يزيد FTY720 من حساسية الدوكسوروبيسين في خلايا سرطان الدم النخاعي الحاد المقاومة

ملخص

يقيم هذا البروتوكول كيف يزيد FTY720 من حساسية الدوكسوروبيسين في خلايا سرطان الدم النخاعي الحاد المقاوم من خلال تقييم قدرة الخلايا، والموت المبرمج، وتراكم الدوكسوروبيسين داخل الخلية، وتعبير ناقل تدفق الأدوية، والهدف الآلي لإشارات راباميسين.

الملخص

تظل المقاومة الكيميائية حاجزا رئيسيا أمام العلاج الفعال لسرطان الدم النخاعي الحاد، جزئيا لأن خلايا اللوكيميا المقاومة تقلل من التعرض للأدوية داخل الخلية وتتجنب الاستماتة المبرمجة. أفادت FTY720، وهي معدل مستقبلات الفوجوسين-1-فوسفات، بنشاط مضاد للتكاثر وتحسس كيميائي في عدة نماذج أورامية. ومع ذلك، لا يزال غير محدد بشكل كاف ما إذا كان FTY720 يزيد من حساسية الدوكسوروبيسين في خلايا سرطان الدم النخاعي الحادة المقاومة للدوكسوروبيسين، وما إذا كان هذا التأثير مرتبطا بتغيرات في ناقلات تدفق الأدوية والهدف الآلي لإشارات الراباميسين باستخدام كيناز البروتين B/الهدف الميكانيكي لإشارات الراباميسين. قيمت هذه الدراسة تأثيرات FTY720 وحده ومع الدوكسوروبيسين في خطوط خلايا سرطان الدم النخاعي الحاد لدى الوالدين (HL60 و K562) ومشتقاتها المقاومة للدوكسوروبيسين (HL60/A و K562/A). تم تقييم فعالية الخلايا باستخدام اختبارات Cell Counting Kit-8، وتم قياس الاستماتة المبرمجة بواسطة قياس تدفق خلوي Annexin V/يوديد البروبيديوم، وتم قياس تراكم دوكسوروبيسين داخل الخلايا بواسطة قياس تدفق الخلايا الخلوي، وتم فحص بروتين P-glycoprotein، وهو بروتين 1 المرتبط بالمقاومة متعددة الأدوية، وكيناز البروتين B/الهدف الميكانيكي لبروتينات مسار الراباميسين، وبروتينات مرتبطة بالموت المبرمج باستخدام قياس تدفق الخلايا وتحليل الغرب. أظهر اختبار FTY720 تسمم خلوي معتمد على الجرعة وزيادة في حساسية الدوكسوروبيسين في خلايا اللوكيميا المقاومة. أدى العلاج المشترك إلى تقليل قدرة الحيوانات، وزيادة كسور الخلايا المايتة، وتعزيز تراكم الدوكسوروبيسين داخل الخلية، وتقليل تعبير بروتين P الجليكوبروتين المرتبط بالمقاومة متعددة الأدوية 1. كما ارتبط علاج FTY720 بانخفاض فسفرة بروتين كيناز B والهدف الآلي للراباميسين، بينما عكس منشط كيناز البروتين B SC79 جزئيا التغيرات الملحوظة في الإشارات، وتعبير الناقل، والموت المبرمج. تشير هذه النتائج إلى أن FTY720 يزيد من حساسية الدوكسوروبيسين في خلايا HL60/A وK562/A، وأن هذا التأثير مرتبط بانخفاض كيناز البروتين B/الهدف الميكانيكي لإشارات الراباميسين، وانخفاض تعبير ناقلات تدفق الأدوية، وزيادة تراكم الدوكسوروبيسين داخل الخلية، وزيادة الاستماتة المبرمجة. نظرا لأن هذه الدراسة كانت محدودة بنماذج خط الخلايا المختبرية ، فإن هناك حاجة لمزيد من التحقق في عينات اللوكيميا الأولية وأنظمة الجسم الحي قبل استخلاص استنتاجات علاجية.

المقدمة

سرطان الدم النخاعي الحاد هو ورم دموي خبيث غير متجانس ينشأ من التحول الخبيث لخلايا الجذع المكونة للدم والخلايا السلفية. يعد هذا النوع الأكثر شيوعا من سرطان الدم الحاد لدى البالغين ولا يزال مرتبطا بضعف البقاء على قيد الحياة على المدى الطويل. على الرغم من تحسن استراتيجيات العلاج، يظل العلاج الكيميائي التحريضي المعتمد على السيتارابين مع الأنثراسيكلين حجر الزاوية في العلاج. ومع ذلك، يطور العديد من المرضى مقاومة أولية أو مكتسبة، مما يؤدي إلى انتكاس، ومرض مقاوم للعلاج، ونتائج سريرية ضعيفة ^1,2,3. لذلك، يظل فهم الآليات التي تقلل من حساسية الدوكسوروبيسين هدفا مهما في أبحاث سرطان الدم النخاعي الحاد.

مقاومة الدوكسوروبيسين هي عملية متعددة العوامل. يمكن لخلايا اللوكيميا المقاومة تقليل التعرض للأدوية داخل الخلية من خلال زيادة التعبير أو النشاط لناقلات تدفق الأدوية المرتبطة بالأدينوزين ثلاثي الفوسفات، بما في ذلك P-glycoprotein المشفر بواسطة العضو B من العائلة الفرعية B للكاسيت المرتبط بالأدينوسين ثلاثي الفوسفات، والبروتين 1 المرتبط بالمقاومة متعددة الأدوية، المشفر بواسطة العضو الفرعي C من العائلة C المرتبطة بالأدينوسين ثلاثي الفوسفات. تنشيط إنزيم كيناز البروتين B والهدف الآلي لإشارات الراباميسين يمكن أن يعزز أيضا بقاء خلايا اللوكيميا، ويثبط الاستماتة المبرمجة، ويساهم في مقاومة العلاج⁵. معا، تقلل هذه الآليات من تراكم دوكسوروبيسين داخل الخلايا وتقلل من فعالية السموم الخلوية. كان الاستهداف الدوائي المباشر للناقلات متعددة المقاومة للأدوية تحديا بسبب السمية، والفعالية المحدودة، وآليات المقاومة التعويضية⁶. وبالمثل، تواجه مثبطات بروتين كيناز B والهدف الميكانيكي لإشارات الراباميسين تحديات ترجمية تتعلق بالسمية المعتمدة على الجرعة، والفعالية المحدودة، وتكيف المسارات ^7,8.

FTY720، المعروف أيضا باسم فينغوليمود، هو معدل مستقبلات سفينغوزين-1-فوسفات معتمد من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية لعلاج التصلب المتعدد، وقد جذب الاهتمام كعامل محتمل لمكافحة السرطان⁹. بعيدا عن نشاطه المناعي، أظهر FTY720 تأثيرات مضادة للتكاثر، وبروابوبتوزيك، وحساسة للعلاج في عدة نماذج أورام قبل سريرية، بما في ذلك سرطان البروستاتا، وسرطان الخلايا الكبدية، وسرطان الرئة، وسرطان القولون، والورم النخاعي المتعدد، وسرطان الثدي، وسرطان المبيض، واللوكيميا، واللمفوما، والورم الأرومي الدبقي 10,11,12,13,14,15,16^{, 17، 18، 19}. أظهرت دراسات سابقة أن FTY720 يمكن أن يعزز نشاط دوكسوروبيسين في سرطان الثدي، ويزيد من حساسية السيسبلاتين في خلايا سرطان الرئة غير الصغيرة المقاومة للسيسبلاتين، ويعيد تحسيس خلايا الميلانوما المقاومة للسيسبلاتين من خلال تعديل إشارات الفوسفينوسيتيد 3-كيناز^20,21,22. تشير هذه النتائج إلى أن FTY720 قد يؤثر على كل من إشارات البقاء وآليات الاحتفاظ بالأدوية في الخلايا السرطانية المقاومة. ومع ذلك، لا يزال غير محدد بشكل كاف ما إذا كان FTY720 يزيد من حساسية الدوكسوروبيسين في خلايا سرطان الدم النخاعي الحاد المقاوم للدوكسوروبيسين، وما إذا كان هذا التأثير مرتبطا بالتغيرات المنسقة في تراكم دوكسوروبيسين داخل الخلية، وتعبير ناقل تدفق الأدوية، والموت المبرمج، وهدف كيناز البروتين B/الهدف الميكانيكي لإشارات الراباميسين.

تم تصميم هذه الدراسة لسد هذه الفجوة باستخدام نماذج خلايا سرطان الدم النخاعي الحادة المقاومة للدوكسوروبيسين HL60/A وK562/A، إلى جانب نظيراتها من الآباء. تم افتراض أن FTY720 قد يزيد من حساسية دوكسوروبيسين من خلال تقليل تعبير ناقل تدفق الأدوية، وزيادة تراكم الدوكسوروبيسين داخل الخلية، وتعزيز الاستماتة المبرمجة، مع تضمين إشارة كيناز البروتين B/الهدف الميكانيكي لإشارات الراباميسين كمسار تنظيمي مرتبط. لتقييم هذه الفرضية، تم تقييم قدرة الخلايا، وقيم تركيز التثبيط نصف الأقصى، والموت المبرمج، وتراكم دوكسروبيسين داخل الخلية، وتعبير الناقل، وتغيرات البروتين الإشارة بعد العلاج ب FTY720 وحده أو مع دوكسوروبيسين. نظرا لأن جميع التجارب أجريت في نماذج خطوط الخلايا، فيتم تفسير النتائج كدليل ميكانيكي في المختبرات وليس كدليل مباشر على الفعالية السريرية.

البروتوكول

أجريت هذه الدراسة باستخدام خطوط خلايا سرطان الدم النخاعي الحاد البشري ومشتقاتها المقاومة للدوكسوروبيسين. لم يشارك أي من البشر أو الحيوانات أو العينات الأولية المستخلصة من المرضى. لذلك، لم تكن هناك حاجة لموافقة لجنة المراجعة المؤسسية للأبحاث البشرية والموافقة على أخلاقيات الحيوانات. تم الحصول على خطوط الخلايا من معهد أمراض الدم، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية، تيانجين، الصين، وتم الحفاظ عليها في معهد فوجيان لأمراض الدم، مستشفى الاتحاد بجامعة فوجيان الطبية. تم تأكيد هوية الخلية من خلال التقييم الكاريوتايبي والشكل قبل التجربة، وتم اختبار جميع المزارع الخلوية للكشف عن تلوث الميكوبلازما. المواد الكيميائية والمعدات والبرمجيات المستخدمة في البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. زراعة الخلايا وتأكيد النمط المقاوم

تم الحصول على خلايا سرطان الدم النخاعي الحادة HL60 وK562 البشرية ومشتقاتها المقاومة للدوكسوروبيسين، HL60/A وK562/A، من معهد أمراض الدم في الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية، تيانجين، الصين. تم زراعة الخلايا في وسط معهد روزويل بارك التذكاري لعام 1640 مع إضافة 10٪ مصل بقري جنيني و1٪ بنسلين-ستربتوميسين عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

تم الحفاظ على خلايا HL60/A في وسط كامل يحتوي على 1 ميكروغرام/مل دوكسوروبيسين، وتم الحفاظ على خلايا K562/A في وسط كامل يحتوي على 5 ميكروغرام/مل دوكسوروبيسين للحفاظ على النمط الظاهري المقاوم. تمت إزالة دوكسوروباسين من وسط الزراعة قبل شهر من الاختبارات التجريبية لتجنب التأثيرات الحادة على اختيار الأدوية أثناء اختبارات العلاج.

قبل التجارب، تم إعادة تأكيد النمط الظاهري المقاوم من خلال مقارنة قيم تركيز دوكسوروبيسين نصف الحد الأقصى بين الخلايا الأبوية والخلايا المقاومة. تم تقييم استقرار المقاومة بعد شهر واحد من الزراعة الخالية من الأدوية من خلال تكرار اختبار حساسية الدوكسوروبيسين وفحص تعبير بروتين P الأساسيي والبروتين المرتبط بالمقاومة متعددة الأدوية 1. استخدمت المزارع في التجارب فقط عندما احتفظت المشتقات المقاومة بقيم تركيز أعلى من الدوكسوروبيسين نصف الحد الأقصى للمثبطات وتعبير أعلى عن ناقلات مقارنة بنظيراتها الأبوية.

2. تصميم تحضير وعلاج الأدوية

تم تجهيز FTY720، ودوكسوروبيسين، وSC79 كحلول مخزونية وفقا لتعليمات المصنعين. تم إذابة FTY720 وSC79 في ثنائي ميثيل كبريتسايد، وتم تحضير دوكسوروبيسين في المذيب الموصى به وحمايته من الضوء أثناء التعامل. تم تخفيف المحاليل العاملة حديثا في وسط الزراعة الكاملة قبل المعالجة. تم الحفاظ على تركيز كبريتات ثنائي ميثيل النهائي متطابقا عبر مجموعات العلاج ولم يتجاوز 0.1٪.

تلقت مجموعات المركبات الضابطة نفس التركيز النهائي لثنائي ميثيل كبريتسيد كبريتيد مثل مجموعات المعالجة المقابلة. في تجارب المعالجة المركبة، تم استخدام تركيز 5 ميكرومولار FTY720 كتركيز تحسيس. تم استخدام دوكسوروبيسين عند 4 ميكرومولار لخلايا HL60/A و8 ميكرومولار لخلايا K562/A في اختبارات الاستماتة وتراكم الدوكسوروبيسين داخل الخلية، ما لم يذكر خلاف ذلك.

3. اختبار بقاء الخلايا وحساب التركيز المثبط نصف الحد الأقصى

تم زرع الخلايا في صفائح بسعة 96 بئر بحجم 1 ×^{10 إلى 4} خلايا في كل بئر في وسط كامل بسعة 100 ميكرولتر. في اختبار FTY720 على دواء واحد، تم علاج خلايا HL60 وK562 وHL60/A وK562/A بجرعات 0، 3.125، 6.25، 12.5، 25، 50، و100 ميكرومولار FTY720 لمدة 48 ساعة. لاختبار حساسية الدوكسوروبيسين، تم علاج خلايا HL60/A وK562/A بتركيزات متسلسلة من دوكسوروبيسين في وجود أو غياب 5 ميكرومولار FTY720 لمدة 48 ساعة.

تم قياس صلاحية الخلايا باستخدام اختبار Cell Counting Kit-8 وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. بعد المعالجة، أضيف كاشف مجموعة عد الخلايا 8 إلى كل بئر، وتم حضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. تم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ ميكروبلايت.

تم حساب قابلية البقاء النسبية للخلايا كما يلي: قابلية البقاء النسبية للخلايا = [(امتصاص الآبار المعالجة - امتصاص الآبار الفارغة) / (امتصاص آبار التحكم بالمركبات - امتصاص الآبار الفارغة)] × 100٪

تم حساب قيم تركيز التثبيط نصف القصوى باستخدام الانحدار غير الخطي باستخدام نموذج جرعة-استجابة لوجستية مكون من أربعة معلمات في منشور GraphPad الإصدار 9.5. تضمنت كل تجربة ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة، مع ثلاثة آبار تقنية لكل حالة علاج.

4. تحليل تركيب الأدوية

تم تقييم تأثيرات FTY720 على حساسية دوكسوروبيسين من خلال مقارنة علاقات جرعة واستجابة دوكسوروبيسين في وجود أو غياب FTY720. تمت معالجة خلايا HL60/A وK562/A بتركيزات متسلسلة من دوكسوروبيسين وحده أو دوكسوروبيسين مع FTY720 لمدة 48 ساعة.

تم تقييم بقاء الخلايا باستخدام اختبار مجموعة عد الخلايا 8، وتم حساب قيم تركيز نصف الحد الأقصى باستخدام الانحدار غير الخطي مع نموذج جرعة-استجابة لوجستي مكون من أربعة معلمات. تم تفسير التغيرات في حساسية الدوكسوروبيسين بناء على تحولات منحنيات الجرعة-الاستجابة والاختلافات في قيم تركيز المثبط نصف الحد الأقصى بين مجموعات العلاج.

نظرا لأن التجارب لم تصمم كدراسة كاملة بنسبة ثابتة على مصفوفة الجرعة، لم يتم إجراء تحليل رسمي لمؤشر التركيبات. لذلك، فسرت النتائج كدليل على تغير حساسية الدوكسوروبيسين بدلا من التآزر الدوائي الحاسم.

5. تحليل الاستماتة المبرمجة بواسطة Annexin V وقياس تدفق يوديد البروبيديوم

تم زرع خلايا HL60/A وK562/A في صفائح ذات 6 آبار عند 4 × 10⁵ خلايا/مل، وعالجت لمدة 48 ساعة باستخدام المركبة، FTY720 فقط، دوكسوروبيسين وحده، أو دوكسوروبيسين مع FTY720. للمعالجة المركبة، تم دمج 5 ميكرومولار FTY720 مع 4 ميكرومولار دوكسوروبيسين في خلايا HL60/A أو 8 ميكرومولار دوكسوروبيسين في خلايا K562/A.

بعد العلاج، تم جمع الخلايا، بما في ذلك الخلايا المعلقة في وسط الزراعة، وغسلها مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد. تم إعادة تعليق الخلايا في مخزن ربط Annexin V بالتركيز الموصى به من قبل مصنع مجموعة كشف الاستماتة المبرمجة. تم صبغ كل عينة ب 5 ميكرولتر من Annexin V-فلوريساين إيزوثيوسيانات أو Annexin V-ألوفيكوسيانين ويوديد 5 ميكرولتر بروبيديوم، تلاها الحضانة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.

تم تحليل العينات فورا بواسطة قياس تدفق الخلية. تم استخدام أدوات التحكم غير المصبوغة، وأدوات التحكم ذات اللون الواحد، وضوابط الفلورية ناقص واحد لضبط بوابات التعويض والرباعية. تم استبعاد الحطام باستخدام التبعثر الأمامي والتشتت الجانبي. تم تعريف الخلايا المبوتة المبكرة بأنها خلايا موجبة ل Annexin V وخلايا سالبة لليوديد بروبيديوم، وكانت الخلايا الموتية المتأخرة أو الميتة تعرف بأنها خلايا موجبة ل Annexin V وخلايا إيجابية لليوديد بروبيديوم. تم حساب الاستماتة الكلي كمجموع كسور الخلايا الموتمة المبكرة والمتأخرة. تم جمع ما لا يقل عن 10,000 حدث خلوي واحد صالح لكل عينة.

6. اختبار تراكم الدوكسوروبيسين داخل الخلايا

تم زرع خلايا HL60/A وK562/A في صفائح ذات 6 آبار بمعدل 4 × 10⁵ خلايا/مل وزرعت طوال الليل. ثم عولجت الخلايا بالتحكم في المركبة، أو دوكسوروبيسين وحده، أو دوكسوروبيسين مع 5 ميكرومولار FTY720. تمت معالجة خلايا HL60/A بدوكسوروبيسين بقوة 4 ميكرومولار، وعالجت خلايا K562/A بدوكسوروبيسين بقوة 8 ميكرومولار. تم حضن الخلايا لمدة 4 ساعات عند درجة حرارة 37 درجة مئوية ومحمية من الضوء.

بعد المعالجة، تم جمع الخلايا وغسلها مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد لإزالة الدوكسوروبيسين خارج الخلية. تم إعادة تعليق الخلايا في محلول ملحي مخزن بالفوسفات وتحليلها بواسطة قياس خلوي تدفق باستخدام التألق الداخلي لدوكسوروبيسين. استخدمت الخلايا غير المعالجة لتعريف التألق الذاتي في الخلفية، واستخدمت الخلايا المعالجة بالدوكسوروبيسين كمرجع إيجابي للفلورة. تم قياس تراكم دوكسوروبيسين داخل الخلايا كمتوسط شدة الفلورة بعد الحطام واستبعاد التجميع. تم تطبيع قيم شدة الفلورة المتوسطة لمجموعة الدوكسوروبيسين وحدها ضمن كل تجربة مستقلة.

7. تحليل تدفق الخلايا لبروتين P وتعبير بروتين المقاومة متعددة الأدوية 1

تم زرع خلايا HL60/A وK562/A في صفائح ذات 6 آبار بمعدل 2 × 10⁶ خلايا/مل، وعالجت ب 5 ميكرومولار FTY720 أو التحكم في المركبات لمدة 24 ساعة. بعد المعالجة، تم غسل الخلايا مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات بارد جدا وأعيد تعليقها في محلول تلوين خلوي بسعة 100 ميكرولتر.

تم صبغ الخلايا بأجسام مضادة مضادة لبروتين P مرافق فيكوإيريثرين ومضادة مضادة للبروتين المضاد للمقاومة متعددة الأدوية 1 المتوافقة أليكسا فلور 647 في التخفيف الموصى به من الشركة المصنعة. تم تضمين ضوابط متطابقة من النظائر النفسية، وأدوات التحكم غير المصبوغة، وأدوات التحكم ذات اللون الواحد، وضوابط الفلورية ناقص واحد لتثبيت البوابة والتعويض. تم حضن العينات لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية في الظلام، ثم غسلت مرتين باستخدام حاجز تلوين الخلية، وأعيد تعليقها في مخزن تلوين خلوي بسعة 500 ميكرولتر قبل الحصول عليها.

تم إجراء قياس خلوي التدفق باستخدام مقياس تدفق BD FACScan. تم جمع ما لا يقل عن 10,000 حدث خلوي واحد صالح لكل عينة. تم قياس مستويات تعبير بروتين P الجليكوبروتين المرتبط بالمقاومة متعددة الأدوية 1 كشدة فلورية متوسطة بعد طرح إشارة التحكم في النمط النظيري المقابل. تم التعبير عن القيم المقررة بالنسبة لمجموعة المركبة والمجموعة الضابطة داخل كل تجربة مستقلة.

8. التلوين الغربي والقياس الكثافي

بعد العلاجات الموجهة، تم جمع الخلايا وغسلها مرتين باستخدام محلول ملحي مخزن بالفوسفات البارد. تم استخراج البروتين الكلي باستخدام محلول اختبار التقرب المناعي المشع مع مكمل مع مثبطات للبروتياز والفوسفاتاز. تم قياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة اختبار بروتين بحمض البيسينشونينيك.

تم فصل ما مجموعه 30 ميكروغرام بروتين في كل مسار بواسطة الرحلان الكهربائي الهلام الدوديسيل كبريت-بولي أكريلاميد الصوديوم ونقله إلى أغشية ثنائي فلوريد بولي فينيليدين. تم حجب الأغشية بحليب 5٪ خالي من الدسم أو ألبومين مصل بقري 5٪ في محلول ملحي مخزن بتريس يحتوي على توين 20 لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.

تم حضان الأغشية طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد كيناز البروتين الكلي B، وكيناز البروتين المفسفر B، والهدف الآلي الكلي للراباميسين، والهدف الميكانيكي المفسفر للراباميسين، والكاسباز-3 المشقوق، وبوليمراز البولي (أدينوسين ثنائي فوسفات-ريبوز) المقسوم، وبروتين P، والبروتين المرتبط بمقاومة الأدوية المتعددة 1، وإنزيم ديهيدروجينازات الجلسرادي-3-فوسفات. بعد الغسيل، تم حضن الأغشية بأجسام مضادة ثانوية متقاربة ببيروكسيداز الفجل الحار لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تم تصور أشرطة البروتين باستخدام كشف كيميائي مصحح.

تم قياس شدة النطاق باستخدام برنامج ImageJ، الإصدار 1.53t. تم تطبيع كيناز البروتين المفسفر B إلى كيناز البروتين الكلي B، وتم تطبيع الهدف الميكانيكي المفسفر للراباميسين إلى الهدف الآلي الكلي للراباميسين. تم تطبيع بوليمراز بوليموراز بولي (أدينوسين ثنائي الفوسفات-ريبوز) إلى إنزيم غليسراللديهيد-3-فوسفات ديهيدروجيناز. تم التعبير عن القيم المقررة كتغيرات في الطية بالنسبة لمجموعة التحكم في المركبة أو مجموعة الدوكسوروبيسين فقط، حسب المقارنة. تم إجراء تحليلات البلوت الغربية باستخدام ثلاث نسخ بيولوجية مستقلة. تم إيداع صور البقعة الغربية غير المقطوعة في مستودع البيانات العام أو رفعها كملفات إضافية.

9. تجربة الإنقاذ SC79

لفحص ما إذا كانت إشارات كيناز البروتين B مرتبطة بالتأثيرات الملحوظة ل FTY720، تم علاج خلايا HL60/A وK562/A ب FTY720 في وجود أو غياب SC79، وهو منشط لكيناز البروتين B. تمت معالجة الخلايا مسبقا ب 5 ميكرومولار FTY720 لمدة 12 ساعة ثم عولجت ب 30 ميكرومولار SC79 أو بتحكم المركبة لمدة 12 ساعة إضافية.

بعد العلاج، تم تقييم مستويات بروتين كيناز B الفوسفوريلي، والهدف الميكانيكي المفسفر للراباميسين، وبروتين P-جليكوبروتين، ومستويات بروتين 1 المرتبطة بالمقاومة متعددة الأدوية بواسطة Western blotting. بالتوازي، تم تقييم الاستماتة المبرمجة من خلال تلوين Annexin V وتلوين يوديد البروبيديوم بعد علاج دوكسوروبيسين وFTY720 وSC79. تم تفسير تأثيرات الإنقاذ كدليل مرتبط بالمسار. ونظرا لعدم إجراء أي تجربة للتعبير الجيني المفرط أو الإقصاء، تم التوصل إلى الاستنتاجات السببية بحذر.

10. التحليل الإحصائي وتقارير البيانات

تم إجراء تحليلات إحصائية باستخدام GraphPad Prism الإصدار 9.5 وIBM SPSS Statistics الإصدار 23.0. تم تعريف النسخ البيولوجية على أنها تجارب مستقلة أجريت في أيام مختلفة باستخدام خلايا مزروعة بشكل مستقل. تم تعريف النسخ التقنية بأنها آبار متكررة أو قياسات متكررة ضمن نفس التجربة البيولوجية.

تم تقديم البيانات كمتوسط ± خطأ معياري للمتوسط ما لم يذكر خلاف ذلك. تم تحليل المقارنات بين مجموعتين باستخدام اختبار t للطالب ذو الذيلين غير المقترن عندما كانت البيانات موزعة بشكل طبيعي تقريبا. تم تحليل المقارنات بين ثلاث مجموعات أو أكثر باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه تلاه اختبار توكي بعد الاختبار. تم تحليل التجارب التي شملت عاملين مستقلين، مثل تركيز الدواء وحالة العلاج، باستخدام تحليل ثنائي الاتجاه للتباين تلاه تصحيح مناسب لمقارنات متعددة.

عندما لم تكن افتراضات الطبيعية مدعومة، استخدمت اختبارات غير معلمية. تم الإبلاغ عن قيم p الدقيقة كلما أمكن. تم تعريف الدلالة الإحصائية بأنها p < 0.05 بعد التصحيح للمقارنات المتعددة. جميع رموز الأشكال حددت عدد النسخ البيولوجية، والاختبار الإحصائي المستخدم، ومعنى أشرطة الخطأ، وعتبة الدلالة. تم عرض قيم النسخ البيولوجية الفردية في مخططات التشتت أو تراكب على الرسوم البيانية الشريطية كلما أمكن.

النتائج

قلل FTY720 من قدرة خلايا اللوكيميا النخاعية الحادة المقاومة للدوكسوروبيسين والآباء وخلايا اللوكيميا الميلويدية الحادة المقاومة للدوكسوروبيسين

تعرضت خلايا HL60 وK562 وHL60/A وK562/A لتركيزات متزايدة من FTY720 (0، 3.125، 6.25، 12.5، 25، 50، و100 ميكرومول) لمدة 48 ساعة، وتم قياس بقاء الخلايا باستخدام اختبار مجموعة عد الخلايا 8. قلل FTY720 من بقاء الخلايا في جميع خطوط الخلايا الأربعة بطريقة تعتمد على التركيز (الشكل 1A...

المناقشة

تظل مقاومة الكيمياء واحدة من العوائق الرئيسية أمام علاج اللوكيميا النخاعية الحاد الفعال. في المرضى الذين لا يستجيبون للعلاج التحفيزي أو يطورون انتكاسة بعد الاستجابة الأولية، يمكن لخلايا اللوكيميا المقاومة أن تستمر رغم التعرض لأنظمة تعتمد على السيتارابين والأنثراسيكلين، مما يجعل تحديد الأساليب التي تزيد من حساسية الأدوية سؤالا تجريبيا وسريريا مهما²³. دوكسوروبيسين هو أنثراسيكلين ذو نشاط واسع مضاد للأورام، لكن استخدامه السريري محدود بسبب السمية التراكمية وقدرة الخلاي...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
6-well tissue culture plates	Corning / Costar	3516 أو ما يعادلها المتحقق من المختبر	يُستخدم لتجارب العلاج، الارتكاس المبرمج، تراكم الدوكسوروبيكين، والتعبير عن البروتين.
96-well tissue culture plates	Corning / Costar	3599 أو ما يعادلها المتحقق من المختبر	يُستخدم لاختبارات Cell Counting Kit-8.
Alexa Fluor 647 mouse immunoglobulin G1 isotype control	BioLegend	400130 أو ما يعادلها المتحقق من المختبر	التحكم في النظائر لصبغة Alexa Fluor 647 المضادة للجسم. استخدم رقم الكتالوج بالضبط من قارورة الكواشف.
Alexa Fluor 647-conjugated anti-human multidrug resistance-associated protein 1 / ABCC1 antibody	BioLegend	370103	يُستخدم للكشف عن البروتين 1 المرتبط بمقاومة الدواء المتعدد بالتدفق الخلوي. يجب تأكيد توفر المنتج لأن بعض أشكال BioLegend MRP1 قد تم إيقافها أو استبدالها.
Annexin V apoptosis detection kit with propidium iodide	BioLegend	640914 أو ما يعادلها المتحقق من المختبر	يُستخدم لتحليل الارتكاس المبرمج بواسطة Annexin V ويوديد البروبيديوم بالتدفق الخلوي. إذا تم استخدام Annexin V-allophycocyanin بدلاً من Annexin V-fluorescein isothiocyanate، فاستبدل هذا برقم كتالوج المجموعة بالضبط.
Bicinchoninic acid protein assay kit	Thermo Fisher Scientific / Beyotime / المورد المتحقق من المختبر	استخدم رقم الكتالوج الفعلي	يُستخدم لقياس تركيز البروتين.
Carbon dioxide cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific / Eppendorf / أداة متحقق من المختبر	الطراز المراد إدخاله من سجل المختبر	يُحافظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
Caspase-3 antibody	Cell Signaling Technology	9662; RRID:AB_331439	يكشف عن caspase-3 كاملة المقطوعة بواسطة Western blot. إذا تم استخدام جسم مضاد محدد لـ caspase-3 المقطوعة، فاستبدل برقم كتالوج بالضبط.
Cell Counting Kit-8	Dojindo Molecular Technologies	CK04	يُستخدم لاختبارات حيوية الخلايا وتركيز تثبيط النصف الأقصى.
Cell staining buffer	BioLegend	420201	يُستخدم لتخفيف الأجسام المضادة والغسل أثناء التلوين بالتدفق الخلوي.
Cleaved poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase antibody	Cell Signaling Technology	94885; RRID:AB_2800237	جسم مضاد لـ Western blot للبروتين المقطوع poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase.
CompuSyn	ComboSyn, Inc.	الإصدار 1.0 أو النسخة المتحقق من المختبر	يُستخدم لتحليل Chou-Talalay combination-index إذا كانت بيانات الجرعة المدمجة الكاملة متاحة.
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich / Merck	D2650 أو ما يعادلها المتحقق من المختبر	حامل FTY720 وSC79 للمحاليل المخزنة؛ لم تتجاوز التركيز النهائي 0.1٪.
Doxorubicin hydrochloride	استخدم المورد الفعلي من سجل شراء المختبر	استخدم رقم الكتالوج الفعلي ورقم الدُفعة الفعلي	أنثراسيكلين يُستخدم للحفاظ على المقاومة وتجارب العلاج. يجب أن يتطابق هذا الإدخال مع الكاشف المستخدم فعليًا في التجارب.
Enhanced chemiluminescence substrate	Thermo Fisher Scientific / MilliporeSigma / المورد المتحقق من المختبر	استخدم رقم الكتالوج الفعلي	يُستخدم لكشف إشارات Western blot.
Fetal bovine serum	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10099-141 أو ما يعادلها المتحقق من المختبر	يُضاف إلى وسط الثقافة بنسبة 10٪. استخدم المصل المنشط حرارياً أو غير المنشط حرارياً بشكل متسق عبر جميع التجارب.
Flow cytometer	BD Biosciences	BD FACScan أو طراز الأداة الفعلي	يُستخدم لاختبارات الارتكاس المبرمج، تراكم الدوكسوروبيكين داخل الخلايا، واختبارات التعبير عن الناقل. قم بتسجيل تكوين الليزر/الفلاتر في الأساليب التكميلية إذا كان متاحًا.
Flow cytometry analysis software	BD Biosciences / FlowJo / البرمجيات المتحقق من المختبر	الإصدار المراد إدخاله من سجل المختبر	يُستخدم للتعويض، وتحديد البوابات، وتحليل كثافة الفلورة المتوسطة.
FTY720 / fingolimod hydrochloride	استخدم المورد الفعلي من سجل شراء المختبر	استخدم رقم الكتالوج الفعلي ورقم الدُفعة الفعلي	كاشف العلاج الدوائي. يجب أن يتطابق هذا الإدخال مع الكاشف المستخدم فعليًا في التجارب. لا تستبدل بمورد مختلف إلا إذا تم إجراء التجربة بهذا المنتج.
Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase antibody	Abcam	ab181602	متحكم في التحميل لـ Western blot. قم بتأكيد RRID من إدراج المنتج قبل الإرسال.
GraphPad Prism	GraphPad Software	الإصدار 9.5	يُستخدم لتلائم منحنى الاستجابة للجرعة، حساب تركيز تثبيط النصف الأقصى، والتحليل الإحصائي.
HL60 human acute myeloid leukemia cells	معهد علم الدم، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية، تيانجين، الصين	لم يتم تصنيفه تجاريًا في هذه الدراسة	خط خلوي أساسي لللوكيميا النخاعية الحادة البشرية؛ تم التوثيق بواسطة الكاريو تايب والمورفولوجيا قبل الاستخدام. إذا كانت هناك حاجة إلى مرجع عام، فإن HL60 تتوافق مع RRID:CVCL_0002.
HL60/A doxorubicin-resistant cells	معهد علم الدم، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية، تيانجين، الصين	لم يتم تصنيفه تجاريًا	مشتق مقاوم للدوكسوروبيكين من خلايا HL60؛ يتم الاحتفاظ به في معهد فوجيان لعلم الدم. تم الحفاظ على المقاومة باستخدام 1 ميكروغرام/مل من الدوكسوروبيكين قبل الثقافة الخالية من الدواء.
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit immunoglobulin G secondary antibody	Cell Signaling Technology / Abcam / المورد المتحقق من المختبر	استخدم رقم الكتالوج الفعلي	جسم مضاد ثانوي لـ Western blot. أدخل المورد الفعلي ورقم الكتالوج من سجلات المختبر.
IBM SPSS Statistics	IBM	الإصدار 23.0	يُستخدم للتحليل الإحصائي.
ImageJ	معاهد الصحة الوطنية	الإصدار 1.53t	يُستخدم لقياس كثافة Western blot.
K562 human leukemia cells	معهد علم الدم، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية، تيانجين، الصين	لم يتم تصنيفه تجاريًا في هذه الدراسة	خط خلوي أساسي لللوكيميا البشرية؛ تم التوثيق بواسطة الكاريو تايب والمورفولوجيا قبل الاستخدام. إذا كانت هناك حاجة إلى مرجع عام، فإن K562 تتوافق مع RRID:CVCL_0004.
K562/A doxorubicin-resistant cells	معهد علم الدم، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية، تيانجين، الصين	لم يتم تصنيفه تجاريًا	مشتق مقاوم للدوكسوروبيكين من خلايا K562؛ يتم الاحتفاظ به في معهد فوجيان لعلم الدم. تم الحفاظ على المقاومة باستخدام 5 ميكروغرام/مل من الدوكسوروبيكين قبل الثقافة الخالية من الدواء.
Microplate reader