توليد السيبريد عبر الميتوكوندريا من صفائح الدم الميتوكوندرية من صفائح الدم المرضى mtDNA: بروتوكول فعال لتحسين اختيار المستعمرات والتحقق الوظيفي

ملخص

نحن نصف بروتوكول مولد السايبريد عبر الميتوكوندريا المحسوب من صفائح الدمى الميتوكوندرية من صفائح الدمى الميتوكوندرية للمرضى، مع التركيز على معايير النمو وعزل المستعمرات. يتيح هذا النهج دراسة متغيرات الحمض النووي الميتوكوندري عند مستويات متغيرة من التغاير في خلفية نووية مشتركة لقياس أهميتها الوظيفية على الأنشطة الإنزيمية لسلسلة نقل الإلكترونات والقدرة التنفسية المتكاملة.

الملخص

يمثل توليد خط خلايا السيبريد عبر الميتوكوندريا الطريقة القياسية لتحديد الممرضية من خلال تمكين التحليلات الكيميائية الحيوية لمتغير محدد في الحمض النووي الميتوكوندري (mtDNA) ذو الاهتمام عند نسب عالية ومنخفضة (مستويات غير متجانسة) ضمن خلفية متطابقة مع الحمض النووي المونتوبلازي والجينوم النووي. تاريخيا، كانت عملية توليد السيبريد مملة وضعيفة الكفاءة. هنا، نصف بروتوكولا عالي الكفاءة وفعالا لتوليد خطوط خلايا سيبريد عبر الميتوكوندريا عن طريق دمج الصفائح الدموية البشرية مع خط خلايا ساركوما العظمية 143B القياسي لتوفير خلفية نووية متساوية الجثة مستنزفة من mtDNA (خلايا Rho⁰ ). تلتقط عزلات الخلايا جينوم mtDNA معين محل اهتمام لإنشاء خطوط خلاية مستقرة تحمل درجات مختلفة من التغاير العنصري، أو لمقارنة التأثيرات المتباينة لمجموعات الميتوكوندريا المختلفة. نظرا لأن السيبريدات من مرضى الميتوكوندريا قد تكون أصعب في التكوين باستخدام البروتوكولات القياسية، تركز هذه المنهجية الحالية على عزل متغيرات mtDNA حيث يتأثر نشاط سلسلة نقل الإلكترونات. نظهر هنا أن تقنيات اختيار المستعمرات تقلل من الوقت وتحسن إنتاجية توليد خطوط سيبريد mtDNA متحولة عالية المستوى. تم تقديم دراسة حالة لتوليد السيبريد لنوع غير معروف الأهمية في MT-ND1، m.3985G>A (ص.E227K). نقوم بتحليل كفاءة عملية توليد السيبريد باستخدام هذا البروتوكول ونجري دراسات وظيفية تجرى بواسطة قياس التنفس عالي الدقة. أظهرت طفرات السيبريد عالية المستوى MT-ND1 m.3985G>A الناتجة عن هذا البروتوكول أنها تعاني من ضعف في التنفس الميتوكوندري المركب المعتمد على I مقارنة بالتحكم من النوع البري، مما يدل على أن m.3985G>A من المحتمل أن يكون ممرضا.

المقدمة

إثبات ممرضية طفرات الحمض النووي الميتوكوندري (mtDNA) يمثل تحديا بسبب ندرتها، ووجود تغاير في الحمض النووي الذي يتضمن مستويات متغيرة من جينومات mtDNA المتحورة والنوع البري في أنسجة مختلفة، وتنوع الآليات المرضية، والتفاعلات المعقدة مع خلفيات الجينوم النووي 1,2,3,4 . لهذه الأسباب، تظل خطوط خلايا السيبريد العابرة للميتوكوندريا الطريقة الذهبية لتحديد ممرضية متغيرات mtDNA، حيث تمثل "السيبريدات" اندماج نواة خلية مع ميتوكوندريا أخرى ^5,6,7,8,9,10 (الشكل 1). تحتوي خطوط خلايا سايبريد على خلفية نووية متساوية وميتوكوندريا مع نسبة محددة من التغاير لمتحور mtDNA قيد الدراسة^11,12. وبهذه الطريقة، يمكن إجراء اختبارات وظيفية مثل قياس التنفس (عن طريق الاستقطابية) أو نشاط إنزيمات نقل الإلكترونات (عن طريق التحليل الطيفي الضوئي) في خطوط سيبريد تتراوح بين مستويات التغاير بين 0٪ و100٪ لتحديد التأثيرات الممرضة المحتملة لمتغير mtDNA معين، بالإضافة إلى التأثير النسبي لمجموعات الهيبلوغروب الميتوكوندرية التي قد تختلف بين خطوط السيبريد¹. يمكن استخدام أنواع خلايا أخرى لدراسة الممرضية، وهي أفضل ما تستخدم لتكمل توليد السيبريد والتحليل الوظيفي، حيث أن لكل نوع من الخلايا مزاياه وعيوبه الخاصة. الخلايا الليفية المريضة تنشأ مباشرة من المريض لكنها محدودة في التغاير الوراثي وتفتقر إلى التحكم النووي الإيزوجيني للقضاء على التأثيرات الجينية النووية. تحرير mtDNA أصبح أكثر شعبية لكنه يعاني من التحرير غير المستهدف ومواقع محدودة قابلة للتعديل في mtDNA¹³. يمكن تمييز الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة (iPSCs) لدراسة تأثير الطفرة على أنواع خلايا مختلفة، مثل الخلايا العصبية وخلايا العقد الشبكية، لكن تحفيز تعدد القدرات قد يؤدي إلى فقدان متغير mtDNA محل الاهتمام أو يؤدي إلى متغيرات جديدة ^{إضافية 14}. تتضمن دراسة سايبريد توليد نظام أكثر اصطناعية يعتمد على خلفية نووية من خط الخلايا السرطانية (كلاسيكيا 143B في ساركوما العظمية)، لكنه ينمو بشكل جيد كلاسيكيا، مما يجعله قابلا للاستخدام في دراسات الفحص عالية الإنتاجية للتدخلات المرشحة. تشمل القيود على توليد السيبريد بمستوى عالي من التغاير جودة الصفائح الدموية، وبداية الهيتروبلازما البدائية، والعيوب الانتقائية للميتوكوندريا الطافرة، والتي نوقشت مطولا في هذا البروتوكول.

على الرغم من أن توليد السيبريد هو المعيار الذهبي لتحديد الوظيفة لمرضية متحور mtDNA، إلا أن عددا قليلا من المختبرات تولد سايبريدات لدراسة مرض الميتوكوندريا 9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26، 27}. بل يتم توليد المزيد من السيبريدات لدراسة السرطان والشيخوخة^28,29. هنا، نستخدم دراسة حالة لمريض مرض ميتوكوندريا مشتبه به لعرض استراتيجيات تحسين تم تطويرها لتسهيل توليد السيبريد من صفائح الدمى الميتوكوندرية للمرضى، بما في ذلك عمليات الاختيار والتحضيرات الخلوية اللازمة لإنشاء خطوط خلايا سيبريد ذات مستويات عالية مقابل منخفضة من التغاير للمتغير المستهدف mtDNA. على وجه التحديد، نعرض المنهجية لإنشاء خطوط خلايا سيبريد لوحدة فرعية معقدة من الوحدة المختلطة I (CI) من نوع MT-ND1 m.3985G>A، حيث نجري دراسات كيميائية حيوية تثبت الطبيعة الممرضة لهذا المتحول. يوضح الشكل 2 الجدول الزمني لتوليد السيبريد، حيث تشمل الخطوات المنهجية الرئيسية الاندماج والانتقاء والعزل لإنتاج مستعمرات مميزة.

البروتوكول

تم الحصول على الصفائح الدموية وفقا لدراسة IRB لمستشفى الأطفال في فيلادلفيا (CHOP) 08-6177.

1. تحضير الصفائح الدموية

1. اليوم الأول: سحب الدم في أنابيب حمض-سترات-ديكستروز عند السحب.
   ملاحظة: يجب وضع دم على المدور فورا. يفضل أن يتم حصاد الصفائح الدموية بعد 4 ساعات كحد أقصى بعد سحب الدم.
2. سجل حجم الدم. يوصى بحجم 5–6 مل من الدم.
3. دم الطرد المركزي عند 200 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 12 درجة مئوية.
   ملاحظة: الطرد المركزي عند 12 درجة مئوية يحافظ على سلامة العينة ويمنع تنشيط الصفائح الدموية.
4. انقل المادة الفائقة (البلازما) إلى أنبوب طرد مركزي جديد.
5. سجل حجم البلازما.
6. قم بطرد مركزي للبلازما عند 1500 × جرام لمدة 20 دقيقة عند 12 درجة مئوية.
7. سجل حجم حبيبات الصفائح الدموية المقدر (Estimate Pressed Pillt).
   ملاحظة: كثرة الصفائح الدموية قد تكون مرهقة في هذا البروتوكول. بعد الدمج، عند تغليف خلايا Rho⁰ والصفائح الدموية، يمكن أن تلتصق كمية زائدة من الصفائح الدموية بأسفل القارورة وتمنع التصاق خلايا Rho⁰ . يوصى باستخدام أقل من 50 ميكرولتر من حجم الحبيبات الصفائح الدموية للاندماج. يمكن تجميد الصفائح الفائضة عن طريق تقسيمها في الخطوات التالية.
8. أزل السوبرناتانت.
   ملاحظة: إذا كانت الحبيبة كبيرة، يمكن إزالة الحبيبة عن طريق الشفط. أحيانا تقل عدد الصفائح الدموية للمرضى بشكل كبير وليست لزجة جدا. إذا كان هذا هو الحال، استخدم الماصة لإزالة البلازما ببطء.
9. إذا استمر مع الصفائح الصفائح الطازجة، أعد تعليق الحبيبة في 1 مل من تعديل سبينر لوسط إيجل الأساسي الأدنى (SMEM)، وانقل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
10. عند التجميد، أعد تعليق الحبيبات (الصفائح الدموية) في محلول تجميد بسعة 1.05 مل من SMEM و450 ميكرولتر من محلول تجميد الصفائح الدموية (350 ميكرولتر من مصل الأبقار الجنيني [FBS] + 100 ميكرولتر من ثنائي ميثيل كبريتسيد [DMSO]).
    ملاحظة: بعض الصفائح الدموية غير المستقرة أثناء إجراء التجميد، ولا يمكن الحصول على سايبريد متحول عالي بعد التجميد. يوصى باستخدام التحضير الطازج.
11. إذا لم تكن خلايا Rho⁰ جاهزة في الوقت المناسب، ضع الصفائح الدموية عند 37 درجة مئوية مع هز خفيف عند 60 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: في النهاية، من الأفضل توقيت الصفائح الدموية وخلايا Rho⁰ لتكون جاهزة في نفس الوقت. لا ينصح بالانتظار لأكثر من ساعتين.

2. تحضير خلايا Rho ⁰

1. استخدم خلايا Rho⁰ في ساركوما العظمية 143B التي ذابت حديثا أو خلايا Rho⁰ التي كانت تنمو حتى تقترب من الالتقاء البعض.
   ملاحظة: يوصى باستخدام خلايا Rho⁰ التي كانت تنمو في الحاضنة حتى تقترب من الالتقاء البعض. يمكن استخدام خلايا Rho⁰ المذابة حديثا، وينصح باستخدام قارورة مجمدة من خلايا Rho⁰ ذات كثافة خلايا عالية. دع الخلايا تلتصق لمدة ساعتين أو أكثر قبل الاندماج.
2. اغسل قارورة T75 بسعة 5 مل من PBS.
3. أضف 1 مل من تريبسين-إيدتا 0.25٪ لتغطية خلايا رو⁰ .
4. حضانه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
5. بعد تشغيل القارورة، اغسل أسفل القارورة ب 5 مل من SMEM.
6. اجمع خلايا Rho⁰ في أنبوب مخروطي بحجم 15 مل.
7. الطرد المركزي عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق للتركيز وقياس عدد الخلايا.
8. أزل المادة الفائقة وأعد تعليقها في 1 مل من SMEM.
9. عد الزنزانات.
   ملاحظة: من الناحية المثالية، يجب أن يكون هناك 1.5 مليون خلية لكل اندماج؛ ومع ذلك، تم إجراء عمليات اندماج ناجحة باستخدام ما لا يقل عن 30,000 خلية.
10. أليكوت 1.5 مليون خلية في 1.5 أنبوب طرد مركزي دقيق ورفع الحجم إلى 1 مل.
    ملاحظة: تأكد من وجود أنبوب "دمج وهمي" إضافي. هذا الأنبوب سيحتوي فقط على خلايا Rho⁰ وسيستخدم للمساعدة في توجيه عملية الاختيار.
11. قم بجهاز الطرد المركزي على الصفائح الدموية عند 1700 × جرام لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: خلايا Rho⁰ حساسة لدرجة الحرارة الباردة.
12. أزل المادة الفائقة من الصفائح الدموية.
13. أضف 1 مل من خلايا Rho⁰ فوق حبيبات الصفائح الدموية.
14. قم بجهاز الطرد المركزي لخلايا Rho⁰ والصفائح الدموية عند 200 × جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.

3. الاندماج

1. أزل المادة الفائقة من خلايا Rho⁰ وحبيبات الصفائح الدموية.
2. أضف 150 ميكرولتر من محلول الاندماج (50٪ بولي إيثيلين جليكول [PEG]/10٪ DMSO) وقم بالتثبيط لمدة 90 ثانية لإعادة التعليق.
   ملاحظة: بعض الحبيبات لزجة جدا وتحتاج إلى تحريكها وتفتيتها يدويا بالإضافة إلى التوصيل بالماصات لأعلى وأسفل. سجل إذا كانت الحبيبة لزجة.
3. أضف 12 مل من وسط سيبريد (DMEM) + 10٪ FBS + 50 ميكروغرام/مل يوريدين إلى قارورة T75.
4. أضف 1 مل من الصفائح الدموية المندمجة وخلايا Rho⁰ إلى القارورة.
5. يتم حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون_{في رطوبة} عالية.
   ملاحظة: جميع خطوات نمو الخلايا تتم تحت هذه الظروف.

4. النمو

1. اليوم الثاني: إزالة وسط سيبريد وإضافة 12 مل من وسط السيبريد الطازج + 10٪ FBS + 50 ميكروغرام/مل يوريدين.
   ملاحظة: خلايا Rho⁰ تستغرق حوالي أسبوع لدمج mtDNA.
2. اليوم الخامس: إزالة وسائط سيبريد وإضافة 12 مل من وسط السيبريد الطازج + 10٪ FBS + 50 ميكروغرام/مل يوريدين.
   ملاحظة: إذا كانت خلايا Rho⁰ عند التقاء بنسبة 80٪، اقسم الخلايا إلى قارورتين.

5. الاختيار

1. اليوم الثامن: إزالة الوسائط وغسل الخلايا ب 5 مل من PBS.
2. أزل PBS وأضف 1 مل من التربسين.
3. غط قاع القارورة بالتريبسين وحضن لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
4. أضف 5 مل من وسط سيبريد + 10٪ FBS + 50 ميكروغرام/ملتر يوريدين.
5. عد الزنزانات.
   ملاحظة: يجب أن يبدأ الانتقاء عند 10٪ التقاء الجسم، أي 125,000 خلية في طبق بتري معالج بزراعة الأنسجة T75. ينصح باستخدام أطباق بتري إذا كان يفضل طريقة قطف المستعمرة. استخدم T75 إذا كنت تستخدم طريقة التخفيف.
6. أضف 125,000 خلية إلى الحاوية المناسبة وأضف بقية الحجم حتى 12 مل باستخدام وسائط الاختيار (DMEM).
   ملاحظة: تم تصميم وسط الانتقاء لفصل الخلايا المندمجة 143B مع الميتوكوندريا عن خلايا Rho⁰ . خلايا Rho⁰ تحتاج إلى البيروفات واليوريدين للبقاء. ال FBS المثول بالدياليز لا يحتوي على البيروفات واليوريدين ويجب استخدامه فقط للاختيار. استخدم وسيطين اختيار مختلفين إذا أمكن. يجب أن يكون أحدهما 10٪ من FBS متحلل للديا، والآخر أقل تقييدا للنمو، مثل 20٪ FBS متحلل + 50 ميكروغرام/مل يوريدين. يقترح وسط انتقاء أقل تقييدا بالتوازي للطفرات الشديدة.
7. تجميد الخلايا المتبقية في حجرين مبردين لكل منهما 1 مل من محلول التجميد.
   ملاحظة: هذه خلايا اختيار مسبق، ويمكن تجربة اختيارات مختلفة لاحقا.
8. غير الوسائط كل يومين لمدة أسبوع تقريبا.
   ملاحظة: خلايا Rho⁰ تطفو عند موتها وستغسل بعد تغيير الوسط. استخدم خلايا الاندماج "الوهمية" لتحديد متى يكتمل الاختيار (لا مزيد من الخلايا في القارورة). هذه القارورة ستكون فارغة تماما لأن جميع خلايا Rho⁰ قد جرفت. من الجيد الانتظار ليوم آخر، حتى عندما تكون القارورة الوهمية فارغة، لأن الخلايا المندمجة يمكن أن توفر العناصر الغذائية في الوسط لمساعدة خلايا Rho⁰ الأخرى على البقاء داخل القارورة. إذا نمت الخلايا لتصل إلى أكثر من 20٪، انقسام وإعادة الطلاء من جديد. المزيد من النمو سيخفي الاختيار.

6. طريقة نمو اختيار المستعمرة

1. ازرع المستعمرات حتى تصبح مرئية بالعين باستخدام وسط سيبريد + 20٪ FBS + 50 ميكروغرام/مل يوريدين.
   ملاحظة: ميل الطبق وارفع الطبق نحو الضوء. تظهر المستعمرات كدوائر غائمة. تحت المجهر، لا ينبغي أن يكون هناك الكثير من الخلايا الخلفية بين المستعمرات.
2. قم بتدوير مستعمرات مستقلة غير متداخلة مع وضع علامة في أسفل القارورة مع رفعها نحو الضوء.
3. استخدم P20 للكشط (إزعاج الخلايا الميكانيكية المثبتة أسفل القارورة) واستنشاق 20 ميكرولتر في نفس الوقت داخل الدائرة المرسومة لوضع الخلايا من المستعمرة المختارة في طرف P20.
   ملاحظة: الكشط يدويا يؤدي إلى فصل الخلايا وسحب 20 ميكرولتر يجمع الخلايا في طرف الماصة.
4. ضع كل مستعمرة في بئرها الخاص في صفيحة مكونة من 96 بئرا.
   ملاحظة: ميزة هذه الطريقة هي أن خلايا 143B تميل إلى النمو معا بشكل جيد، لذا لن تواجه مشكلة في النمو وستحصل على نتائج أسرع. العيب هو أن الشخص قد يكون مختلطا من السكان.

7. طريقة نمو التخفيف

1. عندما تصل الخلايا إلى 75٪ التقاء في وسط السيبريد + 20٪ FBS + 50 ميكروغرام/مل يوريدين، اغسل الخلايا ب 5 مل من PBS.
2. أزل PBS وأضف 1 مل من التربسين.
3. غط قاع القارورة بالتريبسين وحضن لمدة 5 دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
4. أضف 5 مل من وسط سيبريد + 20٪ FBS + 50 ميكروغرام/مل يوريدين.
5. عد الزنزانات.
6. أضف 1 × 10⁵ خلايا في 20 مل من وسط سيبريد + 20٪ FBS + 50 ميكروغرام/مل يوريدين إلى أنبوب مخروطي بحجم 50 مل 1.
   ملاحظة: هذا يعني 5000 خلية/مل، أي 500 خلية في 100 ميكرولتر عند الطلاء في صفيحة بسعة 96 بئر.
7. جهز أنبوبا مخروطيا بسعة 50 مل مع تخفيف 100 طية (200 ميكرولتر من أنبوب 1 في 20 مل من وسط سيبريد + 20٪ FBS + 50 ميكروغرام/مل يوريدين).
   ملاحظة: هذا حوالي 5 خلايا لكل بئر.
8. جهز أنبوب مخروطي 3 بسعة 50 مل مع تخفيف بنسبة 1:1 (10 مل من أنبوب 2 في 10 مل من وسط سيبريد + 20٪ FBS + 50 ميكروغرام/مل يوريدين).
   ملاحظة: هذا يعادل حوالي 2.5 خلية لكل بئر.
9. جهز أنبوب مخروطي بحجم 50 مل 4 مع تخفيف بنسبة 1:1 (10 مل من أنبوب 3 في 10 مل من وسط سيبريد + 20٪ FBS + 50 ميكروغرام/مل يوريدين).
   ملاحظة: هذا يعادل حوالي خلية واحدة لكل بئر.
10. أنابيب الصفائح 2 و3 و4 في ألواح بسعة 96 بئر بسعة 100 ميكرولتر لكل منها.
    ملاحظة: تأكد من خلط الخلايا قبل الطبق. من الصعب التحقق من يوم الفحص لمعرفة ما إذا كانت هناك خلية واحدة في كل بئر لأن الخلايا تحتاج إلى الغوص في القاع والالتصاق. ميزة هذه الطريقة هي أن الخلية الواحدة تنمو لتصبح مستعمرة، مما يضمن غياب خلفية مختلطة. العيب هو أن الطفرات الشديدة قد لا تنجو إذا تم عزلها.
11. في اليوم التالي، قم بشطب الآبار التي تحتوي بوضوح على أكثر من خلية واحدة في كل بئر.
12. بعد بضعة أيام، تحقق من الآبار مرة أخرى.
    ملاحظة: الآن يجب أن تكون هناك مستعمرات، ويكون الأمر أكثر وضوحا إذا كانت هناك خلايا منفردة بالقرب من حواف الآبار. إذا كان هناك أكثر من مستعمرة، قم بإزالة تلك الآبار. إذا لم يكن هناك خلية، أزل البئر.

8. النمو

1. ابدأ من صفيحة 96 بئر وانقل الخلايا إلى صفائح أكبر خطوة بخطوة حسب الحاجة.
   ملاحظة: هذه الخلايا تفضل أن تنمو بشكل أفضل مع كثافة الخلايا العالية، وعدم نقل عدد كاف من الخلايا قد يسبب الموت. احتفظ دائما بالطبق السابق الذي يحتوي على بعض الخلايا وحدد أي بئر جاء من أين حتى يتمكن المرء من العودة إذا لزم الأمر. من المهم أن خلايا 143B تموت وتنفصل إذا تداخلت بشكل مفرط، لذا تحقق من هذه الخلايا يوميا.

9. التأكيد الجيني

1. قم بالطرد المركزي للخلايا المجمعة عند 450 × جرام لمدة 5 دقائق.
2. أزل الوسائط.
3. أضف 5 ميكرولتر من مخزن استخراج الحمض النووي (50 ملليمولار NaOH).
   ملاحظة: يمكن أن يتغير هذا الرقم إذا كان هناك عدد كبير من الخلايا. يمكن أن تكون الحبيبات الخلوية الكبيرة في 10 ميكرولتر من المخزن الخلفي.
4. احتضن عند 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
5. أضف حجما مكافئا من مخزن تثبيت الحمض النووي (0.1 M Tris-HCl؛ pH 8) إلى مخزن الاستخلاص.
6. قم بإجراء تفاعل بوليميراز المتسلسل (PCR) وفقا لإرشادات الإنزيم.
   ملاحظة: بعض الطفرات النقطية يمكنها استخدام إنزيمات التقييد للتمييز بين خلايا التحكم والخلية المريضة. لا يمكن تمييز الطفرات النقطية الأخرى وتتطلب التسلسل. في هذه الحالة، من المهم استخدام خلطات PCR بدون صبغات للحصول على نتائج عالية الجودة. يمكن استخدام تسلسل سانجر والتسلسل من الجيل القادم. 2.5 ميكرولتر من الحمض النووي يكفي لتفاعل بحجم 25 ميكرولتر.
7. استخدم مضخمات PCR الخاصة بهذه الطفرة لتسلسل سانجر.
   ملاحظة: تم إرسال مضخمات PCR لتسلسل سانجر. تم تأكيد مستوى الطفرات المتغاير بعد توسع النسخة المستنسخة وبعد التحليل الوظيفي.

10. قياس التنفس عالي الدقة باستخدام قياس التنفس عالي الدقة

1. قم بمعايرة الهواء وفقا لإرشادات جهاز قياس الهواء (مثل أجهزة أوروبوروس).
2. اغسل السيبريدات في قارورة T75 باستخدام PBS.
   ملاحظة: يجب ألا تكون الخلايا متقاربة بشكل مفرط؛ التقاء 70٪–80٪ هو المثالي.
3. أضف 1 مل من التربسين وحضن لمدة 4 دقائق.
4. أضف 5 مل من وسط سايبريد وعد الخلايا.
5. أضف 500,000 خلية إلى أنبوب لخفض الطرد المركزي عند 450 × جرام لمدة 5 دقائق.
   ملاحظة: رقم الخلايا وأحجام جهاز قياس التنفس مع حجرة 0.5 مل.
6. اغسل الخلايا بإعادة التعليق باستخدام PBS وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى.
7. أعد تعليق الخلايا في 510 ميكرولتر من مخزن MiR05 وأضيف إلى حجرة فارغة.
8. بعد التثبيت، أضف 0.65 ميكرولتر من الديجيتونين (50 ملغ/مل)، و0.8 ميكرولتر من المالات (2.5 م)، و2 ميكرولتر من البيروفات (2.5 م).
   ملاحظة: قبل إضافة الديجيتونين، يتم قياس التنفس القاعدي هناك. يجب تنفيذ كل خطوة لاحقة بعد التثبيت.
9. أضف 12 ميكرولتر من ثنائي فوسفات الأدينوسين (ADP) (0.25 م).
10. أضف 4 ميكرولتر من الجلوتامات (2.5 م).
11. أضف 12 ميكرولتر من السوكسينات (1.25 م).
12. أضف 1 ميكرولتر من الأوليغوميسين (1 ملغ/مل).
13. أضف 1 ميكرولتر من سيانيد الكاربونيل-p-ثلاثي فلوروميثوميثوكسفينيل هيدرازون [FCCP] (0.2 ملم مو).
    ملاحظة: قم بتعديل التعديلات مع عدة إضافات حتى لا يلاحظ زيادة إضافية (عادة من 3 إلى 5).
14. أضف 1 ميكرولتر من الروتينون (2 مللي مول).
15. أضف 1 ميكرولتر من مضاد الميسين A (1 ملغ/مل).
16. أضف 0.5 ميكرولتر من الأسكوربات (0.8 م) و0.5 ميكرولتر من رباعي ميثيل فينيل إنيديامين [TMPD] (0.2 م).
17. افتح الحجرة بفاصل لمدة 20 دقيقة.
18. أغلق الحجرة وثبت الوضع لمدة 5 دقائق.
19. أضف 22.5 ميكرولتر من الأزيد (4 م).
20. اجمع الخلايا لقياس البروتين باستخدام مجموعة اختبار حمض البيسينشونيك (BCA).
21. إجراء الحسابات بعد تثبيت معدل استهلاك الأكسجين وتطبيع النتيجة بواسطة البروتين. التنفس القاعدي هو معدل استهلاك الأكسجين المستقر بعد إضافة الخلايا إلى الحجرة.
    ملاحظة: جميع القياسات الأخرى تؤخذ بعد الركيزة أو المثبط المذكور.
22. احسب_{فاصل الثقة} في أكسفوس: (جلوتامات-أنتيميسين A)/(FCCP-Antimycin A).
23. احسب_{OXPHOS CI+CII}: (سوكسينات-أنتي ميسين A)/(FCCP-Antimycin A).
24. احسب_{ETS CI+CII}: (FCCP-Antimycin A).
25. احسب_{ETS CII:} (روتينون-أنتي ميسين A)/(FCCP-Antimycin A).
26. احسب_{تسرب CI+CII}: (أوليغوميسين-أنتيميسين A)/(FCCP-Antimycin A).
27. احسب_{OXPHOS CIV:} (TMPD/ASC-Azide)/(FCCP-Antimycin A).
28. استخدم على الأقل 4-6 نسخ بيولوجية لقياسات قياس التنفس.

النتائج

لإثبات الفروق المنهجية ومسار تحسين البروتوكول، نقدم نتائج توليد السيبريد من مريض واحد يشتبه في وجود مرض ميتوكوندري يحمل متحورا غير معروف الدلالة (VUS) في MT-ND1 من العقدة الأولى (CI) في سلسلة نقل الإلكترونات. بعد التسلسل السريري التالي لجينوم mtDNA في عدة أنسجة في مختبرين تشخيصيين سريريين معتمدين من CLIA، كان المتغير الوحيد المشكوك فيه في المرض هو MT-ND1 m.3985G>A. كانت نسبة التغاير في دم المريض من طفرة MT-ND1 m.3985G>A (p.E227K) 50٪. تم إثبات رؤى تحسين البروتو...

المناقشة

هنا، نقدم بروتوكولا عالي الكفاءة لتوليد خطوط الخلايا السيبرية العابرة للميتوكوندريا من صفائح الدمى المرضى في mtDNA. نثبت قابلية التطبيق من خلال دراسة حالة لمتحور MT-ND1 ذو الدلالة غير المؤكدة، وأهمية النظر بعناية في معايير النمو والاختيار. بمجرد تحسين هذه القضايا الرئيسية، يتم اختيار السيبريدات الناجحة التي تحمل متغيرات mtDNA قد تعيق وظيفة السلسلة التنفسية. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتوليد السيبريدات ذات الطفرات في mtDNA.

يظهر الجدول الزمني لدراسة ا...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
ADP	Sigma Aldrich	A5285-1G
Antimycin A	Sigma Aldrich	A8674-25MG
Ascorbate	Sigma Aldrich	11140-250G
Azide	Sigma Aldrich	S2002-100G
Dialyzed FBS	Fisher Scientific	35071CV
Digitonin	Sigma Aldrich	D141-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	Cybrid media
DMEM	Corning	10-017-CM	Selection media
FBS	Cytiva	SH30910.03
FCCP	Apex Bio	B5004
Glutamate	Sigma Aldrich	G5889-100G
Graphpad Prism	Graphpad
Hybri-Max	Sigma Aldrich	P7306	fusion buffer
Malate	Sigma Aldrich	M1000-100G
MiR05 buffer	Oroboros Instruments	60101-01
O2K respirometor	Oroboros Instruments	C-0050
Oligomycin	Sigma Aldrich	O4876-5MG
Pyruvate	Sigma Aldrich	P2256-100G
Rotenone	Sigma Aldrich	R8875-1G
SMEM	Sigma	M8167
Succinate	Sigma Aldrich	S2378-100G
TMPD	Sigma Aldrich	T3134-5G
Trypsin-EDTA 0.25%	Thermo Scientific	25200056
Uridine	Sigma Aldrich	U3750-25G