مقالة منهجية

تحضير طعوم الأعصاب الطرفية البشرية منزوعة الخلايا باستخدام هيدروكسيد الصوديوم ودوديسيل كبريتات الصوديوم

22 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/71578

⸱

سبتمبر 1, 2026

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول طريقة معيارية لإزالة الخلايا بمساعدة الوسط القلوي، والتي تدمج بين المعالجة بهيدروكسيد الصوديوم ونظام تبادل محاليل يعمل بمضخة تمعجية، وذلك لإنتاج طعوم أعصاب طرفية بشرية منزوعة الخلايا مع إزالة خلوية فعالة والحفاظ على بنية المصفوفة خارج الخلوية الأصلية.

الملخص

غالباً ما تتطلب إصابات الأعصاب الطرفية مواد تطعيم توفر توجيهاً هيكلياً لتجدد المحاور العصبية. ورغم أن تطعيم الأعصاب الذاتي لا يزال يمثل المعيار السريري الذهبي، إلا أن استخدامه محدود بسبب المراضة في موقع المتبرع ومحدودية توفر الأنسجة. وقد أدت هذه القيود إلى زيادة الاهتمام بطعوم الأعصاب الطرفية البشرية منزوعة الخلايا كبديل حيوي لتجديد الأعصاب. ومع ذلك، فإن بروتوكولات إزالة الخلايا الشائعة القائمة على المنظفات قد تؤدي إلى تعطيل بنية المادة الخلالية (ECM) وترك بقايا سامة للخلايا يمكن أن تضعف جودة الطعم. يصف هذا المقال بروتوكولاً معيارياً لإعداد طعوم الأعصاب الطرفية البشرية منزوعة الخلايا باستخدام منهج إزالة الخلايا بمساعدة القلويات. تبدأ العملية بالمعالجة بهيدروكسيد الصوديوم (NaOH) لتعزيز التفكيك الخلوي الفعال، تليها خطوة خفيفة باستخدام ديوكسي كولات الصوديوم (SDC) لإزالة المكونات الخلوية والمستضدة المتبقية مع الحفاظ على التنظيم الأصلي للمادة الخلالية. وتحد هذه الاستراتيجية من التعرض للمنظفات مع دعم الحفاظ على بنية المادة الخلالية الأصلية. يتضمن سير العمل تحضير عصب المتبرع، والمعالجة المحكومة بـ NaOH، ثم المعالجة الخفيفة بـ SDC، وغسيلاً مكثفاً تحت تبادل مستمر للمحاليل باستخدام نظام يعمل بمضخة تمعجية لتسهيل إزالة عوامل المعالجة المتبقية. كما يتم تنفيذ خطوات معالجة لاحقة للحفاظ على السلامة الهيكلية وتجهيز الطعوم للتعبئة النهائية والتعقيم. يتم تقييم كفاءة إزالة الخلايا من خلال التحليل النسيجي وتقدير كمية الحمض النووي (DNA) المتبقي، كما يتم فحص الحفاظ على بنية المادة الخلالية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح. وتم تأكيد خلو الطعوم المعالجة من بقايا SDC وتوافقها الحيوي من خلال اختبارات السمية الخلوية. يوفر هذا البروتوكول منهجاً عملياً لإنتاج طعوم الأعصاب الطرفية البشرية منزوعة الخلايا لأبحاث تجديد الأعصاب الطرفية والتطبيقات الانتقالية.

المقدمة

يمكن أن تؤدي إصابات الأعصاب الطرفية إلى ضعف وظيفي شديد، ولا تزال تمثل تحدياً سريرياً كبيراً في الطب التجديدي والجراحة الترميمية. يتطلب تجديد العيوب العصبية القطاعية مواد تطعيم لا تكتفي بجسر فجوة الإصابة فحسب، بل توفر أيضاً توجيهاً هيكلياً وإشارات كيميائية حيوية لدعم تجديد المحاور العصبية وإعادة التعصيب. يُنظر إلى تطعيم الأعصاب الذاتية على نطاق واسع على أنه المعيار السريري الذهبي لأنه يحافظ على بنية المصفوفة خارج الخلوية (ECM) الأصلية ويوفر بيئة دقيقة داعمة لتجديد الأعصاب1,2. ومع ذلك، فإن استخدامه السريري محدود بسبب التوافر المحدود للأنسجة المانحة، والحاجة إلى إجراءات جراحية إضافية، ومراضة موقع المانح3,4. وقد دفعت هذه القيود نحو تطوير مواد تطعيم بديلة، لا سيما طعوم الأعصاب الطرفية منزوعة الخلايا التي تحتفظ ببنية المصفوفة خارج الخلوية (ECM) الأصلية مع تقليل المكونات الخلوية المسببة للاستجابة المناعية5,6,7,8.

يعتمد أداء طعوم الأعصاب منزوعة الخلايا بشكل كبير على عملية إزالة الخلايا. وتعتمد الطرق التقليدية عادةً على كواشف قائمة على المنظفات مثل Triton X-100 وديوكسي كولات الصوديوم (SDC)، والتي تعمل على إزالة المكونات الخلوية عن طريق إذابة الأغشية الدهنية9,10,11. ومع ذلك، فإن التعرض المطول لهذه المنظفات قد يؤدي إلى تعطيل البنية المجهرية للمصفوفة خارج الخلوية (ECM) وترك مواد سامة للخلايا تؤثر سلبًا على حيوية الخلايا ونتائج التجدد12,13. ونتيجة لذلك، يجري البحث بنشاط عن استراتيجيات بديلة لإزالة الخلايا تتيح الإزالة الفعالة للخلايا مع الحفاظ على سلامة المصفوفة خارج الخلوية14. وقد ظهرت عملية إزالة الخلايا القلوية باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) كنهج بديل محتمل لأن ظروف pH الشديدة يمكنها تفكيك المكونات الخلوية والأحماض النووية والدهون بكفاءة15,16,17. ومع ذلك، فإن التعرض غير المنضبط للظروف القلوية القوية قد يضعف سلامة المصفوفة خارج الخلوية، مما يسلط الضوء على أهمية التحكم الدقيق في ظروف المعالجة16,18.

يتم هنا عرض بروتوكول موحد لإزالة الخلايا بمساعدة مادة قلوية للطعوم العصبية الطرفية البشرية، حيث يدمج نظاماً مستمراً لتبادل المحاليل يعمل بمضخة تمعجية. وبالمقارنة مع طرق الغمر الساكن التقليدية، تتيح هذه العملية الديناميكية تبادلاً مستمراً للمحاليل، مما يسهل إزالة الحطام الخلوي وعوامل المعالجة المتبقية. يقدم هذا المقال عرضاً مرئياً خطوة بخطوة لسير العمل الكامل، بما في ذلك تحضير العصب المتبرع به، وإزالة الخلايا الموجهة بمساعدة مادة قلوية، وتبادل المحاليل المستمر باستخدام نظام يعمل بمضخة تمعجية. وقد تم تقييم الطعوم الناتجة باستخدام التحليل النسيجي، وتقدير كمية الحمض النووي (DNA) المتبقي، والمجهر الإلكتروني الماسح (SEM) للتأكد من كفاءة إزالة الخلايا والحفاظ على البنية فائقة الدقة للمادة الخلالية (ECM). ومن خلال تمكين التصوير الواضح للخطوات التقنية الحرجة، يوفر هذا المقال إطاراً محدداً بوضوح لتحضير طعوم عصبية منزوعة الخلايا ولتوسيع نطاق العملية في المستقبل.

البروتوكول

تم الحصول على أعصاب طرفية بشرية متبرع بها من بنك أنسجة في الولايات المتحدة بموجب اتفاقية حصرية مع L&تم الحصول على الأنسجة من شركة C BIO، وذلك بما يتوافق مع لوائح الجمعية الأمريكية لبنوك الأنسجة (AATB) وإدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA). وقد تم توفير معلومات المتبرعين، بما في ذلك العمر والجنس، والتاريخ الطبي، ونتائج الاختبارات المصلية، مع الأنسجة، حيث تمت مراجعتها والموافقة عليها من قبل مدير طبي معتمد. وعند الاستلام، خضعت جميع الأنسجة لفحص وارد، شمل التحقق من فحص المتبرعين، والاختبارات المصلية، واختبارات المسببات المرضية ذات الصلة؛ ولم تُستخدم في هذه الدراسة إلا الأنسجة التي استوفت معايير القبول المحددة مسبقاً. أُجريت جميع الإجراءات التي تضمنت عينات بشرية وفقاً لمبادئ إعلان هلسنكي. ونظراً لعدم تجنيد أو إشراك أي مشاركين بشريين بشكل مباشر في هذه الدراسة، لم يتم إصدار رقم موافقة منفصل من مجلس المراجعة المؤسسية (IRB).

1. تحضير المحاليل (اليوم الأول)

  1. قم بتحضير محلول هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بتركيز 0.25 N عن طريق إذابة 10 g من NaOH في 1 L من الماء المقطر مع التقليب المغناطيسي.
  2. قم بتحضير محلول ديوكسيكولات الصوديوم (SDC) بتركيز 4% عن طريق إذابة 40 g من SDC في 1 L من الماء المقطر مع التقليب المغناطيسي.
  3. انقل كل محلول مُحضّر إلى زجاجات معقمة.
    تنبيه: تعامل مع ديوكسيكولات الصوديوم (SDC) داخل خزانة استخلاص كيميائية (fume hood). ارتدِ معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر وواقي العينين، لمنع الاستنشاق وملامسة الجلد.

2. تحضير قطع الأعصاب الطرفية لإزالة الخلايا

  1. قم بتطهير السطح الخارجي لعبوة العصب الطرفي الخام وافتح العبوة بطريقة معقمة.
  2. اشطف العصب الطرفي عدة مرات باستخدام ماء مقطر معقم.
  3. أزل الأنسجة الدهنية المتبقية، والأنسجة الضامة، والتفرعات غير الضرورية، وأنسجة العصب التالفة باستخدام مقص وملاقط معقمة. اشطف العصب الطرفي مرة أخرى بماء مقطر معقم.
  4. قطع العصب الطرفي إلى قطع يتراوح طولها بين 2–5 cm. صنف القطع المجهزة إلى ثلاث مجموعات حسب الطول: 2–3 cm، و>3–4 cm، و>4–5 cm.
    ملاحظة: قم بمعالجة كل مجموعة طول بشكل منفصل لأن مدد المعالجة بـ IPA وNaOH وSDC تختلف وفقاً لطول قطعة العصب، كما هو موضح في الجدول 1.

3. إعداد نظام مضخة 연동ية (peristaltic pump)

  1. قم بتوصيل أنابيب سيليكون مقاومة للمواد الكيميائية بطول كافٍ بكلا طرفي عمود الكروماتوغرافيا.
  2. قم بتوصيل أحد طرفي الأنابيب بالمضخة 연دية.
  3. قم بتوصيل الأطراف الحرة للأنابيب بزجاجة زجاجية سعة 1 L تحتوي على كحول إيزوبروبيل (IPA) باستخدام أنابيب المضخة لإنشاء نظام تدوير مغلق الحلقة.
    ملاحظة: أحكم تثبيت جميع وصلات الأنابيب جيداً، حيث قد يتسبب الضغط والاهتزاز الناتج عن المضخة 연دية في انفصال الأنابيب عن العمود أو الزجاجة.

4. إزالة الدهون من العصب الطرفي

ملاحظة: ما لم يُذكر خلاف ذلك، يتم تنفيذ جميع خطوات تبديل المحلول في درجة حرارة الغرفة (20–25 °C) باستخدام مضخة 연دية (peristaltic pump) مضبوطة على معدل تدفق يتراوح بين 90–186 mL/min، وذلك اعتماداً على تكوين الأنابيب. يجب الحفاظ على معدل التدفق المحدد ثابتاً طوال كل دورة معالجة.

  1. افتح أحد طرفي عمود الكروماتوغرافيا واملأ العمود جزئياً بمحلول IPA لضمان بقاء النسيج العصبي مغموراً فور إدخاله.
  2. باستخدام ملقط معقم، أمسك بلطف الأنسجة الخارجية عند أحد طرفي قطعة واحدة مجهزة من عصب محيطي. تجنب ضغط أو إمساك الجسم الرئيسي للعصب بشكل مباشر. أنزل قطعة العصب بعناية داخل المحلول الموجود في العمود.
  3. باستخدام الملقط، قم بتسوية قطعة العصب برفق ووضعها بشكل طولي، بحيث تكون موازية لاتجاه تدفق السائل. تأكد من أن القطعة ليست مطوية أو ملتفة أو مضغوطة مقابل الجدار الداخلي للعمود أو مرشح المخرج.
  4. أغلق العمود وثبته بزاوية ميل طفيفة نحو المخرج، بحيث يكون المخرج أعلى قليلاً من المدخل. ويساعد هذا الوضع في منع استقرار قطعة العصب مقابل أي من المرشحين الطرفيين، وبشكل خاص مرشح المخرج.
    ملاحظة: يتم معالجة جزء واحد من العصب المحيطي لكل عمود في كل إجراء. لا يلزم استخدام أي جهاز تثبيت فيزيائي إضافي؛ حيث تساهم قوة الطفو الطبيعية لأنسجة العصب وتدفق السوائل اللطيف نسبيًا في الحفاظ على الجزء في وضع معلق وممتد. يجب فحص وضع النسيج أثناء المعالجة، وإعادة وضعه برفق باستخدام ملاقط معقمة في حال التصاقه بجدار العمود أو المرشح أو بنفسه.
  5. قم بتوصيل محلول الكحول الإيزوبروبيلي (IPA) بنظام المضخة 연동ية (peristaltic pump). أجرِ عملية تبديل مستمرة للمحلول عبر العمود لمدة 1.5 ساعة لقطع الأعصاب التي يتراوح طولها بين 2-3 سم، ولمدة ساعتين للقطع التي يبلغ قياسها >3-4 سم، أو 2.5 ساعة للقطع التي يبلغ قياسها >٤-٥ سم.
  6. قم بتصريف المحلول من العمود.
  7. أضف 40 مل من الماء المقطر المعقم إلى العمود. اقلب العمود أو رُجّه بلطف خمس مرات لغسل العصب الطرفي.
  8. كرر الخطوتين 4.6 و 4.7 لإجراء خمس غسلات إجمالاً.
  9. قم بتوصيل خزان يحتوي على 5 لتر من الماء المقطر المعقم بنظام المضخة 연دية (peristaltic pump). قم بإجراء عملية تبديل مستمرة للمحلول عبر العمود طوال الليل.
    نقطة توقف: يمكن إيقاف الإجراء مؤقتاً بعد إتمام عملية الغسل التي تستمر طوال الليل. أوقف المضخة 연동ية (peristaltic pump) واحفظ العصب الطرفي مغموراً بالكامل في ماء مقطر معقم عند 4 °C لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل الانتقال إلى الخطوة 5.1.
    ملاحظة: قلل من الفقاعات الهوائية داخل العمود لتعزيز كفاءة تبادل المحلول. قم بضبط قطعة العصب الطرفي حسب الحاجة لضمان بقائها معلقة في المحلول ومنع التصاقها بالجدار الداخلي للعمود أو المرشح.

5. إجراء عملية إزالة الخلايا الأولى (اليوم 2)

  1. قم بتوصيل محلول هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) بتركيز 0.25 عياري بنظام المضخة 연donية. قم بإجراء تبادل مستمر للمحلول عبر العمود لمدة 6 ساعات لقطع الأعصاب التي يتراوح طولها بين 2 و3 سم، ولمدة 8 ساعات للقطع التي يبلغ طولها >3-4 سم، أو 10 ساعات للقطع التي يبلغ قياسها >٤-٥ سم.
  2. صَفِّ المحلول من العمود.
  3. اغسل العصب الطرفي كما هو موضح في الخطوات 4.6-4.8.
  4. قم بتوصيل خزان يحتوي على 5 لترات من الماء المقطر المعقم بنظام مضخة 연동ية (peristaltic pump). قم بإجراء عملية تبادل مستمر للمحلول عبر العمود طوال الليل.
    نقطة توقف: بعد إتمام عملية الغسيل ليلة كاملة، يمكن إيقاف الإجراء مؤقتاً. أوقف المضخة 연طارية (peristaltic pump) واحفظ العصب الطرفي مغموراً بالكامل في ماء مقطر معقم عند 4 °C لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل الانتقال إلى الخطوة 6.1.

6. إجراء عملية إزالة الخلايا الثانية (اليوم 3)

  1. قم بتوصيل محلول SDC بتركيز 4% (وزن/حجم) بنظام المضخة 연دية (peristaltic pump). أجرِ عملية تبادل مستمر للمحلول عبر العمود لمدة 6 ساعات لقطع الأعصاب التي يبلغ طولها 2-3 سم، و8 ساعات للقطع التي يبلغ طولها >٣-٤ سم، أو ١٠ ساعات للقطع التي يبلغ قياسها >٤-٥ سم.
  2. قم بتصريف المحلول من العمود.
  3. اغسل العصب الطرفي كما هو موضح في الخطوات 4.6-4.8.
  4. قم بتوصيل خزان يحتوي على 5 لترات من الماء المقطر المعقم بنظام المضخة التمعجية. أجرِ عملية تبديل مستمر للمحلول عبر العمود طوال الليل.
    نقطة توقف: يمكن إيقاف الإجراء بعد إتمام عملية الغسل طوال الليل. أوقف المضخة التمعجية واحفظ العصب الطرفي مغموراً بالكامل في ماء مقطر معقم عند 4 °C لمدة تصل إلى 24 ساعة قبل الانتقال إلى الخطوة 7.1.

7. تعقيم العصب الطرفي منزوع الخلايا (اليوم 4)

  1. قم بإزالة حجم صغير من الماء المقطر من العمود. استخرج العصب الطرفي منزوع الخلايا بعناية مع إبقائه معلقاً في السائل المتبقي.
  2. غلف العصب الطرفي مع الماء المقطر المعقم.
  3. قم بتعقيم العصب الطرفي المغلف عن طريق التشعيع بغاما بجرعة 25 kGy.
    ملاحظة: لا تقم بتصريف الماء المقطر من العمود بالكامل. حافظ على قطعة العصب معلقة في حجم كافٍ من السائل المتبقي لمنع التصاقها بالجدار الداخلي للعمود ولتسهيل التعامل معها بلطف دون السماح للسائل بالفيضان.

النتائج

يظهر في الشكل نظرة عامة على عملية تحضير طعوم الأعصاب الطرفية البشرية منزوعة الخلايا الشكل 1تضمن سير العمل تشذيب العصب الطرفي الخام، وإزالة الدهون باستخدام الكحول الإيزوبروبيلي (IPA)، وإزالة الخلايا كيميائياً بالتتابع باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ودوكيسيل سلفات الصوديوم (SDC)، تلا ذلك عمليات غسل مكثفة وتعقيم.الشكل 1).

يوضح الشكل 2A نظام تبادل المحاليل الذي يعمل بمضخة 연동ية (peristaltic pump) والمستخدم في عمليات إزالة الدهون، وإزالة الخلايا، والغسيل. كما تم توضيح عمليات تشذيب وتقسيم العصب في الشكل 2B–D. وبعد اكتمال العملية، حافظ العصب الطرفي على شكله العام دون حدوث أي خلل بنيوي مرئي (الشكل 2E).

يظهر التقييم النسيجي لإزالة الخلايا في الشكل 3صبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E)&كشف صبغ العصب الطرفي الأصلي عن وجود نوى وفيرة، بينما كانت النوى غائبة إلى حد كبير في العينات التي تمت إزالة الخلايا منها (الشكل 3أأظهر قياس كمية الحمض النووي المتبقي، والذي تم التعبير عنه بنانوجرام من الحمض النووي/ملجم من النسيج الجاف، انخفاضاً كبيراً في محتوى الحمض النووي بعد عملية إزالة الخلايا (الشكل 3ب).

يتم عرض التحليل البنيوي الدقيق باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) في  الشكل 4. وقد ظل التنظيم الليفي للمصفوفة خارج الخلية (ECM) مرئياً بوضوح بعد عملية إزالة الخلايا، مما يشير إلى الحفاظ على البنية الأصلية للمصفوفة خارج الخلية (الشكل 4).

يظهر تقييم المنظفات المتبقية والتوافق الخلوي في الشكل 5كانت مستويات SDC المتبقية ضئيلة بعد خطوات الغسيل (الشكل 5-أأظهرت اختبارات السُمية الخلوية عدم وجود استجابة سُمية خلوية ذات دلالة إحصائية في الخلايا المستنبتة التي تعرضت لطعوم الأعصاب الطرفية منزوعة الخلايا (الشكل 5-ب).

figure-results-1
الشكل 1: مخطط لسير عمل تحضير طعوم العصب الطرفي البشري منزوعة الخلايا. يتم أولاً تحضير قطع من الأعصاب الطرفية البشرية المتبرع بها عن طريق التشذيب والتقسيم لإزالة النسيج الضام المحيط. ثم تخضع قطع العصب لعملية إزالة الدهون باستخدام تبادل محاليل قائم على IPA (اليوم 1). ويتم إجراء إزالة الخلايا بالتتابع باستخدام NaOH (اليوم 2) وSDC (اليوم 3) تحت تبادل مستمر للمحاليل في نظام يعمل بمضخة 연دية. بعد ذلك، يتم تعبئة الطعوم المعالجة وتعقيمها (اليوم 4) للحصول على طعوم أعصاب طرفية منزوعة الخلايا. الاختصارات: IPA = إيزوبروبانول؛ NaOH = هيدروكسيد الصوديوم؛ SDC = ديوكسيكولات الصوديوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: صور تمثيلية لسير عمل معالجة العصب الطرفي. (A) نظام تبادل المحاليل الذي تعمل به مضخة 연دية (peristaltic pump) والمستخدم في عمليات إزالة الدهون، وإزالة الخلايا، والغسيل. (B) عصب طرفي بشري متبرع به قبل التقليم. (C) العصب الطرفي أثناء عملية التقليم. (D) العصب الطرفي بعد التقليم والتقسيم. (E) العصب الطرفي بعد اكتمال عملية إزالة الخلايا بأكملها. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3تقييم كفاءة إزالة الخلايا. (A) صور تمثيلية لصبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&صور مصبوغة بصبغة الهيماتوكسيلين والإيوسين (H&E) لأنسجة عصبية محيطية بشرية طبيعية وأخرى منزوعة الخلايا، تظهر انخفاض المكونات الخلوية بعد عملية نزع الخلايا. أشرطة المقياس = 100 µm. (Bتحديد كمية محتوى الحمض النووي (DNA) المتبقي في أنسجة الأعصاب الأصلية ومنزوعة الخلايا، معبراً عنها بنانوجرام من الحمض النووي/مليجرام من النسيج الجاف. يتم عرض البيانات كمتوسط ± الانحراف المعياري (ن = 3). *p < 0.05. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) للبنية المجهرية للعصب. صور ممثلة بواسطة SEM لأنسجة الأعصاب الطرفية البشرية الأصلية (يساراً) ومنزوعة الخلايا (يميناً)، توضح الحفاظ على بنية المصفوفة خارج الخلوية بعد عملية نزع الخلايا. أشرطة المقياس = 2 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تقييم المنظف المتبقي والسمية الخلوية. (A) الكروماتوغرامات الخاصة بمعيار SDC (يساراً) والمستخلصات من طعوم الأعصاب منزوعة الخلايا (يميناً) المستخدمة لتقييم المنظف المتبقي. يشير المربع الأحمر إلى المنطقة المقابلة لوقت الاستبقاء لـ SDC (~3.2 min). (B) تقييم السمية الخلوية للمستخلصات من طعوم الأعصاب منزوعة الخلايا باستخدام الخلايا الليفية L929 وفقاً لإرشادات ISO 10993-5. تُظهر الصور التمثيلية بعد حضانة لمدة 48 h مجموعات التحكم في الكاشف، والمستخلص من طعوم الأعصاب منزوعة الخلايا، ومجموعة التحكم السلبية، ومجموعة التحكم الإيجابية. أشرطة المقياس = 50 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

طول قطعة العصب (سم)المعالجة بـ IPA (ساعة)المعالجة بـ NaOH (ساعة)المعالجة بـ SDC (ساعة)
2–31.566
>3–4288
>4–52.51010

الجدول 1: مدد المعالجة المحددة حسب الطول لقطع الأعصاب الطرفية ضمن النطاق الذي تم تقييمه في هذه الدراسة.

المناقشة

تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً قياسياً لإزالة الخلايا بمساعدة مادة قلوية لتصنيع طعوم أعصاب محيطية بشرية منزوعة الخلايا من أجل تجديد الأعصاب المحيطية. يدمج البروتوكول بين المعالجة المسبقة لعصب المتبرع، وإزالة الخلايا كيميائياً بشكل مدروس، ونظام تبادل للمحاليل يعمل بمضخة 연دية ضمن سير عمل محدد بوضوح، مما يتيح الإزالة الفعالة للمكونات الخلوية والمستضدات مع الحفاظ على بنية المصفوفة خارج الخلوية (ECM) الأصلية.

تتمثل السمة الرئيسية لهذه الطريقة في دمج المعالجة القلوية مع تقليل التعرض للمنظفات. تعتمد البروتوكولات التقليدية القائمة على المنظفات، مثل طريقة Sondell (بتركيز 3% Triton X-100 و 4% SDC) وطريقة Hudson (باستخدام sulfobetaine-10 و sulfobetaine-16 و Triton X-200)، على معالجات طويلة ومتعددة الخطوات بالمنظفات لتحقيق إزالة خلوية فعالة9,10. ورغم أن هذه النهج تزيل المكونات الخلوية بفعالية، إلا أن التعرض المطول للمنظفات قد يؤثر سلبًا على سلامة المصفوفة خارج الخلوية (ECM) ويساهم في حدوث سمية خلوية متبقية مرتبطة بالمنظفات19,20,21. وفي المقابل، يتضمن البروتوكول الحالي استخدام NaOH لتعزيز إزالة الخلايا مع الحد من التعرض لـ SDC، مما يقلل من العبء الإجمالي للمنظفات ويدعم الحفاظ على البنية الأصلية للمصفوفة خارج الخلوية.

ثمة جانب حيوي آخر في هذا البروتوكول وهو نظام تبادل المحاليل الذي يعمل بمضخة تمعجية. وبخلاف منهجيات التروية، التي قد تسبب ضغطاً داخلياً على النسيج وتزيد من خطر التفكك البنيوي21، يتيح هذا النظام تبادلاً مستمراً ومنضبطاً للمحاليل داخل عمود كروماتوغرافي. وتدعم عدة نتائج تحليلية فعالية هذا النهج؛ حيث أكد التحليل النسيجي وتقدير كمية DNA المتبقي الإزالة الفعالة للمكونات الخلوية، بينما أظهر تحليل SEM الحفاظ على البنية الأصلية للمادة الخلالية الخلوية ECM. بالإضافة إلى ذلك، دعمت المستويات المنخفضة من SDC المتبقي ونتائج التوافق الخلوي الإيجابية التوافق الحيوي للرقعة الناتجة. وتؤكد هذه النتائج مجتمعة أن البروتوكول يحقق توازناً بين إزالة الخلايا بفعالية والحفاظ على البنية.

تعد العديد من الخطوات التقنية ضرورية لتقليل التباين الإجرائي والحفاظ على ظروف معالجة محكومة. أولاً، من الضروري التعامل بعناية مع قطعة العصب أثناء التقليم والنقل والغسيل. فتنسج الأعصاب الطرفية هش ميكانيكياً، ويمكن أن يؤدي الضغط المفرط أو الطي أو الشد إلى تعطيل البنية الداخلية وتقويض الحفاظ على المصفوفة خارج الخلوية (ECM)19,20. لذا، يجب الحفاظ على رطوبة الأنسجة والتعامل معها برفق طوال الإجراء. ثانياً، يعد التبادل الموحد للمحلول داخل العمود محدداً رئيسياً لأداء العملية. يجب تقليل فقاعات الهواء داخل العمود إلى أدنى حد، ويجب أن تظل الأنسجة مغمورة ومعلقة بالكامل في المحلول بدلاً من الالتصاق بجدار العمود أو المرشح. فقد يؤدي التصاق الأنسجة إلى تبادل غير متكافئ للمحلول، مما يقلل من كفاءة الغسيل ويتسبب في تعرض غير متسق لكواشف المعالجة21,22. ثالثاً، يجب أن يعمل النظام الذي تعمل به مضخة تمعجية باستقرار طوال الإجراء. فالدوران المستمر مطلوب لعمليات إزالة الدهون، وإزالة الخلايا، والغسيل؛ لذا، يجب تثبيت جميع توصيلات الأنابيب بإحكام لمنع الانفصال الناتج عن الضغط أو الاهتزاز الناجم عن المضخة. وأثناء استعادة العينة، يجب تجنب التفريغ الكامل للعمود، حيث يساعد الحفاظ على حجم سائل كافٍ في منع التصاق الأنسجة ويسهل التعامل برفق أثناء الجمع.

تمت معالجة قطع الأعصاب التي يتراوح طولها بين 2–3 cm باستخدام IPA وNaOH وSDC لمدة 1.5 و6 و6 h، على التوالي. أما القطع التي يتراوح طولها بين >3–4 cm فقد تمت معالجتها لمدة 2 و8 و8 h، على التوالي، بينما تمت معالجة القطع التي يتراوح طولها بين >4–5 cm لمدة 2.5 و10 و10 h، على التوالي. وبذلك، تراوحت مدد المعالجة من 1.5 إلى 2.5 h لعملية إزالة الدهون باستخدام IPA ومن 6 إلى 10 h لكل خطوة من خطوات إزالة الخلايا. وقد تم الحفاظ على جميع معاملات المعالجة الأخرى بشكل ثابت عبر جميع مجموعات الأطوال، بما في ذلك تركيزات الكواشف، وأحجام المحاليل، وإجراءات الغسل. وبناءً على تكوين الأنابيب، تم ضبط معدل التدفق ضمن النطاق المحدد والحفاظ عليه ثابتاً طوال كل دورة معالجة. وتلخص Table 1 ظروف المعالجة المحددة حسب الطول. ولم يتم تقييم التعديلات بناءً على قطر العصب، أو السماكة، أو البنية الحزمية، أو التركيب الخلوي والمصفوفي بشكل منهجي، وهي تتطلب مزيداً من البحث23,24. وبالنسبة لتطبيقات زيادة نطاق الإنتاج، قد يؤدي استخدام نظام مضخة تمعجية متعددة القنوات إلى تحسين الإنتاجية؛ ومع ذلك، يجب التحقق بعناية من اتساق ظروف التدفق عبر القنوات لضمان تجانس المعالجة.

لا تزال هناك عدة اعتبارات من أجل تحسين إضافي. وعلى الرغم من أن هذا البروتوكول يقلل بشكل كبير من التعرض الإجمالي للمنظفات، إلا أن SDC لا يزال مدرجًا، وقد تركز التحسينات المستقبلية على تقليل استخدام المنظفات أو استبدالها مع الحفاظ على كفاءة إزالة الخلايا والحفاظ على ECM25,26. بالإضافة إلى ذلك، يصعب توحيد أنسجة الأعصاب الطرفية بطبيعتها بسبب التباين في البنية الحزمية، والقطر، والسُمك، والتكوين الخلوي والمصفوفي23,24. وأثناء التصنيع واسع النطاق، قد تساهم هذه الاختلافات، إلى جانب التباينات في تحميل الأنسجة وظروف التدفق، في التباين بين الدفعات الإنتاجية. ومع ذلك، لم يتم تقييم إمكانية التكرار من متبرع إلى آخر ومن دفعة إلى أخرى بشكل منهجي في الدراسة الحالية. ولذلك، سيكون من الضروري إجراء مزيد من التحقق باستخدام أنسجة من متبرعين متعددين ودفعات تصنيع مستقلة لوضع معايير مناسبة لقبول الأنسجة، وتوحيد العمليات، وضمان تكرار الدفعات.

يتعلق قصور إضافي بطول الطُعم؛ حيث ينخفض أداء التجدد مع زيادة طول الطُعم، وقد يكون هذا القصور المعتمد على الطول أكثر وضوحاً في الطعوم العصبية الخيفية الخالية من الخلايا مقارنةً بالطعوم الذاتية3,27. ونظراً لأن الطعوم العصبية الخيفية الخالية من الخلايا تفتقر إلى خلايا شوان الحيوية المقيمة، فإنها تعتمد على هجرة وتكاثر خلايا شوان الخاصة بالمضيف لدعم تجدد المحاور العصبية27. وقد أفاد Saheb-Al-Zamani وزملاؤه أن التجدد المحدود في الطعوم العصبية الخيفية الخالية من الخلايا الطويلة كان مرتبطاً بزيادة شيخوخة خلايا شوان27.

ومع ذلك، أظهرت دراسة سابقة in vivo أن طعوم الأعصاب البشرية منزوعة الخلايا القائمة على NaOH دعمت تعافياً وظيفياً وهيكلياً مشابهاً للطعوم الذاتية في عيب بالعصب الوركي للأرنب بطول 15 mm28. كما أثبت Contreras وزملاؤه تجدد المحاور العصبية والتعافي الوظيفي باستخدام طعم عصبي خيفي منزوع الخلايا عبر عيب في العصب الشظوي بطول 70 mm في الأغنام29. وتدعم هذه الدراسات القدرة التجديدية لطعوم الأعصاب منزوعة الخلايا، على الرغم من الحاجة إلى مزيد من التقييم للطعوم المحضرة باستخدام البروتوكول الحالي عبر أطوال طعوم ذات صلة سريرياً. كما تتقيد الطعوم الذاتية بمدى توفر العصب المانح وتتطلب إجراء جراحي إضافي للاستئصال، مما يؤدي إلى وجود موقع جراحي ثانٍ ومراضة في موقع المانح4. وبناءً على ذلك، قد توفر الطعوم العصبية الخيفية غير الخلوية بديلاً ذا صلة سريرياً عندما لا تتوفر أنسجة ذاتية كافية أو عندما يكون استئصال العصب المانح غير عملي.

باختصار، يوفر هذا البروتوكول إطاراً عملياً وقابلاً للتكيف لتحضير طعوم الأعصاب الطرفية منزوعة الخلايا. إن تركيزه على تقليل التعرض للمنظفات، والتبادل المنضبط للمحاليل، وتوحيد العمليات يدعم كلاً من التطبيقات البحثية والاستخدامات الانتقالية المحتملة في تجديد الأعصاب الطرفية. كما يجب أن تركز الدراسات المستقبلية على المزيد من التطوير للمنهجيات الخالية من المنظفات، وقابلية توسيع النظام، والتقييم الشامل in vivo لأداء التجديد.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

This work was supported by the Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) grant funded by the Korea Government (MOTIE) (P0011947, Korea-Czech Bilateral Co-funding R&D Projects).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مضخة 연동ية متعددة القنوات BT100-1LLonger PumpBT100-1Lتُستخدم لتوفير تدوير مستمر وتبادل للمحاليل أثناء عمليات إزالة الدهون، وإزالة الخلايا، والغسيل.
عمود كروماتوغرافيا Econo-Column، 2.5 × 10 cmBio-Rad737-2512يُستخدم لتثبيت قطع الأعصاب الطرفية أثناء التبادل المستمر للمحاليل.
كحول أيزوبروبيل (IPA)Daejeong Chemicals5035-4410يُستخدم لإزالة الدهون من أنسجة الأعصاب الطرفية.
أنابيب مضخة Masterflex Tygon E-LFLThermo Scientific06440-16تُستخدم لتوصيل المضخة 연동ية، وعمود الكروماتوغرافيا، وخزانات المحاليل لضمان تدوير المحلول بشكل مستمر.
ديوكسيكولات الصوديوم (SDC)Sigma-Aldrich30970-100Gتُستخدم كمنظف في الخطوة الثانية من إزالة الخلايا للتخلص من المكونات الخلوية المتبقية.
هيدروكسيد الصوديوم، NaOHDuksan1636لتحليل الخلايا.

المراجع

  1. Kornfeld T, Vogt PM, Radtke C. Nerve grafting for peripheral nerve injuries with extended defect sizes. Wien Med Wochenschr. 2019;169(9):240-251.
  2. Siemionow M, Brzezicki G. Current techniques and concepts in peripheral nerve repair. Int Rev Neurobiol. 2009;87:141-172.
  3. Hoben GM, et al. Increasing nerve autograft length increases senescence and reduces regeneration. Plast Reconstr Surg. 2018;142(4):952-963.
  4. Gaudin R, et al. Approaches to peripheral nerve repair: Generations of biomaterial conduits yielding to replacing autologous nerve grafts in craniomaxillofacial surgery. Biomed Res Int. 2016;2016:3856262.
  5. Lans J, et al. A systematic review and meta-analysis of nerve gap repair: Comparative effectiveness of allografts, autografts, and conduits. Plast Reconstr Surg. 2023;151(5):814e-827e.
  6. Huang H, et al. A comparative study of acellular nerve xenografts and allografts in repairing rat facial nerve defects. Mol Med Rep. 2015;12(4):6330-6336.
  7. Rana D, et al. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 2017;11(4):942-965.
  8. Zhang Y, et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2010;31(20):5312-5324.
  9. Sondell M, Lundborg G, Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction. Brain Res. 1998;795(1-2):44-54.
  10. Hudson TW, et al. Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration. Tissue Eng. 2004;10(11-12):1641-1651.
  11. Rinker B, et al. Use of processed nerve allografts to repair nerve injuries greater than 25 mm in the hand. Ann Plast Surg. 2017;78(6 Suppl):S292-S295.
  12. Zvarova B, et al. Residual detergent detection method for nondestructive cytocompatibility evaluation of decellularized whole lung scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 2016;22(5):418-428.
  13. Fox DA, Epstein ML, Bass P. Surfactants selectively ablate enteric neurons of the rat jejunum. J Pharmacol Exp Ther. 1983;227(2):538-544.
  14. Singh G, et al. Impact of various detergent-based immersion and perfusion decellularization strategies on the novel caprine pancreas derived extracellular matrix scaffold. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1253804.
  15. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006;27(19):3675-3683.
  16. Tsuchiya T, et al. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 2014;20(12):1028-1036.
  17. Sengyoku H, et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 2018;14(2):94-106.
  18. Jones EM, Cochrane CA, Percival SL. The effect of pH on the extracellular matrix and biofilms. Adv Wound Care (New Rochelle). 2015;4(7):431-439.
  19. Nieto-Nicolau N, et al. Effective decellularization of human nerve matrix for regenerative medicine with a novel protocol. Cell Tissue Res. 2021;384(1):167-177.
  20. Philips C, et al. Qualitative and quantitative evaluation of a novel detergent-based method for decellularization of peripheral nerves. Ann Biomed Eng. 2018;46(11):1921-1937.
  21. Wüthrich T, et al. Development of vascularized nerve scaffold using perfusion-decellularization and recellularization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;117:111311.
  22. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011;32(12):3233-3243.
  23. Hopf A, et al. Optimized decellularization protocol for large peripheral nerve segments: Towards personalized nerve bioengineering. Bioengineering (Basel). 2022;9(9):412.
  24. Penkert G. Anatomy of the peripheral nerve system. In: Focal Peripheral Neuropathies: Imaging, Neurological, and Neurosurgical Approaches. Springer; 2014:3-9.
  25. Vasudevan S, et al. Detergent-free decellularized nerve grafts for long-gap peripheral nerve reconstruction. Plast Reconstr Surg Glob Open. 2014;2(8):e201.
  26. García-García ÓD, et al. Comprehensive ex vivo and in vivo preclinical evaluation of novel chemoenzymatic decellularized peripheral nerve allografts. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1162684.
  27. Saheb-Al-Zamani M, et al. Limited regeneration in long acellular nerve allografts is associated with increased Schwann cell senescence. Exp Neurol. 2013;247:165-177.
  28. Kim S, et al. Enhancing peripheral nerve regeneration through NaOH-based decellularization of human nerve tissue. Bioeng Transl Med. 2025;10(6):e70072.
  29. Contreras E, et al. Repair of long nerve defects with a new decellularized nerve graft in rats and in sheep. Cells. 2022;11(24):4074.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DNA
الفيديو قريباً
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.