يظهر هذا البروتوكول الاستئصال بالليزر عبر الدهويزية بتقنية Ho:YAG لإنشاء نموذج فأر قابل للتكرار لتليف رقبة المثانة لدراسة إعادة تشكيل التليف الناتج عن الإصابات الحرارية والتدخلات العلاجية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
هولميوم: تحريض YAG بمساعدة الليزر لتقلص عنق المثانة في نموذج جرذ
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
انقباض المثانة في الرقبة (BNC) هو تضيق ليفي لمخرج المثانة ومضاعفة صعبة بعد استئصال البروستاتا عبر الإحليل (TURP). غالبا ما تعتمد النماذج الحيوانية الحالية على الربط خارج الحويذي أو الكي الكيميائي، الذي لا يعيد إنتاج التليف الناتج عن الإصابة الحرارية الذي يتطور بعد الجراحة بالمنظار وقد يظهر قابلية إعادة إنتاج محدودة. هنا، نصف نموذج فأر لتليف رقبة المثانة الناتج عن استئصال ليزر هولميوم:YAG عبر الحويشة (ليزر هو:YAG) لعنق المثانة. بعد عملية صغيرة لفتح البطن في خط المنتصف السفلي واستئصال المثانة، يتم إدخال ليف ليزر Ho:YAG بقطر 200 ميكرومتر إلى تجويف المثانة تحت الرؤية المباشرة. يتم توصيل طاقة الليزر في وضع التلامس عند 1.0 جول و10 هرتز لمدة 5 ثوان لكل نقطة عند موقعي عنق المثانة عند الساعة 3 و9، أي 50 جول لكل نقطة و100 جول لكل حيوان. بعد أربعة أسابيع، تطور الحيوانات المعالجة تضخما في المثانة بشكل عام، وتضيق رقبة المثانة، وتكثيف جدار المثانة، وأدلة نسيجية على إعادة تشكيل الليف، بما في ذلك زيادة ترسيب الكولاجين وزيادة التعبير عن الكولاجين من النوع الأول والثالث. يوفر هذا البروتوكول نموذجا عمليا يحاكي الندوب الموضعية الناتجة عن الإصابة الحرارية عند مخرج المثانة. نظرا لاستخدام إناث الجرذان ولم تجر اختبارات الديناميكية الوظيفية في الدراسة الحالية، فإن النموذج مناسب بشكل أفضل لدراسة تليف عنق المثانة وإعادة تشكيل الهيكل بدلا من إعادة إنتاج BNC الذكرية بالكامل بعد جراحة البروستاتا. قد يكون النموذج مفيدا لدراسة الآليات الليفية لمرض BNC ولتقييم ما قبل السريري للتدخلات المضادة للتليف أو التدخلات الترميمية.
المقدمة
انقباض رقبة المثانة (BNC) هو تضيق ليفي في عنق المثانة يحدث عادة بعد الإجراءات عبر الإحلال، وخاصة TURP 1,2,3. أساسها المرضي هو تكون الندوب المفرطة وترسيب الكولاجين بعد إصابة الأنسجة وشفاء الجرح غير الطبيعي4،5،6. نظرا لأن BNC يمكن أن يؤدي إلى خلل مستمر في التفريغ، والتدخلات المتكررة، وحدوث مراضة كبيرة، فهناك حاجة إلى نموذج تجريبي قابل للتكرار للتحقيق في مسببه وعلاجه7.
تم استخدام عدة نماذج حيوانية لدراسة انسداد مخرج المثانة أو التليف المحيط بالإحليل، بما في ذلك الربط خارج الوعاء للإحليلالقريب 8 وطرق جراحية مفتوحة أخرى9. على الرغم من أن هذه النماذج يمكن أن تسبب انسداد بولي وتضخم التثبيت، إلا أنها لا تعيد إنتاج الإصابة الحرارية الموضعية التي يعتقد أنها تبدأ الإصابة الكيميائية بعد الجراحة بعد التنظير. بالإضافة إلى ذلك، غالبا ما يكون من الصعب توحيد الهدف التشريحي ودرجة الإصابة، مما قد يزيد من التباين بين الحيوانات.
يجب أن يحقق النموذج المثالي المرتبط ب BNC ثلاثة معايير: يستهدف رقبة المثانة التشريحي، ويعيد إنتاج الإصابة الحرارية المحكومة مشابهة لتلك التي تسببها أجهزة الطاقة بالمنظار، وأن يولد تضيقا ليفيا بشكل موثوق مع تعقيد جراحي مقبول. لتلبية هذه الاحتياجات، طورنا بروتوكول هو:ياغ عبر الوريكية قائم على الليزر في إناث الفئران. تم اختيار الحيوانات الإناث لتسهيل التعرض الجراحي وعزل الإصابات الحرارية الخاصة بالمثانة والركب الليفي دون تدخل من نسيج البروستاتا. باستخدام الرؤية المباشرة داخل الحويصلة، تتيح هذه الطريقة إيصال طاقة الليزر بدقة إلى مخاط رقبة المثانة وتحت الغشاء المخاطي وتؤدي إلى تضيق ليفي قابل للتكرار لمخرج المثانة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة من لجنة العناية والاستخدام المؤسسي للحيوانات التابعة للجنة أخلاقيات رعاية الحيوانات التجريبية في معهد بكين للطب الصيني التقليدي (رقم الموافقة. BJTCM-R-2025-03-02). كانت الحيوانات تؤوي في ظروف قياسية مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء بشكل اختياري. في البروتوكول الحالي، تم استخدام ما مجموعه 16 جرذا، بما في ذلك 8 فئران في مجموعة التحكم بدون جراحة و8 فئران في مجموعة Ho:YAG المعالجة بالليزر. توفي حيوانان من مجموعة Ho:YAG التي تم علاجها بالليزر بعد العملية. لم يتم استبعاد أي حيوانات إضافية بسبب الثقب أو النزيف الحاد أو فشل التحريض النموذجي.
1. التحضير قبل العملية
- تحضير ميلوكسيكام من الدرجة الصيدلانية لتخفيف الألم حول العمليات (الشكل 1A)، ونظام التخدير الاستنشاق للحيوانات الصغيرة (الشكل 1B)، ونظام الليزر Ho:YAG بألياف ليزر بقوة 200 ميكرومتر (الشكل 1C)، وأدوات الجراحة المجهرة المعقمة (الشكل 1D)، 8-0 غرز مضفرة قابلة للامتصاص (حمض بولي غليكوليك مطلي، PGA) لإغلاق عملية فتح المثانة، غرز 4-0 مضفرة من البولي جلاكتين 910 لإغلاق الجلد، محلول ملحي معقم، ستائر معقمة، مسحات قطنية معقمة، وزيت تشحيم معقم (الشكل 1E).
- تحفز التخدير باستخدام 3٪–4٪ إيزوفلوران في الأكسجين في غرفة الحث، والحفاظ على التخدير بنسبة 1.5٪–2.5٪ من الإيزوفلوران عبر مخروط أنف أثناء الجراحة.
- قم بضبط التركيز وفقا لمعدل التنفس والبروتوكول الحيواني المؤسسي المعتمد. تأكد من عمق التخدير الكافي بغياب رد فعل قرص إصبع القدم قبل الجرح وأعد تقييم عمق التخدير طوال الإجراء.
- قم بقص الفرو على نطاق واسع من أسفل البطن بحيث يغطي الغطاء أي فرو متبقي ويمنع التلامس بين الأدوات والشعر غير المقصوص.
- تعقيم الحقل الجراحي بمقشرات بوفيدون-يود و70٪ إيزوبروبيل كحولي متناوب؛ قم بتنفيذ ثلاث تطبيقات لكل محلول قبل التضخيم (drabing).
- ضع الحيوان في وضعية الاستلقاء على وسادة تسخين مضبوطة على 37 درجة مئوية وحافظ على ظروف معقمة طوال الإجراء.
- إذا كان هناك حاجة لملء المثانة أو تحديد عنق المثانة أثناء العملية، قم بتشحيم قسطرة أو قنية صغيرة معقمة في الإحليل بمزلق معقم، ثم أدخلها بلطف عبر فتحة الإحليل إلى المثانة، وقم بإدخال محلول ملحي معقم ببطء. تجنب الإدخال القسري أو التعبئة الزائدة. قم بإزالة أو تثبيت القسطرة وفقا للتعرض الجراحي المخطط له.
2. كشف المثانة
- قم بعمل شق جلدي في منتصف السطح السفلي بمقدار 3–4 سم تحت ظروف معقمة (الشكل 2A).
- باستخدام ملقط ذو طرف دقيق ومقص دقيق، قسم النسيج تحت الجلد وافتح الخط الألبي لدخول تجويف الصفاق.
- قم بإزالة المثانة بلطف باستخدام ملقط غير مسبب للصدمة (الشكل 2B).
- حدد عنق المثانة كنقطة الربط بين قاعدة المثانة والإحليل القريب.
- ضع مسبارا غير مكثف تحت عنق المثانة لتوفير دعم لطيف وتثبيت المنطقة المستهدفة (الشكل 2C).
3. استئصال الليزر عبر الهو: YAG
- قم بتوسيع المثانة باستخدام محلول ملحي معقم حتى يصبح جدار المثانة مشدودا بشكل معتدل. تجنب الانتفاخ الزائد، الذي قد يحجب المعالم التشريحية أو يزيد من التوتر في موقع فتح المثانة.
- أنشئ فتحة تثانية طولية بطول 0.5 سم عند قبة المثانة الأمامية باستخدام المقص الدقيق (الشكل 2D).
- إدخال ألياف ليزر Ho:YAG المحضرة بقدرة 200 ميكرومتر عبر فتحة المثانة إلى تجويف المثانة.
- تقدم الألياف تحت الرؤية المباشرة إلى رقبة المثانة.
- ضع طرف الألياف برفق في ملامسة مباشرة مع مخاط المثانة في الرقبة. الحفاظ على وضع التلامس دون وجود انبعاج مرئي للنسيج؛ تأكد من أن المسافة بين الطرف والنسيج تكون حوالي 0 مم طوال فترة توصيل الطاقة.
- قم بتوصيل طاقة الليزر عند 1.0 جول و10 هرتز لمدة 5 ثوان في موقع الساعة 9 مساء (الشكل 3A) وكرر ذلك في موقع الساعة 3 (الشكل 3B). هذا الإعداد يوفر 50 جول لكل نقطة و100 جول لكل حيوان، مع تثبيت القدرة عند 10 واط عبر الحيوانات.
ملاحظة: يشير نجاح الاستئصال إلى تبييض مخاطي منتظم وتكوين فوهة مخاطية ضحلة من مخاطية إلى تحت مخاطية دون كربون. - حافظ على استقرار الألياف خلال التطبيق لمدة 5 ثوان وتجنب دفع الألياف إلى الحائط. تجنب تكون الحفر العميقة أو الثقب الكامل السمك. لا توجه الألياف نحو فتحات الحالب أو الإحليل البعيد.
- قم بإزالة الألياف وغسل تجويف المثانة بمحلول ملحي معقم لإزالة الحطام وتأكيد حدوث النزيف الدموي.
- إغلاق عملية فتح المثانة مع انقطاع 2–3 8-0 غرز مضفرة قابلة للامتصاص (PGA مطلية) بطريقة محكمة الإغلاق ضد الماء.
- أعد ملء المثانة بمحلول ملحي معقم بسعة 0.5–1.0 مل لتأكيد عدم وجود تسرب من خط الإغلاق (الشكل 3C).
- أغلق جدار البطن والجلد بطبقات (الشكل 3D).
4. الرعاية بعد العملية
- احتفظ بالفأر على وسادة تدفئة حتى يتعافى تماما من التخدير.
- أعط الميلوكسيكام بجرعة 1 ملغ/كغ تحت الجلد لتخفيف الألم بعد العملية واستمر مرة واحدة يوميا لمدة 1–3 أيام، أو وفقا لبروتوكول الحيوانات المعتمد.
- راقب الحيوان يوميا لمدة لا تقل عن 7 أيام بحثا عن علامات الألم أو الضيق أو التربية الدموية أو احتباس البول أو انفصال الجرح أو العدوى.
- قدم الدعم للترطيب والطعام الملطف حسب الحاجة خلال فترة التعافي المبكرة.
5. تقييم انقباض المثانة في الرقبة
- اترك الحيوانات تتعافى لمدة 4 أسابيع بعد الجراحة للسماح بإعادة تشكيل ليفية في عنق المثانة.
- في نقطة التجربة النهائية، قم بقتل الحيوانات باستخدام جرعة زائدة من بنتوباربيتال الصوديوم (150 ملغ/كجم، داخل الصفاق) أو طريقة أخرى معتمدة من بروتوكول الحيوانات المؤسسي، وتأكيد الوفاة قبل حصاد الأنسجة. احصد المثانة، وعنق المثانة، والإحليل القريب بشكل جماعي.
- افتح العينة طوليا وصور عنق المثانة لتوثيق التضيق الشديد.
- تثبيت النسيج في 4٪ بارافورمالديهيد عند 4 درجات مئوية لمدة 24 ساعة، وجفف النسيج عبر الإيثانول المتدرج، ونظف في الزيلين، ودمج في البارافين، واحصل على مقاطع عرضية متسلسلة بمقدار 4 ميكرومتر عبر منطقة عنق المثانة.
- صبغ مقاطع بهيماتوكسيلين وإيوزين، وتريكروم ماسون، وبيكروسيريوس الأحمر وفقا لبروتوكولات الأنسجة القياسية أو تعليمات الشركة المصنعة لتقييم تضيق التلومين، وسماكة جدار رقبة المثانة، وترسيب الكولاجين.
- في الكيمياء المناعية، قم بإزالة البارافينات من المقاطع، وإجراء استرجاع المستضدات، ومنع البيروكسيداز الداخلي والارتباط غير النوعي، وحضان الأقسام التي تحتوي على أجسام مضادة ضد الكولاجين من النوع الأول والكولاجين الثالث، وتطبيق الجسم الثانوي المناسب، وتطوير الكروموجين، وصبغ مضاد باستخدام الهيماتوكسيلين.
ملاحظة: يتم تخفيف الأجسام المضادة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. - قم بقياس مساحة التلال والمنطقة الموجبة للكولاجين باستخدام برنامج ImageJ/Fiji أو برنامج تحليل الصور المكافئ.
- معايرة مقياس البكسل إلى الميكرومتر باستخدام شريط المقياس المجهري، وحدد يدويا تجويف رقبة المثانة ومنطقة الأنسجة المعنية، وقياس مساحة التلومين.
- بالنسبة لتلوين ثلاثي الألوان من ماسون، قم بتطبيق عتبة لونية متسقة لتحديد البكسلات الزرقاء الموجبة للكولاجين ضمن منطقة الاهتمام.
- احسب نسبة المساحة الموجبة للكولاجين كمساحة إيجابية للكولاجين مقسومة على إجمالي مساحة الأنسجة.
- قم بإجراء قياسات على أقسام وحقول مماثلة من كل حيوان، وتحليل الصور بطريقة عمياء.
ملاحظة: يدعم التحريض النموذجي الناجح تضييق مخرج المثانة الإجمالي مع الأدلة النسيجة على التليف المتمركز وزيادة ترسيب الكولاجين في موقع الآلة. كان معدل النجاح التشغيلي 6/8 في مجموعة Ho:YAG المعالجة بالليزر، بناء على تطوير النمط الظاهري الإجمالي والنسجي المتوقع.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
بعد أربعة أسابيع من الجراحة، أظهرت الفئران التي عولجت بليزر Ho:YAG تغيرات جسيمة ونسيجية قابلة للتكرار تتوافق مع تضيق فيبروتي في المثانة في الرقبة. في هذه الدراسة، شملت مجموعة التحكم التي لم تخضع لجراحة 8 فئران، وشملت مجموعة Ho:YAG التي تم علاجها بالليزر 8 فئران. 6/8 الحيوانات المعالجة طورت النمط الظاهري المتوقع؛ تضمنت نسبة الفقدان وفاتين بعد العملية في مجموعة Ho:YAG المعالجة بالليزر، دون استثناءات إضافية. بشكل عام، أظهرت المثانات الضابطة حجما طبيعيا ومظهرا خارجيا أملسا (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الدراسة، أنشأنا نموذجا للفئران لتضيق الرقبة الليفية باستخدام الاستئصال بالليزر عبر الهو:ياغ. القوة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنها تسبب إصابة حرارية مضبوطة في عنق المثانة التشريحي، تليها إعادة تشكيل تليفية تدريجية. يختلف هذا عن نماذج الربط خارج الحواضة التقليدية، التي تولد الانسداد بشكل رئيسي من خلال الضغط الخارجي بدلا من تكوين الندبة الداخلية10. نظرا لأن BNC بعد العملية الجراحية يرتبط ارتباطا وثيقا بإصابة الأنسجة والتليف اللاحق بعد الجراحة بالمنظار، فقد يعكس...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وقد دعم هذا العمل بمنح من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 82474255 للشؤون البشرية) وبرنامج البحث التابع لإدارة إقليم خبي للطب الصيني التقليدي (B2025018 للموارد البشرية).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Absorbable braided suture (coated PGA), 8-0 | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd., Shanghai, China | R831 | |
| Anti-collagen I antibody, mouse monoclonal | Proteintech Group, Inc., Wuhan, China | 66761-1-Ig | |
| Anti-collagen III antibody, mouse monoclonal | Proteintech Group, Inc., Wuhan, China | 68320-1-Ig | |
| Coated Vicryl Plus suture (polyglactin 910), 4-0 | Ethicon, Inc. (Johnson & Johnson) | VCP773D | SH 26 mm ½-circle taper needle; violet braided; absorbable; Lot: RLMCJX |
| Hematoxylin and eosin (HE) staining kit | Servicebio, Wuhan, China | 2310005 | |
| Holmium-YAG Laser System (LITHO) | Quanta System S.p.A, Italy | https://www.quantasystem.com/laser/litho/ | 1 J, 10 Hz, 10 W, 200 μm fiber |
| HRP-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Boster, Wuhan, China | BA1050 | |
| Isoflurane | RWD | 2025010601 | |
| Masson's trichrome staining kit | Zhuhai Baso Biotechnology Co., Ltd., Zhuhai, Guangdong, China | BA4079B | |
| Meloxicam Injection | Qilu Animal Health, Shandong, China | E135H003 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Servicebio, Wuhan, China | 2510H0070148 | |
| Picrosirius red staining kit | Nanjing Senbeijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Jiangsu, China | 20250228 | |
| Safety intravenous catheter, 24 G | Guangdong Lily Medical Technology Co., Ltd., Foshan, Guangdong, China | AD4-240827 | |
| Small-animal inhalation anesthesia system | RWD Life Science, Shenzhen, China | https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/ | Induce with 3%–4% isoflurane in oxygen |
المراجع
- Wu Y, et al. Analysis of risk factors for bladder neck contracture after transurethral endoscopic surgery for benign prostatic hyperplasia. Aging Male. 2024;27(1):2429456.
- Rassweiler J, et al. Complications of transurethral resection of the prostate (TURP)--incidence, management, and prevention. Eur Urol. 2006;50(5):969-79; discussion 980.
- Simhan J, et al. Bladder neck contracture. Transl Androl Urol. 2014;3(2):214-20.
- Browne BM, Vanni AJ. Management of urethral stricture and bladder neck contracture following primary and salvage treatment of prostate cancer. Curr Urol Rep. 2017;18(10):76.
- Pakshir P, Hinz B. The big five in fibrosis: macrophages, myofibroblasts, matrix, mechanics, and miscommunication. Matrix Biol. 2018;68-69:81-93.
- Li L, Zhao Q, Kong W. Extracellular matrix remodeling and cardiac fibrosis. Matrix Biol. 2018;68-69:490-506.
- Ren Y, et al. Bladder neck contracture: incidence, mechanisms, and therapeutic advances. Ann Med Surg (Lond). 2025;87(11):7378-7389.
- Mattiasson A, Uvelius B. Changes in contractile properties in hypertrophic rat urinary bladder. J Urol. 1982;128(6):1340-2.
- Igawa Y, et al. A rat model for investigation of spinal mechanisms in detrusor instability associated with infravesical outflow obstruction. Urol Res. 1993;21(4):239-44.
- Varkarakis IM, et al. Comparison of erbium:yttrium-aluminum-garnet and holmium:yttrium-aluminum-garnet lasers for incision of urethra and bladder neck in an in vivo porcine model. Urology. 2005;65(1):191-5.
- Hu X, et al. Clinical comparison of TURP, PVP and HoLEP for small volume BPH. Sci Rep. 2025;15(1):34751.
- Kang D, et al. Morphological characterization of tissue destruction according to the distance between holmium:YAG laser tip and tissue surface. Int Neurourol J. 2024;28(3):196-206.
- Zhang SL, Wong AW. A novel technique for atraumatic transurethral catheterisation of male rats. Biol Open. 2024;13(9).
- Kendall RT, Feghali-Bostwick CA. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Front Pharmacol. 2014;5:123.
- Kitta T, et al. Benefits and limitations of animal models in partial bladder outlet obstruction for translational research. Int J Urol. 2018;25(1):36-44.
- Wang Y, et al. Urethral orifice hyaluronic acid injections: a novel animal model of bladder outlet obstruction. BMC Urol. 2015;15:8.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
