مقالة منهجية

نموذج فئران في علم الأورام القلبي لدراسة السمية القلبية الناجمة عن الأنثراسيكلين في فئران ذات كفاءة مناعية حاملة لأورام الثدي

6 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71633

⸱

أكتوبر 1, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تندر النماذج الفأرية ذات الصلة سريريًا بسمية القلب الناجمة عن الأنثراسيكلين. لذا، يُقترح هنا نموذج يستخدم فئرانًا ذات كفاءة مناعية تحمل ورمًا وتتلقى علاجًا مضادًا للسرطان، وذلك لمحاكاة البروتوكولات السريرية لمرضى السرطان.

الملخص

يسلط التحديث الأخير الصادر عن الجمعية الأوروبية لأمراض القلب بشأن النماذج قبل السريرية للاختلال الوظيفي القلبي المرتبط بالعلاج السرطاني الضوء على الحاجة الماسة لنماذج in vivo أكثر تمثيلية وقابلية للتطبيق السريري. ويؤكد التحديث على ضرورة تطوير نماذج تستخدم حيوانات حاملة للأورام وذات كفاءة مناعية، مع دمج سلالات متعددة وكلا الجنسين، لمحاكاة التباين الملحوظ في المجموعات السريرية بدقة أكبر. وبناءً على ذلك، تم بناء نموذج ذي صلة سريرياً للتسمم القلبي الناجم عن الأنثراسيكلين (AIC) في حيوانات حاملة لأورام الثدي. ووفقاً للخلفية الجينية للفئران، حُقنت إما خلايا 4T1Luc (بعدد 200k خلية) أو خلايا PY8119 (بعدد 200k خلية) تحت الجلد في الغدة الثديية السفلية لذكور وإناث فئران Balb/c أو فئران C57Bl/6J، على التوالي. تم التحكم في نمو الورم عن طريق التصوير بالتلألؤ البيولوجي والجس. وبمجرد أن أصبح كتلة الورم قابلة للكشف عن طريق الجس، بعد أسبوعين من حقن الخلايا الورمية، تلقت الحيوانات علاجاً بمضاد السرطان دوكسوروبيسين (Doxorubicin). وكانت درجة تحمل الفئران للدكسوروبيسين تعتمد على السلالة. تم تقييم وظائف القلب قبل بدء البروتوكول (كخط أساس) وأسبوعياً بعد ذلك عن طريق الموجات فوق الصوتية للقلب في فئران مخدرة بالكيتامين. عُرّف التسمم القلبي بأنه انخفاض في التقصير الجزئي للبطين الأيسر بنسبة 10% على الأقل عن خط الأساس، وقيمة مطلقة <50%، ومعدل ضربات قلب >300 BPM. كان البروتوكول قابلاً للتكرار بنسبة نجاح بلغت 99% في تطور الورم، ومعدل بقاء للفئران >80%. لوحظ التسمم القلبي في >90% من الفئران المعالجة بالورم والدكسوروبيسين.

المقدمة

تهدف أمراض القلب والأورام إلى تحسين النتائج القلبية الوعائية لدى مرضى السرطان قبل العلاج الكيميائي وأثناءه وبعده. وقد لعبت النماذج قبل السريرية دوراً هائلاً في فهم التداخل بين هذين المرضين بشكل أفضل. ومؤخراً، لاحظت دراسة أحدثت تحولاً جذرياً في المفاهيم أن الفئران المهيئة أصلاً للإصابة بالسلائل المعوية التلقائية طورت المزيد من هذه الأورام بعد تعرضها لاحتشاء عضلة القلب وفترة من قصور القلب (HF)، مما أثبت التأثير المباشر لحدث قلبي وعائي على نمو الورم1. ومنذ ذلك الحين، أبلغت دراسات عديدة عن نتائج متسقة عبر أنواع مختلفة من الأورام وسلالات فئران متنوعة، مع الإشارة تكراراً إلى مسارات جزيئية أو بروتينات محددة، مما يعزز المفهوم القائل بأن تطور السرطان يتم تحفيزه بواسطة أمراض القلب والأوعية الدموية (CVDs)2,3,4,5.

على العكس من ذلك، تمت دراسة تأثير السرطان على خطر الإصابة بأمراض القلب والأوعية الدموية (CVDs) لعدة عقود. وتُظهر البيانات الوبائية أن الناجين من السرطان يعانون من زيادة في أمراض القلب والأوعية الدموية، ويرجع ذلك إلى عوامل الخطر المشتركة بين هذين المرضين، وإلى السمية المتنوعة المعروفة للعلاجات المضادة للسرطان6,7,8,9,10. وقد استخدمت الدراسات قبل السريرية عادةً نماذج الدنف (cachexia) الناجم عن السرطان لتحديد أهداف محددة يمكن تعديلها لدى البشر لتحسين النتائج القلبية الوعائية على المدى الطويل11,12,13,14. ومع ذلك، يمكن القول إن هذه النماذج لا تعكس الموقف السريري الشائع إلا نادراً، حيث يتم علاج المرضى غالباً قبل الوصول إلى هذه المتلازمة السرطانية المتقدمة، ولكن لا يزال يُشتبه في أن الدنف الشامل يساهم بشكل كبير في إجمالي الوفيات الناجمة عن السرطان15.

في أولى إرشادات أورام القلب الصادرة عن الجمعية الأوروبية لأمراض القلب (ESC)، تم الاستنتاج بأن هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لفهم العلاقة بين السرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية (CVDs) بشكل أفضل16. وبشكل أكثر دقة، ورد في تحديث حديث من مجموعة عمل الجمعية الأوروبية لأمراض القلب المعنية بأورام القلب أن الأبحاث قبل السريرية تكتسب أهمية قصوى في معالجة هذه الفجوة المعرفية، خاصة من خلال النماذج التي تستخدم حيوانات تحمل أوراماً17. علاوة على ذلك، هناك حاجة إلى تحقيق ارتباط أفضل بين الدراسات قبل السريرية والدراسات السريرية، نظراً لأن معظم الدراسات السريرية اليوم تُجرى على علاجات مضادة للسرطان لم يتم دراستها بشكل كافٍ في البيئات قبل السريرية18.

تُستخدم الأنثراسيكلينات (ACs)، مثل الدوكسوروبيسين (Dox)، بشكل شائع في العلاج الكيميائي لعدد كبير من الأورام الصلبة وأورام الدم. وبالرغم من توافر علاجات أكثر حداثة اليوم، إلا أن انخفاض تكلفتها، وآثارها الجانبية الموثقة جيداً، وفعاليتها الواضحة ستؤدي إلى استمرار استخدام هذه الأدوية لسنوات عديدة قادمة19,20. وتشير كمية هائلة من الأدلة إلى أن الأنثراسيكلينات تؤدي إلى سمية قلبية تعتمد على الجرعة، تظهر بشكل أساسي على شكل خلل في وظيفة البطين الأيسر، وهو أحد العوامل الرئيسية المحددة لاستخدامها السريري اليوم، وغالباً ما يمثل عاملاً مقلقاً لأطباء القلب المتخصصين في الأورام21,22. وتأتي هذه الدراسات الأدبية بشكل أساسي من أبحاث سرطان الثدي نظراً لارتفاع معدل الإصابة به لدى البشر، إلا أن الدراسات السريرية على الليمفوما وسرطان الرئة وسرطانات الدم تقدم ملاحظات مماثلة23. ولذلك، أُجريت أبحاث قبل سريرية لعدة عقود لفهم الآليات الفيزيولوجية المرضية الكامنة وراء السمية القلبية الناجمة عن الأنثراسيكلينات (AIC)، والتي أثبتت أن الإجهاد التأكسدي، وتلف DNA المباشر وغير المباشر، والموت الخلوي الحديدي (ferroptosis)، وتلف الميتوكوندريا هي عوامل مشتركة في هذه العملية23,24.

ومع ذلك، فإن الأدلة المتاحة حول كيفية الوقاية من التراكم الحديدي في القلب (AIC) أو علاجه محدودة في الواقع. وقد تم اختبار الأدوية الشائعة لعلاج فشل القلب (HF) في تجارب سريرية وأعطت نتائج متباينة، كما كان من الصعب تحديد التوقيت الأمثل لاستخدام المرشحات العلاجية القليلة المحتملة21,23,25,26,27,28. وقد أظهر دواء Dexrazoxane، وهو عقار معدل للحديد، نتائج واعدة في الوقاية من AIC، ولكنه لا يُستخدم بشكل منهجي اليوم21. كما أظهر تقديم المخلبيات (ACs) بأشكال أخرى غير الحالة الحرة في الدم، مثل تغليفها في الليبوسومات، نتائج واعدة، إلا أنها لا تزال تواجه صعوبة في استبدال المخلبيات التقليدية، ويرجع ذلك جزئياً إلى تكلفتها21.

أحد التفسيرات لهذا الوضع هو النقص في النماذج الحيوانية ذات الصلة سريريًا لدراسة AIC17. في البشر، يتم إعطاء Dox بمرور الوقت عن طريق الحقن المتكرر، ويُلاحظ معظم الـ AIC خلال العام الأول بعد العلاج. ومع ذلك، يُلاحظ تباين كبير في البروتوكولات الحيوانية عبر الأدبيات العلمية، كما هو موضح في مراجعة نُشرت مؤخرًا29. ومثال كلاسيكي على نموذج السمية القلبية الحادة هو استخدام فئران خالية من الأورام تتلقى حقنة واحدة بجرعة 20 mg/kg من Dox30. وفي نموذج نموذجي للسمية القلبية المزمنة، تصف العديد من الدراسات فئرانًا خالية من الأورام تتلقى حقنة واحدة أسبوعيًا بجرعة 5 mg/kg من Doxorubicin ليكون إجمالي الجرعة التراكمية 20 mg/kg29,31. ويمكن ملاحظة نموذج السمية القلبية المزمنة هذا أيضًا في الحيوانات الحاملة للأورام عند نفس جرعة Dox؛ ومع ذلك، يظل هذا أمرًا غير شائع للغاية في الأدبيات العلمية29,32.

للمساهمة في تقليل هذه الفجوة المعرفية، تم بناء نموذج عملي وذي صلة سريرياً لفئران ذات كفاءة مناعية حاملة لأورام الثدي لدراسة AIC، وتحديداً في فئران Balb/c الحاملة لخلايا 4T1، وتم تأكيد متانة هذا النموذج في فئران C57Bl/6J الحاملة لخلايا PY8119، وهو ما يمثل، حسب علم المؤلفين، المرة الأولى التي يتم فيها بناء نموذج لأمراض القلب والأورام باستخدام سرطان الثدي ثلاثي السلبية في سلالة C57Bl/6J. وقد تم تحقيق رصد دقيق لنمو الورم via الكمي للتألق الحيوي قبل معالجة الحيوانات بـ Dox، والذي أظهر سمية قلبية، كما تم تنفيذ بروتوكول لجمع الأعضاء لدراسة البيئة الدقيقة للورم بالتزامن مع تجربة أمراض القلب والأورام. علاوة على ذلك، لوحظت نتائج مشابهة لتلك الموصوفة في الأدبيات العلمية فيما يتعلق بالحساسية المرتبطة بالسلالة والجنس. ومن المتوقع أن يساهم هذا العمل في توحيد وتحسين بروتوكولات الحيوانات في دراسات أمراض القلب والأورام المستقبلية، حيث أن فئران C57Bl/6J ذات قيمة عالية نظراً لمعدل بقائها المرتفع في تجارب AIC29.

تكمن ميزة الطريقة المقترحة في استخدام سلالة C57Bl/6J، التي تتميز بسهولة الهندسة الوراثية، وامتلاكها جينومًا محدد الخصائص بدقة، وانخفاض تكلفة الحصول عليها، وتحملها لجرعات تراكمية عالية من ACs29,33,34. وإذا كانت هناك حاجة لتعطيل جين معين في دراسة محددة باستخدام ACs، فإن هذا النموذج يعد مناسبًا تمامًا لهذا الغرض. علاوة على ذلك، فإن استخدام سرطان الثدي ثلاثي السلبية المشتق من هذه السلالة يكتسي أهمية انتقالية، حيث أن النساء المصابات بسرطان الثدي ثلاثي السلبية هن المريضات الأكثر عرضة لتلقي ACs واللواتي يعانين من أسوأ التوقعات المرضية35. ومن المرجح أن يؤدي استخدام هذا النموذج إلى تحسين المعرفة المتعلقة بـ AIC خاصة لهؤلاء المريضات.

تكمن قوة هذا النموذج أيضاً في حقيقة أن الفئران مجهزة مسبقاً بورم، وهو ما يمكن أن يؤثر فعلياً على إعادة تشكيل القلب والأوعية الدموية36,37. كما يقع هذا النموذج بين النماذج الحادة والنماذج المزمنة تماماً لقصور القلب الناتج عن احتشاء العضلة القلبية (AIC)، مع إمكانية تمديد فترة مراقبة الحيوانات نظراً لمعدل بقائها المرتفع، وهو ما قد يكون ذا قيمة كبيرة في حال النظر في دورات أخرى من قصور القلب (AC-cycles).

ومع ذلك، فمن المرجح أن هذا النموذج ليس الأكثر ملاءمة لتوصيف أورام محددة في نهاية البروتوكول، وذلك بسبب نهجه العملي في تلقيح الورم. لذا يجب تنفيذ نسخة معدلة من حقن الورم إذا كان هذا الأمر محورياً في الفرضية العلمية. كما أن حقن خلايا 4T1 في فئران Balb/c يعد نموذجاً راسخاً لمنهج أكثر تركيزاً على علم الأورام، على سبيل المثال لدراسة النقائل السرطانية، وهو أمر غير موصوف هنا ويجب أخذه في الاعتبار إذا كانت النقائل أساسية للسؤال العلمي38. يتم تنفيذ هذا النموذج في الفئران البالغة؛ ومع ذلك، إذا كان الهدف هو دراسة AIC في سياق الأطفال، فيجب النظر في استخدام فئران أصغر سناً، والتي لم يتم دراسة استجابتها لهذا البروتوكول هنا.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقاً للجنة أخلاقيات الحيوان المحلية (Lariboisière-Villemin) وبموافقة وزارة التعليم العالي والبحث الفرنسية (MESRI) بموجب بروتوكول رقم APAFIS 46086. وقد تم مراعاة قواعد 3R أثناء تصميم البروتوكول. تم شراء فئران من سلالتي Balb/c و C57Bl/6J من مُصنِّع حيوانات مثل Janvier Labs أو Envigo. وفي هذا البروتوكول، تراوحت أعمار الفئران عند الإدراج بين 10 أسابيع و 18 أسبوعاً لتتوافق مع مرحلة الشباب، بما يشبه النساء المصابات بسرطان الثدي ثلاثي السلبية. حُفظت الحيوانات في مجموعات تضم 2–5 أفراد في غرفة ذات دورات ضوء/ظلام مدتها 12 h، ودرجة حرارة غرفة تتراوح بين 20 °C و 24 °C، ورطوبة تتراوح بين 30% إلى 70%. ووُفر الماء والغذاء ad libitum. وخلال البروتوكول، تم توخي الحذر لاتباع نقاط النهاية الإنسانية المحددة مسبقاً قبل بدء البروتوكول، كما هو موضح في الجدول التكميلي 1. تأكد من استخدام مرشح الإيزوفلورين لجمع الغاز المهدر من أجل سلامة مستخدم الإيزوفلورين. تعامل مع الحيوانات بعناية، مع ارتداء القفازات والنظارات في كل خطوة من خطوات هذا البروتوكول. يجب أن تتبع جميع المواد الخطرة اللوائح المؤسسية المحلية؛ وهنا، تم التخلص من جميع العينات الملوثة (الدم، والإبر، والقوارير التي تحتوي على dox، وغيرها) في حاويات النفايات الرعاية الصحية ذات المخاطر البيولوجية. يظهر نظرة عامة على البروتوكول في الشكل 1A. الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. الأسبوع 0: تحضير الخلايا وحقنها في الحيوان

ملاحظة: تم وصف الخطوات التالية لخلايا 4T1Luc وكانت متطابقة عند استخدام خلايا PY8119. ومع ذلك، يجب تكييف هذه الخطوات لكل خط خلوي، بناءً على توصيات الشركة المصنعة. ولتحسين البروتوكول، يمكن لشخص واحد تولي تحضير الخلايا، بينما يتولى الشخص الآخر تحضير الحيوانات.

  1. عند الحصول على قارورة زراعة خلايا متلاحمة (تلاحم بنسبة 80%–90%)، يُضاف 3 mL من التربسين لمدة 5 min عند 37 °C و5% CO2.
  2. يُنقر على القارورة بلطف لفصل جميع الخلايا، مع تجنب تكتل الخلايا، ثم يُعاد تعليقها في وسط زراعة الخلايا.
  3. يتم عد الخلايا باستخدام غرفة مالاسيز (أو تقنية أخرى، حسب المتوفر).
  4. تُطرد الخلايا مركزياً عند 300 × g لمدة 5 min، ثم يُعاد تعليقها في حجم مساوٍ من PBS لحقن 200,000 خلية في 100 µL.
    ملاحظة: تم اختيار عدد الخلايا بعد مراجعة أدبية (راجع الجدول التكميلي 2).
  5. يُسحب بلطف باستخدام سرنجة 26 G مقدار 500 µL من معلق الخلايا. ولتجنب قضاء وقت طويل ومعلق الخلايا داخل السرنجة، يُوصى بملء السرنجة بحجم أقل من اللازم لـ 5 حيوانات.
  6. بالتزامن (إن أمكن)، توضع الفئران في غرفة إيزوفلوران ويُحث التخدير بسرعة باستخدام 3% إيزوفلوران بمعدل 1 L/min في الهواء المحيط. وبمجرد نوم الحيوان، يوضع في وضعية الاستلقاء الظهري مع وضع الخطم في مخروط يحتوي على إيزوفلوران بنسبة 1%.
  7. يُوضع كريم إزالة الشعر الناعم باستخدام مسحة قطنية على الجدار الصدري والجدار البطني السفلي الأيسر للحيوان لمدة 1 min. يُزال الشعر والكريم بالماء، ثم يُجفف الجلد بقطعة منديل.
  8. يتم التأكد من كفاية التخدير عن طريق قرص إصبع القدم.
  9. يتم تحديد حلمة الثدي اليسرى في الجزء العلوي من البطن. تُمسك بلطف بالملقط وتُرفع للأعلى (راجع الشكل 1B).
  10. تُدخل إبرة السرنجة تحت الجلد وتُدفع حتى تصبح الإبرة تحت الغدة الثديية.
  11. يُحقن 100 µL من معلق الخلايا. يجب أن تتشكل فقاعة تحت الجلد أسفل الحلمة (راجع الشكل 1C). يجب أن تتلقى حيوانات المجموعة الضابطة PBS. يمكن إجراء العشوائية باستخدام برنامج عشوائي (مثل RandoMice، وهي أداة مجانية عبر الإنترنت) أو عن طريق تخصيص العلاج للفئران بنسبة محددة مسبقاً 1 إلى 1 أو 2 إلى 2 (أو أعلى).
  12. تُسحب الإبرة بلطف، ويُترك الحلمة الممسوكة بالملقط.
  13. يُوزن الحيوان للحصول على وزن أساسي للبروتوكول.
  14. يُترك الحيوان ليستيقظ في الهواء المحيط قبل إعادته إلى قفصه.

2. الأسبوع 1: التحكم في نمو الورم باستخدام التألق الحيوي

ملاحظة: يمكن القيام بذلك في أي يوم بعد الحقن للتحكم في النمو. علاوة على ذلك، يمكن إجراء هذه العملية في نقاط زمنية متعددة إذا كان معدل نمو الورم موضع اهتمام. ومع ذلك، بعد 10–14 يوماً، قد تتلاشى الإشارة بسبب الانتقاء الطبيعي لخلايا الورم أثناء نمو السرطان. كما أن إعادة نمو الشعر لا ينبغي أن تشكل مشكلة أمام الالتقاط السليم للفوتونات إذا تم تنفيذ البروتوكول بشكل صحيح في البداية. انظر الشكل 2A,B للحصول على نتائج نموذجية للتلألؤ البيولوجي التي تم قياسها في الأيام 2 و5 و8 و11 بعد حقن الورم.

  1. ضع الحيوانات في غرفة الإيزوفلوران وحفز التخدير سريعاً باستخدام 3% isoflurane.
  2. بمجرد نوم الحيوانات، احقن 10 µL/g من وزن الجسم من مادة اللوسيفيرين في التجويف البريتوني (IP) باستخدام حقنة قياس 26-G. تجنب حقن اللوسيفيرين في الجانب الأيسر بسبب وجود الورم، والذي قد يكون ملموساً في بعض الأحيان بعد بضعة أيام.
  3. ضع الفئران في جهاز التصوير الفوتوني في وضع الاستلقاء الظهري لتحسين التقاط الفوتونات، بما أن الورم يقع في الجانب البطني. ضع المخطم في القمع الأنفي وخفض تركيز isoflurane إلى 1%.
    ملاحظة: يستغرق وضع 5 حيوانات بشكل صحيح في جهاز التقاط الفوتونات بعض الوقت؛ لذا ابدأ بوضعها قبل دقيقتين على الأقل من الموعد المقرر لبدء عملية الاستحواذ.
  4. ابدأ عملية استحواذ نشاط التألق الحيوي بعد 10 دقائق من حقن اللوسيفيرين، واستمر في ذلك لمدة 5 دقائق (انظر الشكل 2A). كان وضع الاستحواذ للجهاز المستخدم هنا هو BLI بمعدل 89 ms لكل إطار، وبحجم صورة 220 mm x 165 mm وحجم BVR Pixel يبلغ 153 µm.
  5. عند اكتمال عملية الاستحواذ، اترك الحيوان يستيقظ في الهواء المحيط قبل إعادته إلى قفصه.
  6. استخدم برنامج قياس كمي متوافق مع جهاز التصوير الفوتوني، وفقاً لتوصيات الشركة المصنعة.

3. الأسبوع 2: العلاج بالدوكسوروبيسين

ملاحظة: يجب إجراء التقييم بتخطيط صدى القلب قبل البدء في حقن Dox. لذا، استخدم التخدير الناتج بعد تخطيط صدى القلب لإعطاء الحقنة أثناء نوم الحيوان لتقليل التوتر الناتج عن حقنة Dox الأولى. كما يجب مواءمة الجرعة التراكمية لكل سلالة من الفئران. هنا، تم استخدام 16 mg/kg لفئران Balb/c و 24 mg/kg لفئران C57Bl/6J، بناءً على بيانات داخلية سابقة والمؤلفات العلمية29 (انظر الشكل 3A–C).

  1. أعد تعليق مسحوق doxorubicin وخففه باستخدام محلول ملحي. يجب تحضير التخفيف بحيث تعادل جرعة 4 mg/kg من Dox حجماً يتراوح بين 240–360 µL. وبناءً عليه، يُقترح تحضير محلول بتركيز 2 mg/mL، ثم إجراء تخفيف بمقدار 6 أضعاف باستخدام محلول ملحي (التركيز النهائي 0.33 mg/mL).
  2. بعد مرور أسبوعين على حقن الورم، تأكد من أن الورم يمكن جسّه في الجزء السفلي الأيسر من البطن، وبحجم أقل من 1 cm.
  3. زن الحيوان لمراقبة فقدان الوزن بعد العلاج بـ Dox.
  4. باستخدام سرنجة قياس 26 G، احقن الحجم المقابل للوصول إلى جرعة 4 mg/kg عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) في الجزء السفلي الأيمن من البطن. يجب أن تتلقى حيوانات المجموعة الضابطة محلولاً ملحياً. يمكن إجراء التوزيع العشوائي كما هو موضح في الخطوة 1.11.
  5. كرر هذا الإجراء يومياً لمدة 4 أيام للوصول إلى جرعة تراكمية قدرها 16 mg/kg (أضف يومين للوصول إلى 24 mg/kg لفئران C57Bl/6J).

4. الأسبوع 2–5: مراقبة السُمية القلبية

ملاحظة: يمكن إجراء ذلك على أساس أسبوعي. يتطلب التقييم الأكثر تكراراً توخي الحذر، حيث تكون الحيوانات غالباً أكثر عرضة للخطر خلال الأسبوعين 3 و4 من البروتوكول، ولأن بعض سلالات الفئران تكون حساسة للتخدير العام، مما قد يؤدي إلى زيادة معدلات الوفيات. يتم إجراء تخطيط صدى القلب تحت تأثير تخدير الكيتامين لتحسين فرص تسجيل خلل الوظائف القلبية بما أن الإيزوفلوران يسبب تثبيط عضلة القلب، حيث يتم استخدام 40 mg/kg لفئران Balb/c و80 mg/kg لفئران C57Bl/6J39. ويُنصح بإجراء فحص بالموجات فوق الصوتية مرة واحدة قبل البدء بحقن الورم لتحديد التأثير المحتمل لنمو الورم على الوظيفة القلبية قبل بدء العلاج الكيميائي.

  1. قم بوزن الحيوان. في حال ملاحظة فقدان كبير في الوزن، اتبع الجدول التكميلي 1.
  2. قم بتخدير الحيوانات عن طريق حقن داخل الصفاق (IP) باستخدام حقنة قياس 26 G من الكيتامين بجرعة 40 mg/kg (لفئران Balb/c) أو 80 mg/kg (لفئران C57Bl/6J) للحصول على تخدير خفيف.
  3. ضع الحيوان على وسادة تدفئة لتجنب انخفاض درجة حرارة الجسم.
  4. بمجرد أن ينام الحيوان، قم بحلاقة الحيوان كما هو موضح في القسم 1.7 للحصول على منطقة صدر خالية من الشعر.
  5. بعد عشر دقائق من حقن الكيتامين، قم بإجراء تخطيط صدى القلب لمدة أقصاها 5 min. استخدم جل الموجات فوق الصوتية المسخن مسبقاً. وبناءً على الجهاز المستخدم، ركز على وضع M-mode و/أو قم بتحليل كمي للإجهاد (strain-quantification).
  6. في حال استخدام وضع M-mode، قم بتسجيل قطاعات منتصف البطين في عرض المحور الطولي بجانب القص، مع نبض يستمر لـ 4 s على الأقل، وذلك 3 مرات على الأقل للحصول على متوسط تمثيلي لوظائف قلب الفأر (انظر الشكل 4A،B). هنا، تم ضبط معدل الإطارات عند 100 frames/s، وتردد الإرسال عند 38.4 MHz بقدرة 100%، وتردد الاستقبال عند 96 MHz، وسرعة الصوت عند 1538 ms، وسرعة المسح عند 1200 Hz.
  7. بعد حوالي 5 min، سيستيقظ الحيوان لدرجة لا تسمح بإجراء تخطيط صدى القلب. أعده إلى قفصه بعد تنظيف الجل المستخدم في الموجات فوق الصوتية.
  8. قم بإجراء تحليل كمي أعمى لوظائف القلب39,40. يُعرّف الخلل الوظيفي ذو الصلة في هذا النموذج بأنه انخفاض بنسبة 10% عن قيمة خط الأساس وقيمة مطلقة <50% من قصر الجزء البطيني الأيسر (FS) بينما يظل معدل ضربات القلب >300 BPM. إذا كانت قيمة FS قبل العلاج منخفضة جداً، فكر في استبعاد الحيوان من التحليل.
    ملاحظة: يلزم وجود 3 دورات قلبية على الأقل لكل تحليل كمي من المقاطع التي تبلغ مدتها 4 s، ولكن يمكن استخدام دورات أكثر عند الإمكان. إذا أمكن، استخدم نفس الفاحص لجميع عمليات تخطيط صدى القلب وشخصاً مختلفاً للتحليل الكمي لضمان تعمية التحليل. التوصيات المتعلقة بمراقبة جودة تخطيط صدى القلب منشورة في مكان آخر40.
  9. قم بإجراء التحليل الإحصائي (انظر الخطوة 6). الاختبار الموصى به لتحليل مجموعتين على مدار البروتوكول بالكامل هو تحليل التباين ثنائي الاتجاه (two-way ANOVA)، نظراً لمقارنة عاملين: الوقت والعلاج.
  10. قم بإجراء ذلك بشكل أسبوعي. يظهر الخلل الوظيفي بعد أسبوع واحد فقط من العلاج بالدوكسوروبيسين.
    ملاحظة: إذا كانت هناك حاجة لسحب عينات دم في وقت ما بعد إعطاء الـ Dox، على سبيل المثال لقياس المؤشرات الحيوية القلبية، فقم بسحب عينة الدم مباشرة بعد تخطيط صدى القلب لتجنب حقنة تخدير أخرى، وتقليل إجهاد الحيوان، وتحسين استغلال الوقت.

5. الأسبوع الخامس: إجراء التضحية

ملاحظة: يفضل تنفيذ بروتوكول جمع الأعضاء هذا بواسطة شخصين.

  1. بعد آخر تخطيط صدى القلب في الأسبوع 5، أعد حقن الحيوانات بـ ketamine عبر الصفاق (IP) بجرعة 100 mg/kg. ضع تخديرًا موضعيًا باستخدام قطرة من Tetracaïne بتركيز 1% في العين التي ستُستخدم لسحب الدم.
  2. باستخدام أنبوب شعري يحتوي على heparin، قم بإجراء سحب دم من خلف المحجر لجمع أكبر كمية ممكنة من الدم في أنبوب heparin (أو أنبوب شعري EDTA في أنبوب EDTA).
  3. عندما لا يمكن الحصول على المزيد من الدم، قم بإجراء خلع عنقي وفقًا للبروتوكولات المعتمدة مؤسسيًا. ضع الدم المجموع فورًا على الثلج حتى يتم التعامل معه لاحقًا، مع المتابعة في بروتوكول التضحية كما هو موضح في الخطوة 5.5.
  4. قم بطرد مركزي للدم بسرعة 2000 x g لمدة 10 min عند 4 °C لفصل خلايا الدم والبلازما. قم بتجميد أنبوب البلازما تجميدًا سريعًا باستخدام النيتروجين السائل واحفظه عند -80 °C حتى التحليل اللاحق.
  5. ضع الحيوان على غطاء من رغوة البوليسترين مغطى بورق ماص، وثبت الأرجل الأربعة باستخدام دبابيس.
  6. يجب أن يكون الورم بحجم ملحوظ (2 cm على الأقل). اقطع بهامش واسع حول الورم لفصله. يمكن إجراء مزيد من التشريح بعد جمع الأعضاء المتبقية الموصوف في الخطوة 5.15.
  7. في منطقة منفصلة، قم بتشريح الورم برفق باستخدام مقص صغير وحاد مع تثبيته بملقط. لزيادة الشد دون إتلاف الورم، ثبت الجلد الزائد بالدبابيس في الغطاء؛ فهذا يسهل عملية التشريح.
  8. بمجرد تشريح الورم جيدًا، نظفه برفق باستخدام PBS لإزالة الدم والشعر وأي شوائب أخرى غير ملتصقة. قم بوزن الورم.
  9. ضع شبكة نايلون بمسامية 22 µm في أنبوب طرد مركزي سعة 5 mL، وضع الورم عليها برفق، واتركه على الثلج حتى عملية الطرد المركزي.
  10. قم بطرد الأنبوب مركزيًا بسرعة 100 x g لمدة 10 min عند 4 °C لجمع السائل الخلالي (انظر الشكل 5A). يتراوح الحجم الذي يتم الحصول عليه من 1 إلى 20 µL، وغالبًا ما يكون لونه مائلًا للاحمرار (الشكل 5B). انقل السائل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 200 µL واحفظه عند -80 °C حتى التحليل اللاحق.
    ملاحظة: يمكن تقطيع بقية الورم إلى قطع أصغر ووضعها في أنابيب تخزين، وتجميدها تجميدًا سريعًا في النيتروجين السائل، وحفظها عند –80 °C حتى التحليل اللاحق.
  11. لجمع نخاع العظم، اقطع الساق اليمنى بالمقص، وشرح عظم الفخذ وعظم الظنبوب باستخدام مشرط وملقط بحيث يتم إزالة جميع العضلات والأنسجة الضامة والدهون. اقطع المشاشة من كلا جانبي العظمتين باستخدام المشرط. ضع العظام المنظفة في PBS في أطباق زراعة ذات 12 بئرًا أثناء إكمال عملية جمع أعضاء الفئران كما هو موضح في الخطوة 5.15.
    ملاحظة: تتوفر تفاصيل أكثر شمولاً حول عزل نخاع العظم في منشورات أخرى41.
  12. اثقب قاع أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 500 µL باستخدام إبرة 18 G، وضع العظمتين بداخلها، ثم ضع الأنبوب في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 mL مملوء بـ 400 µL من PBS.
  13. قم بطرد الأنابيب مركزيًا بسرعة 10,000 x g لمدة 1 min عند 4 °C. ستظهر كتلة من الخلايا في قاع أنبوب 1.5 mL؛ جميعها خلايا نخاع عظم، بينما تكون سدى نخاع العظم مختلطة في PBS. اسحب كل السائل الطافي (سدى نخاع العظم) إلى أنبوب تخزين منفصل، وقم بتجميد المادة تجميدًا سريعًا في النيتروجين السائل، واحفظها عند -80 °C.
  14. باستخدام المقص، قم بعمل شق عرضي أسفل الصدر عند مستوى الحجاب الحاجز، واقطع عظم القص على طول محوره الطولي لكشف الرئتين والقلب.
    ملاحظة: إذا لزم الأمر للتحليل اللاحق، يمكن إجراء عملية إزالة الدم الكامل باستخدام محلول ملحي هنا.
  15. اجمع جميع الأعضاء اللازمة للتحليل الجزيئي الحيوي والنسيجي. قم بوزنها وتقطيعها إلى قطع أصغر لتسهيل التحليل الجزيئي الحيوي المستقبلي. قم بتجميد جميع الأنابيب تجميدًا سريعًا في النيتروجين السائل بمجرد تقطيع العضو إلى قطع أصغر، ثم احفظها عند -80 °C.
  16. بالنسبة للقلب، افصل القمة عن الجزء العلوي من القلب وضعها في قوالب بلاستيكية مملوءة بـ OCT. وبمجرد وضعها في OCT، ضعها في إيزوبنتان بارد قبل تجميدها تجميدًا سريعًا بالنيتروجين السائل وحفظها عند -80 °C.

6. التحليل الإحصائي

ملاحظة: تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية والرسوم البيانية باستخدام برامج الإحصاء والرسم البياني، واتباع توصيات الدليل الإحصائي42.

  1. تُعرض البيانات الحالية على شكل المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).
  2. استخدم نفس المقياس لجميع الرسوم البيانية الخاصة بالتقصير الجزئي (fractional shortening).
  3. اعرض كل وحدة تجريبية فردية (فأر) في كل رسم بياني.
  4. أجرِ اختبار شابيرو-ويلك (Shapiro-Wilk) لتقييم طبيعية توزيعات كل مجموعة تجريبية، مع تحديد مستوى الدلالة ألفا عند p = 0.05.
  5. للمقارنة بين مجموعتين، استخدم اختبار ويلش (Welch’s) أو اختبار مان-ويتني (Mann-Whitney’s) اعتماداً على طبيعية التوزيع (اختبار ويلش للتوزيعات الطبيعية في كلتا المجموعتين، واختبار مان-ويتني إذا كان توزيع إحدى المجموعتين أو كلتيهما غير طبيعي). اختر خياري الطرفين (two-tailed)، مع تحديد مستوى ثقة عند 95%.
  6. للمقارنة بين أكثر من مجموعتين في نقطة زمنية محددة، حدد مرة أخرى ما إذا كانت توزيعات المجموعات طبيعية كما في الخطوة 6.4. أجرِ تحليل التباين أحادي الاتجاه (one-way ANOVA) متبوعاً بتصحيح هولم-سيداك (Holm-Sidak’s) للمقارنات المتعددة إذا كان التوزيع طبيعياً.
    ملاحظة: إذا كان التوزيع غير طبيعي، يجب بدلاً من ذلك إجراء اختبار كروكسال-واليس (Kruskal-Wallis’s) مع تصحيح دان (Dunn’s) للمقارنات المتعددة. تم تحديد عتبة ألفا للعائلة (family-wise alpha threshold) عند 0.05 لتحديد الدلالة.
  7. بالنسبة للبيانات الطولية، استُخدم تحليل التباين ثنائي الاتجاه للقياسات المتكررة (repeated-measure two-way ANOVA) متبوعاً بتصحيح سيداك (Sidak’s) للمقارنات المتعددة لفحص الفروق بين المجموعات في نقطة زمنية محددة. تم تحديد عتبة ألفا للعائلة عند 0.05 لتحديد الدلالة.

النتائج

يظهر هذا البروتوكول، كما هو موضح في الشكل 1-أعبارة عن بروتوكول مدته 5 أسابيع ينتج عنه المجموعات التجريبية التالية: فئران غير حاملة للأورام وغير معالجة بـ dox، وفئران غير حاملة للأورام ومعالجة بـ dox، وفئران حاملة للأورام وغير معالجة بـ dox، وفئران حاملة للأورام ومعالجة بـ dox. ويمكن مضاعفة هذه المجموعات بناءً على ما إذا كان قد تم استخدام كلا الجنسين. وتعتبر أول أسبوعين من نمو الورم، قبل بدء العلاج بـ Dox، كافية لنمو الورم بعد حقن 200,000 خلية في الـ 4th الغدة الثديية اليسرى للحيوانات (الشكل 1بيتم التأكد من إتمام الحقن تحت الجلد من خلال ظهور فقاعة أسفل الحلمة عند حقن معلق الخلايا الورمية برفق.الشكل 1ج). الجدول 1 يلخص بإيجاز المعايير الرئيسية للبروتوكول لكل سلالة من الفئران، إلى جانب النتائج الرئيسية التي سيتم مناقشتها أدناه.

الشكل 2A هو صورة تمثيلية للإشارة ذات bioluminescent التي تم الحصول عليها عند حقن فأر واحد بدون ورم (يساراً) وفأر واحد بوجود ورم (يميناً) بمادة luciferin، مع تجميع الفوتونات لمدة 5 min. يتطلب هذا التحليل وجود أورام تعبر عن جين luciferase لتوليد الفوتونات عند حقن luciferin. في المجمل، تمت مراقبة 33 فأراً من سلالة Balb/c محقونة بخلايا 4T1Luc لمدة 11 يوماً باستخدام bioluminescence، بينما استُخدم 9 فئران كمجموعة ضابطة. يؤكد الشكل 2B أن الورم ينمو بسرعة، ولكن كثافة الإشارة تبدأ في الاستقرار بعد اليوم 8، ويبدو أن هناك نمواً أولياً أكثر سرعة للورم في الإناث مقارنة بذكور فئران Balb/c، كما هو موضح في الشكل 2C. لم يظهر الورم إلا في فأر واحد فقط من أصل 45 فأراً من سلالة Balb/c بعد 5 أسابيع، بينما ظهر الورم في جميع فئران C57Bl/6J بعد 5 أسابيع (الشكل 2D).

الشكل 3أ  و الشكل 3B إثبات أن الخفض التراكمي لجرعة عقار Dox يؤدي إلى تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة بعد 3 أسابيع من بدء إعطاء Dox: فبينما لم تنجُ أي من فئران Balb/c الحاملة للأورام عند جرعة 24 مجم/كجم، نجت نسبة 50% منها عند جرعة 16 مجم/كجم. ومع ذلك، فإن فئران C57Bl/6J الحاملة للأورام تكون أكثر مقاومة، حتى عند جرعة 24 مجم/كجم من Dox، وذلك لأن >يتمكن 80% منهم من البقاء على قيد الحياة لمدة 3 أسابيع بعد بدء العلاج الكيميائي (الشكل 3Dوكان للجنس تأثير مهم على النتيجة؛ حيث أظهرت الإناث معدل بقاء أفضل بكثير من الذكور في فئران Balb/c (نجت 16 من أصل 29 أنثى مقارنة بـ 3 من أصل 16 ذكراً). الشكل 3ج يوضح الفروق بين الجنسين في فئران Balb/c التي تلقت 16 ملجم/كجم من Dox (لم يتم إجراء اختبار إحصائي بسبب العدد المنخفض من الذكور). وفي فئران C57Bl/6J، لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في معدلات البقاء على قيد الحياة بين الجنسين (انظر الشكل 3E).

تظهر في الصورة الممثلة لوظيفة القلب السليمة لدى الفأر، والتي تم تقييمها بواسطة تخطيط صدى القلب قبل العلاج بـ Dox، ما يلي: الشكل 4A، ويظهر في الشكل أحد النماذج لفأر يعاني من خلل في الوظائف القلبية بعد الحقن بـ Dox الشكل 4بيُظهر قياس الكسر القصير (FS) في وضع M-mode لـ 17 فأراً من سلالة C57Bl/6J حاملة للأورام ومعالجة بجرعة 24 ملغ/كغم من الدوكسوروبيسين (Dox) انخفاضاً ملحوظاً بعد مرور أسبوعين (59.3% قبل العلاج بـ Dox). ضد 44.3% بعد العلاج بـ Dox، p < 0.0001, الشكل 4ج). ولم تستوفِ فأرة واحدة فقط من بين الفئران الـ 12 الناجية (8%) المعايير المحددة مسبقاً لسمية القلب. وينخفض معدل ضربات القلب بشكل طفيف ولكن ملحوظ من 623 نبضة في الدقيقة قبل إعطاء Dox إلى 569 نبضة في الدقيقة بعد إعطائه (p < 0.05, الشكل 4D). يمكن العثور على جميع المعايير التي تم قياسها كمياً بواسطة الوضع M في الجدول التكميلي 3.

يتم تأكيد التأثير السام للقلب لعقار Doxorubicin من خلال التحليل العياني والمجهري. يوضح الشكل 6A،B أن الوزن المطلق للقلب ينخفض بشكل ملحوظ بعد العلاج بـ Dox في عدد قليل من إناث فئران Balb/c الحاملة للأورام والناجية، ولكن عند تطبيع وزن القلب بالنسبة لوزن الجسم الإجمالي، يظهر ذلك مجرد اتجاه عام. وفي تجربة أجريت على فئران C57Bl/6 غير الحاملة للأورام، أدى حقن 24 mg/kg من Dox إلى إحداث تغييرات متوقعة في mRNA القلبي للجينات التالية بعد أسبوع واحد من بدء العلاج بـ Dox: حيث ارتفع تعبير Atrogin و Murf1 لصالح حدوث الضمور، وارتفع تعبير NQO1 لصالح الإجهاد التأكسدي، وارتفع تعبير Bax لصالح حالة محفزة للاستماتة (الشكل 6C–F).

الشكل 5A هو تمثيل تخطيطي لبروتوكول سائل الورم الخلالي. تظهر صورة نموذجية للسائل الذي تم جمعه في الشكل 5B: حيث أن الحجم الذي تم الحصول عليه صغير.

figure-results-1
الشكل 1: رسوم توضيحية ممثلة للبروتوكول التجريبي. (A) نظرة عامة تخطيطية للبروتوكول التجريبي. تم إنشاؤه بواسطة BioRender (ترخيص رقم JE29USE7LU). (B) تمثيل تخطيطي لتلقيح الورم تحت الجلد. تم إنشاؤه بواسطة BioRender (ترخيص رقم SO29JHW7R6). (C) تمثيل تخطيطي لنجاح زرع الورم تحت الجلد. تم إنشاؤه بواسطة BioRender (ترخيص رقم SO29JHW7R6). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: التصوير بالتلألؤ البيولوجي ومعدل زرع الورم. (A) صور تمثيلية للتلألؤ البيولوجي لفأر ضابط (يساراً) وفأر حامل للورم (يميناً). (B) إشارة التلألؤ البيولوجي بمرور الوقت (المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط SEM؛ تحليل التباين ثنائي الاتجاه للقياسات المتكررة [ANOVA]؛ *P < 0.05). (C) مقارنة إشارات التلألؤ البيولوجي بين ذكور وإناث فئران Balb/c (المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط SEM). (D) معدلات نجاح زرع الورم في كلا سلالتي الفئران. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: تحليل البقاء على قيد الحياة للفئران الحاملة للأورام. (A) منحنى كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة لفئران Balb/c المعالجة بـ 24 mg/kg من الدوكسوروبيسين (Dox). (B) منحنى كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة لفئران Balb/c المعالجة بـ 16 mg/kg من Dox. (C) منحنى كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة بمقارنة الذكور والإناث من فئران Balb/c المعالجة بـ 16 mg/kg من Dox. لم يتم إجراء تحليل إحصائي بسبب العدد المحدود من ذكور الفئران. (D) منحنى كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة لفئران C57BL/6J المعالجة بـ 24 mg/kg من Dox. (E) منحنى كابلان-ماير للبقاء على قيد الحياة بمقارنة الذكور والإناث من فئران C57BL/6J المعالجة بـ 24 mg/kg من Dox (اختبار log-rank، P = 0.86). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: التقييم بالتخطيط الصدوي للقلب لسمية القلب الناجمة عن الدوكسوروبيسين. (أ) تخطيط صدوي للقلب بوضع M-mode نموذجي لفأر سليم. (ب) تخطيط صدوي للقلب بوضع M-mode نموذجي لفأر يعاني من سمية القلب الناجمة عن الدوكسوروبيسين. (ج) التقصير الجزئي (FS) في فئران C57BL/6J قبل العلاج بالدوكسوروبيسين وبعده بـ 14 يومًا. (د) معدل ضربات القلب (HR) في فئران C57BL/6J قبل العلاج بالدوكسوروبيسين وبعده بـ 14 يومًا. البيانات معروضة لـ n = 17 فأراً. أُجريت المقارنات الإحصائية باستخدام اختبار Welch's t-test. *P < 0.05; ****P ≤ 0.0001. الاختصارات: FS، التقصير الجزئي؛ HR، معدل ضربات القلب. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: بروتوكول أخذ عينات الأعضاء. (أ) تمثيل تخطيطي لبروتوكول جمع السائل الخلالي للورم. تم إنشاؤه باستخدام BioRender (ترخيص رقم HV29USD91R). (ب) صورة تمثيلية توضح عملية جمع السائل الخلالي للورم أثناء أخذ عينات الأعضاء. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: السمية القلبية المستحثة بـ Doxorubicin. (A) وزن القلب المقاس بعد 3 أسابيع من بدء العلاج بـ doxorubicin بجرعة 16 mg/kg في فئران Balb/c حاملة للأورام. (B) وزن القلب المعياري بالنسبة لإجمالي وزن الجسم المقاس بعد 3 أسابيع من بدء العلاج بـ doxorubicin بجرعة 16 mg/kg في فئران Balb/c حاملة للأورام. (C) تعبير mRNA لـ Atrogin في عضلة القلب لفئران C57BL/6J بعد أسبوع واحد من بدء العلاج بـ doxorubicin بجرعة 24 mg/kg. (D) تعبير mRNA لـ Murf1 في عضلة القلب لفئران C57BL/6J بعد أسبوع واحد من بدء العلاج بـ doxorubicin بجرعة 24 mg/kg. (E) تعبير mRNA لـ NQO1 في عضلة القلب لفئران C57BL/6J بعد أسبوع واحد من بدء العلاج بـ doxorubicin بجرعة 24 mg/kg. (F) تعبير mRNA لـ BAX في عضلة القلب لفئران C57BL/6J بعد أسبوع واحد من بدء العلاج بـ doxorubicin بجرعة 24 mg/kg. أُجريت التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار Welch's t-test أو اختبار Mann–Whitney U، حسبما تقتضي طبيعة توزيع البيانات. ns تعني P > 0.05؛ و * تعني P < 0.05؛ و ** تعني P < 0.01. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

سلالة الفئرانBalb/cC57Bl/6J
الخط الخلوي المستخدم4T1LucPY8119
كمية الخلايا المحقونة200 000200 000
الجنس المستخدمذكر وأنثىذكر وأنثى
عدد أيام الحقن46
الجرعة اليومية4 مجم/كجم4 ملجم/كجم
الجرعة التراكمية من الدوكسوروبيسين١٦ مجم/كجم٢٤ مجم/كجم
جرعة الكيتامين٤٠ مجم/كجم80 مجم/كجم
معدل حدوث السمية القلبية>90%>90%
معدل البقاء على قيد الحياة19/4516/19

الجدول 1: بارامترات البروتوكول الرئيسية لكل سلالة من الفئران. مقارنة للمتغيرات التجريبية الرئيسية وتركيزات الكواشف المستخدمة في بروتوكولات فئران Balb/c وC57BL/6J.

الجدول التكميلي 1: نقاط النهاية لرفاهية الحيوان. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: نظرة عامة أدبية على البروتوكولات التجريبية لـ 4T1. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 3: معلمات تخطيط صدى القلب التي تم قياسها بواسطة وضع M-mode في 17 فأراً من سلالة C57BL/6J حاملة للأورام وعولجت بـ 24 mg/kg من الدوكسوروبيسين. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

تم هنا تطوير نموذج للتسمم القلبي الناجم عن الدوكسوروبيسين في الفئران الحاملة لأورام الثدي، ويُعتقد أنه ذو صلة سريرية قوية للدراسات المستقبلية في مجال أورام القلب. كان الهدف هو محاكاة المسار السريري للمريض منذ وصوله إلى المستشفى بتشخيص الإصابة بالسرطان وصولاً إلى العلاج بكيميائي قد يكون ساماً للقلب. يتبع البروتوكول تصميماً عملياً ويستخدم فئران ذات كفاءة مناعية متاحة في جميع أنحاء العالم، مما يسمح للفرق الأخرى بتكراره في مختبرات أخرى. كما أن معدل نجاح زراعة الورام المرتفع يجعل هذا النموذج مرشحاً قوياً لدراسات السمية القلبية الورمية المستقبلية.

تشمل الأخطاء الشائعة في هذا البروتوكول إجراء تخطيط صدى القلب على الفئران التي تعاني من انخفاض في معدل ضربات القلب، مما قد يؤدي إلى ظهور قيمة منخفضة بشكل مصطنع للتقصير الجزئي (FS). يساعد السماح للفئران بالتعافي من التأثيرات الكرونوتروبية السلبية الأولية للمخدرات قبل تقييم تخطيط صدى القلب في ضمان دقة قياسات FS. وفي فئران Balb/c، قد يكون من الضروري خفض جرعة المخدر بشكل أكبر إذا ظلت معدلات الوفيات مرتفعة. كما يجب أن يقوم نفس الباحث بإجراء جميع تقييمات تخطيط صدى القلب طوال فترة الدراسة لأن التباين بين المراقبين قد يكون كبيراً43. وبالنسبة لزراعة الورم، فإن سحب المحقنة أثناء الحقن قد يؤدي إلى تكوين ورم خطي الشكل، والذي قد ينمو بحجم أكبر من الأورام الناتجة عن الحقن الصحيح. ويعد الحقن في الحلمة الثديية الصحيحة أمراً بالغ الأهمية أيضاً، حيث إن الوضع في حلمة البطن العلوية يمكن أن يتداخل مع تقييم تخطيط صدى القلب خلال المراحل اللاحقة من تطور الورم. ويُنصح بالعد اليدوي للخلايا في المعلق والمزج الجيد قبل الحقن لضمان تلقي كل فأرة عدداً مماثلاً من الخلايا، وبالتالي تقليل التباين في حجم الورم في نهاية البروتوكول. وعندما يتطلب الأمر أخذ عينات دم أسبوعية، يجب التحكم بدقة في الحجم الذي يتم جمعه لأن الفئران تصبح أكثر هشاشة بعد العلاج بـ doxorubicin. ويُوصى بحد أقصى لإجمالي حجم الدم يبلغ 50 µL عند كل نقطة زمنية لأخذ العينات، حيث يمكن للأحجام الأكبر أن تزيد من معدل الوفيات خلال البروتوكول. كما يجب أن يتوافق تكرار وحجم جمع الدم مع متطلبات أخلاقيات التعامل مع الحيوانات المحلية وإرشادات مرافق الحيوانات المؤسسية. ويمكن أن يساعد استبدال حجم الدم المسحوب بحجم مكافئ من المحلول الملحي الذي يتم إعطاؤه تحت الجلد في تعويض فقدان السوائل بعد جمع الدم.

ولمقارنة إجراء الـ dox هذا، لاحظت مراجعة نُشرت مؤخراً حول النماذج الحيوانية لسرطان القنوات الغدية في الرئة (AIC) أن معظم النماذج قبل السريرية (88%) استخدمت حقنات متكررة من Dox وقياسات للنتائج (غالباً عبر تخطيط صدى القلب) بعد عدة أسابيع29. وأفادت معظم المقالات باستخدام سلالة C57Bl/6J بنسبة (73.8%)، وربما يعود ذلك إلى قوتها وتكلفتها المنخفضة29. ولسوء الحظ، تجاهل عدد كبير من الدراسات تأثير الورم على بيولوجيا الحيوان قبل حقن الخلايا السرطانية (ACs)17,29. حيث أبلغت 46 دراسة فقط من أصل 736 عن نماذج حاملة للأورام، استخدم 12 منها الخط الخلوي 4T1 (سرطان الثدي الشبيه بالسالب الثلاثي) في فئران Balb/c، وكانت دراسة واحدة فقط نموذجاً لسرطان الثدي في فئران C57Bl/6J (وتحديداً سرطان الثدي الشبيه بالموجب لـ EGFR2)29. واستخدمت دراسة أخرى فئران C57Bl/6J مصابة بسرطان الثدي الشبيه بالموجب لـ EGFR-2، ولكنها لم تسمح بنمو الورم قبل بدء العلاج الكيميائي، مما يحد من الجانب التطبيقي لهذا النموذج32.

تسمح نماذج الطعوم الغريبة (Xenograft) باستخدام الفئران ناقصة المناعة باستخدام خطوط خلايا أورام بشرية، ولكنها تفتقر إلى جهاز مناعي وظيفي، مما يحد من دراسة آليات السمية القلبية بوساطة المناعة، ويشكل عائقاً رئيساً بالنظر إلى الأهمية المتزايدة للسمية القلبية المرتبطة بمثبطات نقاط التفتيش المناعية. بدأت تظهر نماذج الحيوانات الكبيرة في مجال طب القلب والأورام، إلا أنها ستظل تعاني دائماً من عيوب التكلفة العالية والقدرة المحدودة على الهندسة الوراثية44. تتيح الأنظمة المعتمدة على الخلايا البشرية في المختبر (In vitro) والأنظمة ثنائية وثلاثية الأبعاد (مثل الخلايا القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية المستحثة متعددة القدرات iPSC، والعضويات القلبية) إجراء فحص ميكانيكي وسمومي عالي الإنتاجية، ولكنها لا تستطيع محاكاة الفسيولوجيا المتكاملة للكائن الحي بأكمله (الديناميكا الدموية، والتنظيم العصبي الهرموني، والتفاعل المناعي) التي توفرها نماذج الأحياء (in vivo). ومقارنة بهذه المناهج، يوفر هذا النموذج متجانس الزيجوت، وكامل المناعة، والحامل للأورام سياقاً أكثر صلة سريرياً لدراسة التفاعل بين عبء الورم والسمية القلبية الناجمة عن العلاج الكيميائي، وذلك على حساب تباين بيولوجي أكبر، وارتفاع معدلات الوفيات في بعض السلالات، وإنتاجية أقل مقارنة بنماذج المختبر (in vitro) الأبسط أو نماذج الأحياء (in vivo) غير الحاملة للأورام.

توفر نماذج سمية القلب الناجمة عن العلاج الكيميائي (AC) في الحيوانات غير الحاملة للأورام، والمستخدمة غالباً حتى الآن، قابلية تكرار عالية، وتكلفة منخفضة، وتقييمات أسهل لتخطيط صدى القلب ومعدلات البقاء، ولكنها لا تشمل التأثيرات الجهازية لعبء الورم، والالتهابات المرتبطة بالسرطان، والدنف على القلب، والتي يُعترف بها بشكل متزايد كعوامل مربكة ذات صلة بسمية القلب لدى المرضى17,45. علاوة على ذلك، يمكن أن تتغير إعادة البرمجة الأيضية للقلب، وبالتالي وظيفته الانقباضية، بفعل المستقلبات الورمية المفرزة، مثل D-2-hydroxyglutarate أو succinate14. لذلك، إذا كان الهدف هو بناء نموذج لأمراض القلب والأورام لإجراء تحليل كيميائي حيوي قلبي باستخدام تقنيات أوميكس متنوعة (مثل البروتوميات والميتابولوميات)، فإن وجود الورم قبل العلاج الكيميائي يعد أمراً ضرورياً. وهناك أيضاً بعض الأدلة على أن الورم بحد ذاته يمكن أن يسبب خللاً وظيفياً قلبياً واضحاً، على الرغم من أن هذا الأمر غير متسق في الدراسات المنشورة. فبينما أظهرت بعض النماذج تأثيراً ضاراً لتلقيح الورم على الجزء القذفي (FS) أو معايير التوصيل الكهربائي، وجد البعض الآخر أن وجود الورم قد حمى الفئران من إعادة التشكيل الناجم عن تضيق الأبهر المستعرض11,13,46. كما تبرز الحاجة إلى حيوانات غير حاملة للأورام، اعتماداً على الفرضية الأولية؛ إذ تشكل هذه الحيوانات الإعداد الوحيد الذي يمكن فيه عزل التأثير السمي القلبي المباشر للعامل العلاجي الكيميائي عن التأثير المربك للورم نفسه، وهو شرط أساسي لإثبات السببية وتوضيح آليات عمل محددة للدواء. ستعمل هذه الحيوانات كضوابط لتقييم تأثير العلاج المضاد للسرطان وتفاعله مع الورم في إحداث سمية القلب. وبدون هذا المقارن، سيكون من المستحيل تفكيك أي جزء من النمط الظاهري القلبي الملاحظ يعود إلى الدواء، أو إلى الورم، أو إلى التفاعل بينهما. هذا التمييز ضروري ليس فقط للفهم الميكانيكي، بل أيضاً للتصميم العقلاني لاستراتيجيات حماية القلب. لذا من المهم الإقرار بأن كل نموذج من هذه النماذج يجيب على أسئلة علمية متميزة ومتكاملة، وأن أي نموذج بمفرده ليس كافياً لمحاكاة تعقيد علم أمراض القلب والأورام السريري بشكل كامل؛ وغالباً ما يتطلب الأمر استخداماً مشتركاً أو متسلسلاً لكلا النموذجين لاستخلاص استنتاجات ميكانيكية وترجمية قوية.

في هذا البروتوكول، تم تعريف السمية القلبية وفقاً لإرشادات ESC لعام 2022 في أورام القلب، والتي تعرّف الخلل الوظيفي القلبي المتوسط المرتبط بعلاج السرطان وغير المصحوب بأعراض بأنه انخفاض في الكسر القذفي للبطين الأيسر (LVEF) بنسبة >10% مع قيمة LVEF تتراوح بين 40% و 49%16. ومع ذلك، يتطلب التحديد الكمي الدقيق لـ LVEF وجود وحدة ثلاثية الأبعاد (3D) في جهاز الموجات فوق الصوتية39. ولتجنب التقييم غير الصحيح لوظيفة القلب الانقباضية، وللحفاظ على بروتوكول بسيط يمكن تنفيذه في المختبرات التي تستخدم أجهزة موجات فوق صوتية أقل حداثة، كان من المفضل استخدام FS كعلامة على الخلل الوظيفي القلبي، والذي يمكن الحصول عليه بشكل صحيح وسهل من خلال تحليل M-mode في الفئران، بنفس المعايير التي فرضتها ESC. وباستخدام هذا البروتوكول، تستوفي 90% من الفئران الناجية معايير السمية القلبية، مما يجعلها مرشحاً قوياً للدراسات الانتقالية المستقبلية. وقد تم تأكيد التأثير السام للقلب لعقار Dox من خلال التقييم العياني (انخفاض وزن القلب) في فئران Balb/c. لم يتم إدراج مجموعة "الأورام فقط" في فئران C57Bl/6 هنا؛ وبالتالي، لا تتوفر مقارنة في هذه السلالة حتى الآن. علاوة على ذلك، في فئران C57Bl/6 غير الحاملة للأورام، أحدثت جرعة Dox تغييرات تتفق مع الأدبيات السابقة حول آليات السمية القلبية للأنثراسيكلين: زيادة الضمور، والإجهاد التأكسدي، وموت الخلايا المبرمج (apoptosis)19,20.

ومع ذلك، لم يتم قياس المتغيرات الأكثر حداثة المستخدمة لدى المرضى، مثل الانفعال الطولي العالمي (GLS) المعتمد على تتبع البقع، وذلك لأسباب تقنية. وإذا كان هذا الإجراء متاحاً محلياً، فستكون هناك قيمة مضافة لقياس GLS، حيث يُعتبر عموماً أكثر حساسية في الكشف عن التلف القلبي المبكر23. كما يمكن تقييم المؤشرات الحيوية القلبية المتداولة مثل التروبونين لتعزيز دقة الكشف عن السمية القلبية؛ ومع ذلك، فإن كمية البلازما المطلوبة تقليدياً لهذه التحاليل في الفئران قد تكون عاملاً مقيداً نظراً لانخفاض الحجم الكلي للدم لدى هذه الحيوانات. علاوة على ذلك، فإن ضعف هذه الحيوانات بعد العلاج بـ Dox يمكن أن يزيد من معدلات الوفيات أثناء أو بعد عملية سحب الدم. وهناك عامل مقيد أخير وهو حساسية هذه المقايسات لهذه المؤشرات الحيوية، والتي قد تعيق التفسير في كثير من الأحيان.

على الرغم من أن ذات الباحث الخبير قام بجميع عمليات التصوير بالموجات فوق الصوتية، فقد لوحظ تباين أسبوعي كبير في النتائج لنفس الفئران من سلالة Balb/c، حتى في غياب العلاج. ويمكن تفسير ذلك بحساسية هذه السلالة للتخدير بالكيتامين47. وبالفعل، لوحظ في البداية ارتفاع معدلات الوفيات أثناء الإجراءات التي تتطلب التخدير، مما أدى إلى انخفاض عدد الحيوانات التي وصلت إلى نهاية البروتوكول، وهو ما استدعى تقليل جرعة الكيتامين المستخدمة من 80 mg/kg إلى 40 mg/kg لفئران Balb/c. وبالنظر إلى مخططات البقاء على قيد الحياة لفئران Balb/c المعالجة بـ Dox، يلاحظ حدوث بعض الوفيات عند نقطة التخدير (تخطيط صدى القلب الأسبوعي)، إلا أن غالبية الوفيات تحدث في منشأة تربية الحيوانات دون إجراء أي تدخل نشط، مما يؤكد أن Dox هو المساهم الرئيسي في الوفيات لدى هذه الفئران. ومع ذلك، من المهم مراعاة الوفيات المرتبطة بالتخدير عند تفسير مخططات البقاء على قيد الحياة لهذا النموذج عند مقارنة سلالتين أو أكثر. ولتقليل مخاطر الوفيات المرتبطة بالتخدير، يمكن أيضاً إجراء تخطيط صدى القلب على الفئران الواعية، ولكن هذا يتطلب تدريباً وتأكيلاً قبل إدراج الفئران في البروتوكول. وفيما يتعلق بـ Dox، حتى مع الجرعات المخفضة، فإن نصف فئران Balb/c تقريباً لم تصل إلى نهاية البروتوكول. ويمكن محاولة تحفيز السمية القلبية بجرعات أقل من Dox، مع المخاطرة بتقليل عدد الحيوانات التي تستوفي معايير السمية القلبية. وقد تتمثل استراتيجية أخرى في إعطاء وقت أطول للحيوان للتعافي بعد كل حقنة Dox، وهو أمر لم يتم تطبيقه هنا ولكن توجد أدلة في الدراسات السابقة على تحسين معدلات البقاء على قيد الحياة من خلاله29.

تتوافق الملاحظات التي تم التوصل إليها أثناء بناء هذا النموذج، والمتمثلة في أن فئران Balb/c أكثر حساسية لـ Dox من فئران C57Bl/6J، وأن الإناث أكثر مقاومة لـ Dox من الذكور، مع الدراسات السابقة29. علاوة على ذلك، فإن النتائج المتشابهة والقابلة للتكرار التي تم الحصول عليها في كلتا سلالتي الفئران تؤكد بشكل أكبر قوة هذا النموذج المقترح. ومن خلال الوصول إلى جرعات تراكمية عالية عبر جرعات يومية مرتفعة نسبيًا خلال فترة زمنية قصيرة، تم تحقيق معدلات عالية من السمية القلبية مع معدلات بقاء عالية. وسيكون بناء نموذج لسرطان الثدي (PY8119 هو سرطان ثدي شبيه بالثلاثي السلبي) في فئران C57Bl/6J ذا فائدة كبيرة للدراسات المستقبلية، حيث تمثل هذه الفئران إحدى الخلفيات الجينية الرئيسية للنماذج المعدلة وراثيًا34. كما أن معدل النجاح العالي في تلقيح الأورام، مما يدعم فعالية طريقة الحقن المختارة، يعد أمرًا واعدًا لهذا النموذج. بالإضافة إلى ذلك، فإن تحمل هذه الفئران العالي لـ Dox يفتح الباب أمام دراسات أطول تتضمن إعادة التعرض لـ Dox لمحاكاة الحالة السريرية الشائعة للسرطان الثانوي أو النقائل. وأخيرًا، يتيح بروتوكول أخذ عينات الأعضاء جمع كافة الأعضاء الصلبة والأورام والسائل الخلالي الخاص بها، بالإضافة إلى نخاع العظم وسداه، مما يسمح بإجراء تحليل دقيق وشامل للنموذج.

هذا النموذج لديه بعض القيود. نظراً لتصميمه العملي ولتجنب الجراحة الغازية، لا يمكن التحكم بدقة في الموقع المحدد للورم (أي الغدة الثديية الصحيحة بدلاً من الدهون تحت الجلد) عن طريق الحقن تحت الجلد، وهو أمر قد يكون ذا أهمية كبيرة اعتماداً على السؤال العلمي قيد الدراسة48. وإذا كانت هناك حاجة للحقن الدقيق في موقع السرطان، فقد تكون الجراحة الأكثر شمولاً أكثر ملاءمة لإجراء حقن في الموضع الأصلي (orthotopic injection)، على الرغم من أن هذا يبدو ذا أهمية فعلية بشكل أساسي إذا كان مخططاً لإجراء تحليل كيميائي حيوي للورم، حيث أن الحجم وفترة الكمون ومعدل الإصابة تعطي نتائج متشابهة بغض النظر عن طريقة الحقن48. ويمكن القول أيضاً إن استخدام ACs فقط لا يتوافق تماماً مع الحالة السريرية، حيث يتلقى المرضى غالباً أنظمة علاجية مشتركة، مثل cyclophosphamide أو cisplatin. وقد يكون هذا بالفعل التصميم التالي لهذا البروتوكول؛ ومع ذلك، يجب إجراء تكييف الجرعة لكل علاج كيميائي مستخدم بعناية. علاوة على ذلك، فإن نسبة الوفيات التي تتجاوز 50% في فئران Balb/c بعد 3 أسابيع من بدء العلاج بـ Dox تظل مرتفعة جداً؛ وقد يؤدي خفض الجرعة إلى تحسين البقاء على قيد الحياة، ربما على حساب سمية قلبية أقل وضوحاً. وأيضاً، فيما يتعلق بالجرعات المستخدمة في هذا النموذج، تجدر الإشارة إلى أنها أعلى من تلك المستخدمة عادةً في البشر اليوم، مما قد يحد من الإمكانات الترجمية لهذا النموذج.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح فيما يتعلق بالمخطوطة.

شكر وتقدير

نتقدم بالشكر لفريق مرفق الحيوانات على مساعدتهم في المراقبة اليومية لرفاهية الحيوانات. والشكر موصول لكل من Léanne Borges وElias Ait Assa وClémence Chabaud على المساعدة في بناء بروتوكول الحيوانات. كما نشكر الدكتورة Julie Helft من وحدة INSERM 932 على إهدائنا خلايا PY8119. وشكر خاص للدكتور Sylvain Provost وطالبته Mel Gavens على مساعدتهم في مجال التألق الحيوي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خلايا 4T1LucATCCCRL-2539
مسحوق DoxorubicinCliniscience23214-92-8
جهاز تخطيط صدى القلبVisual SonicsVEVO LT-200
لوسيفيرين (Luciferin)Perkin Elmer E1605
شبكة نايلونMerckNY2002500
جهاز PhotonImager OptimaBioSpace Lab
خلايا PY8119هدية من Dr Julie Helft

المراجع

  1. Meijers WC, et al. Heart failure stimulates tumor growth by circulating factors. Circulation. 2018;138(7):678-691.
  2. de Wit S, et al. Pressure overload-induced cardiac hypertrophy stimulates tumor growth in tumor-prone Apc(Min) mice. Circ Heart Fail. 2023;16(9):e010740.
  3. Avraham S, et al. Early cardiac remodeling promotes tumor growth and metastasis. Circulation. 2020;142(7):670-683.
  4. Langier Goncalves I, et al. Heart failure promotes cancer progression in an integrin β1-dependent manner. Int J Mol Sci. 2023;24(24):17367.
  5. Koelwyn GJ, et al. Myocardial infarction accelerates breast cancer via innate immune reprogramming. Nat Med. 2020;26(9):1452-1458.
  6. Wong J, Soh CH, Wang B, Marwick T. Long-term risk of heart failure in adult cancer survivors: a systematic review and meta-analysis. Heart. 2024;110(19):1188-1195.
  7. Kuiper JG, et al. Risk of heart failure among colon and rectal cancer survivors: a population-based case-control study. ESC Heart Fail. 2022;9(4):2139-2146.
  8. Mamidanna R, Nachiappan S, Bottle A, Aylin P, Faiz O. Defining the timing and causes of death amongst patients undergoing colorectal resection in England. Colorectal Dis. 2016;18(6):586-593.
  9. Armstrong GT, et al. Aging and risk of severe, disabling, life-threatening, and fatal events in the Childhood Cancer Survivor Study. J Clin Oncol. 2014;32(12):1218-1227.
  10. Herrmann J. Adverse cardiac effects of cancer therapies: cardiotoxicity and arrhythmia. Nat Rev Cardiol. 2020;17(8):474-502.
  11. Kelm NQ, Straughn AR, Kakar SS. Withaferin A attenuates ovarian cancer-induced cardiac cachexia. PLoS One. 2020;15(7):e0236680.
  12. Graca FA, et al. Progressive development of melanoma-induced cachexia differentially impacts organ systems in mice. Cell Rep. 2023;42(1):111934.
  13. Xiong S, et al. Development of an efficient mice model of cancer-associated cardiac cachexia. Anim Models Exp Med. 2025; 8(11):1960-1970.
  14. Karlstaedt A, Moslehi J, de Boer RA. Cardio-onco-metabolism: metabolic remodelling in cardiovascular disease and cancer. Nat Rev Cardiol. 2022;19(6):414-425.
  15. Murphy KT. The pathogenesis and treatment of cardiac atrophy in cancer cachexia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2016;310(4):H466-H477.
  16. Lyon AR, et al. 2022 ESC Guidelines on cardio-oncology developed in collaboration with the European Hematology Association (EHA), the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology (ESTRO) and the International Cardio-Oncology Society (IC-OS). Eur Heart J. 2022;43(41):4229-4361.
  17. Ghigo A, et al. Update on preclinical models of cancer therapy-related cardiac dysfunction: challenges and perspectives. A scientific statement of the Heart Failure Association (HFA) of the ESC, the ESC Council of Cardio-Oncology, and the European Association of Preventive Cardiology. Eur J Heart Fail. 2025;27(6):1028-1046.
  18. Cagnazzo R, et al. Mismatch between preclinical cardio-oncology and clinical oncology research. JACC CardioOncol. 2025;7(6):770-773.
  19. Mattioli R, et al. Doxorubicin and other anthracyclines in cancers: activity, chemoresistance and its overcoming. Mol Aspects Med. 2023;93:101205.
  20. Martins-Teixeira MB, Carvalho I. Antitumour anthracyclines: progress and perspectives. ChemMedChem. 2020;15(11):933-948.
  21. Fabiani I, Chianca M, Cipolla CM, Cardinale DM. Anthracycline-induced cardiomyopathy: risk prediction, prevention and treatment. Nat Rev Cardiol. 2025;22(8):551-563.
  22. Rivero-Santana B, et al. Anthracycline-induced cardiovascular toxicity: validation of the Heart Failure Association and International Cardio-Oncology Society risk score. Eur Heart J. 2025;46(3):273-284.
  23. Camilli M, Cipolla CM, Dent S, Minotti G, Cardinale DM. Anthracycline cardiotoxicity in adult cancer patients: JACC: CardioOncology state-of-the-art review. JACC CardioOncol. 2024;6(5):655-677.
  24. Díaz-Guerra A, et al. Anthracycline cardiotoxicity induces progressive changes in myocardial metabolism and mitochondrial quality control. JACC CardioOncol. 2024;6(2):217-232.
  25. Omland T, et al. Sacubitril-valsartan and prevention of cardiac dysfunction during adjuvant breast cancer therapy: the PRADA II randomized clinical trial. Circulation. 2025: 152(16):1136-1145.
  26. Henriksen PA, et al. Multicenter, prospective, randomized controlled trial of high-sensitivity cardiac troponin I-guided combination angiotensin receptor blockade and beta-blocker therapy to prevent anthracycline cardiotoxicity: the Cardiac CARE trial. Circulation. 2023;148(21):1680-1690.
  27. Sobiborowicz-Sadowska AM, Kamińska K, Cudnoch-Jędrzejewska A. Neprilysin inhibition in the prevention of anthracycline-induced cardiotoxicity. Cancers (Basel). 2023;15(1):312.
  28. Stansfeld A, et al. Pharmacological strategies to reduce anthracycline-associated cardiotoxicity in cancer patients. Expert Opin Pharmacother. 2022;23(14):1641-1650.
  29. Li M, et al. Optimizing dose selection for doxorubicin-induced cardiotoxicity in mice: a comprehensive analysis of single and multiple-dose regimens. Eur J Pharmacol. 2025;1003:177883.
  30. Gambardella J, et al. Infiltrating macrophages amplify doxorubicin-induced cardiac damage: role of catecholamines. Cell Mol Life Sci. 2023;80(11):323.
  31. Chen Y, et al. Cysteine imaging reveals early redox dysregulation and identifies gnetol as a ferroptosis-modulating agent in doxorubicin cardiotoxicity. Redox Biol. 2026;92:104131.
  32. Luo W, et al. Critical role of the cGAS-STING pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Circ Res. 2023;132(11):321587.
  33. Mouse Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 2002;420(6915):520-562.
  34. Mekada K, Yoshiki A. Substrains matter in phenotyping of C57BL/6 mice. Exp Anim. 2021;70(2):145-160.
  35. Yin L, Duan JJ, Bian XW, Yu SC. Triple-negative breast cancer molecular subtyping and treatment progress. Breast Cancer Res. 2020;22(1): doi.org/10.1186/s13058-020-01296-5.
  36. Akbay EA, et al. D-2-hydroxyglutarate produced by mutant IDH2 causes cardiomyopathy and neurodegeneration in mice. Genes Dev. 2014;28(5):479-490.
  37. Springer J, et al. Prevention of liver cancer cachexia-induced cardiac wasting and heart failure. Eur Heart J. 2014;35(14):932-941.
  38. Herndon ME, et al. The highly metastatic 4T1 breast carcinoma model possesses features of a hybrid epithelial/mesenchymal phenotype. Dis Model Mech. 2024;17(9):dmm050771.
  39. Lindsey ML, Kassiri Z, Virag JAI, De Castro Brás LE, Scherrer-Crosbie M. Guidelines for measuring cardiac physiology in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2018;314(4):H733-H752.
  40. Zacchigna S, et al. Towards standardization of echocardiography for the evaluation of left ventricular function in adult rodents: a position paper of the ESC Working Group on Myocardial Function. Cardiovasc Res. 2021;117(1):43-59.
  41. Assad N, et al. Crosstalk between circulating DPP3 and immune cells in the context of cardio-systemic stress. iScience. 2026;29(3):115114.
  42. Motulsky HJ. GraphPad Statistics Guide. 2016. http://www.graphpad.com/guides/prism/10/statistics/index.htm.
  43. Garcia-Elcano L, et al. Accurate estimation of interobserver variability in echocardiography segmentation measured from 35 experts and impact on derived clinical metrics. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 2025;26(Suppl 1): jeae333.044.
  44. Medina-Hernandez D, et al. SGLT2i therapy prevents anthracycline-induced cardiotoxicity in a large animal model by preserving myocardial energetics. JACC CardioOncol. 2025;7(2):171-184.
  45. Asnani A, et al. Preclinical models of cancer therapy-associated cardiovascular toxicity: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 2021;129(1):e21–e34.
  46. Awwad L, Shofti R, Haas T, Aronheim A. Tumor growth ameliorates cardiac dysfunction. Cells. 2023;12(14):1853.
  47. Levin-Arama M, et al. Subcutaneous compared with intraperitoneal ketamine-xylazine for anesthesia of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2016;55(6):794-800.
  48. Fleming JM, Miller TC, Meyer MJ, Ginsburg E, Vonderhaar BK. Local regulation of human breast xenograft models. J Cell Physiol. 2010;224(3):795-806.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

نموذج أورام القلبالسمية القلبية الناجمة عن الأنثراسيكلينفئران مصابة بأورام الثديالعلاج بالدوكسوروبيسينالموجات فوق الصوتية للقلبالتلألؤ البيولوجي للأوراموظيفة البطين الأيسرفئران حاملة للأورامالسمية القلبية قبل السريرية

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.