مقالة منهجية

تحضير مفصل لشبكات ألفة أحادية الطبقة الدهنية Ni-NTA لتحليل هيكلي للبروتين القابل للذوبان الموسوم ب polyhistidine

293 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71598

⸱

أغسطس 4, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, UNC Chapel Hill School of Medicine, 2Department of Electrical and Computer Engineering, North Carolina State University, 3Department of Chemistry and Biochemistry, Division of Physical and Biological Sciences, University of California Santa Cruz, 4UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center, UNC Chapel Hill School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تحضير شبكات الميل أحادية الطبقة الدهنية Ni-NTA على الطاولة للمجهر الإلكتروني البارد (cryo-EM). يقوم تعديل سطح شبكة المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) بالتقاط مجمعات البروتين القابلة للذوبان الموسومة ب polyhistidine بشكل انتقائي، مما يحسن تحديد البنيوية من خلال تركيز العينات المخففة وربط الجسيمات بعيدا عن واجهة الهواء والماء.

الملخص

لا يزال تحضير العينات المجمدة تحديا تقنيا كبيرا في تحديد البنى عالي الدقة لمجمعات البروتينات. يمكن أن تؤدي التفاعلات عند واجهة الهواء والماء إلى إزالة الطبيعة للبروتين أو تفضيلها في الاتجاه، مما يحد من الدقة الممكنة. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما تظهر العينات المخففة أو الأهداف منخفضة الوفرة كثافة جسيمات غير كافية، مما يعيق جمع البيانات بكفاءة. توفر شبكات الألفة القائمة على الدهون استراتيجية فعالة لمعالجة هذه القيود. تقدم هذه المقالة بروتوكولا خطوة بخطوة لتحضير شبكات ألفة أحادية الطبقة الدهنية Ni-NTA لتحليل هيكلي لمجمعات البروتينات الموسومة ب polyhistidine القابلة للذوبان. تشمل المراحل الرئيسية للبروتوكول تحضير خليط الدهون، صب خليط الدهون على سطح مخزن الخزان، نقل طبقة الدهون الأحادية الناتجة إلى شبكات TEM، تجفيف وتخزين شبكات الدهون اختياريا لمدة تصل إلى أسبوع، وغمر الشبكات بالتجمد مع العينة. يؤدي التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول إلى شبكات تجميد تحتوي على طبقة واحدة من الجسيمات المتفرقة جيدا مع كثافة جسيمات محسنة مقارنة بالشبكات المعدة بدون طبقة أحادية دهنية. يمكن إتمام العملية خلال بضع ساعات في مختبر مزود بمكبس تجميد، وغطاء بخار كيميائي، وأدوات قياسية تستخدم عادة لتحضير العينات بالتجميد. من خلال دمج التعليمات المكتوبة التفصيلية مع عروض الفيديو، يهدف هذا العمل إلى تحسين سهولة الوصول وقابلية التكرار والتبني الأوسع لشبكات الألفة أحادية الطبقة الدهنية Ni-NTA داخل مجتمع التجميد والكهرومغناطيسية.

المقدمة

تعتمد التقنيات التجريبية لتحديد بنية البروتين، بما في ذلك البلورات بالأشعة السينية، والرنين المغناطيسي النووي (NMR)، والمجهر الإلكتروني البارد (cryo-EM)، جميعها على تحضير عينات بعناية. في تحليل الجسيمات المفردة (SPA) في التجميد الكهرومغناطيسي، غالبا ما تكون جودة العينة هي العامل الأساسي الذي يحد من دقة إعادة البناء النهائية. مع استمرار التقدم التكنولوجي في مجاهر الإلكترونات الناقلة بالتجميد (CRIO-TEMs) وكواشف الإلكترونات المباشرة في تحسين كفاءة جمع البيانات والدقة الممكنة، يتحول التحدي الرئيسي في تقنية التبريد الكهرومغناطيسي عالي الدقة بشكل متزايد من التقاط الصور إلى تحضير العينات والجودة 1,2,3,4,5,6,7.

عادة ما يتضمن تحضير الشبكة البريدية التقليدية تطبيق بضعة ميكرولترات من العينة على سطح شبكة المجهر الإلكتروني الناقل (TEM)، وتغطية الشبكة بورق الترشيح، ثم غمرها بسرعة في مادة تجميد، عادة الإيثان السائل أو خليط البروبان-الإيثان. من الناحية المثالية، تحتوي شبكة التجمد الناتجة على جليد زجاجي رقيق مع جسيمات أحادية التشتت. في الواقع، غالبا ما يكون تحقيق هذه النتيجة صعبا وقد يتطلب عدة جولات من التحسين لتوليد شبكات مناسبة لتحديد الهيكل عالي الدقة. تشمل المشاكل الشائعة إزالة البروتين عند واجهة الهواء والماء (AWI)8,9، الاتجاه المفضل10، وانخفاض كثافة الجسيمات داخل طبقة الجليد 11,12. ويعد هذا التحدي الأخير مهما بشكل خاص للمجمعات البروتينية التي تكون ديناميكية للغاية، قصيرة العمر، أو يصعب عزلها عند تركيزات ميكروموللار. تم تطوير عدة استراتيجيات لمعالجة هذه القيود، بما في ذلك أكسيد الجرافين13، وكربون14 الرقيق جدا المستمر وحبيبات نانوية مغلفة بالستربتافيدين لالتقاط الأهداف البيوتينيلية15.

نهج بديل يتضمن تعديل شبكات TEM ذات أسطح ألفة مصممة لربط الجزيئات المستهدفة بشكل انتقائي. يمكن لهذه الشبكات التقاربية تركيز الجسيمات على سطح الشبكة مع تقليل التعرض للمؤشر الصناعي البشري، مما يحسن توزيع الجسيمات ويحافظ على سلامة الهيكل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن لتأثير التركيز أن يثري المركبات الجزيئية الكبيرة منخفضة الوفرة من عينات مخففة أو غير متجانسة.

خلال العقد الماضي، تم تطوير عدة استراتيجيات لشبكة التقارب لنظام SPA cryo-EM. يمكن تصنيف هذه الأساليب حسب تعديل سطح شبكة TEM واستراتيجية الوظيفة المقابلة. تشمل الأسطح المستخدمة بشكل شائع الكربون غير المتبلور فائق الرقة،و14 الجرافين أو أكسيد الجرافين 13,16، وأحادية الدهون أو أنابيب الدهون، 17,18، وبلورات الستربتافيدين ثنائية الأبعاد التي تنمو على طبقات دهنيةأحادية 19,20. من بين هذه الأساليب، نجحت شبكات الألفة ثنائية الأبعاد لستربتافيدين بشكل خاص في تمكين تحديد بنية البروتين عالية الدقة 21,22,23,24,25,26,27,28,29. تشمل المنهجيات ذات الصلة استخدام ستربتافيدين أحادي الجسيم أحادي التشتت المرتبط بطبقات الدهون الأحادية، والذي تم تطبيقه مؤخرا لتحديد بنية مركب صيانة الكروموسومات المصغر المرتبط بالحمض النووي ثنائي السلسلة (dsDNA)30.

على الرغم من هذه التطورات، لا تزال الطرق المتاحة والقابلة للتكرار لتحضير شبكة التقارب محدودة. لكل تقنية متطلبات عينة فريدة لربط الأهداف الانتقائية، ولا توجد أي منها متاحة تجاريا، مما يتطلب بروتوكولات تصنيع متخصصة وتعديلات كيميائية. يمكن لهذه الخطوات الإضافية أن تزيد بشكل كبير من التعقيد التقني لسير عمل SPA بنظام التجميد والEM. وبناء عليه، تقدم هذه المقالة بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة يهدف إلى تسهيل إعداد تقنية شبكة التقارب الموضحة هنا. بروتوكول شبكة الألفة أحادية الطبقة الدهنية Ni-NTA تم تطبيقه بشكل روتيني في السابق17 ويمكن اعتماده بسهولة في الدراسات البنيوية بالتجميد والEM لمجمعات البروتين القابلة للذوبان الموسومة ب البوليهيستيدين والتي تغطي نطاق واسع من الوزن الجزيئي (97–470 كيلو دالتون) (الشكل 1). الطريقة متوافقة مع تركيزات البروتين التي تتراوح بين 0.05 إلى 0.2 ملغ/مل في المخازم الخالية من المنظفات.

figure-introduction-1
الشكل 1: نظرة عامة على تصميم شبكة الألفة الدهنية Ni-NTA. (أ) مخطط لشبكة جليد دهنية بنسبة 20٪ من Ni-NTA. تظهر شبكة التجمد على اليسار، مع عرض مقطع عرضي للطبقة الأحادية الدهنية توضح أبعاد الطبقة الكربونية، وطبقة الأحادية الدهنية، والجليد الزجاجي، والجسيمات المرتبطة (في المركز). يتم تصوير التفاعل بين سلاسل الجوانب الهيستيدية والدهون النيلولية وغير القابلة للطي (Ni-NTA) على اليمين. (ب) أمثلة على بروتينات موسومة ب polyhistidine تم حلها باستخدام شبكات ألفة دهونية. يتم رسم الخرائط حسب الحجم بالنسبة لبعضها البعض، مع تحديد الوزن الجزيئي، الحجم، الدقة، ورقم وصول EMDB. (ج) شرائح مقطعية تمثيلية من النيوكليوسومات الموسومة بعلامات البوليهستيدين محضرة باستخدام شبكات تجميد غير دهنية عند 2 ملغ/مل (يمين) وشبكات تجميد دهنية Ni-NTA عند 0.05 ملغ/مل (يسار). (د) متوسط عامل التركيز لشبكات التبريد غير الدهنية مقارنة بشبكات التبريد ذات الألفة الدهنية Ni-NTA، مما يدل على قدرة طبقة الدهون على تركيز البروتينات الموسومة بالبوليهستيدين بعيدا عن واجهة الهواء والماء (AWI). تم اقتباس أجزاء من هذا الشكل من الأشكال 1A,B و2A,B في سكراينا وآخرون 17 بإذن من إلسيفير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

البروتوكول

لم تشمل هذه الدراسة مشاركين بشريين، أو بيانات سريرية، أو حيوانات حية. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

ملاحظة: DOPC يشير إلى نسبة 18:1 (Δ9-cis) PC. يشير دهن Ni-NTA إلى نسبة 18:1 DGS-NTA(Ni). يشير العزل منخفض الملح إلى HEPES بمقدار 10 ملليمولار (pH 7.4) مع 50 مللي مولار NaCl. يشير مصطلح التخفيف إلى HEPES بقوة 20 مللي مولار (pH 7.4) مع 150 مللي مولار NaCl.

1. غسل الأواني الزجاجية القابلة لإعادة الاستخدام (~30 دقيقة)

  1. اجمع صحنين صغيرين من البترية، وغطاءين صغيرين لأطباق البتري، وقارورة حجمية بسعة 25 مل مع سدادة، وقارورة حجمية بسعة 1 مل مع سدادة. ضع الأشياء بالقرب من الحوض.
  2. قم بإذابة مسحوق خافض التوتر السطحي الأنيوني في ماء ماء ماء دافئ في حوض بلاستيكي بسعة 11.4 لتر.
  3. اغمر الزجاج بلطف في محلول المادة الفعالة للتوتر السطحي.
  4. أثناء ارتداء قفازات النيتريل، فرك جميع الأسطح الزجاجية المتاحة بفرشاة أدوات المختبر. اشطفها جيدا بماء فائق النقي.
  5. أزل الماء المتبقي عن طريق النقر الخفيف على المناشف الورقية على الأواني الزجاجية.
  6. جفف الأواني بمجفف الشعر حتى لا يبقى أي رطوبة ظاهرة.
    ملاحظة: خزن الأواني الزجاجية المغسولة في بيئة نظيفة وخالية من الغبار.

2. موازنة الدهون إلى درجة حرارة الغرفة (1–4 ساعات)

ملاحظة: إذا كانت مخزونات الدهون قد تم تحضيرها مسبقا، تجاوز هذا القسم.

  1. ضع أمبولة محكمة الإغلاق من مسحوق DOPC بسعة 25 ملغ وأمبولة محكمة الإغلاق من مسحوق الدهون Ni-NTA بجرعة 1 ملغ في غطاء أبخرة كيميائي.
  2. وازن الدهون مع درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة على الأقل.

3. إعداد محطة تنظيف المذيبات (~10 دقائق)

تحذير: الكلوروفورم سائل خطير ومتطاير يعمل كمثبط للجهاز العصبي المركزي ومهيج للجلد والعين والتنفس. قم بجميع الخطوات التي تتضمن أكثر من 100 ميكرولتر من الكلوروفورم داخل غطاء بخار كيميائي مع ارتداء معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات، ومعطف المختبر، وحماية العين. قم بإزالة وتخلص من قفازات النيتريل الملوثة خلال دقيقة واحدة من التعرض، حيث يخترق الكلوروفورم النيتريل بسرعة. لا تدمج نفايات الكلوروفورم مع تدفقات النفايات الكيميائية الأخرى.

  1. اجمع 99.8٪ كلوروفورم، وزجاجة نفايات كلوروفورم بغطاء، و99.5٪ إيثانول، وزجاجة نفايات إيثانول بغطاء، وحاوية حادة واحدة، وصحنين صغيرين من البتري، وغطاءين صغيرين لأطباق بتريري، وطبق بتري كبير يحتوي على ورق فلتر من الدرجة الأولى، وثلاثقطع أو أكثر من الفيلم ذاتي الإغلاق بحجم 1–2 سم، ومناشف ورقية. رتب جميع المواد في غطاء البخار الكيميائي (الشكل 2).
  2. اشطف أطباق البتري بكمية 20–30 مل من الكلوروفورم. تخلص من الشطف في زجاجة النفايات المناسبة. كرر العملية مع الإيثانول. جفف الصحون بالهواء.
  3. املأ صحن بتري صغير بالكلوروفورم والآخر بالإيثانول. غط كلا الطبقين لتقليل التبخر.
  4. أعد تعبئة أطباق البتيري طوال التجربة، خاصة عندما يصبح الكلوروفورم عكما بوضوح بسبب الملوثات.

figure-protocol-1
الشكل 2: غطاء بخار كيميائي يحتوي على أدوات وكواشف لتحضير خليط الدهون. صورة لمحطة تنظيف المذيبات والأدوات النظيفة، والزجاج، وشبكات TEM. زجاجات من اليسار إلى اليمين: نفايات الإيثانول، الإيثانول، الكلوروفورم، ونفايات الكلوروفورم. أطباق بتيري من اليسار إلى اليمين: الإيثانول، الكلوروفورم، وشبكات TEM على ورق الفلتر. تشمل العناصر الإضافية من اليسار إلى اليمين ومن الأعلى إلى الأسفل أنابيب الزراعة في رف الأنابيب، أمبولات دهونية، قوارير حجمية مع سدادات، شبكات TEM مخزنة، ماصات زجاجية مع لمبات، ملاقط ذات رؤوس دقيقة، حقن زجاجية، وملاقط مضادة للشعيرات الدموية مع فواصل (قطع أقلام رصاص) مدمجة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. أدوات التنظيف، وأدوات الزجاج، وشبكات TEM مع المذيبات (~20 دقيقة)

  1. اجمع زوجا واحدا من الملقط ذات الرؤوس الدقيقة، واثني عشر زوجا من الملقط المضاد للشعيرات الدموية ذاتية الإغلاق، وثلاث ماصات زجاجية، وحقنة زجاجية واحدة بسعة 25 ميكرولتر، وحقنة زجاجية بسعة 2.5 ميكرولتر، وثلاثة أنابيب زراعة زجاجية في رف أنبوبي، وقارورة حجمية بسعة 25 مل مع سداد، وقارورة حجم بسعة 1 مل مع سدادة، وعشرين إلى خمسة وعشرين قارورة زجاجية ملولبة بسعة 3.7 مل مع أغطية فينولية. واثنتا عشرة شبكة TEM ذات شبكة ذهبية ثقوبة من الكربون. ضع المواد بالقرب من محطة تنظيف المذيبات في غطاء البخار الكيميائي.
    ملاحظة: احتفظ بفاصل، مثل قطعة قلم رصاص، في كل زوج من الملقط المضاد للشعيرات الدموية عند عدم الاستخدام لمنع تشوه الطرف وعدم محاذاة. تخلص من الملقط المنحني.
  2. نظف الملقط بغمر الأطراف في الكلوروفورم عدة مرات. كرر العملية مع الإيثانول. تجف في الهواء.
  3. نظف الماصات الزجاجية عن طريق شفط وصرف الكلوروفورم عدة مرات. كرر العملية مع الإيثانول. تجف في الهواء.
  4. نظف المحاقن عن طريق شفط وصرف الكلوروفورم حتى يتحرك المكبس بسلاسة. كرر العملية مع الإيثانول. أزل المكبس من فوهة الحقنة وجفف الهواء.
  5. نظف أنابيب الزراعة بإضافة وإزالة الكلوروفورم عدة مرات باستخدام ماصنة زجاجية. كرر العملية مع الإيثانول. أزل السائل المتبقي عن طريق قلب الأنابيب والنقر عليها بلطف على مناشف ورقية. تجف في الهواء.
  6. نظف القوارير الحجمية بإضافة الكلوروفورم باستخدام ماصة زجاجية، وإغلاق القارورة، وتحريك الزجاجة بلطف لشطف الأسطح الداخلية. تخلص من المذيب في زجاجة النفايات. كرر العملية مع الإيثانول. اترك القوارير غير مغلقة وجففها بالهواء.
  7. نظف القوارير بإضافة الكلوروفورم باستخدام ماصة زجاجية، ثم غطاءها، ثم حرك الزجاجة بلطف لشطف الأسطح الداخلية. تخلص من المذيب. كرر العملية مع الإيثانول. اترك القوارير غير مغطاة وجافة في الهواء.
  8. نظف شبكات TEM عن طريق الإمساك بالحافة الخارجية المقوزة بملقط ذو رؤوس دقيقة مع تجنب تلف طبقة الكربون. اغمر الشبكات عموديا في الكلوروفورم ثلاث مرات، ثم في الإيثانول ثلاث مرات.
  9. ضع جانب شبكات TEM الكربوني للأعلى على ورق الفلتر ودعها تجف في الهواء.

5. تبريد مخزن الإلقاء (>20 دقيقة)

  1. ضع على الثلج على الأقل 50 مل من المحلول منخفض المملح.
  2. برد المخزن لمدة لا تقل عن 20 دقيقة.

6. تحضير محاليل منفصلة بسعة 1 ملغ/لتر من مخزون الكلوروفورم من DOPC وNi-NTA (~20 دقيقة)

ملاحظة: إذا كانت مخزونات الدهون قد تم تحضيرها مسبقا، انتقل إلى القسم 8، "تحضير خليط الدهون 80٪ من DOPC/20٪ Ni-NTA."

  1. تأكد من أن مساحيق الدهون DOPC وNi-NTA قد توازنت مع درجة حرارة الغرفة.
    تحذير: الشفرات والزجاج المكسور تشكل مخاطر حادة. كن حذرا عند استخدام ماكينة الحلاقة وكسر أمبولات الزجاج.
  2. لتحسين رؤية مسحوق DOPC، قم بإزالة مسممة الأمبولة عن طريق قطعها بشفرة حلاقة وتقشيرها. كرر ذلك لأمبولة الدهون Ni-NTA.
  3. باستخدام كلتا يديك والعمل على حاوية الحادة، كسر الأمبولة التي تحتوي على 25 ملغ من DOPC بعناية. تخلص من عنق الأمبولة في حاوية الشاريز. ضع جسم الأمبولة بالقرب من طبق الكلوروفورم. كرر العملية مع أمبولة الدهون Ni-NTA بوزن 1 ملغ من Ni-NTA.
  4. قم بتنظيف شظايا الزجاج من القفازات وأسطح العمل بعناية في حاوية الحاد. استبدل القفازات التالفة فورا.
  5. ضع علامة على ماصة زجاجية واحدة للكلوروفورم، وواحدة لمادة DOPC، وواحدة لدهون Ni-NTA.
  6. املأ طبق بتري صغير منظف بالمذيب بالكلوروفورم.
  7. استخدم ماصة DOPC لنقل 2–5 مل من الكلوروفورم إلى أمبولة DOPC. استنشق المحلول ووزعه حتى يذوب الدهون في الأسفل والجوانب تماما.
  8. انقل محلول DOPC إلى قارورة حجمية بسعة 25 مل باستخدام ماصنة DOPC. ارفع حجم القارورة إلى حجم نهائي 25 مل باستخدام الكلوروفورم باستخدام ماصة الكلوروفورم.
  9. تخلص من أمبولة DOPC في حاوية الأصوات الحادة.
  10. نقل أقل من 1 مل من الكلوروفورم إلى قارورة حجم 1 مل باستخدام ماصة الكلوروفورم.
  11. استخدم ماصة الدهون Ni-NTA لنقل الكلوروفورم من القارورة الحجمية بحجم 1 مل إلى أمبولة الدهون Ni-NTA. استنشق المحلول ووزعه حتى يذوب الدهون في الأسفل والجوانب تماما.
  12. نقل محلول الدهون Ni-NTA إلى قارورة حجمية بسعة 1 مل باستخدام ماصة الدهون Ni-NTA. ارفع القارورة إلى حجم نهائي 1 مل باستخدام الكلوروفورم باستخدام ماصة الكلوروفورم.
  13. تخلص من أمبولة الدهون Ni-NTA في حاوية القطع الحادة.

7. تحضير كميات صغيرة من الدهون للتخزين طويل الأمد (~15 دقيقة)

  1. استخدم ماصة DOPC لتقسيم 1–2 مل من مخزون DOPC إلى عدة قوارير زجاجية. أغلق وأضع ملصقات على القوارير.
  2. استخدم ماصة الدهون Ni-NTA لفصل 0.2–0.5 مل من مخزون الدهون Ni-NTA في عدة قوارير زجاجية. أغلق وأضع ملصقات على القوارير.
    تحذير: النيتروجين السائل (LN2) هو مادة تجميد قد تنتج في البداية تأثير لايدنفروست قصير قبل أن يسبب ألما شديدا، وخدرا، وتقرحا، وقضمة صقيع. تزداد شدة الإصابة مع مدة التعرض ويمكن أن تتطور من الحروق من الدرجة الأولى إلى الرابعة في أقل من دقيقة واحدة. الأجسام التي تبرد بواسطة LN2 يمكن أن تسبب إصابات مماثلة. كن حذرا من التوصيل الحراري عبر أدوات العينات المجمدة أثناء التعامل معها في LN2. ارتد واقي وجه للحماية من الرشات الزجاجية. لا تغمر اليدين في LN2، حتى أثناء ارتداء قفازات واقية من التجميد، لأن LN2 المحبوس قد يبقى على اتصال بالجلد. لا تخلط بين بخار الماء المكثف في الغلاف الجوي وبخار LN2. يتمدد LN2 بحوالي 700× حجمه عند تحويله إلى مخنق غازي غير مرئي عديم الرائحة. تأكد من أن جميع خزانات LN2 والديوار مهوية بشكل صحيح لمنع تراكم الضغط. استخدم LN2 فقط في المناطق ذات التهوية الجيدة وقم بتبخير LN2 غير المستخدم في غطاء بخار كيميائي.
  3. املأ ديوار كريوجين صغير ب LN2.
  4. أزل الغطاء من إحدى قارورة الأليكوت، واصب بخار النيتروجين فيها، ثم أعد غطاء القارورة، وأغلقها بطبقة غشية ذاتية الإغلاق ذاتيا. كرر ذلك لجميع قوارير الأليكوت.
    ملاحظة: تخزين مخزون الدهون على درجة حرارة −20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.

8. تحضير خليط الدهون 80٪ DOPC/20٪ Ni-NTA (~15 دقيقة)

  1. تأكد من أن معادلات الدهون في مخزون DOPC وNi-NTA قد توازنت مع درجة حرارة الغرفة.
  2. ضع علامة على أنبوب زراعة زجاجي واحد ل DOPC، وآخر لدهون Ni-NTA، وآخر لخليط الدهون.
  3. استخدم ماصة DOPC لنقل 50–100 ميكرولتر (2–3 قطرات) من مخزون DOPC إلى أنبوب زراعة DOPC. أغلق الأنبوب بفيلم ذاتي الإغلاق.
  4. استخدم ماصة الدهون Ni-NTA لنقل 20–50 ميكرولتر (1–2 قطرة) من مخزون الدهون Ni-NTA إلى أنبوب زراعة الدهون Ni-NTA. أغلق الأنبوب بفيلم ذاتي الإغلاق.
  5. استخدم حقنة 25 ميكرولتر لسحب 20 ميكرولتر من القطر المزدوج المزدوج إلى ماسورة الحقنة. تأكد من أن البرميل لا يحتوي على فقاعات وأعد سحب العينة إذا لزم الأمر. قم بتوزيع العليكوت في أنبوب خليط الدهون. كرر مرة واحدة ليصل إجمالي الحجم إلى 40 ميكرولتر.
  6. نظف الحقنة بالكلوروفورم ثم الإيثانول.
  7. استخدم الحقنة لسحب 10 ميكرولتر من أليكوات الدهون Ni-NTA. تأكد من أن البرميل لا يحتوي على فقاعات وأعد سحب العينة إذا لزم الأمر. قم بتوزيع الأليكوت في أنبوب خليط الدهون، ليصل الحجم الكلي النهائي إلى 50 ميكرولتر.
  8. اخلط الدهون عن طريق شفط المحلول وصرفه عدة مرات. أغلق الأنبوب بفيلم ذاتي الإغلاق.
  9. نظف الحقنة بالكلوروفورم ثم الإيثانول. تجف في الهواء.

9. صب طبقة أحادية الدهون ونقلها إلى شبكات TEM (~10 دقائق)

  1. تأكد من تبريد المحلول منخفض المملح.
  2. اجمع مصباح LED صغير واحد، ومخزن مبرد منخفض الملح، وزجاجة نفايات عازل مغطاة بغطاء، وإيثانول كاشف، وزجاجة نفايات إيثانول واحدة، وزجاجة زيت خروع مع قطارة، وخليط الدهون، وطبق بتري صغير واحد، وحقنة بسعة 2.5 ميكرولتر، واثني عشر زوجا من الملقط المضاد للشعيرات الدموية، واثني عشر شبكة TEM، وأنسجة منخفضة الوبر. رتب المواد على سطح طاولة أسود مضاء جيدا (الشكل 3).
  3. وجه الذراع المسطح لكل زوج من الملقط المضاد للشعيرات الدموية على الجانب الكربوني من شبكة TEM. ثبت الشبكة على طول الحافة الخارجية المقوى. كرر ذلك لجميع الشبكات.
  4. املأ طبق البتري الصغير حتى الحافة بمحلول بارد منخفض الملح (الشكل 4A). ضع قطرة واحدة من زيت الخروع في مركز سطح المخزن (الشكل 4B، 4C).
    ملاحظة: تقدم بسرعة في الخطوات التالية لأن طبقة الدهون الأحادية تتحرك تدريجيا بعيدا عن مركز زيت الخروع مع مرور الوقت، مما يقلل من كفاءة النقل. تقلبات درجة الحرارة والاهتزازات تسرع هذه العملية.
  5. استخدم حقنة 2.5 ميكرولتر لسحب 1 ميكرولتر من خليط الدهون. اخفض طرف إبرة الحقنة إلى مركز زيت الخروع. تخلص خليط الدهون كقطرة معلقة من حافة الإبرة فوق السطح مباشرة، ثم المس القطرة بلطف إلى زيت الخروع (الشكل 4D).
  6. استخدم مصباح LED لتأكيد تكوين دائرة دهنية مسطحة بقطر 2–3 سم محاطة بحلقة من زيت الخروع (الشكل 4E). إذا لم يلاحظ هذا الشكل، قم بإعادة ضبط طبق الصب عن طريق التخلص من المحلول المؤقت (المخزن المؤقت للماء)، وشطف الطبق بإيثانول الكاشف، والتجفيف بأنسجة منخفضة الوبر، وإعادة تطبيق خليط العزل منخفض الملح، وزيت الخروع، وخليط الدهون.
    ملاحظة: زيادة زيت الخروع تعيق تكوين طبقة الديون الأحادية، بينما نقص زيت الخروع يفشل في احتواء الطبقة الأحادية. سيولة الدهون تعتمد على درجة الحرارة. إذا كان المحلول المؤقت باردا جدا، لا ينتشر الدهون إلى طبقة أحادية. إذا كان الحاجز دافئا جدا، ينتقل الدهون وزيت الخروع نحو حافة الطبق وينهاران. صب المحلول المبرد في طبق بتري بدرجة حرارة الغرفة لتحقيق توزيع أمثل للدهون. أعد ضبط طبق الصب حسب الحاجة بعد كل نقل شبكة. تأكد من أن طبق الصب خال تماما من الزيت قبل إضافة المحلول الطازج.
  7. انقل طبقة الدهون الأحادية إلى شبكة TEM عن طريق خفض شبكة TEM المثبتة إلى مركز صب الدهون مع مواجهة الجانب الكربوني للأسفل. المس السطح الكربوني بالكامل بلطف على طبقة الدهون الأحادية دون غمر أو تحرير الشبكة (الشكل 4F).
  8. افحص شبكة الدهون للتأكد من التغطية الكاملة للسائل وعدم وجود زيت الخروع (الشكل 5). تخلص من الشبكات الزيتية.
  9. كرر عملية النقل لجميع شبكات TEM.
    ملاحظة: قد تجف شبكات الدهون المثبتة خلال 5–10 دقائق. قد تبقى شبكات الدهون مثبتة على سطح الطاولة طوال الليل قبل إعادة الترطيب. بدلا من ذلك، يمكن وضع شبكات الدهون المجففة في صندوق شبكي وتخزينها في مجفف على درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع قبل إعادة التثبيت والترطيب.
    حرج: تابع فقط إذا حدث التجمد الغامض خلال ساعتين. وإلا، قم بتأخير الخطوات المتبقية.

figure-protocol-2
الشكل 3: إعداد الطاولة لصب طبقات الدهون الأحادية والتجميد العميق. (أ) العناصر المعروضة من اليسار إلى اليمين ومن الأعلى إلى الأسفل تشمل زجاجة قطارة زيت الخروع، زجاجة نفايات عازلة، مصباح LED، مخزن بارد منخفض الملح على الثلج، رف أنابيب يحتوي على أليكوتات دهنية وخليط دهني، حقنة زجاجية بسعة 2.5 ميكرولتر، طبق بتري فارغ، طبق بتري يحتوي على شبكات TEM على ورق مرشح، ملقط ذو رؤوس دقيقة، وملاقط مضادة للشعيرات الدموية مع فواصل مدخلة. (ب) العناصر المعروضة تشمل مكبس تبريد مبرد ورطب، وعاء مكبس تجميد مجمع، دلو ثلج يحتوي على حاجز تخفيف وعينة، غرفة رطوبة مغطاة بورق الألمنيوم، فيلم مغلق ذاتي الإغلاق مع خطوط قطرات خازن التخفيف، ملاقط مكبس بالتجميد، وميكروبايبت. (ج) غرفة رطوبة على سطح الطاولة تحتوي على الثلج، مناشف ورقية مبللة، فيلم ذاتي الختم، وحامل ملقط على الطاولة. (د) شبكات الدهون المثبتة بواسطة ملقط مضاد للشعيرات الدموية داخل غرفة الرطوبة على سطح الطاولة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-3
الشكل 4: صب طبقة أحادية من الدهون ونقلها إلى شبكات TEM. (أ) طبق صب مملوء بمحلول منخفض الملح. (ب) توزيع قطرة واحدة من زيت الخروع على طبق الصب. (ج) دائرة من زيت الخروع تطفو على سطح المخزن الخارجي؛ يشير السهم الأسود إلى حدود زيت الخروع. (د) إبرة حقنة مركزة فوق زيت الخروع مع الميل للأسفل متجهة للأسفل؛ قطرة واحدة من خليط الدهون معلقة من طرف الإبرة. (ه) خليط الدهون المنتشر داخل حلقة من زيت الخروع؛ السهم الأسود يشير إلى حدود زيت الخروع، والسهم الأبيض إلى حدود طبقة الدهون الأحادية. (و) نقل طبقة الدهون الأحادية إلى الجانب الكربوني من شبكة TEM. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-protocol-4
الشكل 5: أمثلة على شبكات TEM بعد نقل أحادية الطبقة الدهنية. (أ) نقل الدهون بنجاح مع توزيع المخزن المؤقت على كامل سطح الشبكة. (ب) نقل الدهون بنجاح بعد التجفيف بالهواء لمدة ساعة واحدة. (ج) انتقال دهون ملوث بزيت الخروع، مرئي في مركز الشبكة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

10. حضانة ورق البقع في مكبس تجميد عند 4 درجات مئوية ورطوبة 100٪ (>ساعة واحدة)

  1. اضبط غرفة رطوبة المكبس الكريو على 4 درجات مئوية ورطوبة 100٪.
  2. قم بتركيب ورق البقع على وسادات الصبغ. حضن ورق البلوت على رطوبة عالية لمدة ساعة على الأقل.

11. تبريد مخزن التخفيف (~20 دقيقة)

  1. ضع ما لا يقل عن 20 مل من حاجز التخفيف على الثلج.
  2. برد المخزن لمدة لا تقل عن 20 دقيقة.

12. حضانة مخزن التخفيف على شبكات الدهون (>15 دقيقة)

  1. اجمع طبق خبز واحد، ونسخة واحدة من حامل ملقط مطبوع ثلاثي الأبعاد (الملفات الإضافية 1–3)، وشريط 25–35 سم من فيلم ذاتي الإغلاق بعرض 10 سم، وشريط بعرض 35–45 سم من ورق الألمنيوم بعرض 30.4 سم، وثلج، ومناشف ورقية. ضع المواد بالقرب من المكبس البارد (الشكل 3).
  2. ضع طبق الخبز طوليا بجانب مكبس التجميد. املأ الطبق نصف الثلج، ثم غطه بمناديل ورقية. بلل مناشف الورق برفق بماء الصنبور.
  3. ضع شريط الفيلم الذاتي الإغلاق طوليا على النصف البعيد من طبق الخبز مباشرة فوق المناشف الورقية المبللة.
  4. ضع حامل الملقط المطبوع ثلاثي الأبعاد طوليا في وسط طبق الخبز، مباشرة على مناشف الورق المبللة والفيلم الذاتي الختم.
  5. غط طبق الخبز بورق الألمنيوم (الشكل 3).
  6. استبدال الجليد المذاب طوال التجربة.
  7. ضع شبكات الدهون المثبتة في غرفة الرطوبة فوق الفيلم الذاتي الإغلاق بحيث يكون جانب الدهون متجها للأعلى (الشكل 3).
    ملاحظة: تجنب تحريك غرفة الرطوبة على سطح الطاولة أو لمس شبكات الدهون بطرف الماصة لأن هذه الحركات قد تؤدي إلى تحريك الشبكات. استرجع أي شبكات تسقط على الفيلم الذاتي الإغلاق إذا بقيت الشبكات سليمة.
  8. تطبيق 2 ميكرولتر من محلول تخفيف العينة على كل سطح دهني. غط الحجرة بورق الألمنيوم لتقليل التبخر.
  9. حافظ على ترطيب كل شبكة دهنية عن طريق تطبيق 2 ميكرولتر إضافيين من مخزن التخفيف كلما بقي أقل من 1 ميكرولتر من السائل على الشبكة.
  10. قم بضبط شبكات الدهون المائية في غرفة الرطوبة المبردة لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.

13. حضان العينة على شبكات الدهون (>15 دقيقة)

  1. تأكد من أن شبكات الدهون قد تم ترطيبها بمحلول تخفيف مستمر لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
  2. تأكد من أن مخزن تخفيف المخزون مبرد بالكامل.
  3. ضع 3 ميكرولتر من عينة موسومة ب polyhistidine على كل شبكة دهنية مرطبة. غط الحجرة بورق الألمنيوم لتقليل التبخر.
  4. حافظ على ترطيب كل شبكة دهنية عن طريق تطبيق 2 ميكرولتر إضافي من محلول التخفيف كلما بقي أقل من 2 ميكرولتر من السائل على الشبكة.
  5. حضن الشبكات لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.

14. تحضير وعاء المكبس بالتجميد (>15 دقيقة)

  1. قم بتجميع وعاء المكبس بالتجميد، بما في ذلك المغزل المستخدم للتبريد غير المباشر للكوب النحاسي.
  2. ضع علامات على صناديق الشبكة المجمدة وضعها داخل وعاء المكبس بالتجميد.
  3. املأ وعاء المكبس ب LN2. غط القدر لتقليل تلوث الثلج.
  4. حافظ على مستوى LN2 فوق صناديق الشبكة المجمدة عن طريق إضافة LN2 إضافية بشكل دوري.
  5. قم بتبريد المكونات المعدنية وصناديق الشبكة المجمدة إلى درجة حرارة LN2 لمدة لا تقل عن 10 دقائق.
    تحذير: البروبان السائل والإيثان هما مبريدان قابلان للاشتعال بشدة ويسببان إصابات مشابهة ل LN2 لكنهما يفتقران إلى تأثير لايدنفروست الملحوظ. وبالتالي، قد يسبب التلامس إصابة فورية ومستمرة. تجنب الرش أثناء التعامل. إذا لوث البروبان-إيثان LN2، تعامل مع LN2 الملوث بنفس الاحتياطات المكثفة التي يتبعها البروبان السائل والإيثان. بعد الاستخدام، ضع وعاء المكبس بالتجميد داخل غطاء أبخرة كيميائي للسماح للتبخير بأمان من المجمدات المجمدة.
  6. املأ الكوب النحاسي بخليط بروبان وإيثان سائل بنسبة 60:40.
  7. قم بموازنة خليط البروبان والإيثان إلى درجة حرارة LN2 لمدة لا تقل عن 5 دقائق.

15. تجميد الغوص في شبكات الدهون (~1 ساعة)

  1. تأكد من أن ورق البقع قد استقر عند 4 درجات مئوية ورطوبة 100٪ لمدة ساعة على الأقل.
  2. تأكد من أن شبكات الدهون قد حضنت عينة موسومة ب البوليهيستيدين لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
  3. تأكد من أن درجة حرارة البروبان-إيثان أقل من −190 درجة مئوية، ثم أزل المغزل.
  4. قم بتوزيع ثلاث قطرات من مخزن التخفيف بحجم 50 ميكرولتر في خط واحد على قطعة من الفيلم الذاتي الإغلاق بحجم 10 سم2 (الشكل 3).
  5. اغسل شبكة دهنية واحدة مثبتة بلمس سطح الدهون بشكل متسلسل مع كل قطرة مخزن تخفيف وتحرير الشبكة في القطرة النهائية.
  6. استخدم ملقط المكبس البارد لالتقاط شبكة الدهون العائمة. ركبوا الشبكة في المكبس التجميد.
  7. امتص قطرات العزل المستخدمة باستخدام منديل خال من الوبر ثم تخلص منها.
  8. قم بتطبيق إعدادات المكبس الكريو-بلجر التالية على شبكة الدهون قبل الغوص في خليط البروبان-إيثان: وقت الانتظار، 0 ثانية؛ النقطة الكلية، 1؛ قوة البقع، −10؛ زمن البقع، 4 ثوان؛ ووقت التصريف، 0 ثانية.
  9. انقل شبكة التجمد من كوب البروبان-إيثان إلى فتحة متاحة في صندوق الشبكة التجميدية.
  10. كرر عملية التجميد العميق لجميع شبكات الدهون.

النتائج

لتوضيح النتائج المتوقعة لهذا البروتوكول، أجريت سلسلة من التجارب. تم تجميد شبكات الكربون الهولي R1.2/1.3 TEM مع وبدون طبقات دهنية أحادية Ni-NTA بنسبة 20٪ مع العينة وتصويرها باستخدام مبرد TEM بجهد 200 keV. لكل شرط، تم تصوير 3–9 مربعات شبكية. اختلفت سماكة الجليد بين الشبكات الفردية ومربعات الشبكة، حيث تحتوي المناطق المثلى على جليد زجاجي رقيق وجسيمات متأصلة جيدا، كما تم التحقق من خلال حلقات ثون المميزة في تحويل فورييه السريع (FFT)31.

في التجربة الأولى، تم استخدام إنزيم المجمع العنقوي المثبت بمولي الهيستيدين الموسوم ب Staphylococcus aureus aureus glutamate synthase (saGS) لإظهار التحضير الأمثل والأداء المتوقع لشبكات التقارب أحادية الطبقة Ni-NTA الثنائية بنسبة 20٪ (الشكل 6). تم نقل طبقات الدهون الأحادية إلى شبكات TEM ذات شبكة ذهبية. تم تجفيف شبكات الدهون وتخزينها في مجفف لمدة أسبوع قبل إعادة الترطيب. بعد إعادة الترطيب الكاملة، تم حضن saGS عند 0.1 ملغ/مل على الشبكات لمدة 15–30 دقيقة للسماح بارتباط الجسيمات. ظهرت جسيمات saGS، التي يبلغ متوسط عدد الجسيمات 274 جزيئة لكل ميكروجراف (N = 7)، موزعة بشكل متساو عبر طبقة الدهون الأحادية مع تداخل ضئيل أو معدوم.

figure-results-1
الشكل 6: صور تبريد TEM تمثيلية لشبكة ألفة دهنية Ni-NTA بنسبة 20٪. تم تجفيف طبقة الدهون الأحادية لمدة أسبوع وإعادة ترطيبها باستخدام محلول منخفض الملح كما هو موضح في البروتوكول. تم جمع الصور التمثيلية بتكبير منخفض (A)، متوسط (B)، وعالي (C)، مع عرض FFT المقابل في (D). الجسيمات، بمتوسط 274 جزيمة في كل ميكروجراف (N = 7)، متوزعة بالتساوي عبر سطح الشبكة داخل طبقة من الجليد الزجاجي الرقيق. أشرطة المقياس: 10 ميكرومتر، 500 نانومتر، و50 نانومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

في التجربة الثانية، تم استخدام عينات saGS التي تظهر تكديس الجسيمات لإظهار تأثير شبكات الدهون على تجمع البروتينات (الشكل 7). تم فحص أربع حالات لشبكة التجميد: saGS عند 1.0 ملغ/مل على شبكات النحاس بدون دهون، saGS عند 0.1 ملغ/مل على شبكات النحاس بدون دهون، saGS عند 0.1 ملغ/مل على شبكات الذهب ذات الشبك الذهبي مع دهون لم تجف أبدا، وsaGS عند 0.1 ملغ/مل على شبكات الذهب مع الدهون المجففة لمدة أسبوع قبل إعادة الترطيب. أظهرت شبكات الدهون كثافة جسيمات أعلى، بمتوسط 40 أو 46 جسيما لكل ميكروجراف (N = 12)، مقارنة بالشبكات غير الدهنية المحضرة بنفس تركيز البروتين، والتي بلغت متوسط 2 جسيمات لكل ميكروجراف (N = 12). أظهرت هذه النتائج تأثير تركيز واضح مقارنة بشبكات TEM غير المعدلة، مؤكدة أن طبقة الدهون الأحادية Ni-NTA بنسبة 20٪ بقيت سليمة. على الرغم من أن تكديس الجسيمات كان لا يزال ملحوظا، إلا أن الجسيمات على شبكات الدهون أظهرت تداخلا طفيفا وظلت ضمن مستوى تركيزي مشابه. على النقيض من ذلك، ظهرت الجسيمات على الشبكات غير الدهنية عند أعماق بؤرية مختلفة بشكل كبير، مع ملاحظة الجسيمات المجمعة عند تركيز أعلى يبلغ 1 ملغ/مل.

figure-results-2
الشكل 7: صور Cryo-TEM لأقراص saGS المكدسة بعلامات البوليهيستيدين على شبكات دهنية 20٪ Ni-NTA وغير دهونية. (أ–د) شبكة غير دهنية محضرة باستخدام saGS عند 1.0 ملغ/مل، موضحة عند تكبير منخفض (A)، متوسط (B)، وعالي (C)، مع تكبير FFT (D) المقابل. (E–H) شبكة غير دهنية مجهزة باستخدام saGS عند 0.1 ملغ/مل. (I–L) شبكة دهنية لم تجف أبدا مجهزة باستخدام saGS عند 0.1 ملغ/مل.
(M–P) شبكة الدهون المعاد ترطيبها مجهزة باستخدام saGS عند 0.1 ملغ/مل. كانت كثافة الجسيمات على الشبكات غير الدهنية أقل من تلك التي لوحظت في شبكات الألفة الدهنية المقابلة، حيث بلغ متوسط 2 جسيم لكل ميكروجراف مقارنة ب 46 و47 جسيما لكل ميكروجراف على التوالي (N = 12). تشير الأسهم السوداء إلى جسيمات غير مركزة بشكل كبير. الأسهم البيضاء تشير إلى وجود جسيمات قريبة من التركيز. أشرطة المقياس: 10 ميكرومتر، 500 نانومتر، و50 نانومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

في التجربة الثالثة، تعرضت شبكات الدهون لنيترنيتروجين-دودسيل-β-دي-مالتوزيد (DDM). تم استخدام saGS المنقى عند 0.1 ملغ/مل كعينة. المنظف تسبب في تعطيل طبقة الدهون الأحادية. أظهرت شبكات الدهون التي تحتوي على 0.05٪ DDM في المخزن (الشكل 8) فجوات في طبقة الدهون الأحادية، وذرات الدهون على سطح الشبكة، وانخفاض كثافة الجسيمات مقارنة بحالة التحكم.

figure-results-3
الشكل 8: صور تمثيلية لشبكات دهنية Ni-NTA بنسبة 20٪ معرضة ل 0.05٪ N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM). تم تصوير شبكات التجميد بتكبير منخفض ومتوسط وعالي التكبير. (A–C) صور لشبكة ألفة دهنية 20٪ من Ni-NTA معاد ترطيبها باستخدام مخزن تخفيف العينة. (D–L) صور لشبكة ألفة دهنية بنسبة 20٪ من Ni-NTA معاد ترطيبها باستخدام مخزن تخفيف العينة يحتوي على 0.05٪ DDM. كانت كثافة جسيمات saGS أقل على شبكات TEM المعالجة بالمنظفات. السهم في اللوحة I يشير إلى وجود ثقب في طبقة الدهون الأحادية. تشير الأسهم في اللوحين J و K إلى نفس الميسيل الدهني. أشرطة المقياس: 10 ميكرومتر، 500 نانومتر، و50 نانومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

اختلفت سماكة الجليد بين الشبكات وداخل مربعات الشبكة الفردية. في بعض الحالات، كان الجليد رقيقا جدا أو غائبا عن أجزاء من مربع الشبكة (الشكل 9A)، أو موزعا بشكل غير متساو (الشكل 9B)، أو سميكا بشكل مفرط للتصوير (الشكل 9C). في بعض المناطق، كان سمك الجليد أقل من قطر مركب البروتين. يجب تجنب المناطق الجافة أو المناطق التي تحتوي على جليد رقيق جدا، والذي يعرف بأنه أرق من قطر الجسيم، أثناء جمع البيانات لأن البروتينات في هذه المناطق غالبا ما تكون متشوهة. استنادا إلى الخبرة في استخدام هذا البروتوكول، من المتوقع أن تحتوي حوالي 25٪–50٪ من شبكات التجمد على جليد رقيق بما يكفي لجمع بيانات SPA عبر مربعات شبكات متعددة. يمكن تحسين سمك الجليد عن طريق ضبط زمن الطلاء أو تعديل حجم المخزن النهائي على الشبكة قبل التجميد العميق.

figure-results-4
الشكل 9: أمثلة على شبكات الألفة Ni-NTA دون المثالية. صور تجميد تمثيلية لشبكات التبريد غير المثالية بنسبة 20٪ من التقارب Ni-NTA. (أ) طبقة دهنية غائبة عن مركز مربع الشبكة، وتشير إليها الدائرة البيضاء المتقطعة المحيطة بالثقوب الفارغة. (ب) مربع شبكة يحتوي على جليد غير متساو، مع جليد أكثر سمكا بالقرب من المنطقة التي تشير إليها الدائرة البيضاء المتقطعة. (ج) مربع شبكة يحتوي على جليد سميك جدا للتصوير، كما يشير السهم. أشرطة المقياس: 10 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

عند إعدادها بشكل صحيح، تحتوي شبكات الألفة على طبقة أحادية دهنية مع طبقة واحدة في الغالب من الجسيمات الممتصة على الفيلم. من المتوقع أن تتجاوز كثافة الجسيمات تلك التي تلاحظ على الشبكات غير الدهنية المعدة باستخدام تركيزات عينة مماثلة. الفشل في نقل طبقة الدهون الأحادية إلى شبكة TEM يؤدي إلى شبكات تجميد تحتوي إما على ثقوب فارغة (الشكل 10A) أو ثقوب تحتوي على جليد زجاجي يفتقر إلى طبقة دهنية وتظهر القليل أو لا توجد جزيئات (الشكل 10B، C).

figure-results-5
الشكل 10: مثال على شبكة TEM تفتقر إلى طبقة أحادية دهونية. صور Cryo-TEM تظهر فشل نقل طبقة الدهون الأحادية إلى سطح شبكة TEM. يتم امتصاص النيوكليوسومات البشرية المميزة بعلامة البوليهيستيدين على طبقة الكربون. (أ) منطقة من مربع الشبكة تحتوي على ثقوب فارغة. (ب) مناطق مختلفة من نفس الشبكة تحتوي على فتحات مملوءة بالجليد الزجاجي لكنها تفتقر إلى جزيئات مرئية أو طبقة دهنية. (ج) صورة عالية التكبير لثقب يفتقر إلى طبقة دهنية لكنه يحتوي على جليد زجاجي؛ تظهر الجزيئات على طبقة دعم الكربون السميكة. أشرطة المقياس: 1 ميكرومتر و50 نانومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف الإضافي 1: تعليمات الطباعة ثلاثية الأبعاد لحامل الملقط. يحتوي هذا الملف التكميلي على تعليمات مفصلة للطباعة ثلاثية الأبعاد باستخدام حوامل ملقط مخصصة أثناء ترطيب شبكة الدهون وحضانة العينات. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف الإضافي 2: ملف STL لحامل ملقط على سطح طاولة للطباعة ثلاثية الأبعاد. يحتوي هذا الملف التكميلي على ملف الطباعة ثلاثية الأبعاد، وهو النسخة التي تستخدم لحاملة الملقط المستخدمة لحضانة شبكات الدهون المائية في غرفة رطوبة على طاولة (الشكل 3C، 3D).  يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

الملف الإضافي 3: ملف STL لحامل ملقط بالطباعة ثلاثية الأبعاد. يحتوي هذا الملف التكميلي على ملف الطباعة ثلاثية الأبعاد، وهو النسخة المستخدمة لحضان شبكات الدهون المرطبة في غرفة رطوبة المكبس بالتجميد. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

تقدم هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا خطوة بخطوة لتحضير شبكات تقارب أحادية الطبقة الدهنية Ni-NTA وتسلط الضوء على الاعتبارات العملية والمزايا المهمة لهذا النهج لتحديد الهيكل الروتيني بالتجميد والEM لمركبات البروتينات الموسومة ب polyhistidine القابلة للذوبان. تعد عدة خطوات في البروتوكول صعبة تقنيا ومعرضة لأخطاء المستخدم، خاصة للمستخدمين لأول مرة.

يمكن إتمام تعديل طبقة الدهون الأحادية خلال حوالي ساعتين، ويمكن تجفيف وتخزين شبكات الدهون الناتجة لاستخدامها لاحقا. مع ساعتين إضافيتين والوصول إلى مكبس تجميد، يمكن تجهيز شبكات التجمد لاحقا. وبناء عليه، فإن هذه الطريقة مناسبة جدا للمرافق متعددة المستخدمين ومختبرات التجميد المغناطيسي. باستخدام هذا النهج، تم تحديد هياكل لمجمعات بروتينية قابلة للذوبان تتراوح بين 97 إلى 470 كيلو دالتون بدقة أقل من 3 أنغستروما17. يتطلب الارتباط الفعال بطبقة الدهون الأحادية Ni-NTA مكونا موسوم بالبوليهستيدين يحتوي على رابط مرن. على الرغم من أن درجة معينة من الاتجاه المفضل بالنسبة للطبقة الأحادية لوحظ لبعض العينات، بما في ذلك النيوكليوسومات وسينثاز الغلوتامات، إلا أن هذه الاتجاهات لم تحد من الدقة أو أدخلت تشوهات تمدد في إعادة البناء النهائية. التفاعل بين طبقة الدهون الأحادية Ni-NTA والبروتينات الموسومة بالبوليهيستيدين يعزز التقاط الجسيمات بكفاءة على سطح شبكة TEM. وبالتالي، يمكن إجراء التحليل الإنشائي باستخدام عينات مخففة نسبيا وخطوط معالجة تقليدية قياسية بالجليد، مثل RELION وcryoSPARC، دون الحاجة إلى خطوات إضافية لتحضير العينات.

التعامل الدقيق مع شبكات TEM وتحضير خلطات الدهون أمر ضروري لتحقيق نتائج قابلة للتكرار. طبقات الدهون الأحادية حساسة جدا للملوثات، بما في ذلك المنظفات المتبقية، والزيوت، والغبار. لذا فإن التنظيف الشامل لجميع الزجاج أمر بالغ الأهمية. ينصح بشدة بالغسلة بمادة خافضة للتوتر السطحي الأنيوني ثم شطف مكثف بماء فائق النقي وتجفيف هواء كامل قبل الشطف بالكلوروفورم والإيثانول مباشرة قبل الاستخدام.

يستخدم البروتوكول شبكات TEM ذات الشبكة الذهبية لأنها غير تفاعلية عبر مجموعة واسعة من ظروف العينة والمخازن. لاستيعاب عينات مختلفة، يمكن تعديل المخازم المستخدمة أثناء صب الدهون، وإعادة ترطيب شبكة الدهون، وحضانة العينة، والغسل قبل التجميد العميق حسب الحاجة. قد تزال مخازن العينات التي تحتوي على الجليسيرول أو إضافات أخرى أثناء مرحلة الغسيل قبل التزجيج. يجب تجنب المخازم التي تحتوي على ديثيوثرايتول (DTT) لأن DTT يقلل من النيكل32 ويعيق ارتباط البروتينات الموسومة بالبوليهيستيدين وطبقة الدهون الأحادية Ni-NTA. كما لا ينصح باستخدام المنظفات لأن 0.05٪ من N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) تسبب في تعطيل طبقة الدهون الأحادية، ومن المتوقع أن تنتج مساحيق أخرى تستخدم عادة في دراسات بنيوية الغشاء والبروتينات تأثيرات مماثلة (الشكل 8D–L). ما إذا كانت تركيزات المنظفات المنخفضة أو منخفضة التركيز الحرج للميكروسل ستزعزع بنفس الشكل سلامة الطبقة الأحادية يبقى أمرا غير محدد.

الجزء الأكثر تطلبا تقنيا من البروتوكول هو صب ونقل طبقة الدهون الأحادية إلى شبكة TEM. هذه الخطوة حساسة جدا لدرجة الحرارة والاهتزاز وتقنية التحمل. تم الحصول على أفضل النتائج من خلال صب أفلام الدهون في درجة حرارة الغرفة (~22 درجة مئوية) باستخدام المخزن المبرد مسبقا. يجب تقليل الاضطرابات الميكانيكية لأن الاهتزازات قد تزعزع استقرار الطبقة الأحادية. وبناء عليه، يجب أن يبقى طبق البتري ثابتا بعد صب الدهون. أثناء النقل، قد ينتقل زيت الخروع وطبقة الدهون الأحادية تدريجيا عبر سطح المخزن الخادم، مما يزيد من احتمال نقل زيت الخروع بدلا من الطبقة الأحادية الدهنية (الشكل 5C). الحشو الصحيح لطبق البتري والتحكم الدقيق في اتجاه الشبكة ضروريان لضمان نقل كامل وموحد للطبقة الأحادية. فشل نقل طبقة الدهون إلى سطح شبكة TEM ينتج سطح شبكة كاره للماء، مما يؤدي إلى تجمع المخزن على سطح الكربون.

في هذه الدراسة، تم تقييم مكبس تجميد باستخدام البلوط ثنائي الجانب فقط. ومع ذلك، من المتوقع أن تعطي طرق التطهير الأخرى، بما في ذلك المسح اليدوي أو أحادي الجانب، نتائج مماثلة بشرط بقاء طبقة الدهون سليمة. عند تكييف هذا البروتوكول، يجب التعامل مع شبكات الدهون بطريقة مشابهة لشبكات TEM القياسية، مع عدة اعتبارات مهمة. يجب تجنب التنظيف بالبلازما، ويجب أن تبقى شبكات الدهون مرطبة باستمرار لمدة لا تقل عن 15 دقيقة قبل تطبيق العينة. يجب حضن العينات على شبكة الدهون لمدة لا تقل عن 15 دقيقة للسماح بامتصاص السطح، ويجب الاتصال بالشبكة بقطرة واحدة على الأقل من مخزن التخفيف قبل التطهير لتطبيع حجم المخزن النهائي على سطح الشبكة. الحفاظ على ترطيب طبقة الدهون الأحادية Ni-NTA طوال فترة حضانة العينة أمر بالغ الأهمية، حيث يمكن للتبخر أن يزيد من تركيزات الملح المحلية وقد يغير بنية البروتين أو تجميعه المعقد. قد تزيد أوقات الحضانة الأطول (>30 دقيقة) من كثافة الجسيمات على الشبكة، رغم أنه يجب موازنة الحضانة الممتدة مع احتمال تدهور العينة. يوصى بمزيج البروبان السائل مع الإيثان بنسبة 60:40 الموصوف في هذا البروتوكول لكنه ليس مطلوبا بشكل صارم. يمكن أيضا استخدام نسب بديلة بين البروبان والإيثان أو الإيثان النقي مع مكبس تجميد مزود بنظام تسخين كوب الإيثان للحفاظ على حالة التبريد في حالة سائلة طوال التجربة. وأخيرا، يتأثر توزيع الجسيمات بسماكة الثلج. في بعض الحالات، قد تستبعد الجسيمات من المناطق التي تحتوي على جليد رقيق بشكل خاص، خاصة بالقرب من مركز مربعات الشبكة. لذا قد تحتاج ظروف الزرع إلى تحسين لكل جهاز تزجيج. بشكل عام، توفر شبكات الألفة أحادية الطبقة الدهنية Ni-NTA استراتيجية قوية وسهلة الوصول لتحديد البنيويات القابلة للذوبان والمجمعات الموسومة ب polyhistidine. مع التنفيذ الدقيق للإجراء خطوة بخطوة الموضح هنا، يمكن دمج هذه الطريقة بسهولة في سير عمل التجميد الكهرومغناطيسي القياسي.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون كاليب فيشر، روب ماكجينتي، نيكولاس رايت، بليك فورديس، وبرايان روث من جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل على توفير المخازم المستخدمة في هذه التجارب. يتم الاعتراف بمنشأة التجميد الأساسية في جامعة نورث كارولينا في تشابل هيل ولجنة الدفاع عن المرافق الأساسية في جامعة نورث كارولينا على الدعم الفني والمالي. يتم الاعتراف بمنشأة المجهر الإلكتروني البارد الجزيئية الحيوية في قسم الكيمياء والكيمياء الحيوية بجامعة كاليفورنيا، سانتا كروز (RRID: SCR_021755)، على المساعدة الفنية. وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للسرطان التابع للمعاهد الوطنية للصحة بموجب الجائزة رقم P30CA016086 ومن منحة R35GM150960 من المعاهد الوطنية للصحة التي منحت لريتشارد دبليو. بيكر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 mL volumetric flask with stopperAvantor10124-382قارورة حجمية زجاجية، زجاجية شفافة، درجة A، متسلسلة، مع سدادة زجاجية برأس بني، 1 مل
2.5 µL glass syringeHamilton7632-01محقنة زجاجية 2.5 ميكرولتر، إبرة قابلة للإزالة (RN)، بدون إبرة
3.7 mL threaded glass vial with phenolic capFisher Scientific03338Aقارورة زجاجية ملولبة بفتحة، 3.7 مل
4-slot cryo-grid boxMiTeGen71166-10صندوق شبكة كريو دائري بغطاء
11.4 L plastic tubحوض غسيل متعدد الأغراض من Sterilite، 12 لتر
25 µL glass syringeHamilton80430محقنة زجاجية 25 ميكرولتر، إبرة قابلة للإزالة (RN)، تشمل إبرة منحنية مدببة، مقاس 22s، 52 ملم
25 mL volumetric flask with stopperAvantor10123-994قارورة حجمية زجاجية، زجاجية شفافة، درجة A، متسلسلة، مع سدادة زجاجية برأس بني، 25 مل
99.5% pure ethanolThermo Fisher Scientific615090040إيثانول، 99.5%، عامل تنقيح ACS، مطلق، 200 برهان
99.8% pure chloroformFisher ScientificAA32614K2كلوروفورم، ACS، 99.8% +
Aluminum foilWalmartورق الألمنيوم، عرض 30.4 سم
Anionic surfactant powderFisher Scientific50-997-492مسحوق منظف أيوني من Electron Microscopy Sciences Alconox، 4 أرطال
Baking dishWalmartطبق خبز زجاجي عميق، 232-D 3-quart
Blot paperTed Pella47000-100ورق فلتر Vitrobot قياسي، 55/20 ملم، درجة 595
Bottle of castor oil with dropperWalmartزيت الخروع العضوي مع معلق، 1 أونصة سائلة
Cryo-plungerThermo Fisher Scientific1151972FEI Vitrobot Mark IV
DOPCAvanti Polar Lipids850375P-25mg18:1 (Δ9-Cis) PC (DOPC)، مسحوق 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine، 25 ملغ
Fine-tip tweezersTed Pella505ملقط DUMONT Biology Grade، النمط 5، فولاذ مقاوم للصدأ مصقول
Glass culture tubeFisher Scientific14958Aأنبوب زجاجي Fisherbrand من الفيوللين المتاح، طرف عادي، 1 مل
Glass pipetFisher Scientific13-678-20Aماسورة زجاجية Fisherbrand من البورسليكات المتاح، 14.6 سم
Gold-mesh holey-carbon TEM gridQuantifoilN1-C14nAu30-01QUANTIFOIL R 1.2/1.3 Au 300 شبكة
Grade 1 filter paperSigma-AldrichWHA1001150ورق ترشيح Whatman النوعي، الدرجة 1، قطر 150 ملم
Large petri dish with coverFisher Scientific08747Eطبق بيتري قابل لإعادة الاستخدام من Corning PYREX مع غطاء، قطر 150 ملم، ارتفاع 15 ملم
Low-lint tissuesFisher Scientific06-666مناديل Kimtech Science Kimwipes الرقيقة، طبقة واحدة
Ni-NTA lipidAvanti Polar Lipids790404P-5mg18:1 DGS-NTA(Ni)، 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (ملح النيكل)
Pipet bulbFisher ScientificS32325كبس مطاطي Fisherbrand، طبيعي، 2 مل
Reagent ethanolSigma-Aldrich362808-1Lكحول كواشف ≥89% (GC)، يحتوي على 5% كحول إيزوبروبيل و 5% كحول ميثيل
Self-closing anti-capillary tweezersTed Pella510-5ملقط DUMONT anti-capillary معكوسة، درجة Biology، النمط 5ACN، فولاذ مقاوم للصدأ
Self-sealing filmFisher ScientificS47529فيلم لف Parafilm M، 10 سم
Small petri dish with coverFisher Scientific08747Aطبق بيتري قابل لإعادة الاستخدام من Corning PYREX مع غطاء، قطر 60 ملم، ارتفاع 15 ملم
Syringe needleHamilton7803-01إبرة قابلة للإزالة (RN) مقاس 27، مدببة، 75 ملم طول، زاوية 45 درجة

المراجع

  1. Chan, L. M., et al. High-resolution single-particle imaging at 100–200 keV with the Gatan Alpine direct electron detector. J Struct Biol. 216 (3), 108108(2024).
  2. Efremov, R. G., Stroobants, A. Coma-corrected rapid single-particle cryo-EM data collection on the CRYO ARM 300. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (Pt 5), 555-564 (2021).
  3. Frechin, L., et al. High-resolution cryo-EM performance comparison of two latest-generation cryo electron microscopes on the human ribosome. J Struct Biol. 215 (1), 107905(2023).
  4. Herzik, M. A. Jr, Wu, M., Lander, G. C. High-resolution structure determination of sub-100 kDa complexes using conventional cryo-EM. Nat Commun. 10 (1), 1032(2019).
  5. Karia, D., et al. Sub-3 Å resolution protein structure determination by single-particle cryo-EM at 100 keV. Structure. 33 (10), 1717-1727.e4 (2025).
  6. McMullan, G., et al. Structure determination by cryoEM at 100 keV. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (49), e2312905120(2023).
  7. Peng, R., et al. Characterizing the resolution and throughput of the Apollo direct electron detector. J Struct Biol X. 7, 100080(2023).
  8. D’Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. eLife. 8, (2019).
  9. Noble, A. J., et al. Routine single-particle cryoEM sample and grid characterization by tomography. eLife. 7, (2018).
  10. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  11. Snijder, J., et al. Vitrification after multiple rounds of sample application and blotting improves particle density on cryo-electron microscopy grids. J Struct Biol. 198 (1), 38-42 (2017).
  12. Cianfrocco, M. A., Kellogg, E. H. What could go wrong? A practical guide to single-particle cryo-EM: From biochemistry to atomic models. J Chem Inf Model. 60 (5), 2458-2469 (2020).
  13. Cheng, H., et al. Dual-affinity graphene sheets for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 145 (14), 8073-8081 (2023).
  14. Yu, G., Li, K., Jiang, W. Antibody-based affinity cryo-EM grid. Methods. 100, 16-24 (2016).
  15. Arimura, Y., Konishi, H. A., Funabiki, H. MagIC-Cryo-EM, structural determination on magnetic beads for scarce macromolecules in heterogeneous samples. eLife. 13, (2025).
  16. Zhao, Q., et al. An immobilized antibody-based affinity grid strategy for on-grid purification of target proteins enables high-resolution cryo-EM. Commun Biol. 7 (1), 715(2024).
  17. Skrajna, A., et al. Nickel-NTA lipid-monolayer affinity grids allow for high-resolution structure determination by cryo-EM. J Struct Biol. 217 (4), 108253(2025).
  18. Esfahani, B. G., et al. SPOT-RASTR—A cryo-EM specimen preparation technique that overcomes problems with preferred orientation and the air/water interface. PNAS Nexus. 3 (8), pgae284(2024).
  19. Cookis, T., et al. Streptavidin-affinity grid fabrication for cryo-electron microscopy sample preparation. J Vis Exp. (202), e66197(2023).
  20. Han, B. G., et al. Long shelf-life streptavidin support-films suitable for electron microscopy of biological macromolecules. J Struct Biol. 195 (2), 238-244 (2016).
  21. Song, J., et al. Structural basis for inactivation of PRC2 by G-quadruplex RNA. Science. 381 (6664), 1331-1337 (2023).
  22. Cookis, T., et al. Structural basis for the inhibition of PRC2 by active transcription histone posttranslational modifications. Nat Struct Mol Biol. 32 (2), 393-404 (2025).
  23. Gillies, J. P., et al. Structural basis for cytoplasmic dynein-1 regulation by Lis1. eLife. 11, (2022).
  24. Sauer, P. V., et al. Structural and quantum chemical basis for OCP-mediated quenching of phycobilisomes. Sci Adv. 10 (14), eadk7535(2024).
  25. Sauer, P. V., et al. Activation of automethylated PRC2 by dimerization on chromatin. Mol Cell. 84 (20), 3885-3898.e8 (2024).
  26. Ciapponi, M., et al. Structural basis of the histone ubiquitination read-write mechanism of RYBP-PRC1. Nat Struct Mol Biol. 31 (7), 1023-1027 (2024).
  27. Dominguez-Martin, M. A., et al. Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states. Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).
  28. Marechal, N., Serrano, B. P., Zhang, X., Weitz, C. J. Formation of thyroid hormone revealed by a cryo-EM structure of native bovine thyroglobulin. Nat Commun. 13 (1), 2380(2022).
  29. Kasinath, V., et al. JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications. Science. 371 (6527), (2021).
  30. Ma, J., et al. Open architecture of archaea MCM and dsDNA complexes resolved using monodispersed streptavidin affinity CryoEM. Nat Commun. 15 (1), 10304(2024).
  31. Kim, L. Y., et al. Benchmarking cryo-EM single-particle analysis workflow. Front Mol Biosci. 5, 50(2018).
  32. Zhou, Z., Jin, J., Deng, X., Jia, Z. Protein purification via consecutive histidine-polyphosphate interaction. Protein Sci. 33 (6), e5021(2024).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الكيمياء الحيويةالعدد 234العدد 234الكلالعددالكلالعددالكلالعددالكلالعددالكلالعددالكلالعددالكلهذا الشهر في JoVEالعددالمجهر الإلكتروني المبردالجسيم الفرديcryoEMتحضير العينةشبكة الألفةالبيولوجيا التركيبيةالكيمياء الحيويةالفيزياء الحيويةالمجهر الإلكتروني

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.