إجراء متكرر لفقدان الوزن لتأسيس نموذج فأر لإصابة دماغية مزمنة رضحية

ملخص

تم تقديم بروتوكول لإنشاء نموذج متكرر لإصابة دماغية خفيفة مغلقة الرأس لدراسة الآليات الكامنة وراء السلوك الشبيه بالاكتئاب المزمن في غياب آفات هيكلية دماغية كبيرة.

الملخص

يمكن أن تؤدي إصابة الدماغ الرضحية (TBI) إلى تغيرات عصبية مرضية مستمرة وتبعات عصبية نفسية طويلة الأمد. خلال فترة التعافي، يصاب عدد كبير من المرضى باضطرابات عاطفية، بما في ذلك أعراض الاكتئاب وشكاوى متعلقة بالنوم، حتى عندما لا تكشف التصوير المقطعي المحوسب الروتيني أو التصوير بالرنين المغناطيسي عن أي تشوهات هيكلية واضحة. هناك حاجة إلى نماذج تجريبية تعيد إنتاج هذه السمات للتحقيق في الآليات الكامنة وراء أعراض الطب النفسي العصبي المزمن بعد الصدمة. هنا، نقدم بروتوكولا لإنشاء نموذج متكرر لإصابة دماغية خفيفة برأس مغلق لدراسة الآليات الكامنة وراء السلوك المزمن الشبيه بالاكتئاب في غياب آفات هيكلية كبيرة واضحة يمكن اكتشافها بالفحص المجري والتصوير بالرنين المغناطيسي المرجح بدرجة T2. في هذه الطريقة، تتعرض الجمجمة السليمة وتتعرض لضربات متكررة باستخدام معايير محددة لفقدان الوزن على مدى خمسة أيام متتالية. في الظروف الموضحة هنا، ينتج عن الإجراء إصابة في الرأس المغلق دون كسر جسيم في الجمجمة أو كدمة بؤرية كبيرة. بعد فترة ما بعد الإصابة، تظهر الفئران سلوكيات شبيهة بالاكتئاب دون إظهار أي تشوهات بنيوية بؤرية واضحة في الفحص الشامل أو تصوير الرنين المغناطيسي المرجح بوزن T2 في الظروف المستخدمة في هذه الدراسة. يوفر هذا البروتوكول نهجا تجريبيا لدراسة السلوك المزمن الشبيه بالاكتئاب بعد إصابة دماغية رضحية خفيفة متكررة، ولتقييم التدخلات العلاجية المحتملة.

المقدمة

ومع ذلك، وبما أن النموذج الحالي يمنح بشكل أساسي تأثيرا خطيا لفأر مثبت على الرأس، يجب تفسيره كنموذج RMTi مغلق الرأس محسن لدراسة النتائج العاطفية المزمنة بدلا من كونه محاكاة بيوميكانيكية مباشرة لارتجاج مرتبط بالرياضة أو إصابات مرورية طفيفة." تعد إصابات الدماغ الرضحية (TBI) حاليا واحدة من الأسباب الرئيسية للمراضة والوفيات المرتبطة بالصدمات، حيث تفرض عبئا طبيا واقتصاديا كبيرا على العائلات والمجتمع ^1,2. ومن الجدير بالذكر أن تلف الجهاز العصبي المركزي بعد إصابة الدماغ الرضحية ليس عابرا؛ عادة ما يتطور بشكل مزمن وتقدمي. كشفت دراسة حول إصابة دماغ رضحية أنه حتى بعد 18 عاما من الإصابة، يستمر تنشيط الخلايا الدبقية الدقيقة، ويستمر الالتهاب العصبي المزمن المطول في التسبب في تدهور عصبي شديد³. تشير البيانات الوبائية إلى أن ما يصل إلى 28٪–32٪ من المرضى يطورون اضطرابات عاطفية شديدة خلال المرحلة^{الرابعة} من التعافي المطول. في هذا المقال، يشير مصطلح الدماغ الرضحي الرضحي إلى نموذج التحفيز المتكرر لإصابة الدماغ الرضحية الخفيفة، بينما يشار إلى المرحلة المزمنة بعد الإصابة، التي تتميز بتغيرات سلوكية مستمرة، هنا باسم إصابة الدماغ الرضحية المزمنة (c-TBI). يستخدم مصطلح c-TBI هنا لوصف الحالة المزمنة بعد الإصابة التي تتميز بتغيرات سلوكية مستمرة بعد rmTBI (rmTBI)، بدلا من نموذج إصابة مميز. هذا الاستخدام يتوافق مفهوميا مع عملنا السابق الذي يظهر أن الدماغ الرضحية التجريبية يمكن أن تتطور كعملية مزمنة تدريجية مرتبطة باضطرابات نسيجية وسلوكية طويلة الأمد.

هذه الآثار العصبية النفسية المزمنة تؤثر بشدة على جودة حياة المرضى ونتائجهم الوظيفية⁵. ومع ذلك، لا يزال العامل الدقيق وراء هذه الاضطرابات العاطفية الثانوية بعيد المنال، وخيارات العلاج السريري محدودة للغاية. لذلك، فإن التحقيق في آليات السلوكيات الشبيهة بالاكتئاب الناتج عن الدماغ المعقد وتحديد الأهداف العلاجية الدقيقة هو أمر عاجل وذو أهمية عملية كبيرة.

لتوضيح الآليات المرضية لإصابة الدماغ الرضحية، طور الباحثون نماذج حيوانية متنوعة، من بينها نموذج التأثير القشري المسيطر عليه (CCI) الذي يعد حاليا من أكثر نماذج ^6,7 استخداما. يسمح CCI بالتحكم الدقيق في معايير الاصطدام لتوليد آفات بؤرية قابلة للتكرار عاليا. ومع ذلك، فإن نماذج كل من CCI ونماذج إصابات السوائل والطرق التقليدية (FPI) عادة ما تتطلب عملية فتح الجمجمة. تعد هذه الطرق مفيدة بشكل خاص لدراسة الكدمات البؤرية، وفقدان الأنسجة، والاستجابات الالتهابية العصبية الشديدة المرتبطة بالآفات، لكنها تميل إلى محاكاة إصابة دماغية دماغية مفتوحة شديدة، والتي تختلف بشكل كبير عن العروض السريرية الأكثر شيوعا لإصابات الرأس المغلقة الخفيفة، مثل الارتجاجات المرتبطة بالرياضة^8،9. والأهم من ذلك، أن نخر أنسجة الدماغ، والندوب الدبقية، والتجويف في المرحلة المتأخرة الناتج عن بصم الجمجمة والصدمات تشكل قيدين رئيسيين. أولا، غالبا ما تؤدي العجز الهيكلي الشديد إلى خلل في الوظائف الحركية، مما يربك بشكل مباشر التقييم الدقيق للنتائج السلوكية. ثانيا، فقدان الأنسجة الجسدي يقطع الإسقاطات العصبية بعيدة المدى. كما أظهرت الدراسات السابقة باستخدام نموذج الدماغ الرضحي الناتج عن CCI، أظهرت الفئران كدمات دماغية محورية كبيرة⁴. يعيق هذا الاضطراب الهيكلي بشكل كبير تطبيق تقنيات التشريح العصبي المتقدمة، مثل تتبع الفيروسات، مما يجعل من غير الممكن إلى حد كبير دراسة الأعراض النفسية والدوائر العصبية المرتبطة بها. وبالتالي، رغم أن هذه النماذج لا تزال ذات قيمة لدراسات الإصابة الدماغية الدماغية الشديدة أو البؤرية، إلا أنها قد تكون أقل ملاءمة عندما يكون الهدف هو التحقيق في التشوهات العاطفية المزمنة بعد إصابة رأس مغلقة خفيفة متكررة، خاصة عندما يكون الحفاظ على السلامة الهيكلية أمرا مهما للتحليلات السلوكية والدائرية.

لتجاوز قيود نماذج إصابة الدماغ الدماغية المفتوحة الشديدة المذكورة أعلاه، توضح هذه الدراسة بروتوكولا لإنشاء نموذج متكرر لإصابة دماغية رضحية خفيفة (rmTBI) باستخدام طريقة فقدان الوزن على الجمجمة المكشوفة والسليمة دون استئصال الجمجمة. يستخدم هذا البروتوكول معايير تأثير محددة بدقة: ارتفاع سقوط 25 سم ووزن 20 جراما. تم استهداف موقع الاصطدام على بعد 2 مم إلى يسار الغرز السهمي و2 مم خلف الخياطة التاجية، باستخدام طرف معدني منحني بقطر 4 مم لضمان دقة وتجانس قوة الصدمة. علاوة على ذلك، فإن التكرار المحدد للتأثيرات المتكررة على مدى خمسة أيام متتالية يضمن استقرار التغيرات المرضية المزمنة. تظهر التقييمات الشاملة التي تشمل الرنين المغناطيسي، والتحليل النسيجي المرضي، والاختبارات السلوكية أن هذا النموذج يظهر سلوكيات شبيهة بالاكتئاب مع الحفاظ على سلامة الدماغ الهيكلية الكبيرة، دون كدمات بؤرية واضحة أو عجز حركي. يلتقط هذا الملف الظاهري بعض السمات السلوكية المختارة لإصابات الرأس الخفيفة المتكررة، بما في ذلك التغيرات العصبية النفسية رغم عدم وجود تشوهات هيكلية واضحة في التصوير العصبي^{الروتيني} 10,11,12,13. ومع ذلك، وبما أن النموذج الحالي يمنح بشكل أساسي تأثيرا خطيا على فأرة مثبتة على الرأس، يجب تفسيره كنموذج مغلق الرأس للدماغ الدماغي الرضحية المحسن لدراسة النتائج العاطفية المزمنة بدلا من كونه تقليد بيوميكانيكي مباشر لارتجاج مرتبط بالرياضة أو إصابات مرورية طفيفة.

البروتوكول

تمت الموافقة على جميع إجراءات الحيوانات من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية في معهد الذكاء الاصطناعي، المركز الوطني الشامل للعلوم في هيفي (رقم الموافقة: IAI2024071004). تم تنفيذ جميع الإجراءات وفقا للإرشادات المؤسسية والوطنية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. يظهر مخطط تخطيطي للبروتوكول التجريبي في الشكل 1. يمكن استخدام معدات مماثلة من بائعين آخرين، بشرط الحفاظ على خصائص الأداء الحرجة، مثل وزن الاصطدام 20 جرام، ارتفاع السقوط 25 سم، قطر طرف الاصطدام 4 مم، توصيل الإيزوفلوران الموثوق، وإعدادات الرنين المغناطيسي المماثلة لتلك المستخدمة هنا. المواد المستخدمة والمواد المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الحيوانات

1. جهزوا الحيوانات.
   1. استخدم الفئران الذكورية C57BL/6N التي تتراوح أعمارها بين 8 و10 أسابيع ووزنها 20–25 جرام.
   2. ضع الفئران في أقفاص مهواة بشكل فردي (IVCs) في منشأة حيوانية خالية من مسببات الأمراض (SPF). وفر الطعام والماء بحرية وحافظ على دورة إضاءة 12 ساعة و12 ساعة مظلمة تحت درجة حرارة ورطوبة مضبوطة.
   3. تعويد الفئران على غرفة السكن قبل التجربة وإجراء فحوصات صحية روتينية وفقا لإجراءات رعاية الحيوانات المؤسسية.
2. قم بتعيين المجموعات.
   1. قم بتعيين الفئران عشوائيا إلى مجموعة الساذجة، ومجموعة شام، ومجموعة c-TBI. تم تعميم الباحثين المسؤولين عن تفسير الرنين المغناطيسي، والتقييم المرضي الشامل، وتحليل التقييم/البيانات السلوكية لتوزيع المجموعات.
   2. سجل رقم تعريف الحيوان وتعيين المجموعة قبل أول جلسة إصابة.

2. التحضير للجراحة والتخدير

1. جهز الأدوات الجراحية ونظام التخدير.
   1. جهز مشرط معقم مزود بشفرة رقم 11، ومسحات قطنية معقمة، ومحلول ملحي فسيولوجي معقم، ومحلول بوفيدون-يود بنسبة 10٪، وخياطة 5-0 غير ممتصة من خيوط مونوبروبيلين من البولي بروبيلين، وشريط لاصق، ومرهم عيون من الكلورتتراسيكلين.
   2. قم بتعقيم الأدوات الجراحية قبل الاستخدام، وضعها على حقل جراحي نظيف، وحافظ على تقنية المعقمة طوال العملية. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات، ومعطف المختبر، وحماية للعين.
   3. جهز وسادة تسخين حرارية واضبطها على 37 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية.
   4. قم بتوصيل غرفة الحث ومخروط الأنف بنظام تخدير غازات الحيوانات المختبرية.
   5. اضبط معدل تدفق الأكسجين إلى 0.5–1.0 لتر/دقيقة وجهز جهاز تبخير الإيزوفلوران للحث والصيانة. إجراء التخدير في منطقة جيدة التهوية أو استخدم نظام معتمد لإزالة غازات النفايات.
2. جهز الفأر للجراحة.
   1. أعط البوبرينورفين HCl (0.1 ملغ/كجم، داخل الصفاق) قبل 30 دقيقة من التخدير والجراحة وفقا لبروتوكول الحيوانات المعتمد.
   2. ضع الفأر في غرفة الحث وتحفز التخدير باستخدام الإيزوفلوران. اضبط جهاز التبخير على 3٪–5٪ للتحفيز وراقب الفأرة باستمرار حتى يفقد رد فعل التوازن ويتوقف حركة الطرف التلقائية. لا تتجاوز 5٪ من الأيزوفلوران أثناء التحفيز.
   3. انقل الفأر إلى إطار استريوتاكسي في وضعية الاستلقاء وحافظ على التخدير عبر مخروط أنف. قلل إعداد جهاز التبخير إلى 1٪–2٪ للصيانة مع الحفاظ على معدل تدفق الأكسجين بين 0.5–1.0 لتر/دقيقة.
      1. خلال الإجراء، حافظ على معدل تنفس مستقر يقارب 60–100 نفس في الدقيقة. إذا انخفض معدل التنفس إلى أقل من 60 نفسا/دقيقة أو أصبح التنفس ضحلا أو غير منتظم، قم بتقليل تركيز الأيزوفلوران فورا، وتوفير تدفئة داعمة، وأجل التأثير حتى يستأنف التنفس المستقر. لا تتجاوز 2٪ من الإيزوفلوران أثناء الصيانة.
   4. تأكيد التخدير المناسب بغياب رد فعل انسحاب الدواسات، وتثبيت الرأس بقضبان الأذن في الإطار الستيريوتاكسي دون إتلاف أغشية الطبلة (الشكل 2A)، والحفاظ على الفأر في وضعية الاستلقاء. إذا لم يكن بالإمكان تحقيق التخدير الكافي ضمن نطاقات التحفيز والصيانة المحددة، أو إذا حدث اكتئاب تنفسي مفرط، استبعد الحيوان من جلسة الإصابة.
   5. ضع مرهم العيون من كلورتترا سيكلين على كلتا العينين، احلق فروة الرأس، وقم بتعقيم موقع الجراحة بمحلول 10٪ من البوفيدون-يود.

3. تأسيس نموذج إصابات الدماغ الرضحية الخفيفة المتكرر

1. كشف الجمجمة.
   1. قم بعمل شق طولي في منتصف الطريق، يبلغ طوله حوالي 0.5 سم إلى 1 سم، في فروة الرأس باستخدام مشرط معقم مزود بشفرة رقم 11.
   2. قم بتشريح الأنسجة تحت الجلد والشلال بشكل مباشر باستخدام ملقط معقم أو مسحات قطنية لكشف الجمجمة بالكامل دون خدش سطح العظم.
   3. امسح سطح الجمجمة بمسحة قطنية معقمة مبللة بمحلول ملحي فسيولوجي لرؤية العلامات القحفية، بما في ذلك البريغما والخياطة التاجية.
2. جهز جهاز الصدمة.
   1. قم بتركيب رأس تصادم معدني منحني بقطر 4 مم على جهاز إسقاط الوزن القابل للسقوط الحر.
   2. اضبط ارتفاع السقوط إلى 25 سم واستخدم وزن صدمات 20 جرام (الشكل 2B).
3. أرسل التأثير.
   1. حدد موقع الاصطدام عند نقطة تبعد 2 مم إلى يسار الغرز السهمي و2 مم خلف الغرز الإكليلي على سطح الجمجمة (الشكل 2C).
   2. قم بمحاذاة طرف المصاب عموديا فوق موقع الهدف، وخفضه برفق حتى يلامس سطح الجمجمة، وتأكد من بقاء الطرف في المنتصف وعموديا على الجمجمة قبل تحرير الوزن.
   3. أطلق وزن 20 جرام من ارتفاع 25 سم لتنفيذ ضربة واحدة.
   4. بالنسبة للمجموعة الساذجة، لا تجري التخدير أو الجراحة. بالنسبة لمجموعة الشام، قم بإعطاء التخدير وعمل شق في فروة الرأس، لكن لا تترك التأثير.
4. قم بخياطة الجرح وقدم الرعاية بعد العملية.
   1. قم بإزالة طرف الاصطدام فورا بعد الاصطدام وفحص موقع الجراحة.
   2. أغلق شق فروة الرأس بخياطة مونوفلامنت بولي بروبيلين غير الماصة 5-0 وتعقيم موقع الشق بمحلول بوفيدون-يود بنسبة 10٪.
   3. ضع الفأرة على وسادة تسخين حرارية ثابتة تحافظ على 37 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية، راقب التنفس حتى استعادة وعيه الكامل وتحريك الحر، ثم أعد الفأر إلى قفصه الأساسي.
      ملاحظة: يعرف التعافي بعودة التنفس التلقائي المنتظم، واستعادة منعكس التصحيح، والتحرك التلقائي. يجب مراقبة انقطاع التنفس الحاد والنزيف المرئي فورا بعد كل اصطدام وأثناء التعافي المبكر. الحيوانات التي تظهر انقطاع التنفس لفترة طويلة، أو نزيف مرئي، أو تفشل في استعادة رد الفعل التصحيحي خلال 10 دقائق من إيقاف الإيزوفلوران، أو تفشل في المشي تلقائيا خلال 15 دقيقة، يجب استبعادها من الإجراءات الإضافية والتعامل معها وفقا لبروتوكول الحيوانات المعتمد.
   4. تخلص من الشفرات والإبر المستخدمة في حاوية حادة معتمدة. التخلص من نفايات الحيوانات والمواد الملوثة وفقا للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية.
5. كرر الإصابة.
   1. كرر الخطوات 3.1–3.4 كل 24 ساعة لمدة 5 أيام متتالية لتحقيق ما مجموعه 5 تأثيرات.
   2. راقب وزن الجسم ونشاطه باستمرار طوال فترة التعافي بعد العملية. استبعد الحيوانات من التحليلات اللاحقة إذا ظهرت فيها كسر في الجمجمة، أو نزيف مرئي، أو نوبة، أو دوران مستمر، أو عدم القدرة على التغذية أو الشرب بشكل مستقل.

4. الحصول على صور الرنين المغناطيسي

ملاحظة: في هذه الدراسة، أجري تصوير بالرنين المغناطيسي في اليوم السابع بعد الإصابة النهائية. تم فحص الفئران تحت تخدير إيزوفلوران ولم تضحى بها قبل التصوير. تم جمع الأنسجة بعد التصوير وفقا للجدول التجريبي.

1. جهز الحيوان للتصوير بالرنين المغناطيسي.
   1. قم بتخدير الفأر بالإيزوفلوران ووضعه على سرير حيواني متوافق مع الرنين المغناطيسي مزود بمخروط أنف.
   2. راقب التنفس طوال فترة الفحص وحافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية ± 0.5 درجة مئوية.
2. احصل على صور موزونة بوزن T2
   1. التقاط الصور على مغناطيس فائق موصل بقوة 9.4 طن ذو قطر 30 سم ونظام تدرج بقوة تدرج قصوى تبلغ 1000 مللي طن/م ومعدل انحراف أقصى 10000 طن/م/ثانية.
   2. استخدم ملف حجم 86 مم لنقل الترددات الراديوية وملف سطح مستوي بقطر 15 مم لاستقبال الإشارة.
   3. احصل على صور دوران-صدى سريعة عالية الوزن موزونة بوزن T2 باستخدام المعلمات التالية: زمن التكرار = 3000 مللي ثانية، زمن الصدى = 46.34 مللي ثانية، طول قطار الصدى = 13، عرض النطاق الترددي للاستقبال = 220 هرتز/بكسل، مجال الرؤية = 20 × 20 مم²، مصفوفة الاقتباس = 208 × 208، سمك الشريحة = 0.5 مم، فجوة الشريحة = 0 مم، وعدد الإثارة = 2.
   4. احصل على 30 شريحة لتغطية الدماغ بالكامل. استخدم إجمالي وقت الاستحواذ وهو دقيقة و33 ثانية. في هذه الدراسة، تم استخدام التصوير بالرنين المغناطيسي المرجح بوزن T2 للتقييم النوعي فقط. لم يتم إجراء أي تحليل رنين مغناطيسي كمي.
      ملاحظة: تمت مراجعة صور الرنين المغناطيسي بشكل نوعي من قبل باحث كان أعمى عن التعيين الجماعي.

5. تقييم الأمراض العصبية القاسية

1. قم بجمع الأنسجة.
   1. تخدير الفأر بعمق وفقا لبروتوكول الحيوانات المعتمد.
   2. افتح تجويف الصدر، كشف القلب، أدخل إبرة تروية في البطين الأيسر، وشق الأذين الأيمن.
   3. البيرفيوز مع محلول ملحي عادي، ثم بيرفيوز مع 4٪ بارافورمالديهايد (PFA). قم بإجراء كامل عملية التروية باستخدام غطاء بخار كيميائي معتمد وتجنب الاتصال المباشر بالجلد أو العين مع PFA. التخلص من الأنسجة والنفايات السائلة وفقا للوائح النفايات الخطرة والسلامة البيولوجية.
   4. اجمع الجمجمة والدماغ السليم والتقط صورا مقززة باستخدام كاميرا عالية الدقة.
      ملاحظة: تم إجراء تقييم مرضي إجمالي من قبل باحث أعمى عن التعيين الجماعي.

6. راقب وزن الجسم

1. سجل وزن الجسم.
   1. زن كل فأر قبل جلسة الإصابة الأولى وفي الأيام 1، 3، 7، 14، 21، و30 بعد الإصابة، وسجل القيم لتقييم الحالة الصحية العامة مع مرور الوقت.

7. أداء اختبار المشي بالعارضة

1. جهز الجهاز.
   1. استخدم عارضة خشبية أفقية بطول 1 متر وعرضها 1 سم وعلقها على ارتفاع 30 سم فوق الأرض.
2. اختبر تنسيق الحركة.
   1. ضع الفأرة في نهاية الشعاع الابتدائي، ودعها تعبر إلى نقطة النهاية، وسجل الوقت اللازم لعبور العارضة.
   2. قم بإجراء الاختبار قبل الإصابة وفي الأيام 1، 3، 7، 14، 21، و30 بعد الإصابة.
      ملاحظة: تم جدولة اختبارات سلوكية لتقليل التأثيرات المترتبة بين الاختبارات. نظرا لأن اختبار تعليق الذيل (TST) واختبار السباحة القسرية (FST) أكثر إجهادا من اختبار الحقل المفتوح (OFT)، فقد تم إجراؤهما أولا، تليها OFT ومتاهة بارنز في أوقات لاحقة. تم اختيار هذا التسلسل لتقليل الارتباك المحتمل الناتج عن التعود السابق أو التعرض الاستكشافي المتكرر أثناء التقييمات السلوكية اللاحقة.

8. إجراء اختبار تعليق الذيل

1. جهز الجهاز.
   1. قم بإجراء الاختبار في اليوم السابع بعد الإصابة وضع أسطوانة بليكسيغلاس فوق الذيل لمنع تسلق الذيل. استخدم أسطوانة طولها 4 سم وقطر خارجي 1.6 سم، وقطر داخلي 1.2 سم، ووزنها 1.6 جرام.
2. سجل السلوك.
   1. ثبت الذيل على صندوق التعليق بشريط لاصق، وتأكد من أن الفأرة لا تصل إلى قاع الصندوق، وعلق الفأرة لمدة 3 دقائق.
   2. سجل الجلسة كاملة بكاميرا عالية الدقة وحلل وقت الحركة ووقت الجمود يدويا من الفيديو المسجل بواسطة مراقب أعمى.

9. أداء اختبار السباحة القسرية

1. جهز الجهاز.
   1. قم بإجراء الاختبار في اليوم العاشر بعد الإصابة واملأ أسطوانة شفافة بارتفاع 25 سم وقطرها 15 سم بالماء بدرجة حرارة 23–25 درجة مئوية. استخدم عمق ماء يمنع الذيل والأطراف الخلفية من ملامسة القاع.
2. سجل السلوك.
   1. ضع الفأرة في الماء لمدة 6 دقائق وسجل الجلسة كاملة بكاميرا عالية الدقة.
   2. حلل آخر 4 دقائق من التسجيل يدويا بواسطة مراقب أعمى وقم بقياس وقت الحركة ووقت الجمود.
   3. عرف الجمود بأنه الحركات البسيطة اللازمة للحفاظ على الرأس فوق الماء.

10. أداء اختبار الحقل المفتوح

1. جهز الجهاز.
   1. قم بإجراء الاختبار في اليوم الرابع عشر بعد الإصابة في غرفة هادئة تحت إضاءة مستمرة. تم اختيار هذه النقطة الزمنية اللاحقة لتوفير فصل عن جلسات TST وFST السابقة، وبالتالي تقليل انتقال الإجهاد الحاد إلى OFT.
   2. استخدم صندوق مفتوح بقياس 40 سم × 40 سم × 40 سم.
2. سجل وحلل السلوك الاستكشافي.
   1. ضع الفأرة في وسط الساحة ودعها تستكشف بحرية لمدة 6 دقائق.
   2. تتبع السلوك لمدة 6 دقائق باستخدام برنامج تتبع وتحليل سلوكي. قم بمعايرة أبعاد الساحة في البرنامج لتتناسب مع الجهاز بقياس 40 سم × 40 سم وتقسيم الساحة عمليا إلى شبكة 5 × 5.
   3. حدد المربعات الخارجية الستة عشر كمنطقة محيطية والمربع الداخلي التسع كمنطقة المركز. اجعل لون الحيوان أغمق من لون الخلفية. تتبع جسد الحيوان فقط؛ لا تتبع الرأس أو الذيل. التقط الخلفية يدويا.
   4. استخدم البرنامج لقياس متوسط السرعة، والوقت الذي يقضيه في المنطقة المركزية، والوقت الذي يقضيه في المنطقة المحيطية، والمسافة الكلية المقطوعة خلال فترة الاختبار الكاملة.
   5. نظف وقم بإزالة الروائح قبل وبعد كل تجربة لإزالة الإشارات الشمية.

11. أداء متاهة بارنز

1. جهز الجهاز.
   1. ابدأ تقييم متاهة بارنز في اليوم الثلاثين بعد الإصابة.
   2. استخدم منصة دائرية من الفولاذ المقاوم للصدأ قطرها متر واحد مع 20 ثقبا متباعدة بشكل متساو.
   3. ضع صندوق الهروب تحت حفرة هدف محددة، وضع إشارات بصرية حول المتاهة، وحافظ على ثابت موقع حفرة الهدف لجميع التجارب.
2. إجراء مرحلة التدريب
   1. شغل ضوضاء بيضاء بحجم 90 ديسيبل كمنبه مؤلف أثناء التدريب.
   2. ضع الفأرة تحت أسطوانة شفافة في وسط المنصة لمدة 120 ثانية.
   3. أزل الأسطوانة ودع الفأرة تستكشف حتى 180 ثانية.
   4. سجل تجربة ناجحة عندما تدخل جميع الأرجل الأربع صندوق الهروب.
   5. وجه الفأرة إلى صندوق الهروب إذا لم تتمكن من تحديد الهدف خلال 180 ثانية وسجل التأخير ك 180 ثانية.
   6. دع الفأرة تبقى في صندوق الهروب لمدة 60 ثانية.
   7. كرر تجربة التدريب مرة واحدة بعد فترة 4–5 ساعات في كل يوم تدريب واستمر في التدريب لمدة 4 أيام متتالية.
3. إجراء يوم الراحة ومرحلة الاختبار
   1. أوقف التدريب لمدة يوم واحد بعد مرحلة التدريب.
   2. ضع الفأرة في وسط المنصة في يوم الاختبار وتسمح بالاستكشاف لمدة تصل إلى 180 ثانية.
   3. اضبط قطر المتاهة على 100 سم لمعايرة المقياس، وتأكد من أن ساحة التتبع مركزة في إطار الفيديو. اجعل لون الحيوان أغمق من الخلفية. تتبع جسد الحيوان فقط؛ لا تتبع الرأس أو الذيل. التقط الخلفية يدويا.
   4. سجل زمن الاستجابة للدخول إلى صندوق الهروب، متوسط السرعة، والمسافة الكلية المقطوعة خلال جلسة اختبار 180 ثانية باستخدام برنامج تتبع وتحليل سلوكي. حدد منطقة الهروب في البرنامج بناء على موقع الثقب المستهدف المعين قبل التحليل.

12. تحليل البيانات

1. جهز مجموعة البيانات.
   1. قم بتجميع بيانات السلوك، والتصوير، ووزن الجسم في برنامج إحصائي ورسوم بيانية.
   2. عبر عن البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM).
2. قم بإجراء تحليل إحصائي.
   1. تحليل بيانات وزن الجسم الطولي والمشي على الشعاع في هذه الدراسة باستخدام نموذج تأثيرات مختلطة خطية مع تفاعل المجموعة والزمن وتفاعلها كتأثيرات ثابتة وحيوان كتأثير عشوائي، تليها اختبارات مقارنة متعددة بعد الحدث عند الاقتضاء.
   2. حلل نتائج TST، FST، OFT، وBarnes Maze باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه العادي للبيانات الموزعة بشكل طبيعي ذات تباينات متجانسة، تليها اختبار Tukey بعد الاختبار عندما كان التحليل الأصغر الإجمالي ذا دلالة. للبيانات غير البراميترية، استخدم اختبار كروسكال-واليس يليه اختبار دان بعد الاختبار.
   3. أبلغ عن قيم p. الدقيقة كلما توفرت، مع إحصائية الاختبار، درجات الحرية، ومقياس حجم التأثير (R² ل ANO في الاتجاه الواحد). اشتقاق جميع قيم p المبلغ عنها من الاختبارات الإحصائية المحددة أعلاه وإجراء جميع التحليلات باستخدام برامج الإحصاء والرسوم البيانية.
   4. اضبط الدلالة الإحصائية عند الصفحة < 0.05.

النتائج

التصوير والتقييم العصبي المرضي للفئران المصابة ب c-TBI

لتقييم الحالة الصحية العامة والوظائف الحركية الأساسية للحيوانات، تم مراقبة أوزان الجسم وأداء المشي على العارضة وفقا للجدول الزمني الموضح في الشكل 1. تم تحليل الفروق الطولية في المجموعات باستخدام نموذج خطي مختلط التأثيرات مع حيوان كتأثير عشوائي. قبل النمذجة، لم تكن هناك فروق إحصائية في وزن الجسم بين المجموعات (الشكل 4A). بعد النمذج...

المناقشة

توضح هذه الدراسة بروتوكولا تجريبيا موحدا لتأسيس نموذج فأر متكرر لإصابة دماغية رضحية خفيفة (rmTBI) باستخدام طريقة السقوط الحر المتكرر وفقدان الوزن. من خلال تثبيت الفأر المكشوف بالجمجمة في جهاز استيريوتاكسي وتطبيق ضربات متكررة على إحداثيات محددة باستخدام وزن 20 جراما تم إسقاطه من ارتفاع 25 سم لمدة خمسة أيام متتالية، تم تحفيز نمط سلوكي يتميز بسلوك مزمن يشبه الاكتئاب دون كسر في الجمجمة أو كدمة دماغية بؤرية جسيمة. الميزة الرئيسية لهذا النموذج هي الظهور المتكرر لسلوكيات شبيهة بالاكتئاب خلال فت...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
5-0 nonabsorbable polypropylene monofilament suture	Jinhuan Medical	I303	إغلاق الجروح
Anesthesia machine	RWD Life Science	R550	بناء نماذج حيوانية
ANY-maze behavioral tracking software	Stoelting	Version 7	برمجيات سلوكية
Barnes maze	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XB108	برمجيات سلوكية
Biorender	BioRender	https://biorender.com	برمجيات رسم للبحوث العلمية
Buprenorphine	Sigma-Aldrich	Y0001108	تخدير ما بعد العمليات
Electric shaver	AUX	AUX-C5-1	إزالة الشعر قبل العمليات
Forced swimming test	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	برمجيات سلوكية
GraphPad Prism 9.5	La Jolla	9.5	برمجيات إحصائية
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10	بناء نماذج حيوانية
Mice	Charles river	C57/6N	حيوان تجريبي
Open field test	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XZ301	برمجيات سلوكية
Ophthalmic ointment	BEIJING TWINLUCK PHARMACEUTICAL	H11021342	منع جفاف القرنية أثناء التخدير
Paraformaldehyde (PFA), 4%	Biosharp	BL539A	الرشح وتثبيت الأنسجة
Phosphate-buffered saline (PBS)	Biosharp	BL1425A	الرشح وغسل الأنسجة
Povidone-iodine solution, 10%	Beyotime	27883-25g	تطهير الجلد قبل الجراحة
Preclinical Magnetic Resonance Imaging System	United Imaging Life Science Instrument	uMR9.4T	برمجيات التصوير
Scalpel blade No. 11	Jinhuan Medical	K3-11	شق الجلد أثناء الجراحة
Scalpel handle	Jinhuan Medical	K6-10	يستخدم مع نصل المشرط رقم 11
Stereotaxis instrument	RWD Life Science	68025	بناء نماذج حيوانية
Sterile gauze	HYNAUT	BK05	السيطرة على النزيف والتنظيف الجراحي
Tail suspension test	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	برمجيات سلوكية
Weight-drop impactor	RWD Life Science	68093	بناء نماذج حيوانية