بروتوكول التقييم الموحد لوظيفة الأوعية الدموية الدقيقة الجهازية في الدورة الدموية الجلدية الدقيقة للبشر باستخدام التصوير بالليزر بالتباين بالبقع

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة موحدة وغير جراحية لتقييم وظيفة الأوعية الدموية الدقيقة الجهازية في الدورة الدموية الجلدية الدقيقة البشرية باستخدام تصوير التباين بالليزر مع الرسام الأيوني الدوائي والمحفزات الفسيولوجية لتقييم تفاعل الأوعية الدموية الدقيقة في بيئات البحث السريري.

Abstract

تصوير التباين بالليزر (LSCI) هو تقنية بصرية عالية الدقة وغير جراحية تتيح التصور الكامل في الوقت الحقيقي والكامل لتروية الدم الميكرووسكولية. يقدم هذا البروتوكول منهجية موحدة لتقييم وظيفة الأوعية الدموية الدقيقة الجهازية في الدورة الدموية الدقيقة الجلدية البشرية باستخدام LSCI. نظرا لأن القياسات التي يتم الحصول عليها باستخدام هذه التقنية حساسة للغاية للعوامل البيئية والفسيولوجية، يؤكد البروتوكول على إجراءات توحيد صارمة لتحسين قابلية التكرار وموثوقية التجريب. يوضح البروتوكول ضوابط بيئية أساسية، بما في ذلك تثبيت درجة حرارة الغرفة عند 23°C ± 1°C، وتحديد موقع المشاركين، وإجراءات التكيف، وتقليل التداخل الخارجي أثناء التقاط الصورة. تدمج المنهجية LSCI مع حركتين استفزازيتين تكميليتين لتقييم التفاعل الميكروفوعي الجلدي. يستخدم فرط الدم التفاعلي بعد الإسقاط لتقييم التفاعل الدقيق الوعائي المتكامل، بينما تستخدم التحديات الدوائية المدفوعة بالرعب الأيوني لتقييم وظيفة البطانة. تحديدا، يعطى الأستيل كولين لتقييم توسع الأوعية الدموية المعتمد على البطانة، ويعطى نيتروبروسيد الصوديوم لتقييم توسع الأوعية الدموية المستقل عن البطانة. يهدف هذا البروتوكول المرئي خطوة بخطوة إلى تسهيل اعتماد منهجيات LSCI الموحدة في بيئات البحث السريري والترجمي. تم تطبيق هذا النهج بنجاح لتحديد ضعف الأوعية الدقيقة في عدة حالات سريرية، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم المقاوم، والسكري، وأمراض الشرايين التاجية. من خلال تمكين التقييم القابل للتكرار وغير الجراحي لتفاعل الأوعية الدقيقة الدقيقة، توفر هذه المنهجية أداة قيمة للتحقيق في صحة الأوعية الدموية الجهازية، ومراقبة تقدم المرض، وتقييم فعالية التدخلات التي تستهدف الأوعية الميكروية.

Introduction

الهدف الأساسي من هذا البروتوكول هو توفير منهجية موحدة وقابلة للتكرار لتقييم وظيفة الأوعية الدموية الدقيقة الجهازية والتفاعل باستخدام التصوير بالليزر باستخدام تباين البقع (LSCI) إلى جانب مناورات فسيولوجية ودوائية استفزازية. الدورة الدموية الدقيقة، التي تتكون من الأوعية الدموية النهائية—الشرايين الصغيرة، الشعيرات الدموية، والأوردة الداخلية—التي يبلغ قطرها حوالي 100 ميكرومتر^1، هي الموقع الأساسي للتبادل الأيضي وعامل حاسم محدد لمقاومة الأوعية الدموية الطرفية². غالبا ما يسبق خلل البطانة في هذه الأوعية الصغيرة التغيرات الوعائية الكبيرة، ويعد علامة حيوية مبكرة لأمراض القلب والأوعية الدموية، بما في ذلك ارتفاع ضغط الدم، والسكري، ومرض الشرايين التاجية³. ومن المهم أن الإصابة الوعائية الدقيقة تساهم بشكل كبير في تلف الأعضاء النهائية، إلا أنها تعمل جنبا إلى جنب مع تصلب الشرايين الوعائي الكبير والالتهاب المزمن الجهازي ضمن عملية مرض متعددة العوامل. لذلك، فإن التقييم غير الجراحي لتفاعل الأوعية الدقيقة ضروري لكل من التشخيص المبكر ومراقبة فعالية العلاج في البحث الانتقالي⁴.

يكمن مبرر استخدام الدورة الدموية الدقيقة الجلدية كبديل لصحة الأوعية الدموية الجهازية في سهولة الوصول إليه ودوره كنافذة تمثيلية لوظيفة البطانة العالمية ^5,6. تقليديا، يعتبر القياس اللواني بالليزر دوبلر (LDF) المعيار الذهبي لتقييم الجلد غير الجراحي⁷. ومع ذلك، فإن LDF محدودة بسبب ضعف الدقة المكانية لأنها توفر قياسات نقطية حساسة للغاية لتباين تدفق الجلد^{الفطري 8}. على النقيض من ذلك، يقدم LSCI مزايا كبيرة من خلال توفير تصور كامل في الوقت الحقيقي لتروية الأنسجة بدقة زمنية ومكانية عالية⁹. من خلال تحليل نمط التداخل الناتج عن تشتت ضوء الليزر، يمكن LSCI التقييم المتزامن لمناطق وعائية متعددة دون الحاجة إلى اتصال جسدي أو أصباغ خارجية^10,11.

ضمن الأدبيات الأوسع، تم التحقق من صحة دمج LSCI مع الاستفزازات الدوائية المدفوعة بالفوريس الأيوني، مثل الأستيل كولين (ACh) ونيتروبروسيد الصوديوم (SNP)، كنهج قوي لتقييم مسارات توسيع الأوعية المعتمدة على البطانة البطانية والمستقلة عن البطانة^12,13. علاوة على ذلك، يوفر فرط الدم التفاعلي بعد الإغلاق (PORH) تقييما متكاملا للتفاعل الميكروأوعية الدموية الذي يشمل الوسطاء البطانة، والأعصاب الحسية العصبية، ووظائف العضلات الملساء الوعائية¹². على الرغم من مزاياها، فإن حساسية LSCI العالية للتغيرات البيئية والفسيولوجية تتطلب إجراءات توحيد صارمة. يعالج هذا البروتوكول هذه التحديات من خلال تفصيل الضوابط البيئية الحرجة، بما في ذلك تثبيت درجة حرارة الغرفة عند 23°م ±1°C وتحديد موقع المشاركين بشكل موحد، لتحسين قابلية التكرار داخل الموضوع وبين المواضيع¹⁰. هذه المنهجية مناسبة للباحثين السريريين والترجميين الذين يبحثون عن نهج غير جراحي قائم على الأساس المنهجي للتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية الميكروأوعية الدموية عبر مجموعات مرضى متنوعة.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل المشاركين البشريين وفقا للمعايير الأخلاقية للمعهد الوطني لأمراض القلب (وزارة الصحة، البرازيل)، ووفقا للوائح وطنية (اللجنة الوطنية للأخلاقيات للبحث – INAEP – وفقا للقانون رقم 14,874، مايو 2024) وإعلان هلسنكي (معدل 2024).

1. إعداد المشاركين والسيطرة البيئية

1. تثبيت بيئة الفحص
   1. تثبيت درجة حرارة غرفة الفحص (RT؛ 23°C ± 1°C) باستخدام منظم حرارة مخصص للحفاظ على بيئة حرارية مستقرة.
   2. راقب جهاز RT كل 10 دقائق باستخدام مقياس حرارة رقمي معاير (دقة ±0.1°C).
      ملاحظة: وظيفة الأوعية الدموية الدقيقة الجلدية حساسة جدا لتقلبات درجة الحرارة.
2. جهز المشارك قبل التقييم
   1. نصح المشاركين بالامتناع عن التدخين أو تناول الكافيين أو الكحول وممارسة التمارين القوية لمدة 24 ساعة قبل التقييم.
   2. وجه المشاركين للصيام لمدة ساعتين على الأقل قبل التقييم مع السماح بتناول الماء.
      ملاحظة: الامتناع عن الكافيين والتمارين القوية يقلل من التداخل الخارجي مع النغمة الوعائية الجلدية. الكافيين، كمضاد لمستقبلات الأدينوسين، والتمارين الرياضية، من خلال تأثيراتها على الدافع الودي وتنظيم الحرارة، يمكن أن تسبب تغيرات مستمرة في التفاعل الميكرووي الوعائي تستمر لعدة ساعات بعد التعرض ^4,14.
3. تموضع المشارك لالتقاط الصورة
   1. ضع ذراع المشارك غير المسيطرة على مستوى القلب باستخدام وسائد الجسم للحفاظ على الساعد في وضع أفقي ومستقر.
   2. استخدم السطح البطني للساعد كموقع للتقييم.
      ملاحظة: الساعد غير المسيطر يقلل من تأثير إعادة تشكيل الأوعية الوعائية الجانبية المرتبط بالأنشطة اليومية. يوفر الساعد البطني خصائص تشريحية مناسبة للتصوير البصري، بما في ذلك انخفاض كثافة الشعر وتقليل سمك الجلد، مما يقلل من تشوهات الإشارة ويحسن قابلية تكرار توصيل الأدوية الأيونتوفوريتية.
4. السماح بتثبيت القلب والأوعية الدموية
   1. حافظ على راحة المشارك لمدة لا تقل عن 20 دقيقة قبل بدء تسجيل الأوعية الدقيقة.
   2. تقييد المشارك من الكلام، أو تحريك الطرف المقيم أو استخدام الأجهزة الإلكترونية خلال فترة الراحة.
      ملاحظة: فترة التثبيت تقلل من تقلبات الجهاز الذاتي والأوعية الدموية قبل اكتساب المستويات الأساسية.
5. تقليل تشوهات الحركة
   1. ضع ساعد المشارك غير المسيطر على نظام وسادة تفريغ.
   2. اضبط الوسادة للحفاظ على سطح الساعد البطني في وضع أفقي مستقر طوال مدة التقاط الصورة.
6. جهز سطح الجلد
   1. اختر مواقع الجلد بدون شعر ظاهر لجميع المقاسات.
   2. إزالة الشعر باستخدام ماكينة قص جراحية قبل 24 ساعة من التقييم عند الحاجة.
      تحذير: لا تستخدم شفرة حلاقة لإزالة الشعر لأن تهيج الجلد قد يؤثر على قياسات الأوعية الدقيقة الدقيقة.
7. قس ضغط الدم الشرياني
   1. اختر حجم الكفة حسب محيط ذراع المشارك.
   2. قم بإجراء ثلاث قياسات ضغط دم متتالية باستخدام جهاز أوتوماتيكي معاير مع فاصل دقيقة واحدة بين القياسات.
   3. تخلص من القياس الأول واحسب متوسط القياسين الأخيرين لتحديد متوسط ضغط الشريان (MAP)، وفقا لإرشادات القلب والأوعية الدموية ل ESC/ESH وAHA.

2. إعداد نظام LSCI وتكوين البرمجيات

1. جهز نظام LSCI
   1. قم بتشغيل نظام LSCI قبل التقاط الصورة ب 10 دقائق على الأقل للسماح بتثبيت مصدر الليزر.
   2. تحقق من تثبيت الليزر باستخدام مؤشر حالة البرنامج قبل بدء التسجيل.
2. وضع رأس الليزر
   1. ضع رأس الليزر مباشرة فوق ساعد المشارك.
   2. ضبط رأس الليزر على مسافة 15 سم بالضبط من سطح الجلد باستخدام أداة قياس المسافة المقدمة من الشركة المصنعة (الشكل 1A)
      ملاحظة: الحفاظ على مسافة التقاط ثابتة يضمن تركيزا مثاليا للصورة ومجال رؤية متسق بين المشاركين.
3. تكوين برنامج الاستحواذ
   1. شغل برنامج اكتساب الصور وأنشئ ملف دراسة جديد.
   2. أدخل المعلومات الديموغرافية للمشارك وMAP المحسوبة سابقا.
      ملاحظة: أرفق تعليمات تشغيل البرمجيات التفصيلية ولقطات شاشة تمثيلية كمواد إضافية عند الحاجة.
4. تكوين معلمات الاستحواذ
   1. اضبط معدل أخذ العينة على صورة واحدة في الثانية (1 هرتز).
   2. اضبط الدقة المكانية إلى حوالي 0.1 مم/بكسل لمنطقة الاستحواذ المستهدفة.
      ملاحظة: يوفر معدل أخذ عينات 1 هرتز توازنا مناسبا بين الدقة الزمنية ونسبة الإشارة إلى الضوضاء مع التقاط حركية الاستجابة المفرطة والأدوية بشكل كاف.
5. تقليل التداخل الضوئي المحيط
   1. قم بإجراء فحص ضوضاء خلفية أو طرح الإطار المظلم وفقا لمتطلبات النظام قبل التقاط الصورة.
   2. قم بتعتيم أضواء الغرفة وحجب ضوء الشمس الخارجي باستخدام ستائر تعتيم أثناء جميع التسجيلات عندما لا يكون طرح الإطار الداكن متاحا.
      ملاحظة: الإضاءة المحيطة الموحدة تقلل من التداخل البصري وتحسن من قابلية تكرار الإشارة.
6. تعريف مناطق الاهتمام (ROIs)
   1. إنشاء ما لا يقل عن ثلاثة عودقات دائرية على العائد على الاستثمارات بحجم حوالي 80 مم² على شاشة المعاينة الحية داخل برنامج الاستحواذ.
   2. ضع عائد على الاستثمار (ROI) اثنين فوق مواقع أقطاب الرفور الأيوني وعائد عائد واحد فوق موقع تقييم PORH.
   3. ضع جميع مؤشرات العائد على الساعد البطني على بعد حوالي 5 سم بعيدا عن الحفرة الأمامية مع تجنب الأوردة السطحية الظاهرة.
      ملاحظة: توحيد منطقة العائد على الدخل يقلل من تأثير التباين المكاني في التروية الجلدية ويقلل من التشوهات الحوفية المرتبطة بغرف توصيل الأدوية.
7. احصل على تسجيل التروية الأساسي
   1. سجل تدفق الدم الجلدي أثناء الراحة لمدة 5 دقائق قبل التحفيز الوعائي.
   2. راقب إشارة التروية في الوقت الحقيقي وتأكد من غياب الارتفاعات الناتجة عن الحركة أثناء الاكتساب الأساسي.
   3. عرف الاستقرار الأساسي بأنه تغير إشارة التروية بنسبة <10٪ خلال فترة متواصلة مدتها دقيقتان.
8. تمكين تحليل التوصيل الوعائي الجلدي (CVC)
   1. أدخل مخطط MAP الخاص بالمشارك في برنامج الاستحواذ.
   2. تفعيل الحساب التلقائي ل CVC داخل إعدادات البرنامج.
9. تسجيل بيانات التروية والتوصيل
   1. قم بتكوين البرنامج لحساب CVC تلقائيا عن طريق قسمة قيم التروية في الوقت الحقيقي (APU) على MAP.
   2. سجل كل من وحدات التروية الخام (PU) وقيم CVC المحسوبة في نفس الوقت طوال البروتوكول.
      
      ملاحظة: التعبير عن التروية الدقيقة الوعائية أثناء CVC يقلل من التأثير المربك لتقلبات ضغط الدم الجهازية ويتيح مقارنات أكثر موثوقية بين المشاركين ذوي الملفات الديناميكية الدموية المختلفة.

الشكل 1. إعداد تجريبي لتقييم التروية الدقيقة الوعائية الجلدية باستخدام تصوير تباين البقع بالليزر (LSCI) مع الرعب الأيوني. (أ) إعداد تجريبي تمثيلي يستخدم لتقييم الأوعية الدقيقة الجلدية باستخدام تصوير تباين البقع بالليزر والرحلان الأيوني لعوامل موسعات الأوعية. (ب) الاستجابة التمثيلية للتروية الوعائية الدقيقة أثناء توصيل الجرعات التراكمية من الأستيل كولين (ACh) عبر الجلد عبر الجلد. (ج) صورة تمثيلية لفرع الأيونات ACh. (د) صورة تمثيلية لقطب تحكم يحتوي على مركبة. تشير الملصقات إلى المكونات التالية: (1) رأس الصورة؛ (2) أقطاب توصيل الأدوية في الرسام الأيوني؛ و(3) قطب التشتت. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. الرعب الأيوني والاستفزاز الدوائي

1. جهز الجلد للفوريس الأيوني
   1. نظف مواقع الجلد البطني المختارة باستخدام محلول ملحي خال من الكحول أو منظف خفيف للبشرة.
   2. جفف الجلد بلطف قبل وضع الأقطاب الكهربائية.
      ملاحظة: تجنب التحفيز الميكانيكي المفرط أثناء تحضير الجلد لأن توسع الأوعية الدموية الناجم عن الميكانيكا قد يتداخل مع القياسات الأساسية.
2. وضع أقطاب توصيل الدواء
   1. قم بتثبيت قطبين كهربائيين لتوصيل الأدوية في مواقع الجلد المحضر باستخدام أقراص لاصقة مزدوجة الوجه (الشكل 1A).
   2. حافظ على مسافة بين الأقطاب حوالي 5 سم لمنع تداخل التيار الكهربائي.
3. تحضير حل ACh
   1. املأ غرفة القطب الأول ب 200 ميكرولتر من محلول 2٪ ACh معد في محلول ملحي بنسبة 0.9٪^14,15.
   2. استخدم قطب ACh لتقييم توسع الأوعية المعتمدة على بطانة الرحم.
      ملاحظة: تم تحسين تركيز الدواء المختار لتحفيز استجابة ميكروأوعية وعائية قوية تعتمد على الجرعة مع تقليل التهيج غير النوع والآثار الجلفانية.
4. تحضير حل SNP
   1. املأ غرفة القطب الثانية ب 200 ميكرولتر من محلول SNP بنسبة 2٪ محضر في محلول ملحي بنسبة 0.9٪.
   2. استخدم قطب SNP لتقييم توسع الأوعية المستقلة عن بطانة الأوعية.
      تحذير: SNP حساس للضوء. احم المحلول من التعرض للضوء باستخدام ورق الألمنيوم واستخدم المحلول خلال 4 ساعات من التحضير للحفاظ على الاستقرار الدوائي.
      ملاحظة: تركيز SNP المختار يسهل توسع الأوعية المستقرة في الهضبة مع تقليل التأثيرات الكهربائية غير النوعية.
5. إزالة فقاعات الهواء المحبوسة
   1. افحص غرف الأقطاب بحثا عن فقاعات هواء محبوسة قبل التثبيت الجلدي.
   2. قم بإزالة فقاعات الهواء الظاهرة عن طريق النقر بلطف على غرفة الأقطاب أو باستخدام طرف حقنة بلاستيكي معقم.
      ملاحظة: قد تعيق فقاعات الهواء تدفق التيار وتنتج توصيل أدوية غير متجانس.
6. وضع القطب المرجعي
   1. قم بتثبيت القطب المرجعي (المحايد) على بعد حوالي 15 سم من الأقطاب المباشرة باستخدام جل أو لاصق موصل (الشكل 1A).
   2. تأكد من تلامس الأقطاب الكهربائي المستقر قبل بدء التحول الأيوني.
      ملاحظة: الفصل المكاني بين منطقتي تقييم الأدوية ومنطقة تقييم PORH يقلل من التفاعلات المربكة ويمنع تداخل انعكاسية المحاور العصبية الناتجة عن ACh مع منطقة قياس PORH.
7. ربط نظام الرسام الأيوني
   1. قم بتوصيل جميع الأقطاب الكهربائية بوحدة توصيل الأيونتوفوريس قبل التطبيق الحالي.
   2. تأكد من قطبية القطب قبل بدء البروتوكول (أنودال ل ACh؛ الكاثودال ل SNP).
      تحذير: قد يؤثر القطبية الكهربائية غير الصحيحة على كفاءة توصيل الدواء ويؤثر على الاستجابات الوعائية.
8. إعطاء بروتوكول تيار الرعب الأيوني
   1. قدم ست جرعات تيار متزايدة بجرعات 30، 60، 90، 120، 150، و180 ميكروأمبير لكلا الدوائيين.
   2. ضع كل جرعة حالية لمدة 10 ثوان.
      ملاحظة: يتيح بروتوكول التيار التصاعدي بناء منحنى جرعة-استجابة ويسهل تقييم حساسية الأوعية الدقيقة واستجابات الاستقرار¹¹. يؤدي الجمع بين سعات التيار المنخفضة وفترات التحفيز القصيرة إلى تقليل توسع الأوعية الزهرية غير النوعية.
9. حافظ على الفترة بين التحفيز
   1. حافظ على فترة زمنية تبلغ 60 ثانية بين تطبيقات التيار المتتالية.
   2. راقب إشارة التروية خلال فترة التثبيت بين الجرعات.
      ملاحظة: تسمح الفترة المحددة باستقرار الاستجابة الوعائية الدقيقة مع الحفاظ على توصيل الدواء المحلي دون تأثيرات جهازية.
10. سجل الاستجابة الميكروفوعية الدموية
    1. سجل إشارة التروية الميكروأوعية بشكل مستمر طوال جميع تحفيزات الرحلان الأيوني.
    2. استمر في التسجيل لمدة لا تقل عن 10 دقائق بعد التطبيق الحالي النهائي لالتقاط أقصى استجابة للهضبة. يظهر رد فعل تمثيلي يعتمد على الجرعة في الشكل 2A.

الشكل 2. تسجيلات تمثيلية لتدفق الأوعية الدموية الدقيقة الجلدية أثناء الفوريس الأيوني وارتفاع الدم التفاعلي بعد الانسداد (PORH). (أ) تسجيل تمثيلي لتدفق الدم الميكروفوسي الجلدي الذي تم الحصول عليه باستخدام LSCI أثناء الرحلان الأيوني بنسبة 2٪ ACh الذي يتم تسليمه باستخدام تيارات مثلثية متزايدة بمقدار 30، 60، 90، 120، 150، و180 ميكروأمبير لفترات زمنية مدتها 10 ثوان بفاصل دقيقة واحدة. (ب) تسجيل تمثيلي تم الحصول عليه أثناء تقييم PORH. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. فرط الدم التفاعلي بعد الإغلاق (PORH)

1. وضع سوار الإغلاق
   1. ضع كفة هوائية قياسية (بعرض حوالي 12 سم) على الذراع العلوية لنفس الطرف المستخدم في تسجيل LSCI.
   2. ضع الكفة القريبة من موقع التقييم الدقيق الوعائي المختار.
2. تعريف منطقة تقييم PORH
   1. إنشاء عائد عائد ثالث على الساعد البطني المجاور لمواقع قطب الرعب اليونيتوفوريس.
   2. ضع عائد الاستثمار داخل منطقة جلدية خالية من العلاج لتجنب التداخل الدوائي.
      ملاحظة: الحفاظ على الفصل المكاني بين مواقع التحفيز الدوائي ومنطقة تقييم PORH للحفاظ على الاستجابات الوعائية المستقلة.
3. الحصول على تسجيل خط الأساس PORH
   1. سجل تروية الجلد أثناء الراحة بشكل متواصل لمدة 5 دقائق قبل إغلاق الشريان.
   2. راقب إشارة التروية الأساسية للتأكد من استقرار الإشارة قبل انتفاخ الكف.
4. تحفيز انسداد الشريان
   1. قم بنفخ السوار الهوائي بسرعة خلال < 5 ثوان باستخدام منفاخ أوتوماتيكي أو لمبة نفخ يدوية.
   2. ارفع ضغط الكفة إلى 50 ملم زئبق فوق ضغط الدم الانقباضي المقاس سابقا للمشارك.
      تحذير: تأكد من الانسداد الشرياني الكامل قبل بدء فترة الإسقاط لأن عدم الإغلاق قد يؤثر على الاستجابة المفرطة في النوم.
5. الحفاظ على فترة الإخفاء
   1. حافظ على انسداد الشرايين بشكل مستمر لمدة 3 دقائق فقط.
   2. تحقق من الانسداد الكامل بتأكيد أن إشارة LSCI تنخفض إلى هضبة بيولوجية صفرية (< 10 وحدة APU).
      ملاحظة: تعكس إشارة الصفر البيولوجية حركة متبقية لخلايا الدم بشكل مستقل عن تدفق الدم الموجه، بما في ذلك الحركة البراونية.
6. فك سوار الإغلاق
   1. حرر ضغط الكفة فورا باستخدام صمام العادم السريع.
   2. السماح باستعادة تدفق الدم فورا لبدء الاستجابة التفاعلية لفرط الدمية.
7. سجل الاستجابة المفرطة للدم
   1. استمر في تسجيل LSCI لمدة لا تقل عن 5 دقائق بعد تحرير الكفة.
   2. التقاط ذروة استجابة التروية والعودة اللاحقة نحو مستويات التروية الأساسية. يظهر استجابة PORH تمثيلية في الشكل 2B.
8. قم بقياس استجابة PORH
   1. احسب ذروة CVC داخل برنامج التقاط الصور.
   2. احسب المساحة تحت المنحنى (AUC) لإشارة الاستجابة المفرطة الانتشار باستخدام برنامج التحليل.

5. استخراج البيانات والتحليل الإحصائي

1. افتح وتحقق من البيانات المسجلة
   1. افتح ملفات الاستحواذ المسجلة باستخدام برنامج تحليل الصور.
   2. تحقق من أن جميع العائد على الاستثمار المحددين مسبقا لا تزال موضوعة بشكل صحيح فوق مواقع القياس المقابلة.
      ملاحظة: إعادة تموضع العائد على الاستثمار فقط عندما تؤثر تشوهات الحركة أو انحراف الاكتساب على الموقع الأصلي.
2. حدد فترات التحليل
   1. حدد فترات التحليل المحددة على مخططات اتجاهات تدفق الدم وCVC.
   2. اختر فترة أساسية مستمرة مدتها 60 ثانية تسبق مباشرة أول منبه وعائي.
   3. اختر آخر 30 ثانية من كل فترة 60 ثانية بعد تحفيز الرعب الأيوني لالتقاط استجابة الميكروسكوال الوعائية في الهضبة.
      ملاحظة: عرف الاستقرار الأساسي كمعامل تباين (CV) < 5٪ في إشارة التروية لتقليل تأثير تذبذبات الأوعية الدموية والحركيات الحركية قبل تحليل البيانات.
3. تحديد متغيرات استجابة PORH
   1. تحديد الإشارة البيولوجية الصفرية خلال مرحلة انسداد الشرايين في بروتوكول PORH.
   2. حدد قيمة CVC القصوى فور تحرير الكف.
4. احسب قيم متوسط الفترة
   1. احسب متوسط قيمة CVC لكل فترة تحليل محددة مسبقا باستخدام برنامج تحليل الصور.
   2. تحقق من عدم وجود تشوهات الحركة قبل تأكيد القيم المحسوبة النهائية.
5. تنظيم البيانات المستخرجة
   1. قم بتصدير أو نسخ يدويا لمتوسط قيمة وحدة التزويد الخام ومتوسط CVC إلى جدول بيانات منظم.
   2. نظم مجموعة البيانات وفقا لمجموعات الدراسة والمحفزات الوعائية، بما في ذلك الأسيتيل كولين، نيتروبروسيد الصوديوم، واستجابات PORH.
      ملاحظة: حافظ على تسمية الملفات ورموز تعريف المشاركين المتسقة طوال معالجة البيانات لتقليل أخطاء النسخ.
6. حساب النتائج الوعائية الثانوية
   1. احسب نسبة الزيادة من قيم التروية الأساسية أو CVC لتحديد التفاعل الوعائي.
   2. احسب AUC عند الحاجة لتحليل نقطة النهاية الثانوي.
7. إجراء التحليل الإحصائي
   1. حلل البيانات باستخدام برامج التحليل الإحصائي.
      ملاحظة: أضف لقطات شاشة تمثيلية أو تعليمات سير العمل للتحليلات البرمجية كمواد إضافية عند الاقتضاء.
   2. تقييم توزيع البيانات
      1. تقييم طبيعية البيانات باستخدام اختبار شابيرو-ويلك.
      2. عبر عن البيانات الموزعة عادة كمتوسط ± انحراف معياري (SD).
      3. التعبير عن البيانات غير الموزعة بشكل طبيعي كنطاق وسيط ونطاق رباعي (IQR).
   3. قارن الاستجابات الميكروأوعية الدموية
      1. قارن مجموعات بيانات من مجموعتين باستخدام اختبار t مستقل عندما تتحقق افتراضات الطبيعية.
      2. قارن عدة مجموعات باستخدام تحليل أنوفاي أحادي الاتجاه متبوعا باختبار ما بعد الوقوع لتوكي.
   4. تعريف معايير الدلالة الإحصائية
      1. عرف الدلالة الإحصائية ك p < 0.05.
      2. التعامل مع البيانات المفقودة الناتجة عن تشوهات الحركة باستخدام حذف أو استبعاد زوجي من التحليل المتأثر.
         ملاحظة: تطبيق نفس استراتيجية البيانات المفقودة باستمرار في جميع مجموعات الدراسة للحفاظ على نزاهة التحليل.

Results

يؤدي التطبيق الناجح لهذا البروتوكول إلى خط أساس مستقر يتبعه استجابات دقيقة وعائية واضحة ومميزة لكل محفز وعائي. في تجربة ناجحة تقنيا، يظهر التسجيل الأساسي إشارة تروية مستقرة مع تقلبات طفيفة، تعرف بأنها SD < 10٪ من متوسط الإشارة. خلال التأين الأيوني لل ACh وSNP، يتوقع زيادة تدريجية في APU، مما يعكس توسع الأوعية الدموية المعتمد على الجرعة. تتميز استجابة PORH الناجحة بانخفاض سريع في تدفق الدم إلى صفر بيولوجي مستقر أثناء انسداد الشريان، تليها ذروة شديدة في ارتفاع الخوف مباشرة بعد تحرير الكف، وعادة ما تصل إلى قيم أعلى بعدة مرات من المستويات الأساسية لدى الأشخاص الأصحاء. يوضح الشكل 1A الإعداد التجريبي المستخدم لتقييم الأوعية الدقيقة الجلدية باستخدام LSCI والرحلان الأيوني. تظهر الأشكال 1B–1D استجابات الرعبان الأيوني التمثيلية وتحديد مواقع الأقطاب. يعرض الشكل 2A استجابة ميكروأوعية دموية معتمدة على الجرعة أثناء رحلة الأيونات ACh، بينما يوضح الشكل 2B استجابة PORH تمثيلية.

غالبا ما تتميز التسجيلات غير المثالية أو غير الناجحة تقنيا بعدم استقرار الإشارة أو تشوهات مرتبطة بالحركة. تشير الارتفاعات عالية التردد أو التقلبات المفاجئة في خط الأساس إلى حركة المشاركين أو عدم استقرار نظام دعم الفراغ الوسادة بشكل كاف. انخفاض أو غياب الاستجابة الموسعة أثناء الرفور الأيوني لدى مشارك سليم يشير عادة إلى ضعف تلامس الأقطاب مع الجلد أو حبس فقاعات هواء داخل غرفة الأقطاب، مما يؤدي إلى ضعف في توصيل التيار الكهربائي. يقدم الشكل 3 مثالا ممثلا لتسجيل غير مقبول يتميز بعدم استقرار الإشارة المرتبط بالحركة.

الشكل 3. مثال تمثيلي لتسجيل غير مقبول لتروية الأوعية الدقيقة أثناء الرحلان الأيوني. تسجيل تمثيلي لتدفق الدم الميكروفوسي الجلدي الذي تم الحصول عليه باستخدام LSCI أثناء الرسام الأيوني ACh يظهر عدم استقرار الإشارة والعيوب المرتبطة بالحركة غير مناسبة للتحليل الكمي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الفشل في تحقيق صفر بيولوجي مستقر خلال مرحلة انسداد PORH يشير إلى انسداد شرياني غير مكتمل، وغالبا ما يكون سببه وضعية الكفة غير الصحيحة أو ضغط انتفاخ الكفة غير كاف. في ظل هذه الظروف، تصبح الاستجابة المفرطة اللاحقة ضعيفة وغير مناسبة للتفسير الموثوق.

البروتوكولات التي تم تنفيذها بنجاح تولد منحنيات تروية وCVC قابلة للتكرار. تعكس الهضبة القصوى في القلب القلبي الوعائي أثناء الرفور الأيوني SNP القدرة الكلية على توسيع الأوعية الدموية والسلامة الهيكلية الوعائية، بينما تعكس الاستجابة التي يعبر عنها ACh بشكل أساسي وظيفة الأوعية الدقيقة المعتمدة على البطانة. المقارنة الموحدة لهذه الاستجابات الوعائية تتيح التمييز بين الأنماط المتوافقة مع الحفاظ على الوظائف الدقيقة الوعائية الضعيفة. تعرض الجدول 1 معايير الأوعية الميكروأوعية الكمية الممثلة التي تم الحصول عليها من أشخاص شباب أصحاء ومرضى يعانون من ارتفاع ضغط الدم الشرياني المقاوم.

المعامل الدقيق الوعائي	الوحدة	الضوابط الصحية للشباب (n = 25)	المرضى الذين يعانون من ارتفاع ضغط الدم الشرياني المقاوم (n = 50)	قيمة p
CVC الأساسي	APU/mmHg	0.37 ± 0.13	0.29 ± 0.12	0.01
ذروة CVC المستحثة بواسطة ACh	APU/mmHg	0.67 ± 0.23	0.51 ± 0.19	0.004
CVC الذروة المستحثة بواسطة SNP	APU/mmHg	0.60 ± 0.21	0.41 ± 0.17	0.0003
بروز بيك CVC	APU/mmHg	0.87 ± 0.18	0.60 ± 0.16	< 0.0001

الجدول 1: معايير تفاعل الأوعية الدقيقة التمثيلية لدى الأشخاص الشباب الأصحاء والمرضى الذين يعانون من ارتفاع ضغط الدم الشرياني المقاوم. تعبر القيم كمتوسط ± انحراف معياري (SD). تم حساب قيم p باستخدام اختبار t مستقل للمقارنات بين المجموعات. الاختصارات: ACh، أستيل كولين؛ SNP، نيتروبروسيد الصوديوم؛ POH، فرط الدم التفاعلي بعد الانسداد؛ التوصيل الوعائي الجلدي، التوصيل الوعائي الجلدي؛ وحدة تفريغ عشوائية، وحدات تروية عشوائية. تمثل البيانات نتائج غير منشورة من مختبر المؤلفين.

Discussion

يوفر LSCI نهجا موحدا وغير جراحي لتقييم الوظائف الميكروأوعية الدموية الجهازية بدقة مكانية وزمنية عالية. مقارنة ب LDF، الذي يقتصر على القياسات ذات النقطة الواحدة وحساس جدا للتباين المكاني لتروية الجلد، يتيح LSCI التصوير الكامل وتقييم العائد على الاستثمار المتعدد. تحسن هذه الخاصية بشكل كبير قابلية تكرار القياس وتقلل معامل التغير في الدراسات السريرية الميكروفوعية. علاوة على ذلك، فإن الطبيعة الخالية من التلامس ل LSCI تقلل من التشوهات المحلية المرتبطة عادة بتقنيات المجسات، مما يعزز ملاءمته للتقييمات المتكررة في بيئات البحث الترجمي والسريري.

مكون أساسي في هذا البروتوكول هو تطبيع بيانات التروية إلى MAP لحساب CVC. نظرا لأن تدفقات الدم الجلدية تتأثر بشدة بضغط التروية الجهازي، فإن تفسير APU الخام وحده قد يؤدي إلى خلط كبير، خاصة في الفئات التي لديها ملفات هيموديناميكية متغيرة مثل ارتفاع ضغط الدم أو خلل شحمية الدم. لهذا السبب، يوصي البروتوكول بالإبلاغ عن كل من قيم الوحدة الجزئية الخام وقيم CVC الموحدة لتحسين تفسير وظيفة الأوعية الدموية الدقيقة تحت ظروف فسيولوجية ومرضية مختلفة. جانب آخر حاسم في البروتوكول هو التثبيت البيئي الصارم وتثبيت المشاركين، بما في ذلك التحكم في درجة حرارة الغرفة، وتقليل تشوهات الحركة، وتحديد مواقع المشاركين الموحدة، وكلها ضرورية لتحقيق تسجيلات قابلة للتكرار.

يجب أيضا مراعاة عدة قيود في LSCI. تقوم التقنية بشكل أساسي بتقييم الدورة الدموية السطحية الجلدية على عمق يقارب 0.5–1 مم، وبالتالي قد لا تمثل طبقات الأوعية الدموية الأعمق بشكل كامل. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤثر تصبغ الجلد وتداخل الضوء المحيط على نسبة الإشارة إلى الضوضاء، مما يعزز أهمية الضوابط البيئية الموضحة في هذا البروتوكول. قيد آخر هو استخدام قياس MAP واحد من الخط الأساسي لحساب CVC طوال الإجراء. على الرغم من أن ضغط الدم الجهازي قد يتقلب خلال فترة التسجيل التي تبلغ حوالي 40 دقيقة، إلا أنه تم تجنب التكرار من النفخ المتكرر للكفة عمدا لأن قياسات ضغط الدم المتكررة قد تحفز تنشيط ودي وحركات تتداخل مع إشارة الليزر سبكل. الدراسات المستقبلية التي تدمج المراقبة الديناميكية الدموية المستمرة غير الغازية قد تحسن التفسير الفسيولوجي لقياسات التوصيل الميكرووعائي بشكل أكبر.

تشمل الخطوات الحرجة في البروتوكول تثبيت البيئة، والتحكم في الحركة، وتحديد موقع الأقطاب الكهربائية، والإغلاق الكامل للشرايين أثناء عملية PORH. عادة ما تحدث تسجيلات الأساس غير المستقرة بسبب حركة المشاركين أو فترات راحة غير كافية، وقد يتم تقليلها بإعادة تثبيت نظام التفريغ وتمديد فترة التكيف. غالبا ما تشير الاستجابات الأيونتوفوريتيكية الباهتة إلى ضعف تلامس الأقطاب مع الجلد أو احتجاز فقاعات هواء داخل غرفة التسليم؛ عادة ما يحل ملء الحجرة بعناية وإعادة تموضع الأقطاب هذه المشكلات. الفشل في تحقيق الصفر البيولوجي خلال مرحلة انسداد PORH عادة ما يعكس انسدادا شريايا غير مكتمل ناتجا عن انتفاخ الكفة غير الكافي أو وضعية الكفة بشكل غير صحيح. في ظل هذه الظروف، تصبح الاستجابة المفرطة الناتجة ضعيفة وغير مناسبة للتفسير الموثوق.

يمثل دمج الاستفزازات الفسيولوجية والدوائية قوة رئيسية لهذا البروتوكول لأن هذه الأساليب تقيم الجوانب التكميلية لتنظيم الأوعية الدقيقة. يوفر PORH تقييما فسيولوجيا متكاملا للتفاعل الميكروأوعية الدموية الذي يشمل آليات بطانة الجسم، والخلايا العصبية، وآليات العضلات الملساء الوعائية التي تثارها نقص التروية العابر وإجهاد القص¹⁶. على النقيض من ذلك، يمكن الرعب الأيوني التقييم الانتقائي لمسارات توسيع الأوعية المعتمدة على البطانة والمستقلة عن البطانة¹⁵. يقيم ACh توسع الأوعية الدموية المعتمد على أكسيد النيتريك المعتمد على البطانة، بينما يقوم SNP، وهو مانح مباشر لأكسيد النيتريك، بتقييم استجابة العضلات الملساء الوعائية بشكل مستقل عن إشارات البطانة¹⁵. يسمح التفسير المقارن لهذه الاستجابات بالتمييز بين ضعف البطانة الوظيفية وإعادة تشكيل الأوعية الدقيقة الهيكلية. هذا التمييز ذو صلة خاصة في حالات الشيخوخة، وارتفاع ضغط الدم المقاوم، والسكري، والأمراض الأيضية المزمنة، حيث قد يتعايش ضعف الإشارات البطانية مع تراجع الأوعية الدقيقة^14,17.

باختصار، يوفر هذا البروتوكول الموحد للتحليل النفسي طريقة قابلة للتكرار وذات صلة ترجمية للتقييم غير الجراحي لصحة الأوعية الدموية الدقيقة البشرية. يتيح الجمع بين الرحلان الأيوني الدوائي واختبار نقص التروية الفسيولوجي إعادة التروية توصيفا تفصيليا لوظيفة البطانة والأوعية الدموية الهيكلية مع تقليل التنوع التجريبي من خلال التوحيد البيئي والديناميكي الدموي الصارم. نظرا لحساسيته للكشف المبكر عن خلل الأوعية الدموية الدقيقة عبر اضطرابات القلب والأوعية الدموية والتمثيل الغذائي المتنوعة، يمثل هذا النهج أداة قيمة للبحث السريري، والمراقبة الطولية، والتقييم العلاجي في طب الأوعية الدموية الانتقالية.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<قوي>معدات
جهاز مراقبة ضغط الدم الكهربائي المتذبذب الآلي	أومرون للرعاية الصحية	HEM-7120	يستخدم لتقييم الضغط الشرياني المتوسط الأساسي (MAP) (3 قياسات)
مقياس الحرارة الرقمي المعاير	دلتا OHM	HD2301.0	الدقة والمزاج؛ 0.1° C لمراقبة درجة حرارة الغرفة
القطب المرجعي (التشتتي)	بيريمد AB	PF 384	قطب محايد كبير المساحة
أقطاب توصيل الأدوية	بيريمد AB	PF 383 / LI 611	غرف الرعب الأيوني غير الغازية (حوالي 80 مم² م²)
وحدة تحكم الطاقة بالرعب الأيوني	بيريمد AB	نظام تشخيص الأوعية الدقيقة بحول الأيونت	وحدة تحكم تيار ثنائية القناة (حتى 200 وميكرو؛ A)
نظام تصوير التباين بالليزر سبكل (LSCI)	بيريمد AB	بيريكام PSI NR	جهاز تصوير تروية الدم عالي الدقة
وسادة تفريغ طبية	إيه بي جيرما	لا يوجد	يستخدم لتثبيت وضعية الساعد على مستوى القلب
مضخة تفريغ تعمل بيد واحدة	إيه بي جيرما	لا يوجد	تستخدم لإخلاء وسائد التفريغ
منفخ الكفة السريع	شركة دي. إي. هوكانسون.	منفخ الكفة السريع E20	يستخدم لانسداد شريان موحد لمدة 3 دقائق
<قوي>المواد الكيميائية والمستهلكات
كلوريد الأستيل كولين (ACh)	سيغما-ألدرتش	A6625	موسع الأوعية المعتمد على البطانة تم تحضيره بنسبة 2٪
وسادات تحضير الكحول	بيكتون ديكنسون	326895	وسادات كحول الأيزوبروبيل بنسبة 70٪ لتحضير البشرة
الماء منزوع الأيونات	سيغما-ألدرتش	38796	يستخدم في الشطف النهائي للأقطاب الكهربائية
كلوريد الصوديوم (0.9٪ محلول ملحي)	المورد المحلي	لا يوجد	مذيب لتحضير الأدوية وتنظيف الجلد
نيتروبروسيد الصوديوم (SNP)	سيغما-ألدرتش	S0501	موسع الأوعية المستقلة عن البطانة تم تحضيره بنسبة 2٪
شاش معقم	المورد المحلي	لا يوجد	يستخدم لتجفيف سطح الجلد بعد التنظيف
<قوي>برمجيات
برنامج تحليل التروية	بيريمد AB	PIMSoft	برامج لجمع بيانات LSCI وتحليل العائد على الاستثمار
برنامج التحليل الإحصائي	برنامج جراف باد	بريزم 10	يستخدم لحساب ملاءمة منحنى الجرعة-الاستجابة وحساب المساحة تحت المنحنى (AUC)