يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحفيز تحولات الطور اليومي خلال النهار باستخدام الأساليب الكيميائية والطائفية

289 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71594

⸱

يونيو 12, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section on Light and Circadian Rhythms, National Institute of Mental Health (NIMH), National Institutes of Health (NIH)

في هذه المقالة

ملخص

تقدم هذه الدراسة استراتيجيات تعتمد على الكيميائي الوراثي والضوء البنفسجي لتمكين تغيير الطور اليومي بشكل موثوق خلال النهار.

الملخص

في الثدييات، يحد تغير الطور اليومي خلال النهار بسبب انخفاض الاستجابة الضوئية للنواة فوق التشكيازمية (SCN)، مما يحد من القدرة على التلاعب التجريبي بالساعة اليومية خلال هذه المرحلة. لذا فإن الطرق الموثوقة لتحفيز تحولات الطور خلال النهار ضرورية لدراسة آليات اللدونة اليومية وتزامن الفوتيك. توصف استراتيجيات جينية والطيفة مكملة لتمكين التلاعب القوي والدقيق زمنيا بالساعة البيولوجية خلال النهار. النهج الأول، الذي يقتصر حاليا على الفئران، يستخدم استراتيجية كيميائية وراثية تتضمن توصيل مستقبلات مصممة مفعلة حصريا بواسطة أدوية مصممة (DREADDs) عبر الجسم الزجاجي لتنشيط خلايا عقدة الشبكية الحساسة للضوء (ipRGCs) بشكل انتقائي. يسمح هذا النهج بتنشيط متحكم فيه لمسار شبك الوطاء ويحث تحولات طورية قابلة للتكرار خلال النهار بشكل مستقل عن ظروف الإضاءة المحيطة. الطريقة الثانية تستخدم التحفيز البصري الخاص بالطول الموجي كبديل غير جراحي. يستغل التعرض للضوء البنفسجي الحساسية الطيفية لعناصر ipRGC لتقليل كتلة إزالة الاستقطاب وتعزيز التنشيط المستمر، مما يمكن من إعادة ضبط الطور بشكل موثوق خلال اليوم الذاتي. هذه الطريقة قابلة للتطبيق على نطاق واسع عبر أنظمة الثدييات ولا تتطلب تلاعبا جينيا أو تدخلا دوائيا. تم توفير بروتوكولات مفصلة للتحضير التجريبي، وتوقيت التحفيز، والتحقق من تحولات الطور باستخدام النشاط الحركي، وتقييم تنشيط الخلايا العصبية عبر الكيمياء المناعية النسبية c-Fos. تم توضيح الاعتبارات الرئيسية، بما في ذلك توقيت الساعة البيولوجية، ومعايير التحفيز، وضوابط تجريبية، لتسهيل قابلية التكرار. معا، توفر هذه الأساليب أدوات متعددة الاستخدامات وقابلة للتنفيذ تجريبيا لتحفيز تحولات الطور اليومي النهاري وتمكن من التحقيق المباشر في الآليات الكامنة وراء الاستجابة اليومية اليومية خلال النهار.

المقدمة

تنسق النواة فوق التشكيازمية (SCN)، وهي الساعة اليومية الرئيسية لدماغ الثدييات، الإيقاعات اليومية الأساسية في الفسيولوجيا والسلوك، بما في ذلك دورات النوم والاستيقاظ وأنماط التغذية. للحفاظ على التوافق مع البيئة الخارجية، يتلقى SCN مدخلات ضوئية مباشرة من خلايا عقدة الشبكية ذات الحساسية الجوهرية للضوء (ipRGCs)، التي تنقل معلومات ضوء الشبكية لمزامنة الإيقاعات البيولوجية الداخلية مع اليومالشمسي 1,2.

السمة المميزة للأنظمة اليومية عبر الكائنات هي الاستجابة المعتمدة على الطور: فنفس المنبه الذي يرسل في أوقات يومية مختلفة يمكن أن ينتج تأثيرات مختلفة بشكل ملحوظ. في الثدييات، يحفز الضوء الليلي تحولات طور ساعة SCN بشكل موثوق، بينما يؤدي التعرض خلال اليوم الذاتي إلى القليل أو عدم إعادة الضبط 3,4. لقد لوحظ هذا عدم الحساسية الظاهرة خلال النهار باستمرار في كل من التحضيرات في الجسم الحي والمختبري، حيث تفشل محاولات تقليد المدخلات الضوئية في تحقيق تحولات طورية كبيرة 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 .

وقد عزى عدم الحساسية خلال النهار، على الأقل جزئيا، إلى نقص دفع الشبكية لتفعيل آليات إعادة ضبط الطور، إلى جانب آليات البوابة اليومية داخل SCN. تماشيا مع هذه الفكرة، فإن ipRGCs ليست مستجيبة بشكل موحد تحت ظروف فوتوبية؛ تدخل مجموعة فرعية في كتلة إزالة الاستقطاب، مما يحد من إمكانية الإطلاق المستدام 17,18,19. قد يقلل هذا القيد الفسيولوجي من فعالية التحفيز الضوئي التقليدي خلال النهار. تجاوز هذا القيد سيمكن من الاستجواب المباشر لمرونة الساعة النهارية، وهي مرحلة تعتبر تقليديا مقاومة لإعادة ضبط التركيز.

يتم وصف منهجيتين تكميليتين لتمكين تحول الطور القوي للساعة البيولوجية خلال اليوم الذاتي. يستخدم النهج الأول استراتيجية كيميائية لتنشيط ipRGCs بشكل انتقائي مستقل عن ظروف الإضاءة المحيطة. على وجه التحديد، تتلقى فئرانOpn4 Cre/+ حقن داخل الجسم الزجاجي لفيروس مرتبط بالأدينوس (AAV) يشفر المستقبل المصمم المحفز المنشط حصريا بواسطة الأدوية المصممة (DREADD)، hM3Dq، بطريقة تعتمد على ال Cre. إعطاء كلوزابين-إن-أكسيد (CNO) في الوقت اليومي 4 (CT4) يحفز إطلاق متفجرات لمركبات ipRGCs، مما يوفر تنشيط مستمرا لمسار الشبكية تحت المهاد. يتم قياس تحولات الطور باستخدام تسجيلات النشاط الحركي، ويتم تقييم التنشيط الجزيئي داخل SCN بواسطة الكيمياء المناعية النمطية c-Fos.

النهج الثاني يستخدم التحفيز البصري الخاص بالطول الموجي كاستراتيجية غير جراحية لتطبيق أوسع. تتعرض فئران النوع البري للضوء البنفسجي (385 نانومتر) عند الزمن اليومي 6 (CT6)، خلال منتصف اليوم الذاتي. ينتج الضوء البنفسجي حجزا أقل في إزالة الاستقطاب ويدعم تنشيط ipRGC بشكل مستدام مقارنة بالضوء الأزرق أو الأبيض19. يتم قياس إزاحات الطور كما هو موضح أعلاه.

يهدف كلا النهجين إلى تعزيز الإشارات المدفوعة ب ipRGC إلى SCN، وبالتالي التغلب على انخفاض الاستجابة الضوئية المميز لليوم الذاتي. معا، توفر هذه المنهجيات استراتيجيات قوية وقابلة للتنفيذ تجريبيا للتلاعب بالساعة البيولوجية خلال مرحلة تقليديا مقاومة لإعادة ضبط الضربات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات وأجريتها وفقا لإرشادات لجنة رعاية واستخدام الحيوانات التابعة للمعهد الوطني للصحة النفسية (NIMH) (ASP-SLCR-01). تم بذل كل الجهود لتقليل الألم وتقليل عدد الحيوانات المستخدمة. الأدوات البحثية المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. استراتيجية الكيموجينية

  1. حقن الفيروس المرتبط بالألدية داخل الجسم الزجاجي في فئرانOpn4 Cre/+
    1. تنظيف وتعقيم المرحلة الستيريتاكسية وجميع الأدوات الجراحية باستخدام إجراءات التعقيم المناسبة. قم بتركيب جهاز الحقن وربط إبرة حقن شعيرات شعرية زجاجية.
    2. تخدير الفأر باستخدام الإيزوفلوران. اضبط معدل تدفق الأكسجين إلى حوالي 1.5 لتر/دقيقة. اضبط الإيزوفلوران إلى 3٪–5٪ للتحفيز وقلل إلى 1–3٪ للصيانة طوال الإجراء.
    3. تحقق من كفاية التخدير باستخدام قرص إصبع القدم. اعتبر الحيوان مخدرا بالكامل عندما لا يلاحظ رد فعل انسحابي أو ارتعاش.
    4. ضع الفأرة على وسادة تسخين للحفاظ على درجة حرارة الجسم طوال العملية.
    5. اسحب إبر الشعيرات الدموية الزجاجية. تم وضع علامات على الإبر على بعد ~1.5 مم من الطرف باستخدام علامة دقيقة تحت المجهر المجسم لضمان عمق اختراق متسق.
    6. اضغط بلطف على الجفن السفلي باستخدام ملقط ذو طرف غير حاد لتبرز كرة العين قليلا وكشف الليفي الظهري. باستخدام النهج الظهري، أدخل الإبرة بشكل مماسي على سطح العين واخترق الصلبة على بعد 0.5–1 مم خلف الليمبوس مع تجنب المناطق الوعائية في الليمبوس.
    7. أدخل الإبرة في غرفة الجسم الزجاجي إلى العمق المحدد مسبقا. اسحب قليلا لتخفيف الضغط داخل العين ومنع انسداد طرف الإبرة بواسطة الأنسجة.
    8. حقن حجم إجمالي 1.5 ميكرولتر محلول AAV (بحجم 2.4 × 1013 GC/ml)، يتم تقديمه كخمس حقن متتالية بسعة 300 نانولتر لكل منها (بمعدل 50 نانولتر/ثانية). توقف لمدة 5 ثوان بين الحقن للسماح بالانتشار وتقليل الارتجاع. بعد الحقنة النهائية، انتظر 30 ثانية قبل سحب الإبرة ببطء. كرر نفس العملية في العين المقابلة باستخدام نفس المعايير، مع الحرص على تقليل الصدمة والارتجاع.
    9. أعط الكيتوبروفين (10 ملغ/كغ، تحت الجلد) مباشرة بعد الجراحة.
    10. اترك للفئران تتعافى لمدة لا تقل عن أسبوعين لضمان التعبير الكافي للفيروس قبل نقلها إلى مركز السلوك.
  2. نشاط القيادة على العجلات وإدارة رئيس العمليات البحرية (الشكل 1A)
    1. فئران المنزل بشكل فردي في أقفاص مجهزة بعجلات ركض. سجل نشاط الجري باستخدام نظام جمع بيانات آلي.
    2. الفئران المدمنة في دورة 12:12 ساعة من الضوء إلى الظلام لمدة 4–7 أيام. أكد التثبيت المستقر ثم انتقل الحيوانات إلى الظلام الدائم (DD).
    3. حدد بداية النشاط باستخدام برامج التحليل. عرف بداية النشاط بأنها CT12 في القوارض الليلية. احسب CT4 وفقا لذلك.
    4. في اليوم الثامن في الولاية، تتلقى الفئران حقن داخل الصفاق من CNO (1 ملغ/كغ) أو محلول ملحي عند CT4 تحت ضوء أحمر خافت.
    5. أعد الحيوانات إلى أقفاصها المنزلية وحافظ عليها في ظلام دائم. سجل النشاط الحركي بشكل متواصل لمدة 8 أيام.
    6. تحديد بداية النشاط وإجراء تحليل الانحدار في فترات ما قبل وبعد الحقن. احسب تحولات الطور كفرق بين بداية النشاط المتوقع والملاحظ.
  3. الكيمياء المناعية لنظام c-Fos من SCN بعد التنشيط الكيميائي
    1. الفئران المجمعة في دورة ضوء-ظلام مدتها 12:12 ساعة وتطلق في ظلام مستمر. في اليوم الثاني في DD، أعط CNO في CT6. حقن الحيوانات بعد 30 دقيقة من الحقن.
      ملاحظة: تم استخدام CT4 في تجارب سلوكية لتقليل احتمال امتداد تأثيرات CNO إلى الليل الذاتي، حيث يمكن أن يبقى CNO نشطا لعدة ساعات. على النقيض من ذلك، استخدم CT6 في تجارب التلوين المناعي لتقييم التأثيرات الحادة ل CNO على الساعة اليومية، حيث تم حقن الحيوانات بعد 30 دقيقة من الحقن.
    2. قم بتشريح الدماغ وبعد التثبيت بمادة بارافورمالديهايد 4٪ طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. كريوبروتكيت في 30٪ سكروز حتى تغوص الأنسجة. مقطع إكليليا عند 40 ميكرومتر.
    3. حضانة الأقسام في محلول حاجب، تليها حضانة الأجسام المضادة الأولية طوال الليل عند درجة حرارة 4 درجات مئوية. اغسل واحتضن الأجسام المضادة الثانوية لمدة ساعة واحدة. استخدم الصبغة العكسية باستخدام DAPI وأقسام التركيب.
    4. احصل على صور باستخدام إعدادات المجهرية المتسقة. معالجة الصور باستخدام برامج التحليل. تحديد المناطق المصابة ب AAV بواسطة الخلايا الموجبة للكرز المغناطيسي.

2. الاستراتيجية الطيفية

  1. انقل الفئران البرية إلى منشأة السلوك واحتزنها بشكل فردي في أقفاص مزودة بعجلات جري، كما هو موضح أعلاه. الحفاظ على الحيوانات في ظلام دائم (DD) لمراقبة النشاط اليومي الحر.
  2. في اليوم الثامن في DD، عند التوقيت اليومي 6 (CT6)، أزل القفص من الخزانة الضوئية وعرض الفأرة لنبضة ضوء مدتها 15 دقيقة.
  3. تعرض الفئران إما لنبضة ضوء زرقاء (λmax = 470 نانومتر؛ 1.8 × 1014–2.2 × 1014 فوتون/سم2/ث) أو نبضة ضوء بنفسجي (λmax = 385 نانومتر؛ 1.45 ×10 14–3.3 × 1014 فوتونا/سم2/ث)، مع قياس الشدة عند المركز وجميع زوايا القفص الأربع على مستوى عين الحيوان.
  4. في كلا الحالتين الموجتين، احتفظ بالفئران في أقفاصها المنزلية مع إزالة أسطح الأقفاص. ضع الأقفاص مباشرة تحت مصدر ضوء ثابت بحيث يكون مركز شعاع الضوء محاذاة مع مركز القفص لضمان إضاءة متجانسة.
  5. أعد الأقفاص فورا إلى مكانها الأصلي تحت ظلام مستمر بعد التعرض للضوء. استمر في تسجيل نشاط تشغيل العجلات دون انقطاع لتحليل إزاحة الطور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لم تظهر فئرانOpn4 Cre/+ التي تعبر عن AAV-DREADD والتي تلقت محلول ملحي عند CT4 تغير طور كبير في نشاط تشغيل العجلات (n = 5؛ الشكل 1B). على النقيض من ذلك، أدى إعطاء CNO عند CT4 إلى تأخير طور كبير في بدء النشاط (متوسط ± SEM: 5.03 ± 0.48 ساعة؛ n = 5؛ الشكل 1C, D)، مما يوضح أن تنشيط DREADD في هذا الزمن اليومي يغير إيقاعات النشاط الحركي. يظهر مخطط التصميم التجريبي في الشكل 2A. ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تظهر النتائج أن تنشيط ipRGCs خلال اليوم الذاتي يمكن أن يسبب تحولات في الطور اليومي في الفئران، وهو وقت يتميز عادة بانخفاض الحساسية للتحفيز الضوئي. مكن النهج الكيميائي الوراثي من التنشيط الانتقائي لمصطلحات ipRGCs بشكل مستقل عن الضوء الخارجي، وأنتج تأخيرات طورية قوية في سلوك دوران العجلة. كما أدى هذا التنشيط إلى تعبير حاد في C-Fos في SCN، مما أكد تنشيط منظم ضربات القلب المركزي. تشير هذه النتائج إلى أن التحفيز القوي المدفوع ب ipRGC لمسار شبكية تحت المهاد كاف للتغلب على انخفاض استجابة النظام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون أعضاء SLCR في NIMH ومختبر الفئران البيولوجي الثلاثي في جونز هوبكنز على النقاشات المفيدة. مصادر التمويل: منحة  المعهد الوطني للصحة النفسية ZIAMH002964 (S.H.)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361نواقل فيروسية تعتمد على Cre ترميز DREADD (hM3Dq) المنصهر مع mCherry لتنشيط ipRGC الانتقائي
Anti-c-Fos antibody (rabbit monoclonal)Cell Signaling Technology2250Sالجسم المضاد الأساسي المستخدم للكشف عن c-Fos كمؤشر على تفعيل الخلايا العصبية
Anti-tdTomato antibody (goat)LSBioLS-C340696الجسم المضاد الأساسي المستخدم للكشف عن تعبير مراسل mCherry/tdTomato
Blue LED driverThorlabsLEDD1Bمورد طاقة للتحكم في شدة ومخرجات LED الأزرق
Blue LED light sourceThorlabsM470L5مصدر LED يصدر ضوءًا أزرق (λmax ≈ 470 نانومتر) للتحفيز الضوئي
ClockLab softwareActimetricsالإصدار 6.0.53برنامج لاكتساب وتحليل بيانات النشاط الحركي اليومي
Clozapine-N-oxide (CNO)Sigma-AldrichC0832-5MGالرابط المستخدم لتفعيل مستقبلات hM3Dq DREADD في الجسم الحي
DAPIInvitrogen62248صبغة نووية مضيئة لتسمية نوى الخلايا
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555InvitrogenA21432الجسم المضاد الثانوي المضيء للكشف عن الأجسام المضادة الأساسية للماعز
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA21206الجسم المضاد الثانوي المضيء للكشف عن الأجسام المضادة الأساسية للأرانب
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02وسط التثبيت المستخدم للحفاظ على اللمعان في أقسام الأنسجة
ImageJ (Fiji) softwareNIHالإصدار 2.16.0/1.54gبرنامج مفتوح المصدر لمعالجة الصور والتحليل الكمي
Opn4cre MiceThe Jackson LaboratryRRID:IMSR_JAX:035925الفئران المستخدمة للتفعيل الكيميائي
Violet LED driverMightexSLA-1000-2مورد طاقة للتحكم في مخرج LED البنفسجي
Violet LED light sourceMightexBLS-LCS-0385-04-22مصدر LED يصدر ضوءًا بنفجي (λmax ≈ 385 نانومتر) للتحفيز المحدد بالطول الموجي
Wild-type miceThe Jackson LaboratryJackson strain #101043الفئران المستخدمة في تجربة الضوء البنفسجي

المراجع

  1. Hattar S, Liao HW, Takao M, Berson DM, Yau KW. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 2002;295(5557):1065–70.
  2. Jones JR, Simon T, Lones L, Herzog ED. SCN VIP neurons are essential for normal light-mediated resetting of the circadian system. J Neurosci. 2018;38(37):7986–95.
  3. Coursey PJ. Daily light sensitivity rhythm in a rodent. Science. 1960;131:33–35.
  4. Kornhauser JM, Ginty DD, Greenberg ME, Mayo KE, Takahashi JS. Light entrainment and activation of signal transduction pathways in the SCN. Prog Brain Res. 1996;111:133–46.
  5. Ding JM, Weber ET, Faiman LE, Rea MA, Gillette MU. Resetting the biological clock: mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO. Science. 1994;266(5191):1713.
  6. Mintz EM, Gillespie CF, Price KM, Albers HE. Activation of NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus produces light-like phase shifts of the circadian clock in vivo. J Neurosci. 1999;19(12):5124–30.
  7. Shirakawa T, Moore RY. Glutamate shifts the phase of the circadian neuronal firing rhythm in the rat suprachiasmatic nucleus in vitro. Neurosci Lett. 1994;178(1):47–50.
  8. Shibata S, Watanabe A, Hamada T, Ono M, Watanabe S. N-methyl-D-aspartate induces phase shifts in circadian rhythm of neuronal activity of rat SCN in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1994;267(2):R360–R364.
  9. Asai M, Yamaguchi S, Isejima H, Jonouchi M, Moriya T, et al. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr Biol. 2001;11(19):1524–27.
  10. Sladek M, Sumova A. Modulation of NMDA-mediated clock resetting in the suprachiasmatic nuclei of mPer2 (Luc) mouse by endocannabinoids. Front Physiol. 2019;10:361.
  11. Shibata S, Moore RY. Neuropeptide Y and optic chiasm stimulation affect suprachiasmatic nucleus circadian function in vitro. Brain Res. 1993;615(1):95–100.
  12. Jones JR, Tackenberg MC, McMahon DG. Manipulating circadian clock neuron firing rate resets molecular circadian rhythms and behavior. Nat Neurosci. 2015;18(3):373–75.
  13. Kim S, McMahon DG. Light sets the brain’s daily clock by regional quickening and slowing of the molecular clockworks at dawn and dusk. Elife. 2021;10:e70137.
  14. de Vries MJ, Treep JA, de Pauw ES, Meijer JH. The effects of electrical stimulation of the optic nerves and anterior optic chiasm on the circadian activity rhythm of the Syrian hamster: involvement of excitatory amino acids. Brain Res. 1994;642(1-2):206–12.
  15. Rusak B, Groos G. Suprachiasmatic stimulation phase shifts rodent circadian rhythms. Science. 1982;215(4538):1407–09.
  16. Duy PQ, Komal R, Richardson ME, Hahm KS, Fernandez DC, et al. Light has diverse spatiotemporal molecular changes in the mouse suprachiasmatic nucleus. J Biol Rhythms. 2020;35(6):576–87.
  17. Liu A, Milner ES, Peng YR, Blume HA, Brown MC, et al. Encoding of environmental illumination by primate melanopsin neurons. Science. 2023;379(6630):376–81.
  18. Milner ES, Do MTH. A population representation of absolute light intensity in the mammalian retina. Cell. 2017;171(4):865–876.e16.
  19. Komal R, Beier C, Nath A, et al. ipRGC properties prevent light from shifting the SCN clock during daytime. Nature. 2026;650(8103):942–50. .
  20. Jewett ME, Rimmer DW, Duffy JF, Klerman EB, Kronauer RE, et al. Human circadian pacemaker is sensitive to light throughout subjective day without evidence of transients. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1997;273(5):R1800–R1809.
  21. Revell VL, Molina TA, Eastman CI. Human phase response curve to intermittent blue light using a commercially available device. J Physiol. 2012;590(19):4859–68.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

DREADDs c Fos
تحفيز تحولات الطور اليومي خلال النهار باستخدام الأساليب الكيميائية والطائفية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.