التصوير الموحد بالفلورية المناعية لأنابيب النانو النفقية ونقل الميتوكوندريا بين الخلايا النجمية والعصبونات

Xiaoyan Du; Yang Deng

doi:10.3791/71670

مقالة منهجية

التصوير الموحد بالفلورية المناعية لأنابيب النانو النفقية ونقل الميتوكوندريا بين الخلايا النجمية والعصبونات

DOI:

10.3791/71670

⸱

يونيو 12, 2026

Xiaoyan Du¹ , Yang Deng¹

¹School of Public Health, Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science and Technology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقوم هذا البروتوكول بتوحيد طرق التثبيت، والتلوين، والتصوير الكونفوكلي لرؤية الأنابيب النانوية النفقية ونقل الميتوكوندريا بين الخلايا النجمية والعصبونات في المختبر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الميتوكوندريا هي عضيات أساسية تنظم إنتاج الطاقة، والإشارات الخلوية، والتوازن الأيضي في الخلايا العصبية. الأنابيب النانوية النفقية (TNTs) هي هياكل غشائية رقيقة تتوسط في التواصل بين الخلايا لمسافات طويلة وتسهل نقل المكونات الخلوية، بما في ذلك الميتوكوندريا، بين الخلايا المتصلة. يتطلب التصور الموثوق ل TNTs ونقل الميتوكوندريا التعامل الدقيق مع العينات لأن هذه الهياكل هشة للغاية وحساسة لظروف التثبيت والغسل والتصوير. يصف هذا البروتوكول إجراءات موحدة لتثبيت وتلوين وتصوير الكونفوكال لأنابيب TNT في الخلايا النجمية وأنظمة الزراعة المشتركة بين الخلايا النجمية. يشمل سير العمل التلوين الغشائي والهيكلي الخلوي لتصوير TNT، وتصنيف الميتوكوندريا لتتبع تحديد موقع الميتوكوندريا، والتلوين المناعي الفلوري لتحليل التداخل مع Miro1. يتم التأكيد على خطوات حيوية للحفاظ على شكل TNT، بما في ذلك الغسل اللطيف والتعامل المحمي من الضوء، طوال فترة الإجراء. كما يوضح البروتوكول أساليب التصوير لتوصيف TNTs والميتوكوندريا في تحضيرات الخلايا الثابتة. توفر هذه الطرق إطارا تجريبيا قابلا لإعادة إنتاج لدراسة تكوين TNT ونقله الميتوكوندري بين الخلايا العصبية في المختبر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعمل الميتوكوندريا كمصانع طاقة للخلية، توفر الطاقة اللازمة للأنشطة الخلوية من خلال إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات، كما تلعب أدوارا مهمة في نقل الإشارات الخلوية وتوازن الأكسدة والاختزاز¹. في الجهاز العصبي، يمكن لمستقلبات الميتوكوندريا زيادة تعقيد وقابلية الإثارة للعمليات العصبية، مما يدعم نمو وتطور الخلايا العصبية². الميتوكوندريا ليست عضيات ثابتة؛ يغيرون شكلها وموقعها وتوزيعها باستمرار للتكيف مع مختلف الضغوط داخل الخلية وخارج الخلايا ومتطلبات الأيض³. يساهم النقل بين الخلايا الميتوكوندرية في الحفاظ على توازن الأنسجة ويعزز التطور في الظروف الفسيولوجية، بينما في الظروف المرضية، يشارك في إصلاح الأضرار، وتنظيم المناعة، وتطور المرض⁴^،⁵.

يعد التواصل بين الخلايا للمواد والطاقة ضروريا لمختلف العمليات البيولوجية، بما في ذلك التوازن الخلوي، وإصلاح الأنسجة، وتنظيم الشبكات العصبية. كشفت الدراسات الحالية عن عدة أنماط للتواصل بين الخلايا، من بينها أنابيب النانو النفقية (TNTs) التي تمثل واحدة من أكثر الآليات دراسة أوسع المرتبطة بنقل الميتوكوندريا بين الخلايا⁶. ال TNTs هي هياكل غشائية شبيهة بالجسر تعتمد على F-Actin، ذات شكل أنبوبي، يتراوح قطرها بين 50 إلى 200 نانومتر وتمتد حتى عدة أقطار خلايا بطول⁷. أظهرت الأبحاث أن TNTs يمكن أن تكون روابط فيزيائية بين الخلايا العصبية وترتبط ارتباطا وثيقا بظهور وتطور الأمراض التنكسية العصبية وسرطان الدماغ واضطرابات أخرى. على سبيل المثال، تم الإبلاغ عن نقل الميتوكوندريا من الخلايا الدبقية الصغيرة إلى الخلايا العصبية عبر TNTs لإنقاذ الخلايا العصبية ^8,9.

تواجه الأبحاث الحالية حول مادة تي إن تي عدة تحديات، منها هشاشة البنيوية لمادة تي إن تي، مما يجعلها عرضة للكسر وقد تؤثر نتيجة التجارب بالتالي؛ صعوبة التمييز بين TNTs وبين الفيلوبوديا أو النتوءات الغشائية الأخرى؛ والتحديات المرتبطة بقياس دقيق لمادة TNTs بين الخلايا. لتحسين قابلية تكرار واتساق الدراسات المتعلقة ب TNT، هناك حاجة إلى طرق موحدة لغسل وتثبيت وتلوين وتصوير TNTs لتمكين تقييم دقيق لتركيبها وتوزيعها مع تقليل التباين التجريبي. عوامل مثل كثافة الخلايا قبل التثبيت، الحماية من الضوء، شدة الغسيل، مدة التثبيت، وظروف التلوين بعد التثبيت يمكن أن تؤثر جميعها على بنية واستقرار مادة TNTs. في هذه الدراسة، نصف إجراءات المعالجة المسبقة، والتلوين، والتصوير الكونفوكلي لمادة TNTs وهياكل TNT المرتبطة بالميتوكوندريا في أنظمة زراعة الخلايا النجمية والخلايا العصبية النجمية.

يمكن تطبيق هذا البروتوكول البحثي بشكل عام في معظم البيئات المختبرية. أكد التحقق في الخلايا النجمية الأولية وخط الخلايا العصبية الحصينية في الفأر أن البروتوكول مناسب لكل من الخلايا العصبية الأولية وخطوط الخلايا الخالدة. ومع ذلك، لا يزال لهذا البروتوكول عدة قيود. يوفر المجهر الكونفوكلي دقة مكانية أقل من طرق التصوير فائقة الدقة لتصوير TNT، وقد يتأثر تقييم نقل الميتوكوندريا المعتمد على MitoTracker بتسرب الصبغة وتداخل الإشارة غير الميتوكوندرية¹⁰.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم تشمل هذه الدراسة مواضيع بشرية أو حيوانات فقارية حية؛ تم استخدام خطوط الخلايا فقط التي تم الحصول عليها تجاريا أو القائمة، ولم تكن هناك حاجة لموافقة أخلاقية.

1. التلوين لمادة TNTs في الخلايا النجمية

البذر الخلوي
1. تم عزل الخلايا النجمية الأولية للفئران عند الممر 3 (P3) في أطباق زراعة زجاجية بقطر 35 مم بكثافة 5 × 10^{إلى 4} خلايا لكل طبق. أضف 2 مل من خليط Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) من Dulbecco مع 10٪ مصل أبقار جنيني (FBS) و1٪ خليط مضاد حيوي ثلاثي (بنسلين G، ستريبتومايسين، وأمفوتيرسين B). زراعة الخلايا عند 37°C في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂.
2. حضن الخلايا لمدة تقارب 24 ساعة حتى يحدث الالتصاق.
المعالجة المبدئية والتثبيت
1. انقل أطباق الزراعة إلى طاولة نظيفة تحت ظروف محمية من الضوء بعد تثبيت الخلية.
  ملاحظة: تقليل الحركة والاهتزاز غير الضروريين أثناء التعامل للحفاظ على سلامة مادة TNT.
2. أزل وسط الزراعة بلطف تحت ظروف إضاءة خافتة.
  ملاحظة: تجنب الجفاف الكامل لسطح الخلية أثناء إزالة الوسط لأن مادة TNTs قد تنهار وتلتحق بركيزة الزراعة.
3. اغسل الخلايا بلطف مرة واحدة ب 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بدون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم (درجة الحموضة 7.3–7.5). أضف وأزل PBS ببطء على طول جدار طبق الزراعة لتجنب تعطيل مادة TNT بين الخلايا أثناء الغسيل.
4. أزل PBS بحذر.
5. ثبت الخلايا بمحلول تجاري بنسبة 4٪ من خلايا الأنسجة يحتوي على بارافورمالديهايد (درجة حموضة 7.2–7.4) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT؛ 20°C–25°C) تحت ظروف إضاءة خافتة.
  تحذير: التعامل مع المحاليل المثبتة باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وأداء جميع الإجراءات وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية المؤسسية.
6. أزل المحلول المثبت.
7. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.
نفاذية الخلايا والتلوين الفلوري
1. قم بنفخ الخلايا بمحلول 500 ميكرولتر من محلول ترايتون X-100 الجاهز للاستخدام لمدة 20 دقيقة عند RT.
  تحذير: قد يتسبب ترايتون X-100 في تعطيل هياكل TNT الهشة. قلل من التحريك المفرط أثناء النفاذ.
2. قم بإزالة محلول النفاذية.
3. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.
4. جهز محلول التلوين مباشرة قبل الاستخدام. يتم تخفيف صبغة تلوين F-actin في PBS إلى تركيز نهائي 1 ميكرومولار واستخدام 4′,6-دياميدينو-2-فينيل إندول (DAPI) كصبغة نووية جاهزة للاستخدام. اخلط محلولين التلوين جيدا قبل الاستخدام.
  ملاحظة: يمكن استخدام كواشف التلوين القائمة على الفالويدين كبدائل لتصوير F-actin.
5. اخلط محاليل التلوين F-actin والمحاليل النووية بنسبة 1:1 (أحجام متساوية) في ظروف محمية من الضوء.
6. أضف محلول التلوين المحضر إلى أطباق الثقافة.
7. حضن الخلايا لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37°C في الظلام.
8. أزل محلول التلوين.
9. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS باستخدام 500 ميكرولتر في كل غسلة لمدة دقيقة واحدة في كل غسلة.
10. أضف 1 مل من PBS لمنع جفاف الخلايا أثناء تحضير التصوير.
التصوير الكونفوكالي
1. التقاط الصور باستخدام مجهر كونفوكال مقلوب من نيكون مزود بعدسة ×20 الموضوعية. استخدم إثارة 405 نانومتر لتطبيق DAPI و488 نانومتر لصبغ F-actin. التقط صورا بدقة 1024 × 1024 بكسل تحت ظروف محمية من الضوء عند RT.
2. إجراء تقييم نوعي وقياس يدوي باستخدام خمسة حقول رؤية عشوائية على الأقل لكل عينة. قم بقياس عدد الخلايا الموجبة ل TNT وعدد الخلايا الموجبة ل TNT التي تحتوي على واحد أو أكثر من TNTs في كل مجال رؤية (الشكل 1A و 1B).
  ملاحظة: التقط الصور مباشرة بعد التلوين لتقليل فقدان الفلورة والاضطرابات الهيكلية لمادة TNTs.

الشكل 1: تلوين الفلورة لأنابيب النانو النفقية (TNTs) في الخلايا النجمية. (أ) صور المجهر الكونفوكالي الممثلة تظهر تلوين نووي وأكتين F في الخلايا النجمية التي تزرع في أطباق زراعة قاع زجاجي. (ب) عرض موسع للمنطقة المربعة في اللوحة أ. تشير الأسهم البيضاء إلى هياكل شبيهة ب TNT بين الخلايا المجاورة. (ج) صور تمثيلية تظهر هياكل شبيهة ب TNT تم تعطيل بعد التعامل غير السليم مع العينات. (د) عرض موسع للمنطقة المربعة في اللوحة C. تشير الأسهم الصفراء إلى هياكل شبيهة ب TNT مضطربة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. التلوين لنقل الميتوكوندريا من الخلايا النجمية إلى الخلايا العصبية عبر TNTs

بذر الخلايا النجمية ووضع العلامات الميتوكوندرية
1. عزلت بذور الخلايا النجمية الأولية للفئران عند الممر 3 (P3) في أطباق زراعة زجاجية بقطر 35 مم بكثافة 3 × 10^{إلى 4} خلايا لكل طبق. أضف 2 مل من DMEM/F-12 الوسط الكامل مع 10٪ FBS و1٪ خليط مضاد حيوي ثلاثي (البنسلين G، الستربتومايسين، والأمفوتريسين B). زراعة الخلايا عند 37°C في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂.
2. حضن الخلايا لمدة تقارب 24 ساعة حتى يحدث الالتصاق.
3. انقل أطباق الزراعة إلى طاولة نظيفة تحت ظروف إضاءة خافتة بعد تثبيت الخلية.
  ملاحظة: تقليل الحركة والاهتزاز غير الضروريين أثناء التعامل للحفاظ على سلامة مادة TNT.
4. أزل وسط الزراعة بلطف تحت ظروف محمية من الضوء. تجنب تعطيل مادة TNT أثناء الإزالة المتوسطة.
  ملاحظة: تجنب الجفاف الكامل لسطح الخلية أثناء إزالة الوسط لأن مادة TNTs قد تنهار وتلتحق بركيزة الزراعة.
5. إعادة تشكيل 50 ميكروغرام من صبغة MitoTracker المحمولة بالليوفيل في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) لتحضير محلول مخزون بحجم 1 ملليمول وتخزين محلول المخزن عند −20°C. قبل الاستخدام، يتم تخفيف محلول المخزون في 400 ميكرولتر من وسط DMEM/F-12 الكامل مع 10٪ FBS و1٪ خليط مضاد حيوي ثلاثي للحصول على تركيز نهائي MitoTracker يبلغ 50 ميكرومول.
  تحذير: حماية الأصباغ الفلورية من التعرض المباشر للضوء أثناء إجراءات التحضير والحضانة.
6. أضف محلول تلوين الميتوكوندريا إلى أطباق الزراعة.
7. حضن الخلايا عند 37°C في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂ لمدة 30 دقيقة تحت ظروف محمية من الضوء.
8. قم بإزالة محلول التلوين الميتوكوندري في ظروف محمية من الضوء.
9. اغسل الخلايا بلطف مرة واحدة ب 500 ميكرولتر من PBS بدون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم (pH 7.3–7.5). أضف وأزل PBS ببطء على طول جدار طبق الزراعة لتجنب تعطيل مادة TNT بين الخلايا أثناء الغسيل.
10. أزل PBS بحذر.
الزراعة المشتركة بين الخلايا النجمية والعصبون
1. خلدت الخلايا العصبية الحصينية للفئران عند المرور 3 (P3) إلى أطباق الزراعة التي تحتوي على الخلايا النجمية بكثافة 3 × 10^خلايا في كل طبق. أضف الخلايا بحجم إجمالي 2 مل يتكون من خليط 1:1 من DMEM وDMEM/F-12 كامل مع 10٪ FBS و1٪ ثلاثي مضادات حيوية. أنشأ الزراعة المشتركة باستخدام طريقة الاتصال المباشر بدون إدخال ترانسويل. زراعة الخلايا عند 37°C في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂.
  ملاحظة: أضف الخلايا العصبية بلطف لتقليل اضطراب البنى الموجودة مسبقا ل TNT.
2. الحفاظ على الزراعة المشتركة لمدة 24 ساعة تحت ظروف الحاضنة القياسية مع حماية العينات من التعرض غير الضروري للضوء أثناء إجراءات التعامل.
التثبيت والنفاذية
1. أزل وسط الزراعة تحت ظروف محمية من الضوء.
2. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.
3. ثبت الخلايا بمحلول تثبيت 4٪ يحتوي على بارافورمالديهايد لمدة 30 دقيقة عند RT تحت ظروف إضاءة خافتة.
  تحذير: التعامل مع المحاليل المثبتة باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وأداء جميع الإجراءات وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية المؤسسية.
4. أزل المحلول المثبت.
5. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.
6. قم بنفاذ الخلايا بسعة 500 ميكرولتر من محلول ترايتون X-100 الجاهز للاستخدام لمدة 20 دقيقة في RT تحت ظروف إضاءة خافتة.
  تحذير: قد يتسبب ترايتون X-100 في تعطيل هياكل TNT الهشة. قلل من التحريك المفرط أثناء النفاذ.
7. قم بإزالة محلول النفاذية.
8. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.
التلوين الفلوري والتصوير
1. جهز محلول التلوين مباشرة قبل الاستخدام. تخفيف صبغة تلوين F-actin في PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 1 ميكرومولار واستخدم DAPI كصبغة نووية جاهزة للاستخدام. اخلط محاليل التلوين جيدا قبل الاستخدام.
  ملاحظة: يمكن استخدام كواشف التلوين القائمة على الفالويدين كبدائل لتصوير F-actin.
2. اخلط محاليل التلوين F-actin والمحاليل النووية بنسبة 1:1 (أحجام متساوية) في ظروف محمية من الضوء مباشرة قبل الاستخدام.
3. أضف محلول التلوين المحضر إلى أطباق الثقافة.
4. حضن الخلايا لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37°C في الظلام.
5. أزل محلول التلوين.
6. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS باستخدام 500 ميكرولتر في كل غسلة لمدة دقيقة واحدة في كل غسلة.
7. أضف 1 مل من PBS لمنع جفاف الخلايا أثناء تحضير التصوير.
8. التقاط الصور باستخدام مجهر كونفوكال مقلوب من نيكون مزود بعدسة ×20 الموضوعية. استخدم إثارة 405 نانومتر لصبغ DAPI، و488 نانومتر لصبغ F-actin، و665 نانومتر لصبغ MitoTracker. التقط صورا بدقة 1024 × 1024 بكسل تحت ظروف محمية من الضوء عند RT.
9. قم بإجراء تقييم نوعي باستخدام خمسة حقول رؤية عشوائية على الأقل لكل عينة. قيم وجود هياكل شبيهة ب TNT وإشارات فلورية مرتبطة بالميتوكوندريا داخل وصلات الغشاء بين الخلايا (الشكلان 2A و 2B).
  ملاحظة: التقط الصور مباشرة بعد التلوين لتقليل فقدان الفلورة والاضطرابات الهيكلية لمادة TNTs.

الشكل 2: تلوين فلوري للميتوكوندريا وTNTs في نظام الزراعة المشتركة بين الخلايا النجمية والخلايا العصبونية. (أ) صور مجهر كونفوكلي تمثيلية تظهر التلوين النووي والميتوكوندريا وأكتين F في الخلايا النجمية والعصبونات التي تزرع في أطباق زراعة قاع زجاجي. أظهرت الخلايا النجمية أشكال غير منتظمة تشبه النجوم أو متعددة الأضلاع مع عمليات خلوية ممتدة، بينما كانت الخلايا العصبية تبدو دائرية أو بيضاوية مع امتدادات رفيعة تشبه العصب العصبي. (ب) عرض موسع للمنطقة المعلبة في اللوحة أ. تشير الأسهم البيضاء إلى هياكل شبيهة ب TNT المرتبطة بالميتوكوندريا بين الخلايا. تم تمييز مجموعتي الخلية بشكل أساسي بناء على شكل الخلية المميز. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

3. التلوين المشترك بالفلورة المناعية للميتوكوندريا والميرو1 في مادة TNTs

بذر الخلايا النجمية ووضع العلامات الميتوكوندرية
1. عزلت بذور الخلايا النجمية الأولية للفئران عند الممر 3 (P3) في أطباق زراعة زجاجية بقطر 35 مم بكثافة 3 × 10^{إلى 4} خلايا لكل طبق. أضف 2 مل من DMEM/F-12 الوسط الكامل مع 10٪ FBS و1٪ خليط مضاد حيوي ثلاثي (البنسلين G، الستربتومايسين، والأمفوتريسين B). زراعة الخلايا عند 37°C في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂.
2. حضن الخلايا لمدة تقارب 24 ساعة حتى يحدث الالتصاق.
3. انقل أطباق الزراعة إلى طاولة نظيفة تحت ظروف إضاءة خافتة بعد تثبيت الخلية.
  ملاحظة: تقليل الحركة والاهتزاز غير الضروريين أثناء التعامل للحفاظ على سلامة مادة TNT.
4. أزل وسط الزراعة بلطف تحت ظروف محمية من الضوء. تجنب تعطيل مادة TNT أثناء الإزالة المتوسطة.
  ملاحظة: تجنب الجفاف الكامل لسطح الخلية أثناء إزالة الوسط لأن مادة TNTs قد تنهار وتلتحق بركيزة الزراعة.
5. إعادة تشكيل 50 ميكروغرام من صبغة MitoTracker المحمولة بالليوفيل في DMSO لتحضير محلول مخزون بحجم 1 مللي مولار وتخزين محلول المخزون عند −20°C. قبل الاستخدام، يتم تخفيف محلول المخزون في 400 ميكرولتر من وسط DMEM/F-12 الكامل مع 10٪ FBS و1٪ خليط مضاد حيوي ثلاثي للحصول على تركيز نهائي MitoTracker يبلغ 50 ميكرومول.
  تحذير: حماية الأصباغ الفلورية من التعرض المباشر للضوء أثناء إجراءات التحضير والحضانة.
6. أضف محلول تلوين الميتوكوندريا إلى أطباق الزراعة.
7. حضن الخلايا عند 37°C في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂ لمدة 30 دقيقة تحت ظروف محمية من الضوء.
8. قم بإزالة محلول التلوين الميتوكوندري في ظروف محمية من الضوء.
9. اغسل الخلايا بلطف مرة واحدة ب 500 ميكرولتر من PBS بدون أيونات الكالسيوم والمغنيسيوم (pH 7.3–7.5). أضف وأزل PBS ببطء على طول جدار طبق الزراعة لتجنب تعطيل مادة TNT بين الخلايا أثناء الغسيل.
10. أزل PBS بحذر.
الزراعة المشتركة بين الخلايا النجمية والعصبون
1. خلدت الخلايا العصبية الحصينية للفئران عند المرور 3 (P3) إلى أطباق الزراعة التي تحتوي على الخلايا النجمية بكثافة 3 × 10^خلايا في كل طبق. أضف الخلايا بحجم إجمالي 2 مل يتكون من خليط 1:1 من DMEM وDMEM/F-12 كامل مع 10٪ FBS و1٪ ثلاثي مضادات حيوية. أنشأ الزراعة المشتركة باستخدام طريقة الاتصال المباشر بدون إدخال ترانسويل. زراعة الخلايا عند 37°C في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ CO₂.
  ملاحظة: أضف الخلايا العصبية بلطف لتقليل اضطراب البنى الموجودة مسبقا ل TNT.
2. الحفاظ على الزراعة المشتركة لمدة 24 ساعة تحت ظروف الحاضنة القياسية مع حماية العينات من التعرض غير الضروري للضوء أثناء إجراءات التعامل.
التثبيت والنفاذية
1. أزل وسط الزراعة تحت ظروف محمية من الضوء.
2. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.
3. ثبت الخلايا بمحلول تجاري بنسبة 4٪ يحتوي على بارافورمالديهايد (درجة الحموضة 7.2–7.4) لمدة 30 دقيقة عند RT تحت ظروف إضاءة خافتة.
  تحذير: التعامل مع المحاليل المثبتة باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة وأداء جميع الإجراءات وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية المؤسسية.
4. أزل المحلول المثبت.
5. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.
6. قم بنفاذ الخلايا بسعة 500 ميكرولتر من محلول ترايتون X-100 الجاهز للاستخدام لمدة 20 دقيقة في RT تحت ظروف إضاءة خافتة.
  تحذير: قد يتسبب ترايتون X-100 في تعطيل هياكل TNT الهشة. قلل من التحريك المفرط أثناء النفاذ.
7. قم بإزالة محلول النفاذية.
8. اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.
الحجب والتلوين بالفلورة المناعية
1. قم بإغلاق الخلايا بمصل ماعز بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة في RT تحت ظروف إضاءة خافتة. حضر محلول الانسداد عن طريق تخفيف مصل الماعز بمقدار 1:20 في PBS.
2. أزل محلول الانسداد.
3. تخفيف الأجسام المضادة وحيدة النسيلة لميرو1 في PBS بنسبة تخفيف 1:100. أضف محلول الأجسام المضادة الأولية المخفف إلى أطباق الزراعة وحضن المحلول طوال الليل (12–16 ساعة) عند 4 درجات مئوية.
  ملاحظة: احم العينات الموسومة بالفلورية من التعرض المباشر للضوء طوال عملية التلوين.
4. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي.
5. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS باستخدام 500 ميكرولتر في كل غسلة لمدة دقيقة واحدة في كل غسلة.
6. قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي IgG المضاد للأرانب الفلوري في PBS بنسبة تخفيف 1:100. أضف 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية المخفف إلى كل طبق زراعة واحتضن لمدة ساعة واحدة تحت ظروف محمية من الضوء.
  ملاحظة: لم يتم تضمين أي ضابط عدم وجود أجسام مضادة أولية في هذه الدراسة. يجب أن تتضمن التجارب المستقبلية ضوابط مناسبة للتألق المناعي لضمان تحديد خصوصية التلوين.
7. إزالة محلول الأجسام المضادة الثانوية الفلورية.
التلوين المضاد بالفلورسنت والتصوير
1. جهز محلول التلوين مباشرة قبل الاستخدام. تخفيف صبغة تلوين F-actin في PBS إلى تركيز نهائي يبلغ 1 ميكرومولار واستخدم DAPI كصبغة نووية جاهزة للاستخدام. اخلط محاليل التلوين جيدا قبل الاستخدام.
  ملاحظة: يمكن استخدام كواشف التلوين القائمة على الفالويدين كبدائل لتصوير F-actin.
2. أضف محلول التلوين إلى أطباق الزراعة.
3. حضن الخلايا لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37°C في الظلام.
4. أزل محلول التلوين.
5. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS باستخدام 500 ميكرولتر في كل غسلة لمدة دقيقة واحدة في كل غسلة.
6. أضف 1 مل من PBS لمنع جفاف الخلايا أثناء تحضير التصوير.
7. التقاط الصور باستخدام مجهر كونفوكال مقلوب من نيكون مزود بعدسة ×20 الموضوعية. جمع صور مكدس Z باستخدام حجم خطوة 5 ميكرومتر على نطاق تصوير إجمالي يبلغ 40 ميكرومتر (8 مقاطع بصرية). استخدم إثارة 405 نانومتر لصبغ DAPI، و488 نانومتر لصبغ F-actin، و594 نانومتر لصبغ المناعة ب Miro1، و665 نانومتر لصبغ MitoTracker. التقط صورا بدقة 1024 × 1024 بكسل تحت ظروف محمية من الضوء عند RT.
8. قم بإجراء تقييم نوعي باستخدام خمسة حقول رؤية عشوائية على الأقل لكل عينة. تقييم البنى الشبيهة ب TNT، وإشارات الفلورة المرتبطة بالميتوكوندريا، والتزامن الظاهري بين الميرو1 والتلوين المرتبط بالميتوكوندريا داخل الوصلات الغشية بين الخلايا (الشكل 3A–3C).
  ملاحظة: التقط الصور مباشرة بعد التلوين لتقليل فقدان الفلورة والاضطرابات الهيكلية لمادة TNTs.

الشكل 3: تلوين التداخل بين الميتوكوندريا والميرو1 في TNTs في نظام الزراعة المشتركة بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية. (أ) صور مجهر كونفوكلي تمثيلية تظهر تلوين نووي، ميتوكوندري، ميرو1، وF-أكتين في الخلايا النجمية والعصبونات المزروعة في أطباق زراعة قاع زجاجي. تشير الأسهم البيضاء إلى مناطق من التداخل الظاهري بين الإشارات المرتبطة بالميتوكوندريا وMiro1 داخل هياكل شبيهة ب TNT. (B) صورة ثلاثية الأبعاد معاد بناؤها على شكل Z-stack تظهر هياكل شبيهة ب TNT تتكون بين الخلايا المجاورة. (ج) إعادة بناء جانبية لنفس صورة مكدس Z تظهر هياكل شبيهة ب TNT تمتد بين الخلايا المجاورة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في تحضيرات زراعة الخلايا النجمية، لوحظت نتوءات أغشية رقيقة تربط الخلايا المجاورة بعد تلوين F-actin والنواة (الشكلان 1A و1B). تم اكتشاف عدة هياكل شبيهة ب TNT تمتد بين الخلايا النجمية المجاورة، وغالبا ما تكون الخلايا النجمية الفردية تتشكل اتصالات مع عدة خلايا محيطة. كان الحفاظ الناجح على هياكل شبيهة ب TNT مرتبطا بالتعامل اللطيف أثناء عمليات الغسيل والتثبيت. أدى الاضطراب الميكانيكي المفرط أثناء إزالة الوسط أو غسله إلى تقليل قابلية الكشف وتعطيل هيكلي لهذه الاتصالات الغشائية، كما يظهر في الهياكل الشبيهة ب TNT التي تعطلت بعد التعامل غير الصحيح مع العينات (الشكلان 1C و1D).

في تحضيرات الزراعة المشتركة بين الخلايا النجمية، لوحظت إشارات الفلورة المرتبطة بالميتوكوندريا داخل هياكل شبيهة ب TNT تربط الخلايا المجاورة بعد تلوين MitoTracker والتصوير الكونفوكال (الشكلان 2A و2B). تم تصور هذه الهياكل مع التلوين بفيتامين أكتين والنووي لدعم التقييم الشكلية للوصلات الشبيهة ب TNT. حسن الحماية الصحيحة للضوء وتقليل شدة الغسيل الحفاظ على إشارة الفلورة وشكل TNT أثناء التحضير للتصوير.

في تجارب التزامن مع التألق المناعي، لوحظت إشارات فلورية متداخلة تتوافق مع التلوين المرتبط بالميتوكوندريا وتلوين المناعة ب Miro1 داخل هياكل شبيهة ب TNT في تحضيرات الزراعة المشتركة بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية (الشكل 3A). تشير هذه الملاحظات إلى وجود ارتباط محتمل بين ميرو1 والميتوكوندريا موضعية داخل هياكل شبيهة ب TNT. دعم التصوير ثلاثي الأبعاد المعاد بناؤه بتقنية Z-stack وجود هياكل شبيهة ب TNT الممتدة بين الخلايا المجاورة (الشكلين 3B و 3C). تأثرت ظروف التثبيت والنفاذية والتصوير بحفظ TNT، وشدة إشارة الفلورة، وجودة الصورة.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوة الحرجة الأولى في البروتوكول التجريبي الموصوف أعلاه هي المعالجة المبدئية المحمية بالضوء قبل التثبيت. الهياكل الشبيهة ب TNT شديدة الهشاشة، والحفاظ على ظروف محمية من الضوء بعد إزالتها من الحاضنة مهم للحفاظ على شدة إشارة الفلورة والسلامة الهيكلية أثناء تحضير العينة. الخطوة الثانية الحاسمة هي إجراء غسل PBS مع التلاعب اللطيف لتقليل اضطراب الهياكل الشبيهة ب TNT الناتج عن تدفق السوائل. يساعد الالتزام بهذه الإجراءات الرئيسية في الحفاظ على شكل وثبات البنى الشبيهة ب TNT ويحسن من اتساق نتائج التصوير اللاحقة. قد يؤدي الاستنشاق المفرط، أو الغسل المطول، أو تحريك السائل القوي إلى انهيار أو تجزئة هياكل شبيهة ب TNT أثناء معالجة العينة. نظرا لطبيعتها الديناميكية العالية، فإن TNTs حساسة للضوء. يمكن أن تسبب السمية الضوئية الناتجة عن التعرض للضوء اضطرابا ل TNT، مما يجعل من الصعب تصور هذه البنى¹¹. لذلك، يجب الحفاظ على ظروف محمية من الضوء أثناء التجارب المتعلقة ب TNT.

تساهم حركة الميتوكوندريا داخل الخلايا في توزيع الطاقة الخلوية، خاصة في الخلايا العصبية. أظهرت الدراسات أن الميتوكوندريا يمكنها التحرك على طول خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة¹². كما أظهرت الدراسات الحديثة أن TNTs يمكن أن تعمل كهياكل اتصال خلوية طويلة المدى مرتبطة بنقل الميتوكوندريا بين الخلايا^{العصبية 13}. النهج المنهجي الموضح في هذه الدراسة يتيح تصور هياكل شبيهة ب TNT وإشارات الفلورة المرتبطة بالميتوكوندريا في أنظمة زراعة الخلايا العصبية. أظهرت دراسات سابقة أن نقل الميتوكوندريا بين الخلايا العصبية قد يساهم في إصلاح الأنسجة والعمليات الواقية العصبية في الاضطرابات العصبية مثل مرض باركنسون والإصابة الإقفارية الدماغية¹⁴^،¹⁵. باستخدام الطرق الموضحة في هذه الدراسة، لوحظت هياكل شبيهة ب TNT بين الخلايا النجمية وبين الخلايا النجمية والعصبونات، إلى جانب إشارات فلورية مرتبطة بالميتوكوندريا موضعة داخل هذه الهياكل.

كما ذكر في الدراسات^{السابقة 10}، فإن صبغة MitoTracker عرضة لتسرب الصبغة ونقل الإشارة غير الميتوكوندرية، مما قد يقلل من موثوقية البيانات. ولمعالجة هذا القيد، يجب أن تستخدم التحقيقات المستقبلية طرقا أكثر قوة، مثل وضع العلامات الميتوكوندرية المشفرة وراثيا، للحصول على نتائج أكثر حسما. في ظل الظروف التجريبية الحالية، تم التمييز بين نوعي الخلايا بشكل أساسي بناء على شكل الخلية، وهو نهج قد يقلل من خصوصية تحديد نوع الخلية. يجب أن تتضمن الدراسات المستقبلية وسم فلوري خاص بنوع الخلية لتحسين دقة تحليل الزراعة المشتركة. ميرو1 هو بروتين محول متمركز في الغشاء الخارجي للميتوكوندريا وقد تم الارتباط به في عمليات نقل الميتوكوندريا في الخلايا العصبية^16,17. باستخدام بروتوكول التموضعي المشترك للفلورة المناعية الموضح في هذه الدراسة، لوحظت إشارات فلورية متداخلة تتوافق مع التلوين المرتبط بالميتوكوندريا وتلوين المناعة ب Miro1 داخل هياكل شبيهة ب TNT. تشير هذه الملاحظات إلى وجود ارتباط محتمل بين ميرو1 والميتوكوندريا موضعية داخل هياكل شبيهة ب TNT. ومع ذلك، قد يحد الدقة المكانية للمجهر الكونفوكالي التقليدي من التقييم الحاسم للتوطين الجزيئي داخل نتوءات غشاء رقيقة.

قمنا بتصوير Z-stack لتأكيد وجود هياكل شبيهة ب TNT بين الخلايا، مما دعم التحقق الهيكلي لهذه الاتصالات الغشائية. بينما البروتوكول الحالي مناسب لمعظم البيئات التجريبية، قد يؤدي التصوير الكونفوكالي للخلايا الثابتة إلى فقدان هياكل هشة شبيهة ب TNT أثناء معالجة العينات مقارنة بالتصوير بالخلايا الحية، مما يحد من القياس الدقيق ل TNT¹⁸. علاوة على ذلك، لا يسمح تصوير الخلايا الثابتة بتحديد اتجاه انتقال الميتوكوندريا بشكل واضح وواضح، مما يستدعي المزيد من البحث في الدراسات المستقبلية. يوفر هذا البروتوكول سير عمل تجريبي موحد لتلوين هياكل شبيهة ب TNT، والإشارات المرتبطة بالميتوكوندريا، والبروتينات ذات الصلة في أنظمة زراعة الخلايا العصبية. مقارنة بإجراءات الغسل والتثبيت غير المنضبطة، يركز البروتوكول على التعامل اللطيف مع العينات والحفاظ على الفلورة أثناء التحضير للتصوير. قد تساعد هذه الطرق في تحسين الاتساق التجريبي وقابلية التكرار في دراسات التصوير المتعلقة ب TNT.

باختصار، توفر هذه الدراسة بروتوكولا مختبرا عمليا وواسع التطبيق للتقييم النوعي لمادة TNTs ودراسة نقل الميتوكوندريا عبر هياكل شبيهة ب TNT. ومع ذلك، قد تؤدي خطوات معالجة العينات مثل التثبيت والغسل إلى تباين في القياس مقارنة بأساليب التصوير بالخلايا الحية. علاوة على ذلك، يوفر المجهر الكونفوكلي دقة مكانية أقل من المجهر فائق الدقة، مما يحد من التوصيف الهيكلي التفصيلي لمادة TNTs. بالإضافة إلى ذلك، يتأثر التلوين الميتوكوندري المعتمد على MitoTracker بتسرب الصبغة ونقل الإشارة غير النوعية، ويجب معالجة ذلك في الدراسات المستقبلية لتحسين دقة التجريب.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه لا توجد لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82260650)؛ مشروع مؤسسة العلوم الطبيعية لمنطقة منغوليا الداخلية ذاتية الحكم (2025MS08067)؛ برنامج تدريب طلاب الكلية على الابتكار وريادة الأعمال في كلية الطب باوتو (S202510130008)؛ مشروع برنامج براعم الزهور في كلية الطب باوتو (HLJH202529) ومشاريع أبحاث كلية الطب في باوتو لتنمية الصحة العامة والطب الوقائي من الدرجة الأولى (GWGG-20250807).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
1% triple antibiotic mixture	Biosharp	BL142A	يمنع التلوث البكتيري والفطري أثناء زراعة الخلايا
4% Tissue Cell Fixative	Solarbio	P1110	عامل تثبيت الخلايا
Anti-Miro1 antibody	Abcam	AB319154	الجسم المضاد الأساسي ضد Miro1
Astrocytes	Laboratory-isolated primary cells	NA	تم عزل الخلايا النجمية من القشرة الدماغية لجيف SD حديثي الولادة بعمر 1–3 أيام. تم تأكيد نقاء الخلايا المعزولة ليكون >95% عن طريق تلوين GFAP، وتم استخدام الخلايا من الممر 3 (P3) لجميع التجارب
Astrocyte cell culture medium medium (DMEM/F-12)	Gibco	6125011	تم خلط DMEM و F-12 بنسبة 1:1 (v/v)، مضافًا إليها 10% مصل بقري جنيني (FBS) و 1% مضادات حيوية ثلاثية
Confocal microscope	Nikon AX	ECLIPSE TI2-E	تم الحصول على الصور باستخدام مجهر Nikon AX المجسم (Nikon Corporation، اليابان) المتحكم فيه بواسطة NIS-Elements (الإصدار 5.4)
DAPI	Servicebio	G1012-100ML	صبغة تلوين النواة
DMSO	BioFroxx	1084ML100	المذيب المستخدم في تحضير محاليل مخزون الأصباغ الفلورية
F-actin staining dye	Thermo Fisher Scientific	A57243	عامل تلوين F-actin لتصور الهياكل الهيكلية الخلوية والأنابيب النانوية الأنبوبية
Fetal bovine serum	ExCell Bio	FSD500	يوفر العناصر الغذائية الأساسية لزراعة الخلايا
Fluorescent secondary antibody (Goat Anti-Rabbit IgG)	ABclonal	AS039	الجسم المضاد الثانوي لتلوين المناعة الفلورية
Glass-bottom cell culture dish	NEST	801001	طبق تصوير لعلم الأحياء المجهرية المجسم
Goat serum	Solarbio	210C051	عامل حجب لتلوين المناعة الفلورية
MitoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	M22426	صبغة تلوين الميتوكوندريا
Neurons	Cell Bank of CAS	HT22-GNM47	تم الحفاظ على الخلايا العصبية المخية الفئران الخلودية في وسط DMEM كامل. تم جمع الخلايا في الممر 3 (P3) واستخدامها للتجارب اللاحقة.
Neuron cell culture medium (DMEM)	Servicebio	G4511-500ML	DMEM مضافًا إليها GlutaPlus وصودا البيروفات، بدون HEPES، مضافًا إليها 10% مصل بقري جنيني (FBS) و 1% مضادات حيوية ثلاثية
Phosphate-buffered saline (PBS)	Servicebio	G4203-500ML	محلول الغسل المستخدم أثناء التثبيت والتلوين
Triton X-100	Solarbio	P1080	عامل اختراق الخلايا

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Miro1

التصوير الموحد بالفلورية المناعية لأنابيب النانو النفقية ونقل الميتوكوندريا بين الخلايا النجمية والعصبونات

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة