع الحفاظ على معلومات مهمة في الموقع . ومع ذلك، فإن العديد من منصات تحليل مورفولوجيا الميكروغليالا المتوفرة حاليا إما غير متاحة للجمهور أو تتطلب خبرة حسابية متخصصة، مما يحد من انتشارها الواسع. لمعالجة هذه القيود، تم تطوير منصة مفتوحة المصدر لتحليل مورفولوجيا الميكروغليا، تسمى برنامج تعيين معلمات الميكروغليالي (MMPS)، باستخدام بايثون 3.11. MMPS متوافق مع سير العمل المعتمد على الفلورة المناعية ولا يتطلب خبرة في الترميز للتركيب أو التشغيل. يقوم البرنامج بأتمتة جزئية لتحليل مورفولوجيا الخلايا الدقيقة للدبق الأحادي من خلال واجهة مستخدم رسومية سهلة الوصول، ويدمج سير عمل معالجة الصور وتوليد الأقنعة القابلة للتخصيص القابلة للتعديل. تتضمن الدراسة التحقق من صحة MMPS باستخدام نموذج التهاب عصبي ناتج عن عداد الدهون القوارض (LPS). أظهر التحليل الكمي على مستوى الحيوانات أن الخلايا الدبقية الصغيرة من الحيوانات المعالجة ب LPS أظهرت زيادة ملحوظة في مساحة السوما (p < 0.01) وانخفاض محيط الخلية (p < 0.05) مقارنة بمجموعة الضوابط المعالجة بالمركبات، بما يتوافق مع الخصائص الشكلية المرتبطة بتنشيط الخلايا الدبقية الصغرية والالتهاب العصبي. بشكل عام، يوفر MMPS منصة موحدة وقابلة للتكرار للتحليل الكمي لشكل الميكرو دبقيا عبر المختبرات.

المقدمة

الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا مناعية فطرية في الجهاز العصبي المركزي (CNS) تقوم بمسح محيطها باستمرار بحثا عن مسببات الأمراض وتلف الأنسجة¹. عند التفعيل، تتراجع الخلايا الدبقية الصغيرة عن عملياتها وتنتقل من شكل متشابكي متفرع إلى نمط أميبويدي ^2,3. في الأمراض التنكسية العصبية مثل السكتة الدماغية الإقفاري ^4,5 ومرض الزهايمر ^6,7. غالبا ما تكرس الخلايا الدبقية الصغيرة الالتهاب العصبي من خلال إنتاج السيتوكينات المستمر، وتدهور واسع للأنسجة، والبلعمة². تساهم هذه العمليات في تعطيل وحدة الأوعية العصبية، مما يزيد من تفعيل الخلايا الدبقية الدقيقة وإصابة الجهاز العصبي^{المركزي 8}، مما يجعل الخلايا الدبقية الصغيرة أهدافا علاجية واعدة ^9,10.

أحد الأساليب لتحديد الفروق الدقيقة بين الفروق الفرعية الدقيقة في الأمراض التنكسية العصبية هو من خلال التحليل الشكلي. يتم ذلك عادة باستخدام حيوانات Cx3CR1-GFP باستخدام المجهر ثنائي الفوتون 11 في الجسم الحي أو من خلال وسم الفلورية المناعية (IF) لمؤشرات ميكروبرالية معروفة مثل جزيء محول ارتباط الكالسيوم المؤين-1 (Iba1) أو مستقبل Purinoceptor^{P2Y 12}. على الرغم من أن الخلايا الدبقية الصغيرة تنتقل كثيرا بين الأشكال النظيفية والأشكال الأميبية بعد الإصابة، إلا أن الدراسات السابقة أظهرت أن الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أن تتبنى أيضا أنماطا ظاهرية إضافية، بما في ذلك الدبقية الدقيقة المتفرعة ^3,13، والدبقية الصغيرة في شبكة النحل ^3,14، والدبقية التفاعلية¹⁵، والدبقية الصغيرة ^3,16. ومع ذلك، غالبا ما تعتمد دراسات الشكل الدقيق الدبقي على التصنيف اليدوي للأنماط الظاهرية النظيرية التوازن الداخلي والأميبيويد. تتطلب هذه الأساليب خطوط تحليل متخصصة غالبا ما تفتقر إلى التوحيد بين المختبرات وتجعل التمييز بين الأشكال المشابهة، مثل الأنماط الظاهرية المتشابهة مقابل الأنماط الظاهرية المتفرعة بشكل مفرط، صعبا حتى للأفراد المدربين¹⁷. علاوة على ذلك، يتطلب التحليل القائم على الصيام الصوتي للتغيرات الشكلية الدقيقة تصويرا عالي الدقة، مما قد يطرح تحديات تقنية إضافية.

لمعالجة هذه القيود، تم تطوير عدة منصات تحليلية تكتشف الخلايا^{الصغيرة 11} أو¹⁸ بشكل شبه تلقائي وتولد تمثيلات ثنائية متعددة للخلايا، تعرف باسم "الأقنعة"، عبر مناطق مستهدفة يحددها المستخدم (مثل 200–800 ميكرومتر²). تقلل هذه الأساليب من تحيز المستخدم، وتحسن قابلية التكرار، وتزيد من الكفاءة التحليلية. على الرغم من هذه التطورات، فإن العديد من منصات البرمجيات المتاحة حاليا تعاني من قيود تقيد الاعتماد الواسع، بما في ذلك نقص الوصول مفتوح المصدر¹⁷، متطلبات الخبرة البرمجية 11,19,20، الاعتماد على أنظمة المجهر الثنائي الفوتوني في الجسم الحي ^11,19، غياب واجهات المستخدم الرسومية البديهية 11,21,22، البطء سرعات المعالجة¹¹، أو الاعتماد على منصات البرمجيات التجارية^{12، 19، 21}. على الرغم من أن الدراسات الحديثة بدأت في معالجة العديد من هذه القضايا، إلا أن العديد من المنصات الحالية لا تزال غير مناسبة لسير العمل القائم على الصيام الصيامي، والتي لا تزال مستخدمة على نطاق واسع لدراسة مورفولوجيا الميكروليال الدبقية.

يقدم هنا منصة تحليل مورفولوجيا ميكروليال دقيقة موجهة للمستخدم تسمى برنامج تعيين معلمات الميكرودبقية (MMPS). لا يتطلب MMPS خبرة في البرمجة، ويتكامل مع سير العمل المعتمد على ImageJ، ومصمم خصيصا للاستخدام مع صور IF. تم تطوير البرنامج بلغة بايثون 3.11 ويدمج مفاهيم من منصات مورفولوجيا مفتوحة المصدر^{المنشورة سابقا 11}. يتميز MMPS بواجهة مستخدم رسومية بديهية تتيح للمستخدمين استيراد ومعالجة دفعات كبيرة من صور IF باستخدام خيارات معالجة صور متعددة قابلة للتخصيص. تتضمن المنصة أيضا اختيار الخلايا يدويا لتقليل العينة الزائدة التي تحدثت أثناء تصوير الصيام، بالإضافة إلى رسم مخططات يدوية للسوما لمنع إدخال العمليات الخلوية في قياسات السوما. بالإضافة إلى ذلك، يتضمن MMPS معلمات توليد أقنعة قابلة للتخصيص وميزات ضمان جودة متعددة لتحسين دقة الأقنعة. يحسب البرنامج عدة معايير مورفولوجية شائعة، بما في ذلك المحيط، متوسط مسافة مركز الوسط، مساحة القناع، الشذوذ، الاستدارة، ومساحة السوما. للدراسات المتقدمة، تكون المخرجات المولدة بواسطة MMPS متوافقة مع عدة إضافات ImageJ ويمكن تحليلها بشكل أعمق باستخدام إضافات مرافقة لتحليلات الكسور والهيكل العظمي والهيكل.

تم التحقق من صحة MMPS باستخدام نموذج التهاب عصبي ناتج عن دهون عشبية القوارض (LPS) من خلال فحص التغيرات الدقيقة الدبقية داخل الطبقة القشرية IV. أظهر التحليل الكمي أن إعطاء LPS زاد بشكل كبير من منطقة السوما الدبقية الدقيقة مع تقليل محيط الخلية مقارنة بالمواد الضابطة المعالجة بالمركبة، مما يشير إلى أن MMPS يكتشف بدقة التغيرات الشكلية الدقيقة المرتبطة بتنشيط الخلايا الدبقية.

البروتوكول

تم إجراء جميع إجراءات الحيوانات وفقا للجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في جامعة فرجينيا الغربية (البروتوكول #2109047180) ودليل العناية واستخدام الحيوانات المختبرية المدعوم من المعاهد الوطنية للصحة. المعدات والكواشف والبرمجيات المستخدمة في هذه الطريقة مدرجة في جدول المواد.

1. الحيوانات التجريبية

1. احصل على 10 ذكور من فئران سبراج-داولي (عمرها من 2 إلى 3 أشهر). بمجرد وصول الفئران إلى منشأة الحيوانات، يجب أن توضع في مجموعة ضمن دورة ضوء/ظلام لمدة 12 ساعة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء. عند الوصول، يتم تأقلم الفئران لمدة 3 أيام قبل الاستخدام.
2. قم بتعيين الفئران عشوائيا إلى مجموعات المركبات أو المعالجات ب LPS (n = 5 فئران لكل مجموعة).
   ملاحظة: نظرا لقلة عدد الفئران المستخدمة، يمكن استخدام استراتيجية عشوائية بسيطة، مع أرقام عشوائية مولدة بالحاسوب لتعيين الفئران إلى مجموعة علاج.
3. راقب الفئران بعد العلاج من "سلوك المرض": فقدان الوزن (>15٪)، إفراز البورفيرين، اضطرابات في الجهاز التنفسي، أو انخفاض النشاط.
   ملاحظة: غالبا ما تظهر أعراض سلوك المرض خلال أول 12 ساعة بعد الاستخدام، لذا قم بحقن الجرذان في الصباح الباكر (6-8 صباحا)، وراقب السلوك طوال اليوم، وأعد الفئران إلى المنشأة في وقت متأخر من اليوم (5-7 مساء).

2. نموذج التهاب الأعصاب

1. تحضير محلول LPS (O111:B4) (10 ملغ/مل) عن طريق إذابة 50 ملغ في الثانوية في محلول ملحي مخزن بفوسفات بحجم 5 مل.
   ملاحظة: LPS هو سم داخلي. يجب على الباحثين اتباع قواعد التشغيلات القياسية لمؤسستهم للتعامل مع المؤسسة والتخلص منها.
2. وزن الفئران ثم حقنه داخل الصفاق بمحلول LPS (10 ملغ/كغ) أو PBS (المركبة).
3. استنادا إلى وزن الفئران، من المتوقع أن يكون حجم الحقن بين 150–300 ميكرولتر.
4. قتل الفئران بعد 24 ساعة من الحقن بالتروية القلبية ثم قطع الرأس.
5. قم بتخدير الفئران باستخدام الإيزوفلوران المستنشق (5٪ في الأكسجين₂) لمدة 5–10 دقائق. أكد التخدير بغياب رد فعل الانسحاب عن الدواسة.
6. أثناء التخدير، قم بإنشاء شق صدر في منتصف الخط لكشف الحجاب الحاجز وعظمة القص. ثبت عملية الزايفوئيد باستخدام الهيموستاتات لكشف التجويف الصدري.
7. اقطع الحجاب الحاجز والقفص الصدري باتجاه الأطراف الأمامية لكشف القلب.
8. قم بتثبيت الشريان الأبهر النازل والوريد الأجوف السفلي باستخدام الهيموستاتات. أدخل إبرة مجنحة بقياس 25 في البطين الأيسر.
9. استخدم الفئران المثقبة بمضخة بيرستالية باردة جدا (25 مل عند 30 مل/دقيقة) باستخدام مضخة بريستالتيك. قم بشق الأذين الأيسر خلال عدة ثوان من بدء التروية للسماح بتصريف البرفوزات.
10. فئران بيرفيوز تحتوي على 4٪ بارافورمالديهايد (25 مل عند 30 مل/دقيقة).
    تحذير: التعامل مع بارافورمالديهايد باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة في بيئة جيدة التهوية. التخلص من نفايات بارافورمالديهايد وفقا للوائح المؤسسية والمحلية.
11. قطع رؤوس الفئران بالمقصلة بعد التروية.
    ملاحظة: اتبع إرشادات مؤسستك بشأن تسجيل قطع الرؤوس وشحذ الشفرات.
12. كشف الجمجمة عن طريق سحب فروة الرأس نحو البونا.
13. اكسر العظم الجبهي باستخدام المستوطنات الدموية أو الرونجرز التي تدخل في تجاويف الحجاج.
14. أدخل الملقط في الثقبة الكبرى وقشر عظام الجدارية.
15. أزل الدماغ باستخدام ملاقط دقيقة وحضن الدماغ طوال الليل في 4٪ بارافورمالديهايد.
16. نقل الأدمغة بشكل متسلسل إلى 20٪ سكروز و30٪ سكروز خلال ليلة وضحاها للحماية بالتبريد.

3. التألق المناعي

1. تجميد الأدمغة المحمية بالتجميد في مركب O.C.T. على الثلج الجاف.
2. يتم قطع الأدمغة عند 30 ميكرومتر باستخدام جهاز تجميد (كريوستاتات).
3. اجمع المقاطع في PBS وانقلها إلى آبار شبكية تدرج في صفيحة مكونة من 12 بئرا.
4. اختر على الأقل قسمين لكل فأر يحتوي على الحصين الظهري الأمامي.
5. اغسل الأقسام في PBS لمدة 5 دقائق مرتين أثناء التأرجح.
6. اخترع الأجزاء بنسبة 0.3٪ من Triton X-100/PBS لمدة 45 دقيقة أثناء التأرجح.
   ملاحظة: استخدم محلول 3 مل لكل مرحلة غسيل أو حضانة ما لم يذكر خلاف ذلك.
7. اغسل الأقسام في PBS لمدة 5 دقائق مرتين.
8. قم بتخفيف محلول استرجاع المستضدات إلى 1x في PBS وإضافة 2 مل لكل بئر.
9. حضن الأقسام عند درجة حرارة 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة باستخدام حمام مائي.
10. اترك الأجزاء لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل التقدم.
11. اغسل الأقسام في PBS لمدة 5 دقائق مرتين.
12. قطع القطع في سيروم الحمار 10٪ / 0.05٪ ترايتون X-100/PBS لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز عند 75 دورة في الدقيقة.
13. اغسل الأقسام بسيروم الحمار بنسبة 1٪ / 0.05٪ ترايتون X-100/PBS لمدة 5 دقائق ثلاث مرات.
14. نقل الأقسام إلى صفيحة جديدة مكونة من 12 بئر بدون آبار شبكة تحتوي على 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولي لمضاد Iba1 المحضر في 1٪ مصل حمار / 0.05٪ ترايتون X-100/PBS.
15. جهز ضوابطات سلبية عن طريق حذف الجسم المضاد الأساسي من محلول الحضانة.
16. حضن جميع الأقسام طوال الليل عند 4°C على جهاز هزاز مداري
17. أعد الأقسام إلى آبار الشبكة.
18. اغسل الأقسام بسيروم الحمار بنسبة 1٪ / 0.05٪ ترايتون X-100/PBS لمدة 10 دقائق ثلاث مرات.
19. حضن أقسام بالأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب (تخفيف 1:1000) في سيروم الحمار بنسبة 1٪ و0.05٪ ترايتون X-100/PBS لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: قلل من التعرض للضوء أثناء جميع الإجراءات التالية ولف الألواح بورق الألمنيوم لمنع تحلل الفلوروفور.
20. اغسل الأقسام في PBS لمدة 5 دقائق مرتين.
21. ثبت الأجزاء على شرائح المجهر.
22. ينزلق بالهواء للتجفيف في الظلام لمدة >ساعتين.
23. أقسام الانزلاق الغطاء باستخدام مركبات قابلة للذوبان في الماء.
24. جهز شرائح التحكم السلبي باستخدام وسط تركيب.
25. خزن الشرائح في صندوق شرائح بدرجة حرارة الغرفة وفي بيئة مظلمة.

4. التصوير

1. تحديد حجم بكسل نظام التصوير بتكبير 40x. إذا لم يتم العثور على المقياس، أضف شريط مقياس لكل صورة.
2. استخدم صبغة DAPI لتحديد نطاق كثيف من نوى القشرة عند تكبير منخفض يتوافق مع الطبقة القشرية IV.
3. ركز الصورة على المنطقة القشرية المحددة.
4. انتقل إلى التكبير 40x .
5. قم بضبط إعدادات تعريض القناة لتعظيم فصل إشارة DAPI وIba1 عن الفلورة الخلفية.
6. احصل على صور مكدس Z (> 30 خطوة) تمتد عبر عمق الميكروغليا بالكامل.
7. توليد وحفظ صورة إسقاط مركبة بأقصى شدة من مكدس Z المكتسب لكلا الصبغتين.
   ملاحظة: قم بتحسين إعدادات التعريض وتركيب Z-stack لكل صورة لتعظيم فصل الإشارة بين DAPI/Iba1 والفلورة الخلفية. يقلل الفصل الضعيف للإشارة من دقة توليد الأقنعة.

5. برنامج رسم المعلمات الدقيقة (MMPS)

1. تخزين جميع الصور المركبة في مجلد صور واحد.
2. أنشئ مجلد إخراج منفصل للنتائج التي تولدها MMPS.
3. قم بتحميل حزمة MMPS المستقلة أو سكريبت MMPS.py من مستودع GitHub.
4. قم بتثبيت جميع التبعيات المذكورة في ملف requirements.txt إذا كنت تشغل MMPS عبر MMPS.py.
5. افتح حزمة MMPS أو شغل MMPS.py السكريبت.
6. اختر "تحديد مجلد الصورة" واختر مجلد الصور.
7. اختر "اختيار مجلد الإخراج" واختر مجلد الإخراج.
8. امنح صلاحيات الوصول إلى المجلدات إذا طلب النظام ذلك من قبل نظام التشغيل.
   ملاحظة: تعليمات تثبيت إضافية، إرشادات استكشاف الأخطاء، وأمثلة الاستخدام متوفرة في الوثائق الإضافية ومستودع GitHub.
9. اختر "وضع علامات الصور" وخصص معرفات الحيوانات ومجموعات العلاج لكل صورة.
   ملاحظة: إذا تم تخطي وضع علامات الصور، يصدر MMPS طلبات لمعرفات مجموعة العلاج والحيوانات قبل تصدير البيانات.
10. أدخل حجم البكسل تحت تبويب "المعلمات".
11. اختر "معايرة من شريط المقياس" إذا كان حجم البكسل غير معروف. اختر نقطة البداية والنهاية في شريط السلم عند طلب ذلك. ادخل المسافة المعروفة لشريط المقياس بالميكرومتر.
12. اختر قناة الفلورة التي تحتوي على إشارة الميكروبرال.
13. اختر الصور للمعالجة بتحديد المربع بجانب اسم كل صورة. يعالج الصور بشكل فردي عندما يختلف الفلورة في الخلفية بشكل كبير بين الصور.
14. راجع علامات تبويب "الأصلي"، "المعاينة"، "معالجة"، و"الأقنعة" لمقارنة مراحل معالجة الصور.
15. اختر "معاينة الصورة الحالية" لتقييم إعدادات معالجة الصور.
16. قم بضبط إعدادات طرح الخلفية الكروية المتدحرجة، وإزالة التحذير، وتحسين الإعدادات حسب الحاجة.
17. استخدم قيم كرة التدحرج بين 5–150 بكسل للطرح في الخلفية.
18. استخدم قيم إزالة الضوضاء بين 3–7 بكسل لتقليل تشوهات الإضاءة غير المتساوية.
19. استخدم قيم الحدة بين 1–2 لتحسين تعريف الحواف.
20. اختر "معالجة الصور المختارة" بعد تحسين إعدادات معالجة الصور.
    ملاحظة: يختلف وقت معالجة الصورة حسب رقم الصورة والمعلمات المختارة.
21. اختر "اختر سوماس (جميع الصور)."
22. اختر "عرض اللون (C)" لعرض صور RGB المركبة. اختر "القنوات..." وإلغاء تحديد القنوات غير المستخدمة إذا بدا تلوين الصورة مشوها.
23. اختر سوما ميكروليالية تعرض التداخل المشترك بين DAPI وIba1. تجنب اختيار خلايا تلامس حدود الصورة. قم بإزالة علامات soma المختارة بشكل خاطئ باستخدام مفتاح "Backspace" أو "Delete".
24. اضغط على "إدخال" أو "إرجاع" للانتقال إلى الصورة التالية.
25. اختر "مخطط سوماس (كل)" بعد الانتهاء من اختيار السوما.
26. حدد محيط السوما لكل خلية دبقية دقيقة مختارة. استبعد العمليات الخلوية من مخطط السوما واستخدم على الأقل ثماني نقاط مخطط لكل سوما. قم بإزالة نقاط المخطط الموضوعة بشكل خاطئ باستخدام "التراجع عن النقطة الأخيرة" أو "حذف" أو "الفراغ الخلفي".
27. الصحافة "إدخال"، "إرجاع"، نقرة مزدوجة، أو نقرة بزر الفأرة الأيمن لإنهاء كل مخطط سوما.
28. اختر "إعادة رسم المخطط الأخير" لتكرار مخطط سوما السابق إذا لزم الأمر.
29. اختر "توليد جميع الأقنعة" بعد الانتهاء من مخطط السوما.
30. تطبيق قيمة عتبة دنيا لتقييد دمج بكسل الخلفية منخفضة الشدة في الأقنعة.
    ملاحظة: القيم الأعلى تحافظ على دقة السوما على حساب التفرع، بينما القيم المنخفضة تحافظ على دقة التفرع على حساب السوما. توفر قيم العتبة بين 10–30٪ عادة قمع متوازن للخلفية والحفاظ على الفروع.
    ملاحظة: يختلف وقت توليد القناع حسب عدد الخلايا المختارة.
31. اختر "ضمان الجودة لجميع الأقنعة" لبدء ضمان جودة الكمامات.
32. مراجعة الأقنعة المقدمة من أكبر (800 ميكرومتر²) إلى أصغر (200 ميكرومتر²).
33. قارن كل قناع مع الميكروغليا المقابلة باستخدام تبويتي "معالج" و"قناع".
34. قبول الأقنعة باستخدام اختصار لوحة المفاتيح "A". رفض الأقنعة باستخدام اختصار لوحة المفاتيح "R". اضغط على "B" لإلغاء القبول أو الرفض. تنقل بين أحجام الأقنعة باستخدام مفاتيح الأسهم على لوحة المفاتيح.
35. اختر أكبر قناع مقبول يلتقط تفرعات الخلايا الدبقية الدقيقة بدقة دون تضمين الخلايا المجاورة، أو الخلفية الزائدة، أو حدود الصورة، أو أشرطة المقياس.
    ملاحظة: ارفض الأقنعة إذا كان هناك شك في دقتها.
    ملاحظة: اختر "إزالة جميع الأقنعة"، ثم أعد توليد الأقنعة بقيمة عتبة مختلفة إذا كانت معظمها غير دقيقة.
36. اختر "حساب الخصائص البسيطة" بعد اكتمال ضمان جودة الكمامة إلى
    احسب متوسط مسافة مركز الوسط، مساحة القناع، محيطه، الشذوذ، الاستدارة، وحجم السوما باستخدام الأقنعة المقبولة وخطوط SOMA.
37. راجع الجدول 1 لتعريف المعلمات واتجاهات الدبقية الصغيرة في التهاب الأعصاب.
38. تحميل "Sholl.py"، "FractalAnalysis_ImageJ.py"، و"SkeletonAnalysisImageJ.py" لإجراء تحليلات إضافية.
39. افتح "FractalAnalysis_ImageJ.py" كإضافة فيجي لتحليل الكسور والهيكل.
40. أدخل موقع دليل الإخراج وحجم البكسل عند الطلب. اختر خيار "أكبر قناع فقط" إذا كان من المرغوب فيه تحليل أكبر قناع مقبول فقط.
41. افتح "Sholl.py" كإضافة فيجي لتحليل شول.
42. أدخل موقع دليل الإخراج وحجم البكسل عند الطلب.
43. هنا يأتي حجم خطوة تحليل شول المطلوب. اختر "استخدم نصف قطر السوما كنصف قطر بداية" لاستخدام نصف قطر السوما المشتق من MMPS كنصف قطر بداية لتحليل شول. أدخل قيمة نصف قطر سومة ثابتة إذا لم تستخدم أنصاف قطر السومات المشتقة من MMPS.
44. افتح "SkeletonAnalysisImageJ.py" كإضافة فيجي لتحليل الهياكل العظمية.
45. أدخل موقع دليل الإخراج، حجم البكسلات، وموقع مجلد الأقنعة عند الطلب.
46. تصدير جميع النتائج التي يتم إنشاؤها بواسطة الإضافات كملفات CSV إلى مجلد الإخراج عند الانتهاء.

6. الصيغ المستخدمة في MMPS لحسابات شكل الخلايا الدبقية الدقيقة

ملاحظة: تجرى جميع الحسابات تلقائيا بواسطة MMPS عند الضغط على "حساب الخصائص البسيطة". يتم عرض حسابات المعلمات أدناه.

1. المحيط
   1. احسب المحيط باستخدام المعادلة التالية:
      
   2. عرف كمحيط، كعدد بكسلات الحواف، وحجم البكسل بالميكرومتر.
2. متوسط مسافة مركز الوسط
   ملاحظة: يشار إلى متوسط مسافة مركز الوسط أيضا باسم انتشار الخلايا¹¹.
   1. حدد أربعة نقاط نهاية فرعية بناء على إحداثيات الخلية:
      الفرع الأعلى: الحد الأدنى لإحداثيات y،
      الفرع السفلي: أقصى إحداثي y،
      الفرع الأيسر: إحداثي x الأدنى,
      الفرع الأيمن: أقصى إحداثي x.
   2. احسب إحداثيات المركز باستخدام المعادلات التالية:
      
      
   3. عرف c_x و _{c y} كإحداثيات مركزية، وx_i و y_i كإحداثيات بكسل، وكإجمالي عدد البكسلات.
   4. احسب مسافة التفرع باستخدام المعادلة التالية:
      
   5. عرف d كمسافة فرع، وx_i و y_i كإحداثيات الطرف الفرعي، وc_x و _{c y} كإحداثيات مركزية.
   6. احسب متوسط مسافة مركز الوسط باستخدام المعادلة التالية:
      
   7. نعرف كمتوسط مسافة المركز المركزي، كمسافة الفرع، d_i وحجم البكسل بالميكرومتر.
3. منطقة القناع
   1. احسب مساحة القناع باستخدام المعادلة التالية:
      
   2. نعرف مساحة القناع بμm²، كعدد البكسلات داخل القناع، وحجم البكسل بالميكرومتر.
4. الغرابة
   1. احسب العزوم المركزية الثانية باستخدام المعادلات التالية:
      
      
      
   2. عرف μ₂₀، μ₀₂، و μ₁₁ كعزمان مركزية ثانية، x i و y_i كإحداثيات بكسل، c_x و c_y كإحداثيات مركزية، وN كإجمالي عدد البكسلات.
   3. احسب قيم الذاتية لمصفوفات التغاير باستخدام المعادلة التالية:
      
   4. عرف λ₁ ≥ λ₂.
   5. احسب أطوال المحاور الرئيسية والصغرى باستخدام المعادلات التالية:
      
   6. عرف a كطول المحور الرئيسي وb كطول المحور الصغير.
   7. احسب الشذوذ باستخدام المعادلة التالية:
      
   8. عرف على أنه غريب الأطوار.
5. الاندارة
   1. احسب الاستدارة باستخدام المعادلة التالية:
      
   2. عرف كأنها استدارة، كطول للمحور الرئيسي، وطول المحور الصغير.
6. حجم سوما
   1. احسب مساحة السوما باستخدام المعادلة التالية:
      
   2. عرف Sa كمساحة سوما بμm²، كعدد البكسلات داخل قناع السوما، وS كحجم بكسل بالميكرومتر.

7. التحليل الإحصائي

1. قم بإجراء جميع التحليلات الإحصائية باستخدام الإصدار 4.3.2 من R.
2. تصفية مجموعات البيانات باستخدام أكبر قناع مقبول لكل خلية.
3. متوسط المعاملات الخلوية على مستوى الحيوان قبل التحليل الإحصائي.
4. تقييم الطبيعية والتباين باستخدام اختبارات شابيرو-ويلك وليفين.
5. قم بإجراء اختبارات t للطالب أو تحليل التنوع المعاد المتكرر مع اختبارات t المزدوجة المصححة بعد هولم عندما تحقق مجموعات البيانات افتراضات بارامترية.
6. إجراء اختبارات مجموع الرتبة أو فريدمان مع اختبارات ويلكوكسون المرتبة الموقعة المزدوجة المصححة بهولم عندما لا تحقق مجموعات البيانات الافتراضات البراميترية.
7. عرف الدلالة الإحصائية ك p < 0.05 .

النتائج

تم تطوير منصة مستقلة ومفتوحة المصدر لتحليل مورفولوجيا الميكرودبقية الدقيقة، تسمى برنامج تعيين معلمات الميكرودبقية (MMPS)، لتوفير سير عمل موحد وسهل الوصول لتحليل مورفولوجيا ميكروغليالا القائم على IF. تعتمد المنصة على منهجيات تحليل الشكل السابقة، ولا تتطلب خبرة في البرمجة، وتتضمن واجهة مستخدم رسومية سهلة الوصول. تم تصميم MMPS لتحسين اكتشاف التفرعات الدقيقة للدبقية مع دمج عدة ضمانات لتقليل المبالغة في تقدير الأقنعة الدبقية الدقيقة.

تم التحقق من صحة MMPS باستخدام نموذج التهاب عصبي للقوارض المستحث بواسطة LPS. بعد معالجة الأنسجة والتقاط الصور (الشكل 1)، تم تأكيد خصوصية الصيام المتقطع باستخدام مقاطع تحكم سالبة تفتقر إلى صبغة الأجسام المضادة الأولية (الشكل التكميلي 1). تبدأ معالجة MMPS باستيراد صور IF إلى واجهة البرمجيات (الشكل 2A). يوفر البرنامج خيارات معالجة الصور متعددة لتحسين اكتشاف إشارات الميكروبرال وفصل الخلفية. يتم إجراء الطرح الإلزامي للخلفية باستخدام خوارزمية الكرة المتدحرجة المطبقة في حزمة صورة Scikit، بينما تتوفر مرشحات إزالة الضوضاء وزيادة الحدة الاختيارية عبر التصفية الغاوسية المعتمدة على SciPy. بعد معالجة الصور، يتم اختيار السوما الدقيقة دبقيا يدويا وتحديدها بواسطة علامات اختيار حمراء (الشكل 2B). يتم تحديد حدود السوما يدويا لاحقا للحسابات المورفولوجية في الأسفل (الشكل 2C).

الشكل 1: نظرة عامة بيانية على نموذج ومعالجة التهاب الأعصاب. تم حقن الفئران بحقن LPS أو PBS وجمعت 24 ساعة مع تروية القلب تلتها قطع الرأس. تم استخراج الأدمغة وتقطيعها إلى أقسام بحجم 30 ميكرومتر لاستخدامها في الصيام الصافي لمؤشر الدبقية Iba1، والتي تم معالجتها بعد ذلك باستخدام MMPS. تم إنشاؤه باستخدام Biorender. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: نظرة عامة على استخدام MMPS. (أ) مثال على صورة للدبقية الدبقية القشرية (حمراء، Iba1) مع نوى خلية (زرقاء، DAPI) يجب الرجوع إليها في MMPS (شريط المقياس = 75 ميكرومتر، 40x). بعد معالجة الصورة باستخدام MMPS، يتم تقليل الخلفية وتقييم الأشكال الدقيقة (B) بعد معالجة الصورة في MMPS، يتم اختيار السومات يدويا مع دائرة حمراء لاستخدامها في الخطوات التالية المفصلة في الطرق (شريط المقياس = 75 ميكرومتر، 40x). (ج) تم رسم خطيطين يدويين لدبقية صغيرة ممثلة، والصور المحفوظة لمخطط السوما موضحة أدناه. (د) توليد الأقنعة لخلايا مختارة يتتبع تلقائيا فروع الميكروغليالي حتى 800 ميكرومتر^مربع، لكنه يتطلب ضمان جودة يدوي. هنا نعرض قناع 800 ميكرومتر² غير الدقيق يليه القناع الأكثر دقة 700 ميكرومتر² . يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

بعد تحديد مخططات SOMA، يقوم MMPS بتوليد أقنعة بشكل تكراري عبر نطاق حجم يتراوح بين 200–800 ميكرومتر^مربع باستخدام عتبات تكيفية مقيدة بعتبات دنيا للشدة المحددة من قبل المستخدم. تتبع الأقنعة الأصغر العتبة التي يحددها المستخدم بشكل أوثق، بينما تخفف الأقنعة الأكبر تدريجيا قيود العتبة لتعظيم دمج الفروع. تخضع الأقنعة المولدة لمراجعة يدوية لضمان الجودة لمنع إدراج الخلايا المجاورة، أو الدمج المفرط في الخلفية، أو القطع بواسطة حدود الصورة أو أشرطة المقياس. كما هو موضح في الشكل 2D، امتد القناع⁸⁰⁰ ميكرومتر 2 لخلية ميكروليالية ممثلة إلى خلية مجاورة. رفض قناع 800 ميكرومتر² واختيار قناع 700 ميكرومتر² صحح خطأ التقسيم مع الحفاظ على تحديد دقيق للميكروغليا المستهدفة.

بعد معالجة MMPS، تم تقييم تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة باستخدام أكبر قناع مقبول لكل خلية، حيث التقطت هذه الأقنعة التفرعات البعيدة بدقة أكبر مع تقليل دمج الخلفية. يتم تلخيص المعاملات الشكلية المحسوبة في الجدول 1 وممثلة في الشكل 3. أدى إعطاء LPS إلى تقليل متوسط مسافة مركز المركز ومحيط الخلية بشكل ملحوظ مقارنة بعناصر التحكم المعالجة بالمركبات (p < 0.05؛ الشكل 3A,B)، يتوافق مع انحسار العمليات الصغيرة الدبقية أثناء التفعيل. لم تلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في مساحة القناع أو استدارتها أو الشذوذ بين مجموعات العلاج (الشكل 3C–E)، رغم أن التقارير السابقة ربطت هذه المعايير بالأنماط الظاهرية الدقيقة الدبقية المنشطة ^3,23. لم تكن الدراسة الحالية قادرة إحصائيا على اكتشاف الفروق الدقيقة في شكل السوما أو مساحة القناع، ويمكن للمجموعات الفرعية الميكروبرالية أن تتبنى أشكال التهابية غير متجانسة لا تتبع هذه الاتجاهات بشكل موحد³. على النقيض من ذلك، زادت مساحة السوما بشكل ملحوظ في الحيوانات المعالجة ب LPS مقارنة بالمركبات الضابطة (p < 0.01؛ الشكل 3F)، مما يدعم بشكل أكبر إعادة تشكيل المورفولوجيا المرتبطة بالتفعيل²².

الشكل 3: مقارنة بين المعلمات المورفولوجية للميكروغليا. في جميع اللجان، أجريت اختبارات للطبيعية (شابيرو-ويلك وليفين) حيث تم العثور على قيم غير ذات دلالة في جميع الحالات (ص>0.05)، مما أدى إلى استخدام اختبارات t للطلاب. تمثل النقاط حيوانات فردية (n=5 لكل معالجة) (A) كان متوسط مسافة مركز الوسط أكبر بشكل ملحوظ في مجموعة المركبات مقارنة بمجموعة معالجة LPS. (ب) كان محيط الخلايا الدقيقة الدبقية أكبر بشكل ملحوظ في مجموعة المركبات مقارنة بمجموعة علاج LPS. (ج) لم يكن هناك فرق ذي دلالة إحصائية في منطقة الكمامات بين مجموعات العلاج. (د) لم يكن هناك فرق كبير في الشرابة المركزية بين المجموعات. (ه) لا يوجد فرق كبير في استدارة السوما بين مجموعات العلاج. (و) كان هناك زيادة كبيرة في مساحة السوما في مجموعة LPS * p<0.05، ** p<0.01، *** p<0.001. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المعلمة	التعريف	العلاقة بتنشيط الخلايا الدبقية
متوسط مسافة مركز المركز	متوسط المسافة لأبعد فرع في المواقع العلوية، اليمنى، السفلية، واليسرى	الانخفاض
المحيط	قياس محيط الخلية	الانخفاض
منطقة القناع	المنطقة الفعلية للخلية، وليس منطقة القناع المستهدف	الانخفاض
الغرابة	قياس التقريبي لطول السوما الخلوي (0: دائري، 1: شديد الطول)	الانخفاض
الاندارة	قياس الدائرية التقريبية لسوما الخلية (0: ممدودة، 1: دائرية)	الزيادات
حجم سوما	مساحة السوما الخلية	الزيادات

الجدول 1: المعاملات المحسوبة من MMPS والتغير المتوقع في الاستجابة لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. يلخص الجدول المعلمات الشكلية التي تم حسابها بواسطة برنامج Mapping Microglial Parameters Software (MMPS)، بما في ذلك المحيط، متوسط مسافة مركز الوسط، مساحة القناع، الشذوذ، الاستدارة، ومساحة السوما.

تم تقييم قابلية تكرار المستخدمين لاحقا من خلال توفير نفس مجموعة الصور للمستخدمين المكفيين وغير المدربين سابقا للتحليل المستقل (الشكل التكميلي 2). لم يتم اكتشاف فروق ذات دلالة إحصائية بين المستخدمين، وقام جميع المستخدمين بإعادة إنتاج اتجاهات شكلية تتوافق مع تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة في الحيوانات المعالجة ب LPS.

كما يدعم MMPS التحليلات الموركولوجية المتقدمة في المرحلة اللاحقة. أظهر التحليل الارتباطي للمعاملات الناتجة من الشكل 3 علاقات بين السمات الشكلية المميزة. أظهرت الفئران المعالجة بالمركبات ارتباطا ضعيفا فقط بين استدارة الدبقية الصغيرة والمحيط (R² = 0.17)، بينما أظهرت الفئران المعالجة ب LPS ارتباطا أقوى (R² = 0.64)، مما يشير إلى أن زيادة تنشيط الخلايا الدبقية كانت مرتبطة بانخفاض متزامن في الاستدارة والمحيط (الشكل 4A). بالإضافة إلى ذلك، أظهرت منطقة القناع ارتباطات إيجابية قوية مع متوسط مسافة مركز الأرويدات في كل من المركبات والمجموعات المعالجة ب LPS (R² = 0.71 و0.88 على التوالي)، مما يتوافق مع التغيرات في تعقيد التفرع المرتبط بحالة تنشيط الخلايا الدبقية (الشكل 4B).

الشكل 4: تحليل متقدم لمعلمات الميكروبراليا. جميع الألواح هي خطوط على مستوى الحيوان لأفضل ملاءمة، يتم حسابها باستخدام طريقة المربعات الصغرى العادية، وتعرض بمعامل تحديدها (R²) وتظليل بفاصل ثقة 95٪. (أ) استدارة السوما الدقيقة الدبقية واتجاه طول المحيط الكلي في الميكرودبقيا تشكل مجموعة المركبات (R² = 0.17) ولكن هناك ارتباط أقوى بعد التعرض لل LPS (R² = 0.64). (ب) ترتبط المسافة المتوسطة للمركز المركزي بمساحة الميكروغليا في مجموعتي المركبة (R² = 0.71) وLPS (R² = 0.88). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل الإضافي 1: التحقق من بروتوكول الصيام المتقطع من خلال السيطرة السلبية. شريحة دماغية واحدة من نفس المنطقة لكل فأر خضعت لبروتوكول IF دون إضافة أجسام مضادة أولية لتأكيد نقص التألق الذاتي (شريط المقياس = 75 ميكرومتر) (A) صورة تمثيلية للأنسجة المصبوغة بالمركبات ل DAPI (أزرق). (ب) صورة تمثيلية للأنسجة الملطخة بمركبة ل Iba1 (أحمر). (ج) صورة تمثيلية للأنسجة الملطخة بالمركبات ل DAPI (الأزرق) وIba1 (الأحمر). (د) صورة تمثيلية للأنسجة المصبوغة ب LPS ل DAPI (أزرق). (ه) صورة تمثيلية للنسيج المصبوغ ب LPS ل Iba1 (أحمر). (و) صورة تمثيلية للأنسجة المصبوغة ب LPS ل DAPI (أزرق) و Iba1 (أحمر). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الشكل الإضافي 2: تقييم التنوع بين المستخدمين في MMPS. استخدم عدة مستخدمين مكفوفين اختبار MMPS على نفس العينات من الشكل 3 وتمت مقارنة النتائج على مستوى الحيوان. بالنسبة للجميع، كانت اختبارات الطبيعية (شابيرو-ويلك وليفين) غير ذات دلالة (ص>0.05)، مما أدى إلى استخدام تحليل أنفي بمتوسط متكرر مع اختبار t المزدوج المصحح بعد هولم (p>0.05). (أ) لم يكن هناك فرق ذي دلالة إحصائية في كل مجموعة بين المستخدمين لمتوسط مسافة مركز الوسط (p>0.05). (ب) لم يكن هناك فرق ذي دلالة إحصائية في كل مجموعة بين المستخدمين للمحيط (p>0.05). (ج) لم يكن هناك فرق ذي دلالة إحصائية في كل مجموعة بين المستخدمين من حيث منطقة الكمامة (p>0.05). (د) لم يكن هناك فرق ذي دلالة إحصائية في كل مجموعة بين المستخدمين من حيث الشذوذ المركزي (ص>0.05). (ه) لم يكن هناك فرق ذي دلالة إحصائية في كل مجموعة بين المستخدمين من حيث الاستدارة (ص>0.05). (و) لم يكن هناك فرق ذي دلالة إحصائية في كل مجموعة بين المستخدمين لمنطقة السوما (ص>0.05). يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

الهدف الأساسي من هذه المنهجية هو توسيع إمكانية الوصول إلى تحليل مورفولوجيا الميكرودبقية من خلال تقليل الحواجز التقنية الشائعة مع الحفاظ على نقاط قوة أساليب التقييم الشكلية المعتمدة. يتيح MMPS اكتشاف التغيرات الشكلية الدبقية الدقيقة مع الحفاظ على التوافق مع التحليلات المتقدمة، بما في ذلك تحليلات الكسير، والهيكل العظمي، والهيكل، والشول. مقارنة بالأساليب المنشورة سابقا، يوفر MMPS واجهة مستخدم رسومية سهلة الوصول، وحسابات متكاملة للمعاملات الشكلية المستخدمة بشكل شائع، وإلغاء متطلبات الترميز مع الحفاظ على التوافق مع التحليلات المتقدمة في مرحلة ما بعد التيار المستمر.

تؤثر عدة خطوات منهجية حاسمة بشكل كبير على دقة التحليل وقابلية التكرار. يعد التصوير عالي الجودة بالفلورية المناعية (IF) ضروريا لتوليد الأقنعة وحسابات مورفولوجيا موثوقة. تمثل خصوصية الأجسام المضادة عاملا رئيسيا في جودة الصورة، حيث يزيد التسميم غير المحدد من التألق الخلفي ويقلل من فصل الإشارات بين الخلايا الدبقية الصغيرة والأنسجة المحيطة. وبالمثل، يمكن أن تقلل تركيزات الأجسام المضادة دون المستوى المثالي من شدة الفلورية وتقلل من دقة الصورة. كما أن الحصول على صور مكدس Z أمر بالغ الأهمية، حيث يمكن أن يؤدي حذف تصوير Z-stack إلى تغيير مصطنع تعقيد التفرع الدقيق الدبقي الظاهر وانتشار العملية، مما يؤدي إلى تحيز الحسابات الشكلية الشكلية.

هناك عدة اعتبارات إضافية مهمة أثناء معالجة MMPS. على الرغم من أن MMPS يدعم معالجة الصور دفعات، إلا أن تحسين الصور الفردية غالبا ما يكون مفضلا لأن خصائص الخلفية وجودة التلوين قد تختلف بشكل كبير بين الصور. جودة الصورة تؤثر مباشرة على دقة إنشاء القناع؛ لذلك، فإن التحسين أثناء المعالجة المسبقة للصور يحسن بشكل كبير من قابلية تكرار الصور ومتانة التحليلات اللاحقة. كما أن الاختيار الدقيق للسوما الدبقية مهم أيضا، خاصة تجنب تلامس الخلايا مع حدود الصورة، حيث يمكن للاختيار الجزئي للخلايا أن يقلل بشكل مصطنع من قياسات السوما ويشوه تكوين الأقنعة. خلال مراجعة ضمان جودة الأقنعة، يجب رفض الكمامات التي تتضمن خلايا مجاورة، أو حدود خلفية مفرطة، أو حدود صورة. وعلى العكس، لا ينبغي رفض الأقنعة الصغيرة فقط لأنها تفشل في التقاط جميع العمليات البعيدة، حيث تقوم خوارزمية توليد الأقنعة التكرارية بتعديل معلمات العتبة المحلية حسب حجم القناع وشدة البكسل الإقليمية.

هذه المنهجية قابلة للتكيف للغاية ويمكن تعديلها لتلبية متطلبات تجريبية محددة. نظرا لأن MMPS مفتوح المصدر، يمكن توسيع المنصة لتحليل إطارات Z-stack الفردية أو دمج خوارزميات كشف الخلايا المؤتمتة لإنشاء خط أنابيب تحليل مورفولوجي آلي بالكامل. بالإضافة إلى ذلك، تظل الأقنعة المولدة ومخططات سوما متوافقة مع سير العمل المعتمد على ImageJ لتحليلات الكسور والهيكل والهيكل العظمي والشول. نظرا لأن MMPS تم تطويره في بايثون 3.11، يمكن أيضا دمج تحليلات إضافية مباشرة في البرنامج باستخدام حزم بايثون العلمية المتوفرة بشكل شائع دون الحاجة إلى منصات برمجية خارجية.

على الرغم من هذه المزايا، يجب النظر في عدة قيود. تم التحقق من صحة MMPS باستخدام نموذج التهاب عصبي في منطقة دماغية محددة من ذكور فئران سبراج-داولي، وقد تؤثر مناطق دماغية مختلفة، ونماذج مرضية، وأنواع مختلفة، أو جنس بيولوجي قد تؤثر على النتائج الشكلية المختلفة. لذا يجب التحقق من تطبيق MMPS على النماذج التجريبية البديلة من خلال دراسات تجريبية أو دعمها من خلال مقارنات الأدبيات السابقة. بالإضافة إلى ذلك، يلتقط التصوير القائم على IF بشكل غير كامل هياكل التفرع ثلاثية الأبعاد لأن العمليات التي تمتد مباشرة فوق أو تحت المستوى البؤري قد لا تكتشف في صور الإسقاط العظيمى. زيادة عدد الخلايا المحللة قد تساعد في التخفيف من هذا القيد. كما يظل MMPS يعتمد على جودة التقاط الصور، وبالتالي يتطلب تحسينا لأنظمة التصوير الفردية، وبروتوكولات التلوين، وتحضيرات الأجسام المضادة. يمكن للصور منخفضة الدقة أن تضخم حجم القناع بشكل مصطنع بسبب الحدود الضبابية المحيطة بالسوما والفروع المتكددة بإحكام. لهذا السبب، يتضمن البروتوكول الحالي طرق IF العائمة بحرية وخيارات متعددة لمعالجة الصور لتعظيم جودة الصورة.

كما يحتفظ MMPS ببعض الإمكانيات للتغير المعتمد على المستخدم لأن المستخدمين يختارون الخلايا يدويا ويرسمون السومات المحيطية. ومع ذلك، يقلل استخدام DAPI والتجمع المشترك ل Iba1 بشكل كبير الغموض أثناء اختيار الخلية. علاوة على ذلك، أظهر التحليل الأعمى بين المستخدمين تباين طفيف بين المستخدمين غير المدربين سابقا، مما يدعم قابلية تكرار سير العمل التحليلي.

على عكس عدة منصات مورفولوجيا ميكروليالية منشورة سابقا، فإن MMPS ليس مؤتمتة بالكامل. ومع ذلك، تم اختيار هذا التصميم لإعطاء الأولوية لدقة التقسيم وضمان جودة الكمامات. يمكن دمج سير العمل الآلي من خلال تعديل شفرة مصدر بايثون لتمكين الكشف التلقائي عن التداخل مع DAPI/Iba1، ورسم مخططات SOMA المعتمدة على الكونتور، وقبول أو رفض الأقنعة المعتمدة على التعلم الآلي. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب MMPS سعة تخزين كبيرة على الأقراص لأن الأقنعة المولدة ومخططات SOMA تحفظ تلقائيا كملفات .tiff للتحليلات اللاحقة وضمان الجودة. يمكن تقليل متطلبات التخزين من خلال تعديل البرنامج لتوليد الأقنعة بشكل متسلسل على أساس خلية تلو الأخرى، تليها تقييم جودة فوري واستخراج المعلمات.

في الختام، يوسع MMPS الوصول إلى التحليل الكمي لشكل الخلايا الدبقية من خلال توفير منصة موحدة مفتوحة المصدر لا تتطلب خبرة في البرمجة أو قدرات التصوير الحي . تسهل المنصة التحليل القابل للتكرار لشكل الخلايا الدبقية المعتمدة على الصيام الصوتي مع الحفاظ على التوافق مع الأساليب التحليلية المتقدمة في المراحل النهائية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
لوحة 12 بئر	Fisher Scientific	07-200-82	لوحة تستخدم للحضانة وغسل مقاطع الأنسجة.
رقائق الألمنيوم	Fisher Scientific	01-213-101	يستخدم لحماية العينات الفلورية من التعرض للضوء.
محلول استرجاع المستضد (10×)	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	يستخدم لتحسين قابلية الوصول إلى المستضد أثناء التلطيخ المناعي الفلوري.
الجسم المضاد الأساسي المضاد لـ Iba1	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	الجسم المضاد الأساسي المستخدم لتمييز الخلايا الدبقية الصغيرة بالتلطيخ المناعي الفلوري.
الكريوستات	Fisher Scientific	95-710-0L	الأداة المستخدمة لقطع أنسجة الدماغ المجمدة بسمكات محددة.
المصل المناعي للماعز ضد IgG الأرنب، Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	الجسم المضاد الثانوي الفلوري المستخدم لتصور الأجسام المضادة الأولية للأرانب.
مصل الماعز	Fisher Scientific	50-413-115	عامل حجب يستخدم لتقليل ارتباط الأجسام المضادة غير المحدد.
نظام التصوير EVOS FL Auto 2	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	مجهر فلوري يستخدم للحصول على الصور.
Fiji (ImageJ) 2.16.0	NIH	fiji.sc	منصة معالجة الصور المستخدمة لتحليلات المورفولوجي اللاحقة والمكونات الإضافية.
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	وسط التجميع المستخدم للحفاظ على الفلورية وتثبيت الشرائح الزجاجية.
Isoflurane	EntirelyPets Pharmacy	MWI502017	تخدير استنشاقي يستخدم أثناء الإجراءات على الحيوانات.
الليبوبوليساكاريد	Millipore Sigma	L2630	يستخدم لإحداث الالتهاب العصبي الجهازي وتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة في القوارض.
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		مكتبة رسم Python المستخدمة لتصور البيانات وإنشاء الرسوم البيانية.
MMPS (برنامج رسم حدود الخلايا الدبقية الصغيرة) الإصدار 1.00	This work	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	منصة برمجيات مفتوحة المصدر تم تطويرها لتحليل مورفولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة.
الثقوب الشبكية	Millipore Sigma	CLS3477	إدخالات تستخدم لتثبيت مقاطع الأنسجة العائمة بحرية أثناء إجراءات التلطيخ.
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		مكتبة Python المستخدمة في الحسابات العددية داخل MMPS.
العدسة الهدف (4×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	عدسة عالية التكبير تستخدم لتحديد الهوية الإقليمية والتوجيه التشريحي.
العدسة الهدف (40×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	عدسة عالية التكبير تستخدم لتصوير مورفولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة.
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		مكتبة رؤية الكمبيوتر المستخدمة لوظائف معالجة الصور داخل MMPS.
البارافورمالديهايد	ThermoFisher Scientific	169650025	مثبت يستخدم لتعقيم الأنسجة والحفظ قبل التقطيع.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	وسط تثبيت دائم يستخدم لحفظ الشرائح.
محلول فوسفات عازل	Fisher Scientific	BP3991	محلول عازل يستخدم لغسل الأنسجة وتحضير المواد الكيميائية.
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		مكتبة تصوير Python المستخدمة لعمليات معالجة الصور.
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		إطار عمل واجهة المستخدم الرسومية Python المستخدم لإنشاء واجهة المستخدم الرسومية لـ MMPS.
Python 3.11	Python Software Foundation	python.org	بيئة لغة البرمجة المستخدمة لتطوير وتشغيل MMPS.
R 4.3.2	R Foundation for Statistical Computing	r-project.org	البرنامج الإحصائي المستخدم لتحليل البيانات وإنشاء الرسوم البيانية.
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		مكتبة تحليل الصور Python المستخدمة لمعالجة الصور والفصل.
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		حزمة الحوسبة العلمية Python المستخدمة لعمليات الترشيح ومعالجة الصور.
الجرذان Sprague-Dawley	Evingo	002	الحيوانات التجريبية المستخدمة للتحقق من صحة نموذج الالتهاب العصبي.
السكروز	Fisher Scientific	S5-3	مادة حماية مضادة للتجمد تستخدم قبل تجميد أنسجة الدماغ.
Tifffile	https://pypi.org/project/tifffile/		حزمة Python المستخدمة لقراءة وكتابة ملفات صور TIFF.
مركب Tissue-Tek O.C.T.	Sakura Finetek	4583	وسط التضمين المستخدم لتجميد عينات الأنسجة المجمدة.
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	المنظف المستخدم لاختراق الغشاء أثناء التلطيخ المناعي الفلوري.