مقالة منهجية

نظام مراسل غدّي قائم على الخلايا الليفية وموجه بمحفز كولاجين النوع الأول ألفا 1 الفأري لفحص الأدوية المضادة للتليف

65 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/71678

⸱

أغسطس 14, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases, Ministry of Education, Shihezi University School of Medicine, 2NHC Key Laboratory of Cardiopulmonary Rehabilitation and Functional Recovery; Research Center for Cardiopulmonary Rehabilitation, University of Health and Rehabilitation Sciences Qingdao Hospital (Qingdao Municipal Hospital), 3School of Health and Life Sciences, University of Health and Rehabilitation Sciences, 4Department of Cardiology and Institute of Vascular Medicine, Peking University Third Hospital, 5State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, Peking University Institute of Advanced Clinical Medicine, 6NHC Key Laboratory of Cardiovascular Molecular Biology and Regulatory Peptides, Beijing Key Laboratory of Cardiovascular Receptors Research, 7Research Unit of Medical Science Research Management/Basic and Clinical Research of Metabolic Cardiovascular Diseases, Chinese Academy of Medical Sciences, 8Haihe Laboratory of Cell Ecosystem

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول تطوير نظام مراسل أدينوفيروسي يعتمد على الخلايا الليفية، يتم تحفيزه بواسطة محفز الكولاجين من النوع I للفئران، وذلك لتمكين المراقبة الطولية لتنشيط الخلايا الليفية وتسهيل الفحص عالي الإنتاجية للمركبات المضادة للتليف.

الملخص

يفتقر التليف القلبي، الذي يتميز بتنشيط غير طبيعي للخلايا الليفية وترسيب مفرط للمادة الخلالية خارج الخلية، إلى علاجات محددة الهدف، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى غياب منصات فحص in vitro طولية وقابلة للتوسع وغير مدمرة. إن المقاييس النهائية التقليدية ونماذج الخلايا الجذعية كثيفة الموارد تمنع بطبيعتها المراقبة في الوقت الفعلي لتطور التليف. وللتغلب على هذه القيود، يصف هذا البروتوكول إنشاء وتحسين والتحقق من صحة نظام مراسل فلوري غدي mCherry مدفوع بمحفز الكولاجين من النوع الأول ألفا 1 (Col1a1) للفئران (Ad-mCol1a1p-mCherry) في الخلايا الليفية NIH/3T3. وتفصل هذه الطريقة الخطوات الحرجة لتعبئة الفيروس الغدي المؤتلف، وتحسين عملية التنقل (تعدد العدوى) لتقليل السمية الخلوية، وتأسيس نموذج تليف قوي محفز بعامل النمو التحويلي بيتا (TGF-β). ومن خلال تجنب الحاجة إلى تثبيت الخلايا، يتيح هذا النظام مراقبة مباشرة وطولية لنسخ الكولاجين في الخلايا الحية. وقد تم التحقق من خصوصية النموذج وموثوقيته دوائياً باستخدام مثبط مستقبل TGF-β من النوع الأول (ALK5) وهو SB431542، حيث ارتبطت القراءات الفلورية بعلامات التليف الداخلية التي تم قياسها كمياً عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم. وفي النهاية، توفر هذه المنصة ذات التكلفة المنخفضة أداة سهلة الوصول للفحص عالي الإنتاجية لعوامل جديدة مضادة للتليف، مما يسرع من الأبحاث القلبية الوعائية الانتقالية.

المقدمة

تمثل إدارة التليف القلبي تحديات سريرية كبيرة. ويتميز التليف بالتنشيط غير الطبيعي للخلايا الليفية الساكنة وتحولها إلى خلايا ليفية عضلية، وترسيب مفرط للمادة الخلالية خارج الخلوية (ECM)، وهو ما يمثل مساراً نهائياً غير قابل للانعكاس تشترك فيه حالات فشل القلب، واحتشاء عضلة القلب، وغيرها من أمراض القلب والأوعية الدموية1,2,3. ومع ذلك، تواجه استراتيجيات العلاج الحالية قيوداً كبيرة؛ إذ تعمل التدخلات التقليدية - مثل مدرات البول، وحاصرات β، ومثبطات نظام الرينين-أنجيوتنسين-ألدوستيرون - بشكل أساسي على تخفيف الإجهاد الهيموديناميكي الجهازي وتقليل التنشيط العصبي الهرموني4,5,6,7. وتفشل هذه العلاجات في استهداف تنشيط الخلايا الليفية بشكل مباشر أو وقف ترسيب الكولاجين المستمر. علاوة على ذلك، ورغم أن شلالات الإشارات مثل مسار عامل النمو التحويلي بيتا (TGF-β)/Smad، والإجهاد التأكسدي، وإعادة البرمجة الأيضية تقود هذه الحالة المرضية، فإن ترجمة هذه الرؤى إلى علاجات مباشرة مضادة للتليف تظل صعبة بسبب السميات الجهازية وآليات التوصيل غير المتخصصة8,9,10. وبناءً على ذلك، تبرز حاجة ملحة لعلاجات جديدة مضادة للتليف ومحددة الهدف. وتتمثل إحدى العقبات الرئيسية في الترجمة السريرية في غياب أنظمة تقييم وظيفية قادرة على رصد تنشيط الخلايا الليفية بدقة وديناميكية. وتظهر النماذج التجريبية التقليدية قيوداً كبيرة تحول دون إجراء فحص دوائي فعال11,12. وبينما تعيد نماذج الحيوانات in vivo محاكاة إعادة تشكيل القلب بشكل شامل، إلا أنها تعاني من الاختلافات بين الأنواع، والجداول الزمنية التجريبية الطويلة، والتكاليف العالية، وانخفاض معدل الإنتاجية11.

للتغلب على هذه العقبات، ظهرت منصات فحص متنوعة in vitro؛ ومع ذلك، لا تزال هناك عيوب منهجية حرجة. تتطلب مقايسات التألق المناعي عالية المحتوى تثبيتاً تدميرياً للخلايا ومعالجة شاقة، مما يوفر لقطة ثابتة فقط بدلاً من رصد حركية تنشيط الخلايا الليفية في الوقت الفعلي. وبالمثل، تعاني المنصات التي تدمج مراقبة المعاوقة الخالية من الوسوم مع مطيافية الكتلة (MS/MS) من عدم الخصوصية وانخفاض القابلية للتوسع، حيث يمكن الخلط بسهولة بين انخفاض المعاوقة الناتج عن السمية الخلوية العامة وبين الفعالية الحقيقية المضادة للتليف. علاوة على ذلك، تفرض أنظمة المراسل المهندسة بتقنية التكرارات العنقودية المتناظرة القصيرة منتظمة التباعد (CRISPR) التي تستخدم الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) لتتبع علامات الهيكل الخلوي (على سبيل المثال، alpha-smooth muscle actin [α-SMA]/ACTA2) حواجز ترجمية كبيرة13. فهذه النماذج القائمة على iPSCs باهظة التكلفة بشكل مفرط، ومتطلبة تقنياً، وغير متاحة إلى حد كبير للفحص الروتيني عالي الإنتاجية. فضلاً عن ذلك، فإن الاعتماد على علامات الهيكل الخلوي مثل α-SMA قد لا يعكس بدقة نقطة النهاية المرضية، حيث أن تعبيرها لا يرتبط ارتباطاً وثيقاً بالإفراز الوظيفي والترسيب المفرط لـ ECM14. ومن ثم، فإن هذه الأنظمة غير كافية لرسم خريطة طولية للاستجابات الخلوية في المراحل المبكرة للتدخلات الدوائية.

في المقابل، يصف هذا البروتوكول نظام تقرير وظيفي طولي يتم تحفيزه بواسطة محفز الكولاجين من النوع الأول ألفا 1 (Col1a1)، وذلك بهدف إنشاء منصة قوية وغير مدمرة لمراقبة تنشيط الخلايا الليفية. وبما أن الكولاجين من النوع الأول هو المكون السائد في المصفوفة خارج الخلوية (ECM) الذي يتم ترسيبه أثناء إعادة تشكيل القلب، فإن رصد التنشيط النسخي للجين المشفر له، Col1a1، يعمل كقراءة مباشرة وذات صلة مرضية لتنشيط الخلايا الليفية. يتيح هذا النموذج القائم على محفز Col1a1 مراقبة مستمرة على المستوى الجزيئي للعمليات التليفية، مما يوفر منصة حساسة وطولية وقابلة للقياس ومُحسَّنة لفحص الأدوية القائم على الآلية.

البروتوكول

نؤكد أن جميع التجارب قد أُجريت وفقاً للإرشادات المؤسسية والوطنية. ونظراً لأن هذه الدراسة اعتمدت حصرياً على خط خلايا ليفية جنينية لفئران سويسرا المعتمد من NIH (NIH/3T3) ونظام المراسل mCol1a1p-mCherry، ولم تتضمن أي حيوانات فقارية أو أجنة أو مشاركين بشريين، فإن الإجراءات الموضحة في هذه المخطوطة لم تكن تتطلب موافقة أخلاقية من مجلس مراجعة مؤسسي.

أُجريت جميع الإجراءات التي تضمنت ناقلات فيروسية غدانية مؤتلفة وفقًا للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية وممارسات المستوى الثاني من السلامة البيولوجية (BSL-2) القياسية. وقد تم تنفيذ عمليات التعامل مع الفيروسات، والنقل الجيني، والتخزين، والتخلص من النفايات باستخدام كبائن السلامة البيولوجية المعتمدة ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة. كما عُقمت النفايات السائلة التي تحتوي على مواد فيروسية غدانية باستخدام محلول مبيض مُعد حديثًا قبل التخلص منها، وعُقمت المستهلكات الملوثة بجهاز التعقيم البخاري (autoclave) وفقًا لبروتوكولات السلامة البيولوجية المؤسسية. أما الانسكابات العرضية، فقد تم تطهيرها فورًا باستخدام عوامل مضادة للفيروسات معتمدة باتباع إجراءات الاستجابة للانسكابات المؤسسية.

1. نظرة عامة على سير العمل التجريبي

  1. توليد فأر Col1a1 الفيروس الغداني المؤشب الذي يتم تحفيزه بواسطة المحفز كما هو موضح في الخطوة 2.
  2. تحسين ظروف التنبيغ الفيروسي في الخلايا الليفية من سلالة NIH/3T3 كما هو موضح في الخطوة 3.
  3. إنشاء نظام استجابي لـ TGF-β في المختبر نموذج مراسل التليف كما هو موضح في الخطوة 4.
  4. تحقق من استقرار النموذج وخصوصيته وقابليته للتكرار البيولوجي باستخدام تحفيز TGF-β المعتمد على الوقت والجرعة كما هو موضح في الخطوة 4.
  5. قم بإجراء التثبيط الفارماكولوجي باستخدام SB431542 كما هو موضح في الخطوة 5.
  6. أجرِ تحليلات مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qPCR) اللاحقة كما هو موضح في الخطوة 5.
    ملاحظة: يُرجى الرجوع إلى الشكل 1أ للحصول على نظرة عامة تخطيطية لسير العمل التجريبي. يرجى الرجوع إلى الـ جدول المواد للأجهزة والمواد الكيميائية التجريبية.

مخطط للمراسل الغدوي mCol1a1p-mCherry؛ وعملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، واستنساخ البلازميد، وفحص الخلايا الليفية.
الشكل 1. سير عمل إنشاء والتحقق من صحة نظام المراسل الغدوي mCol1a1p-mCherry في الخلايا الليفية. (أ) نظرة عامة تخطيطية على بناء نظام المراسل الغدوي (AdV) mCol1a1p-mCherry وسير العمل التجريبي للتحقق من النموذج في الخلايا الليفية NIH/3T3. يتضمن سير العمل استنساخ المحفز، وتجميع الفيروس الغدوي المؤتلف، وتغليف الفيروس في خلايا HEK293، وتحسين تعدد العدوى (MOI)، وفحص الفلورة عالي المحتوى اللاحق. (ب) صور فلورية ممثلة للخلايا الليفية NIH/3T3 المصابة بالفيروس الغدوي Ad-mCol1a1p-mCherry عند قيم MOI تبلغ 0، 1، 10، 100، و1000. صُبغت النوى بصبغة Hoechst 33342 (باللون الأزرق)، وتشير فلورة mCherry (باللون الأحمر) إلى نشاط محفز Col1a1. تم قياس شدة الفلورة باستخدام التصوير عالي المحتوى ومعايرتها وفقاً لأعداد النوى. تم اختيار MOI بقيمة 100 للتجارب اللاحقة بناءً على تعبير قوي ومتجانس للمراسل مع حد أدنى من التغيرات المورفولوجية. أشرطة القياس = 200 µm. تم إنشاء هذا الشكل باستخدام BioRender.com بتراخيص معتمدة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. بناء وتعبئة وتضخيم الفيروس الغدي الحامل للمروج mCol1a1

  1. بناء الناقل الغدي المؤتلف
    1. قم باستنساخ قطعة محفز Col1a1 للفأر بطول 2354 bp (الإحداثيات الجينية: chr11:94824779–94827132؛ من −2271 إلى +83 bp بالنسبة لموقع بدء النسخ [TSS]) في المنطقة الواقعة upstream من الجين المراسل mCherry داخل ناقل المكوك الغدي pDC315.
      ملاحظة: تتوفر التسلسلات الكاملة لمحفز Col1a1 وخريطة البلازميد التفصيلية لـ pDC315-mCol1a1p-mCherry في الملف التكميلي 1 والشكل التكميلي 1.
    2. قم بخطية (Linearize) ناقل pDC315 باستخدام BamHI وKpnI. ثم قم بتضخيم قطعة المحفز المدرجة باستخدام بادئات تحتوي على أذرع تماثل بطول 15–25 bp.
      ملاحظة: استخدم استراتيجية استنساخ سلسة تعتمد على إعادة التركيب المتماثل لتسهيل عملية إعادة التركيب in vitro.
    3. تحقق من البلازميد الناتج عن طريق فحص PCR وتسلسل سانجر.
      ملاحظة: افحص بدقة تسلسل نقطة الالتقاء بين المحفز والمراسل للتأكد من عدم وجود انزياحات في إطار القراءة (frameshifts) أو كودونات وقف مبكرة.
    4. قم بإنتاج الفيروس الغدي المؤتلف باستخدام نظام AdMax من خلال إعادة التركيب داخل الخلايا بوساطة Cre.
      ملاحظة: يحتوي بلازميد الهيكل pBHGloxΔE1,3Cre على جينوم Ad5 غير متكاثر مع عمليات حذف في E1/E3 وكاسيت تعبير لإنزيم Cre recombinase، مما يسهل إعادة التركيب المحددة للموقع مع موقع loxP الموجود على ناقل المكوك.
    5. قم بإجراء ترصيف مشترك (Co-transfect) لخلايا HEK293 باستخدام ناقل المكوك pDC315-mCol1a1p-mCherry المعتمد وبلازميد الهيكل الغدي pBHGloxΔE1,3Cre.
  2. تعبئة الفيروس الغدي وتضخيمه
    1. حافظ على خلايا HEK293 في وسط Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) مكمل بـ 10% من مصل البقر الجنيني (FBS). استخدم خلايا ذات ممرات منخفضة (<20 passages) لتعبئة الفيروس الغدي.
    2. قم بزراعة خلايا HEK293 بكثافة تلاقي (confluence) تتراوح بين 30%–40% قبل 24 ساعة من الترصيف للوصول إلى تلاقي بنسبة 50%–60% في وقت الترصيف.
    3. قم بإجراء ترصيف مشترك لخلايا HEK293 باستخدام 5 µg من بلازميد المكوك و5 µg من بلازميد المساعدة pBHGloxΔE1,3Cre باستخدام كاشف الترصيف Lipofectamine 2000.
      ملاحظة: حافظ على نسبة الحمض النووي إلى الكاشف بمقدار 1:1 (10 µg إجمالي DNA إلى 10 µL من كاشف الترصيف).
    4. ازرع الخلايا المرصفة عند 37°C مع 5% CO₂ وراقبها يومياً لرصد التأثيرات المرضية الخلوية (cytopathic effects).
      ملاحظة: قد يستغرق ظهور التأثيرات المرضية الخلوية الأولية (CPE) من 7–14 يوماً. إذا أصبح الوسط حمضياً (أصفر اللون)، قم بإجراء تبديل لطيف لنصف الوسط دون إزعاج الخلايا.
    5. قم بحصد الخلايا والسائل الطافي عند ملاحظة التأثيرات المرضية الخلوية النموذجية، والتي تتميز بتدوير الخلايا وانكماشها، وعند انفصال 50% على الأقل من الخلايا عن سطح المزرعة.
      ملاحظة: يتم الوصول إلى هذه المرحلة عادةً بعد 10–15 يوماً من الترصيف.
    6. قم بإجراء ثلاث دورات من التجميد والإذابة عن طريق تجميد العينات عند −70°C لمدة 30 min وإذابتها في حمام مائي عند 37°C.
    7. قم برج المعلق بجهاز Vortex لمدة 30 s بعد كل خطوة إذابة لتسهيل تحلل الخلايا.
      ملاحظة: تجنب الحضانة المطولة عند 37°C أثناء الإذابة للحفاظ على استقرار الفيروس.
    8. جهز تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف للمحلل الفيروسي (10−1 إلى 10−13) باستخدام DMEM كامل. أضف 90 µL من كل تخفيف فيروسي إلى خلايا HEK293 المزروعة في أطباق ذات 96 بئراً باستخدام 10 آبار مكررة لكل تخفيف.
      ملاحظة: تم تحديد عيار فيروسي يبلغ ≥1 × 109 PFU/mL كنقطة نهاية تضخيم كافية للتنقية اللاحقة.
    9. قم بتصفية 10 mL من المحلل الفيروسي الخام عبر مرشح 0.45 µm لإزالة الحطام الخلوي.
    10. عالج المحلل المصفى بإنزيم Benzonase nuclease بتركيز (10 U/mL) عند 37°C لمدة 30 min.
    11. قم بتنقية الفيروس الغدي المؤتلف باستخدام Adeno-X Virus Purification Kit وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: اخلط المحلل مع 1× dilution buffer قبل تحميله على مرشح التنقية المتوازن مسبقاً. اغسل المرشح بـ 1× Wash Buffer واستخلص الفيروس المنقى باستخدام 3 mL من 1× Elution Buffer.
    12. قم بحضانة الأطباق لمدة 10 أيام وقيم التأثيرات المرضية الخلوية (CPE) تحت المجهر الضوئي. سجل الـ CPE الإيجابي بناءً على تدوير الخلايا وانفصالها المميز. احسب العيار الفيروسي المعدي باستخدام طريقة Spearman–Karber بناءً على تسجيل CPE.
      ملاحظة: تأكد من أن المخزون الفيروسي النهائي يصل إلى 1 × 1011 PFU/mL على الأقل للتطبيقات اللاحقة.
    13. قم بتقسيم الفيروس الغدي المنقى إلى حصص (Aliquot) وخزن المخزون الفيروسي عند −80°C.
      ملاحظة: خزن حصص الفيروس الغدي المنقى عند −80°C للحفظ طويل الأمد. تجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة للحفاظ على القدرة الإعدائية للفيروس.

3. زراعة الخلايا وتحسين ظروف العدوى الفيروسية

  1. يتم استزراع خلايا NIH/3T3 الليفية في وسط DMEM/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) مضاف إليه 10% FBS و1% penicillin–streptomycin.
    ملاحظة: استخدم الخلايا ما بين الممرات 3 و8 التي وصلت إلى درجة تلاحم (confluence) تتراوح بين 70% و80% في قارورة المصدر لضمان اتساق حالة الخلايا.
  2. تُبذر خلايا NIH/3T3 الليفية في أطباق ذات 384 بئراً بمعدل 4 × 103 خلية لكل بئر في 40 µL من وسط استزراع كامل.
  3. تُحضن الخلايا عند 37°C مع 5% CO₂ لمدة 12 h للسماح بالتصاق الخلايا ودخولها في مرحلة النمو اللوغاريتمي.
    ملاحظة: لتقليل التوزيع غير المتكافئ للخلايا وتأثيرات الحواف، تُترك الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 20–30 min قبل التحضين. تُملأ الآبار الخارجية بمحلول الفوسفات المنظم الملحى (PBS) المعقم أو بالماء المعقم.
  4. تُصيب الخلايا بالفيروس الغدي المؤتلف بمضاعفات عدوى (MOIs) تتراوح بين 1–1,000 إلى جانب عينة ضابطة غير مصابة.
    ملاحظة: يتم حساب حجم الفيروس الغدي المطلوب باستخدام الصيغة التالية:

    صيغة الحمل الفيروسي V=N×MOI/T، معادلة رياضية لأبحاث وتحليلات علم الفيروسات.
    هنا، V هو حجم المخزون الفيروسي الغدي (mL)، وN هو عدد الخلايا المبذورة لكل بئر (4 × 103)، وMOI هو مضاعف العدوى المطلوب، وT هو العيار الفيروسي المعدي (PFU/mL). كان المخزون الفيروسي المستخدم في هذه الدراسة يتمتع بعيار معدٍ قدره 1 × 1011 PFU/mL، وفقاً لما تم تحديده بطريقة Spearman–Karber الموضحة في الخطوة 2.2.12.
  5. يجب التأكد من أن حجم المخزون الفيروسي المضاف لا يتجاوز 10% من الحجم الإجمالي للبئر.
    ملاحظة: قد تؤدي أحجام المخزون الفيروسي المفرطة إلى تغيير pH الوسط وتحفيز سمية خلوية غير نوعية.
  6. يُستبدل الوسط المحتوي على الفيروس بـ 40 µL من وسط استزراع كامل طازج بعد 24 h من العدوى.
    ملاحظة: استخدم DMEM/F12 مضاف إليه 10% FBS و1% penicillin–streptomycin، بما يتوافق مع الخطوة 3.1.
  7. يتم إجراء تبديل الوسط باستخدام معالج سوائل آلي منخفض السرعة أو عن طريق إمالة رؤوس الماصة متعددة القنوات بعناية مقابل الجدار الجانبي العلوي لكل بئر.
    ملاحظة: تجنب الشفط القياسي بالتفريغ عند التعامل مع الأطباق ذات 384 بئراً لتقليل انفصال الخلايا.
  8. يُحدد مضاعف العدوى (MOI) الأمثل بأنه أدنى جرعة فيروسية تنتج فلورة mCherry مرئية ومتجانسة مع الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا وتعدادات النوى بشكل مشابه للخلايا الضابطة غير المصابة.
    ملاحظة: يتم تقييم تعبير البروتين المراسل باستخدام تعدادات النوى المصبوغة بـ Hoechst والتصوير الفلوري. يجب أن تحتفظ الخلايا بمورفولوجيتها المغزلية المميزة دون تدوير أو انفصال. قد تؤدي مضاعفات العدوى العالية بشكل مفرط إلى تنشيط قاعدي لـ mCherry من خلال استجابات الإجهاد الخلوي. تظهر نتائج الفلورة النموذجية عند مضاعفات عدوى مختلفة في الشكل 1B.
  9. يتم اختيار مضاعف العدوى (MOI) المحسّن لجميع التجارب اللاحقة.
    ملاحظة: في هذه الدراسة، تم اختيار MOI قدره 100 للتجارب اللاحقة.

4. تقييم استقرار النموذج باستخدام تحفيز TGF-β

  1. أصِب الخلايا الليفية NIH/3T3 بالفيروس الغدي المؤتلف عند تعددية عدوى (MOI) محسنة قدرها 100، كما تم تحديده في الخطوة 3.9.
  2. أجْرِ تجويعاً مصلیاً للخلايا الليفية في وسط DMEM/F12 يحتوي على 0.2% FBS لمدة 12 h قبل التحفيز بـ TGF-β.
    ملاحظة: تم إجراء التجويع المصلي لمزامنة الخلايا وتقليل التنشيط الأساسي لمروج Col1a1.
  3. حضّر محلولاً مركزاً من TGF-β البشري المؤتلف بتركيز 100 µg/mL باستخدام 4 mM HCl يحتوي على 0.1% bovine serum albumin (BSA).
    ملاحظة: قم بتقسيم المحلول المركز لـ TGF-β إلى أحجام صغيرة واحفظها في درجة حرارة −80°C لتجنب دورات التجميد والإذابة المتكررة.
  4. عالج الخلايا بتدرج في تركيز TGF-β يتراوح من 0–40 ng/mL في ست مكررات بيولوجية مستقلة.
    ملاحظة: استُخدم تركيز 0 ng/mL كمجموعة ضابطة غير محفزة.
  5. حضّن الخلايا المحفزة عند 37°C مع 5% CO₂ لمدة 24، أو 48، أو 72 h. استخدم أطباقاً متوازية منفصلة لكل نقطة زمنية للتصوير لتقليل السمية الضوئية التراكمية.
  6. اصبغ الخلايا بمحلول Hoechst 33342 بتركيز نهائي قدره 2.5 µg/mL لمدة 15 min قبل التصوير.
    ملاحظة: حضّر محلول الصبغ بتخفيف المحلول المركز لـ Hoechst 33342 بتركيز 10 mg/mL بنسبة 1:4,000 في PBS معقم. أجرِ عملية الصبغ في ظروف محمية من الضوء لتقليل التبييض الضوئي.
  7. التقط صور الفلورة باستخدام نظام تصوير عالي المحتوى مزود بعدسة شيئية جافة 10×.
  8. التقط خمسة حقول غير متداخلة لكل بئر في تنسيق طبق 384-well لكل حالة تجريبية.
    ملاحظة: حافظ على إعدادات تصوير متطابقة عبر جميع المجموعات التجريبية لضمان القابلية للمقارنة. استخدم نظام التركيز التلقائي المعتمد على الليزر وحافظ على ظروف التحكم البيئي عند 37°C مع 5% CO₂ أثناء تصوير الخلايا الحية.
  9. التقط صور فلورة mCherry باستخدام إثارة بطول موجي 561 nm، ومرشح انبعاث نطاق تمرير 600/52 (BP600/52)، وزمن تعريض 200 ms.
  10. التقط صور فلورة Hoechst باستخدام إثارة بطول موجي 405 nm، ومرشح انبعاث BP445/45، وزمن تعريض 30 ms.
    ملاحظة: اضبط كسب الكاميرا (gain) على 1.0 والتقط جميع الصور بدقة الكاميرا الكاملة باستخدام تجميع بكسلات 1 × 1 للحفاظ على كشف الفلورة الخطي وزيادة الدقة المكانية.
  11. حلل الصور المكتسبة باستخدام برنامج تحليل الصور CellPathfinder.
  12. حدد النوى في قناة Hoechst كأجسام أولية باستخدام قطر نووي مرجعي قدره 20 µm ونطاق مساحة يتراوح بين 20–400 µm2.
  13. حدد مناطق الاهتمام (ROIs) السيتوبلازمية في قناة mCherry عن طريق التوسع من حدود النواة باستخدام قطر خلوي مرجعي قدره 60 µm.
    ملاحظة: طبق مرشح "استبعاد الحواف" (Exclude Edge) أثناء عملية التقسيم لإزالة الخلايا الجزئية التي تلامس حدود الصورة.
  14. احسب متوسط شدة الفلورة لكل خلية محددة، وحدد متوسط شدة الفلورة لكل بئر من جميع الحقول الخمسة التي تم التقاطها.

5. التحقق من موثوقية النموذج باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction)

  1. قم بإصابة الخلايا الليفية NIH/3T3 بالفيروس الغداني المؤتلف عند تعددية عدوى (MOI) محسنة تبلغ 100، كما هو موضح في الخطوة 3.9.
  2. عالج الخلايا مسبقاً بمركب SB431542 لمدة 30-60 دقيقة قبل التحفيز بـ TGF-β.
    ملاحظة: قم بتحضير محلول مخزون من SB431542 بتركيز 20 mM في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) واحفظ الحصص عند −20°C.
  3. عالج الخلايا بـ 10 ng/mL من TGF-β وبمركب SB431542 بتركيزات نهائية تبلغ 1 و5 و10 و15 µM. قم بتضمين مجموعة ضابطة بالمذيب تحتوي على 0.1% (v/v) من DMSO بدون معالجة بـ SB431542.
    ملاحظة: حافظ على التركيز النهائي لـ DMSO عند 0.1% (v/v) في جميع مجموعات المعالجة.
  4. قم بتحضير محلول العمل لـ TGF-β باستخدام طريقة التخفيف على خطوتين.
    ملاحظة: خفف محلول مخزون TGF-β بتركيز 100 µg/mL (المحضر في 4 mM HCl المحتوي على 0.1% BSA) بنسبة 1:100 في PBS معقم قبل مزيد من التخفيف في وسط زراعة كامل للوصول إلى تركيز العمل النهائي البالغ 10 ng/mL.
  5. قم بتحضين الخلايا المعالجة في أطباق ذات 6 آبار لمدة 24 ساعة عند 37°C مع 5% CO₂.
  6. اجمع 2 mL من طافي المزرعة من كل بئر لتحليل ELISA.
  7. قم بطرد مركزي للطوفات المجموعة عند 1,000 × g لمدة 5 دقائق عند 4°C لإزالة الحطام الخلوي.
  8. قسم الطوفات المصفاة إلى حصص واحفظها عند −80°C حتى إجراء تحليل ELISA.
    ملاحظة: يمكن تخزين الطوفات المصفاة عند −80°C قبل تحليل ELISA.
  9. اغسل الخلايا الملتصقة بلطف باستخدام PBS مبرد بالثلج بعد إزالة الطافي.
  10. أضف 1 mL من كاشف TRIzol مباشرة إلى كل بئر لتحليل الخلايا.
    ملاحظة: قم بسحب المحلل بالماصة عدة مرات لضمان التجانس التام قبل نقل العينات إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة. يمكن تخزين محللات RNA عند −80°C قبل استخلاص RNA.
  11. استخلص RNA الكلي من المحللات لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (RT-qPCR).
  12. أجرِ النسخ العكسي باستخدام 1 µg من RNA الكلي.
    ملاحظة: أجرِ النسخ العكسي باستخدام ظروف التفاعل التالية: 25°C لمدة 10 دقائق، و42°C لمدة 15 دقيقة، و85°C لمدة دقيقتين.
  13. أجرِ تفاعل PCR الكمي باستخدام PerfectStart Green qPCR SuperMix. حضر كل تفاعل في حجم نهائي قدره 20 µL يحتوي على 5 µL من قالب الحمض النووي المتمم (cDNA).
  14. شغل تفاعلات qPCR باستخدام ظروف الدورات التالية: مسخ أولي عند 94°C لمدة 30 ثانية، يليه 40 دورة من 94°C لمدة 5 ثوانٍ، و60°C لمدة 15 ثانية، و72°C لمدة 10 ثوانٍ.
    ملاحظة: أجرِ تحليل منحنى الانصهار بعد التضخيم للتأكد من خصوصية المنتج.
  15. قم بتعيير التعبير الجيني لـ Col1a1 بالنسبة لـ 18S rRNA كضابط داخلي.
    ملاحظة: تتوفر جميع تسلسلات البادئات في الجدول التكميلي 1.
  16. قم بقياس مستويات بروتين الكولاجين من النوع الأول المفرز في الطوفات المصفاة باستخدام ELISA وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة. يتراوح نطاق المنحنى القياسي لمقايسة ELISA للكولاجين من النوع الأول في الفئران بين 0.78–50 ng/mL، مع حساسية كشف للمقايسة تبلغ 0.37 ng/mL.
  17. حلل جميع المعايير والعينات في مكررات تقنية وقم بقياس الكثافة الضوئية (OD) عند 450 nm باستخدام قارئ الأطباق الدقيقة.
    ملاحظة: استخدم الطوفات المصفاة غير المخففة لزيادة حساسية المقايسة للكشف عن Col1a1 المفرز.

النتائج

يظهر في الشكل 1A مخطط عام لعمليتي بناء وتعبئة الفيروس الغدي المؤتلف mCol1a1p-mCherry. حيث تم استنساخ محفز Col1a1 الخاص بالفئران في المنطقة العلوية (upstream) من الجين المراسل mCherry ودمجه في ناقل فيروسي غدي، تلا ذلك تعبئة الفيروس وتضخيمه في خلايا HEK293. يوضح سير العمل الخطوات التجريبية الرئيسية، بما في ذلك العدوى الفيروسية، والتحفيز التليفي، والتدخل الدوائي، وقراءة الإشارة القائمة على الفلورة. يوفر هذا المخطط إطاراً مرئياً لتنفيذ النظام المراسل ويدعم تفسير تجارب التحقق الوظيفي اللاحقة.

لتحديد الظروف المثلى للعدوى الفيروسية، تم إصابة الخلايا الليفية NIH/3T3 بفيروس غدي mCol1a1p-mCherry عبر مجموعة من تعدديات العدوى (MOIs). وكما هو موضح في الشكل 1B، زادت شدة فلورية mCherry مع زيادة الـ MOI. في مستويات الـ MOI المنخفضة، كان تعبير المراسل ضعيفاً وغير متجانس، مما يمثل حالة غير مثالية للتحليل الكمي. أما في مستويات الـ MOI العالية، أظهرت الخلايا تغيراً في المورفولوجيا، بما في ذلك التكور والانفصال، مما يشير إلى آثار سمية خلوية. وقد أنتجت قيمة MOI تبلغ 100 فلورية قوية ومتجانسة مع الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا، وبناءً على ذلك تم اختيارها كظرف مثالي للتجارب اللاحقة.

عند تعددية العدوى (MOI) المثلى، تم تحفيز الخلايا الليفية NIH/3T3 بتركيزات متزايدة من TGF-β. وقِيست فلورة المراسل عند 24 و48 و72 ساعة بعد التحفيز. وكما هو موضح في الشكل 2A–C، زادت كثافة فلورة mCherry بطريقة تعتمد على التركيز في جميع النقاط الزمنية. كما ازدادت كثافة الإشارة تدريجياً من 24 إلى 72 ساعة، مما يدل على استجابة تعتمد على الوقت. تمثل هذه النتائج نتيجة إيجابية، مما يشير إلى أن نظام المراسل يستجيب طولياً وبشكل قابل للتكرار للتحفيز التليفي.

صور مجهر فلوري توضح تأثيرات TGF-β على كثافة mCherry في الخلايا، مع نتائج الرسم البياني الشريطي.
الشكل 2. تفعيل المراسل mCol1a1p-mCherry المعتمد على الوقت والجرعة بواسطة تحفيز عامل النمو التحويلي بيتا (TGF-β). تم تحفيز الخلايا الليفية NIH/3T3 المصابة بالفيروس الغدي Ad-mCol1a1p-mCherry عند MOI المحسن بتركيزات متزايدة من TGF-β. تظهر الصور الفلورية التمثيلية والتحليلات الكمية المقابلة لنشاط المراسل mCherry بعد 24 ساعة (A)، و48 ساعة (B)، و72 ساعة (C) من التحفيز. يعكس فلورسنت mCherry (الأحمر) نشاط محفز Col1a1، وتم صبغ النوى باستخدام Hoechst 33342 (الأزرق). تم قياس كثافة الفلورسنت كمياً باستخدام التصوير عالي المحتوى وتم تطبيعها بالنسبة لأعداد النوى. تم عرض البيانات كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط (SEM) من ست مكررات بيولوجية مستقلة لكل حالة. أُجريت المقارنات الإحصائية بالنسبة لمجموعة التحكم غير المعالجة باستخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعاً باختبار Tukey للمقارنات المتعددة. تم الحفاظ على ثبات معاملات التصوير عبر جميع الظروف التجريبية. أشرطة المقياس = 200 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لتقييم خصوصية المسار، تمت معالجة الخلايا الليفية NIH/3T3 بمثبط مستقبل TGF-β من النوع الأول (ALK5) وهو SB431542 تحت تحفيز TGF-β. وكما هو موضح في الشكل 3A–C، قلل SB431542 من شدة فلورة mCherry بطريقة تعتمد على الجرعة. وقد لوحظ تثبيط لنشاط المراسل عبر جميع النقاط الزمنية المفحوصة، مع تثبيط أكبر عند تركيزات أعلى من المثبط. وتمثل هذه النتائج نتيجة إيجابية، مما يشير إلى أن تنشيط المراسل يعتمد على إشارات TGF-β ويمكن تعديله دوائياً.

المجهر الفلوري، mCherry، Hoechst، مقايسة TGF-β+SB43 لمدة 24-72 ساعة، تحليل الكثافة، رسوم بيانية.
الشكل 3. يعمل SB431542 على تثبيط تنشيط مراسل mCol1a1p-mCherry المستحث بواسطة TGF-β بطريقة تعتمد على الوقت والجرعة. تم تحفيز الخلايا الليفية NIH/3T3 المصابة بالفيروس الغدي Ad-mCol1a1p-mCherry بواسطة TGF-β (10 ng/mL) بوجود تركيزات متزايدة من مثبط مستقبل عامل النمو التحويلي بيتا من النوع الأول (ALK5) وهو SB431542 (0، 1، 5، 10، و15 µM؛ ويرمز له اختصاراً بـ SB43 في لوحات الشكل). تظهر صور الفلورة التمثيلية والتحليلات الكمية المقابلة لها عند 24 ساعة (A)، و48 ساعة (B)، و72 ساعة (C) بعد المعالجة. تعكس فلورة mCherry (باللون الأحمر) نشاط محفز Col1a1، وتم صبغ النوى بصبغة Hoechst 33342 (باللون الأزرق). تم قياس كثافة الفلورة باستخدام التصوير عالي المحتوى ومعايرتها بالنسبة لأعداد النوى. يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM من ست مكررات بيولوجية مستقلة لكل حالة. أجريت المقارنات الإحصائية بالنسبة للمجموعة المعالجة بـ TGF-β باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه متبوعاً باختبار Tukey للمقارنات المتعددة. تم الحفاظ على ثبات معاملات التصوير عبر جميع الظروف التجريبية. أشرطة المقياس = 200 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

لتقييم ما إذا كان نشاط المراسل يعكس الاستجابات التليفية الداخلية، تم تحليل الخلايا الليفية NIH/3T3 تحت ظروف محسنة من العدوى والتحفيز والتثبيط. تم تلخيص سير العمل التجريبي المستخدم للتحقق من صحة نظام المراسل في الشكل 4A. قيست المؤشرات المرتبطة بالتليف على مستويي البروتين وmRNA. وكما هو موضح في الشكل 4B–C، أظهر اختبار ELISA زيادة في إفراز البروتينات المرتبطة بالتليف بعد التحفيز بـ TGF-β، والتي انخفضت عند المعالجة بـ SB431542. وبشكل متسق، أظهر اختبار RT-qPCR تغيرات مقابلة في تعبير الجينات المرتبطة بالتليف، بما في ذلك Col1a1. ويمثل التوافق بين قراءة الفلورية وإفراز البروتين والتعبير الجيني نتيجة تحقق إيجابية، مما يشير إلى أن نظام المراسل يعكس التنشيط التليفي تحت هذه الظروف.

سير العمل التجريبي للتحقق من صحة النموذج. تحليل ELISA وRT-qPCR لـ mRNA الخاص بـ Col1a1، وإفراز الكولاجين.
الشكل 4. التحقق من صحة نظام المراسل mCol1a1p-mCherry عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بالنسخ العكسي (RT-qPCR) والمقايسة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA). (A) نظرة عامة تخطيطية لسير العمل التجريبي للتحقق من صحة نظام المراسل. تم تحفيز الخلايا الليفية NIH/3T3 باستخدام TGF-β (10 ng/mL) ومعالجتها بتركيزات متزايدة من مثبط مستقبل TGF-β وهو SB431542 (SB43). جُمعت نواتج تحلل الخلايا وسوائل المزرعة العلوية لإجراء التحليلات اللاحقة. (B) التحليل الكمي للتعبير عن الحمض الريبي النووي المرسال (mRNA) لـ Col1a1 الذي تم تحديده بواسطة RT-qPCR تحت تحفيز TGF-β عبر تدرج تركيز من SB431542. تم تطبيع مستويات التعبير النسبي لـ Col1a1 mRNA بالنسبة إلى الحمض الريبي النووي الريبوسومي 18S (18S rRNA) وتم التعبير عنها كـ fold change بالنسبة لمجموعة التحكم غير المعالجة. (C) تقدير كمية مستويات الكولاجين من النوع الأول المفرز في سوائل المزرعة العلوية باستخدام ELISA تحت نفس الظروف التجريبية المذكورة في اللوحة B. يتم التعبير عن تركيزات الكولاجين من النوع الأول بوحدة ng/mL. تُمثل البيانات كـ mean ± SEM من ست مكررات بيولوجية مستقلة لكل حالة. أجريت المقارنات الإحصائية بالنسبة للمجموعة المعالجة بـ TGF-β باستخدام one-way ANOVA متبوعاً باختبار Tukey للمقارنات المتعددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1. التسلسل النيوكليوتيدي الكامل لقطعة محفز Col1a1 للفأر المستخدمة في بناء ناقل المراسل الغدي. تتوافق منطقة المحفز البالغ طولها 2354 bp مع الإحداثيات الجينية chr11:94824779–94827132 (NC_000077.7) وتمتد من −2271 إلى +83 bp بالنسبة لموقع بدء النسخ (TSS). تم استنساخ قطعة المحفز في المنبع من جين المراسل mCherry في الناقل المكوك pDC315 لإنشاء نظام مراسل غدي مأشوب.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي S1. تواليات البادئات المستخدمة في تحليل RT-qPCR. تم إدراج تواليات البادئات الأمامية والعكسية لـ Col1a1 والجين المرجعي الداخلي 18S rRNA باتجاه 5′–3′.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S1. خريطة البلازميد لناقل المكوك الغدي pDC315-mCol1a1p-mCherry. تم إدراج قطعة محفز Col1a1 للفئران بطول 2354 bp في المنبع من الجين المراسل mCherry باستخدام استراتيجية استنساخ سلسة تعتمد على إعادة التركيب المتماثل لإنتاج بنية المراسل الغدي المؤشابة.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

يساهم التليف القلبي في تطور فشل القلب، ويحد نقص منصات الفحص الطولي من تطوير علاجات فعالة مضادة للتليف2,13. وتعتمد الطرق التقليدية لتقييم الفعالية المضادة للتليف، بما في ذلك لطخة ويسترن (Western blotting)، وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR)، والتلوين المناعي الفلوري، على قياسات نقطة النهاية التي تتطلب تحلل الخلايا أو تثبيتها. وتمنع هذه المنهجيات المراقبة في الوقت الحقيقي لتطور التليف في الخلايا الحية، وتحد من قابليتها للتطبيق في التحليلات الطولية وعالية الإنتاجية. بالإضافة إلى ذلك، غالباً ما يكون إنشاء خطوط خلايا مراسلة مستقرة من خلال ترانسفكشن البلازميد أو التكامل الفيروسي البطيء مقيداً بانخفاض كفاءة الترانسفكشن في الخلايا الليفية، والتباين المرتبط بالتكامل الجينومي العشوائي، والإسكات التدريجي للتعبير عن المراسِل عبر الممرات الخلوية المتتالية15.

بينما تُستخدم النواقل اللنتيفيروسية بشكل متكرر لإيصال الجينات في الخلايا الليفية NIH/3T3، فقد استخدمت دراستنا تحديداً نظام تقرير أدينوفيروسي للحفاظ على الدقة الفسيولوجية للخلايا الليفية. تندمج الفيروسات اللنتيفيروسية بشكل دائم في جينوم المضيف، مما يحمل خطراً متأصلاً بحدوث طفرات إدراجية قد تؤدي دون قصد إلى تعطيل شبكات الإشارات الداخلية، وهو أمر بالغ الأهمية عند تقييم الشلالات المعقدة مثل التليف الناتج عن TGF-β. وفي المقابل، تظل النواقل الأدينوفيروسية خارج الجينوم (episomal)، مما يضمن السلامة الجينومية. علاوة على ذلك، فإن تجاوز عملية الانتقاء بالمضادات الحيوية الطويلة المطلوبة لسلالات الخلايا اللنتيفيروسية المستقرة يمنع التحولات المظهرية الناجمة عن العلاج، مما يسمح بتعبير عابر سريع وقوي وعالي الكفاءة يتناسب مع الفحص عالي الإنتاجية.

لمعالجة هذه القيود التقنية، يوفر نظام التقرير الفيروسي الغدي mCherry المدفوع بمحفز mCol1a1 طريقة لمراقبة تنشيط الخلايا الليفية in vitro. يجمع هذا النظام بين التوصيل الفيروسي الغدي ومحفز Col1a1 الفأري، وهو علامة نسخية مرتبطة بتنشيط الخلايا الليفية وترسيب المادة الخلالية خارج الخلوية (ECM)16. إن ربط نشاط محفز Col1a1 بمراسل فلوري يتيح تصور وقياس الاستجابات النسخية التليفية في الخلايا الحية. تزداد فلورة المراسل بعد التحفيز بـ TGF-β في نقاط زمنية متعددة، مما يعكس التقدم الطولي لتنشيط الخلايا الليفية. ويشير تثبيط نشاط المراسل بواسطة مثبط ALK5 المسمى SB431542 إلى تنظيم يعتمد على المسار. إن التطابق بين فلورة المراسل وتعبير الجينات والبروتينات الداخلية المرتبطة بالتليف، كما تم قياسه بواسطة RT-qPCR وELISA، يدعم استخدام هذه الطريقة لمراقبة الاستجابات التليفية في ظل هذه الظروف.

استخدمت الدراسات الحديثة الخلايا القلبية المشتقة من الخلايا الجذعية المحفزة متعددة القدرات (iPSC) مقترنة بالاضطراب الجيني القائم على نظام CRISPR-Cas9 لفحص الأدوية واكتشاف الأهداف العلاجية11,13. على سبيل المثال، تم تطبيق الخلايا الليفية القلبية المشتقة من iPSC والتي تم هندستها بواسطة CRISPR لتكون مراسلات فلورية في منهجيات فحص المركبات واسعة النطاق11,17. وعلى الرغم من أن هذه الطرق توفر دقة جينية عالية، إلا أنها ترتبط بجداول زمنية طويلة للتمايز، وتعقيد تقني، وتفاوت بين الدفعات، وزيادة في التكلفة التجريبية13,18. وفي المقابل، تتيح منصة المراسلة الفيروسية الغدانية الموصوفة هنا تنفيذًا أكثر سرعة دون الحاجة إلى تحرير الجينوم أو تمايز خلوي ممتد. ويمكن استخدام هذه المنهجيات بطريقة تكاملية، حيث يعمل نظام المراسلة mCol1a1p-mCherry كأداة فحص أولية، بينما تُطبق النماذج القائمة على iPSC للتحقق اللاحق11.

يوفر نظام المراسل mCol1a1p-mCherry الموصوف هنا طريقة لفحص المركبات المرشحة، بما في ذلك المعدلات الأيضية والمنتجات الطبيعية، في نموذج يعتمد على الخلايا الليفية. ولضمان تكرارية هذا البروتوكول، تتطلب عدة خطوات حرجة واعتبارات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها الاهتمام. أولاً، تعد نقاوة التحضير الفيروسي الغدي أمراً ضرورياً؛ حيث إن استخدام المستخلصات الفيروسية غير المنقاة قد يؤدي إلى إدخال حطام الخلايا المضيفة ومكونات سامة للخلايا، مما يؤدي إلى تأثيرات غير محددة في الخلايا الليفية NIH/3T3 وإرباك قراءات المراسل. علاوة على ذلك، ولضمان التكرارية الصارمة والاتساق بين الدفعات في تطبيقات الفحص اللاحقة، خضع كل تحضير فيروسي لتنقية قياسية وتم تقديره كمياً بدقة عبر مقايسة التخفيف النهائي. ومن خلال تطبيق تعدد عدوى (MOI) محدد بدقة بناءً على العيارات الفيروسية الوظيفية (PFU/mL) بدلاً من الكميات الحجمية، نجحنا في تحييد الاختلافات بين الدفعات، وبالتالي توحيد استجابة المراسل عبر جميع التشغيلات التجريبية المستقلة. ثانياً، أثناء تحسين هذا الـ MOI، من المهم التأكد من أن حجم اللقاح الفيروسي لا يتجاوز 10% من إجمالي حجم المزرعة؛ إذ يمكن للمنظم الفيروسي المفرط أن يغير من الـ pH والأسمولية في وسط المزرعة، مما قد يؤدي إلى تحفيز استجابات الإجهاد الخلوي بشكل مستقل عن تحفيز TGF-β.

علاوة على ذلك، يفرض التعامل مع الأطباق ذات 384 بئراً في التصوير عالي المحتوى تحديات تقنية؛ إذ تكون الخلايا الليفية من نوع NIH/3T3 عرضة للانفصال أثناء خطوات استبدال الوسط والغسيل. ويمكن تقليل فقدان الخلايا من خلال التعامل اللطيف مع السوائل، مثل استخدام أجهزة مناولة السوائل الآلية بسرعات توزيع منخفضة أو إمالة رؤوس الماصات مقابل الجدران الجانبية للآبار. ولتقليل التنشيط الأساسي للمروج Col1a1 وتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء، يمكن استخدام التجويع من المصل لمدة 12–24 h قبل التحفيز بـ TGF-β. وخلال التصوير المتسلسل للخلايا الحية عبر نقاط زمنية متعددة (على سبيل المثال 24 و48 و72 h)، يجب تقليل السمية الضوئية التراكمية وتأثيرات ارتباط DNA الناتجة عن صبغ Hoechst المتكرر عن طريق تحسين ظروف التعريض أو استخدام أطباق تجريبية متوازية لكل نقطة زمنية19.

ينبغي مراعاة العديد من القيود المتعلقة بهذه الطريقة. أولاً، يعتمد النظام على خط خلوي من الخلايا الليفية المخلدة ولا يمثل بشكل كامل التباين الخلوي للخلايا الليفية القلبية in vivo. ثانياً، يعكس المراسل التنشيط النسخي لـ Col1a1 ولا يرصد التنظيم ما بعد النسخي أو نضج المصفوفة خارج الخلوية. قد تشمل التعديلات المستقبلية استخدام الخلايا الليفية القلبية الأولية، أو أنظمة الزراعة المشتركة، أو النماذج ثلاثية الأبعاد لتحسين الصلة الفسيولوجية. وباختصار، يصف هذا البروتوكول نظام مراسل غدوي مدفوع بمحفز Col1a1 لمراقبة تنشيط الخلايا الليفية. وتدمج هذه الطريقة بين التوصيل الفيروسي، والتعديل الدوائي، والمقاييس الجزيئية التكميلية لتمكين التحليل الطولي وغير المدمر في الخلايا الحية. ويمكن تطبيق هذا النهج في فحص المركبات ودراسة عمليات إشارات التليف تحت ظروف in vitro مضبوطة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال منح مقدمة من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (رقم 32371158 لـ H.X.)، والبحث الوطني الرئيسي ر&برنامج D (من 2023YFA1800902 إلى H.X.)، "تيانشي تالنت (Tianchi Talent)" برنامج، المشروع المفتوح للمختبر الوطني الرئيسي للتوازن الوعائي وإعادة التشكيل (جامعة بكين) (202404 إلى R.Z؛ 202403 إلى Y.M.W.)، المشروع المفتوح للمختبر الرئيسي للأمراض المتوطنة والعرقية في شينجيانغ، وزارة التربية والتعليم (جامعة بكين) (KF202404 إلى H.X.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
صفيحة مجهرية ذات قاع زجاجي بـ 384 بئرًاCellvis، الولايات المتحدة الأمريكيةP384-1.5H-Nلوحة زجاجية القاع تحتوي على 384 بئراً تُستخدم لزراعة الخلايا، والعدوى الفيروسية، والتصبيغ، والتصوير الفلوري.
بلازميد الهيكل الأساسي للفيروس الغديMicrobix، كنداpBHGloxΔE1,3Creالبلازميد المستخدم لإنتاج الجينوم الفيروسي الغدي المؤتلف كامل الطول.
ناقل مكوك أدينوفيروسي: pDC315-mCol1a1p-mCherryجيني كيم (GeneChem)، الصينخدمة مخصصةناقل مكوك غدي فيروسي معاد التركيب يحتوي على محفز Col1a1 للفأر بطول 2354 زوجًا قاعديًا والذي يحفز تعبير mCherry.
إنزيم بنزوناز النووي (Benzonase Nuclease)Merck Millipore، الولايات المتحدة الأمريكية70664-3إنزيم نوكلياز داخلي يُستخدم أثناء تنقية الفيروسات الغدانية لإزالة الأحماض النووية الملوثة.
كابينة السلامة البيولوجية (الفئة الثانية)مجموعة إيسكو لعلوم الحياة (Esco Lifesciences Group)، سنغافورةAC2-4S1كابينة سلامة حيوية معتمدة تُستخدم للتعامل مع الفيروسات الغدية المؤشابة وإجراءات الزرع الخلوي المعقمة.
وسط زراعة الخلايا (DMEM/F12 كامل)HyClone, الولايات المتحدة الأمريكية12800-017وسط زرع كامل مستخدم لصيانة خلايا NIH/3T3 وHEK293.
برنامج CellPathfinder لتحليل الصورشركة Yokogawa Electric، اليابانالإصدار 3.08.01برنامج لتحليل الصور يُستخدم للتقدير الكمي التلقائي للفلورة وتجزئة الخلايا.
نظام الفحص عالي المحتوى CellVoyager CV8000شركة يوكوجاوا إلكتريك (Yokogawa Electric Corporation)، اليابانCV8000نظام تصوير عالي المحتوى مستخدم للحصول على صور الفلورة الخاصة بـ mCherry وHoechst.
أول أكسيد الكربون2 حضّانة زراعة الخلاياThermo Fisher Scientific، الولايات المتحدة الأمريكية3111حاضنة مرطبة يتم الحفاظ عليها عند 37 درجة مئوية °C مع 5% CO2 لزارعة الخلايا الثديية.
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Sigma-Aldrich، الولايات المتحدة الأمريكيةD2650المذيب المستخدم لتحضير SB431542.
دولبيكو’وسط إيجل المعدل/خليط المغذيات F-12 (DMEM/F-12)Servicebio، الصينG4610وسط استزراع أساسي مستخدم للخلايا الليفية من سلالة NIH/3T3.
مصل جنين البقر (FBS)أوزبيان، أسترالياVS500Tمكمل مصل يُستخدم بتركيز 10% (حجم/حجم) لتحضير وسط زراعي كامل.
صبغة Hoechst 33342 الفلوريةInvitrogen، الولايات المتحدة الأمريكيةH3570صبغة نووية تستخدم للتصوير الفلوري ومعايرة عدد النوى.
خلايا HEK293ATCC، الولايات المتحدة الأمريكيةCRL-1573خط خلوي للتعبئة يُستخدم لإنتاج الفيروسات الغدانية وتضخيمها.
عامل النمو التحويلي بيتا البشري المؤتلف (Human Recombinant TGF-β)β1MedChemExpress، الصينHY-P78214السيتوكين المستخدم لتحفيز التنشيط التليفي في الخلايا الليفية من سلالة NIH/3T3.
برمجيات الحصول على الصورشركة Yokogawa Electric Corporation، اليابانالإصدار 3.08.01.03البرنامج المستخدم للاستحواذ الآلي على صور الفلورسنت والتحكم في المجهر.
كاشف ترانسفكشن قائم على الدهونInvitrogen، الولايات المتحدة الأمريكية11668-019كاشف ترانسفكشن (Transfection reagent) مستخدم لنقل بلازميد الفيروس الغدي إلى خلايا HEK293.
أنابيب الطرد المركزي الدقيقةAxygen، الولايات المتحدة الأمريكيةMCT-150-Cالأنابيب المستخدمة لتخزين نواتج تحلل الحمض النووي الريبوزي (RNA lysate) ومعالجة العينات.
قارئ الأطباق الدقيقةTecan، سويسراشرارةقارئ أطباق ميكروي متعدد الأنماط يُستخدم لقياسات الامتصاصية في مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).
طقم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم لكولاجين النوع الأول في الفئرانشركة Meike Biotechnology، الصينMK6778Aطقم مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) المستخدم لتقدير كمية الكولاجين من النوع الأول المفرز في طافي المزارع الخلوية.
خلايا ليفية من فئران NIH/3T3Procell Life Science، الصينCL-0171خط خلوي من الخلايا الليفية للفأر استُخدم لإنشاء نموذج مراسل والتحقق من صحته.
إنزيم القطع PacINew England Biolabs، الولايات المتحدة الأمريكيةR0547Sإنزيم التقييد المستخدم لخطية البلازميد الغدي.
البنسلين–محلول الستريبتومايسينGibco، الولايات المتحدة الأمريكية15140-122محلول مضاد حيوي مضاف بنسبة 1% (حجم/حجم) لمنع التلوث البكتيري.
المزيج الفائق PerfectStart Green qPCR SuperMixترانس جين بيوتك (TransGen Biotech)، الصينAQ602مزيج رئيسي لـ qPCR يعتمد على SYBR Green يستخدم لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي.
المحلول الملحي الموقوف بالفوسفات (PBS)Servicebio، الصينG4202المحلول المنظم المستخدم لغسل الخلايا وتحضير الكواشف.
ناقل مكوك pDC315-EGFPGeneChem، الصيننظرًا لعدم توفر نص مصدر للترجمة، يرجى تزويدنا بالمحتوى العلمي المطلوب ترجمته من اللغة الإنجليزية إلى اللغة العربية، وسنقوم بمعالجته وفقًا للمعايير الأكاديمية والتقنية المحددة.ناقل مكوك أدينوفيروسي أب مستخدم في بناء بلازميد مراسل.
نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR)Applied Biosystems، الولايات المتحدة الأمريكيةQuantStudio 5نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي المستخدم لتحليل التعبير الجيني الكمي.
إنزيمات القطع (BamHI وKpnI)Abclonal، الصينRK21101, RK21104إنزيمات القطع المستخدمة لخطية ناقل المكوك.
طقم النسخ العكسيترانس جين بيوتك، الصينAT311طقم النسخ العكسي المستخدم لتخليق الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين المتمم (cDNA) قبل إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (RT-qPCR).
كاشف تحلل الرناInvitrogen، الولايات المتحدة الأمريكية15596026الكاشف المستخدم لاستخلاص الحمض النووي الريبوزي (RNA) الكلي من الخلايا المستنبتة.
SB431542MedChemExpress، الصين301836-41-9عامل النمو المحول بيتا (TGF-β)β مثبط مستقبل من النوع الأول يستخدم في تجارب التثبيط الفارماكولوجي.
خدمة تسلسل سانجر/الكواشفشركة شنغهاي بوشانغ للتكنولوجيا الحيوية المحدودة، الصينخدمة مخصصةخدمة التسلسل/الكواشف المستخدمة للتحقق من تسلسل البلازميد.
المصّاصات المصليةCorning، الولايات المتحدة الأمريكية4488ماصات معقمة تُستخدم لنقل السوائل أثناء إجراءات زراعة الخلايا.
جهاز التدوير الحراري T30لونجين للأجهزة العلمية (LongGene Scientific Instruments)، الصينT30جهاز الدورات الحرارية المستخدم في النسخ العكسي وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
محلول التريبسين-إيديتات ثنائي الصوديوم (Trypsin-EDTA)Gibco، الولايات المتحدة الأمريكية25200-056كاشف تفكيك الخلايا المستخدم في عملية تمرير الخلايا الروتينية.
طقم تنقية الفيروساتTakara Bio USA631533طقم مستخدم لتنقية الفيروسات الغدانية المؤشبة.
حمام مائيشركة شانغهاي ييهينغ للأجهزة العلمية (Shanghai Yiheng Scientific Instruments)، الصينHWS-12حمام مائي مضبوط درجة الحرارة مُستخدم أثناء تجميد الفيروسات الغدانية–دورات الإذابة.

المراجع

  1. Frangogiannis NG. Cardiac fibrosis. Cardiovasc Res. 2021;117(6):1450–1488.
  2. Ghazal R, et al. Cardiac fibrosis in the multi-omics era: implications for heart failure. Circ Res. 2025;136(7):773–802.
  3. Kurose H. Cardiac fibrosis and fibroblasts. Cells. 2021;10(7):1716.
  4. Heidenreich PA, et al. 2022 AHA/ACC/HFSA guideline for the management of heart failure. J Am Coll Cardiol. 2022;79(17):e263–e421.
  5. Fang L, et al. A clinical perspective of anti-fibrotic therapies for cardiovascular disease. Front Pharmacol. 2017;8:186.
  6. Khalid A, et al. Breaking new ground in heart failure management: novel therapies and future frontiers. Front Cardiovasc Med. 2025;12:1643971.
  7. González A, et al. New targets to treat the structural remodeling of the myocardium. J Am Coll Cardiol. 2011;58(18):1833–1843.
  8. Tuleta I, et al. Fibroblast-specific TGF-β signaling mediates cardiac dysfunction, fibrosis, and hypertrophy in obese diabetic mice. Cardiovasc Res. 2024;120(16):2047–2063.
  9. Li C, et al. Mechanism of action of non-coding RNAs and traditional Chinese medicine in myocardial fibrosis: focus on the TGF-β/Smad signaling pathway. Front Pharmacol. 2023;14:1092148.
  10. Vistnes M. Hitting the target: challenges and opportunities for TGF-β inhibition for the treatment of cardiac fibrosis. Pharmaceuticals (Basel). 2024;17(3):267.
  11. Cardona-Timoner M, et al. Dressed in collagen: 2D and 3D cardiac fibrosis models. Int J Mol Sci. 2025;26(7):3038.
  12. Garvin AM, et al. Primary cardiac fibroblast cell culture: methodological considerations for physiologically relevant conditions. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2023;325(4):H869–H881.
  13. Zhang H, et al. Multiscale drug screening for cardiac fibrosis identifies MD2 as a therapeutic target. Cell. 2024;187(25):7143–7163.e22.
  14. Bollong MJ, et al. Small molecule-mediated inhibition of myofibroblast transdifferentiation for the treatment of fibrosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2017;114(18):4679–4684.
  15. Stepanenko AA, et al. Transient and stable vector transfection: pitfalls, off-target effects, artifacts. Mutat Res Rev Mutat Res. 2017;773:91–103.
  16. Tallquist MD. Cardiac fibroblast diversity. Annu Rev Physiol. 2020;82:63–78.
  17. Hofbauer P, et al. Modeling acute myocardial infarction and cardiac fibrosis using human induced pluripotent stem cell-derived multicellular heart organoids. Nat Commun. 2024;15:308.
  18. Li Q, et al. Human iPSC-based modeling of central nervous system disorders for drug discovery. Int J Mol Sci. 2021;22(3):1203.
  19. Icha J, et al. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 2017;39(8):1700003.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

mCherry
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.