مقالة منهجية

تفاعل التهجين المتسلسل FISH في الفص البصري ذبابة الفاكهة النامية

DOI:

10.3791/71681

⸱

يوليو 17, 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, New York University, 2Department of Biological Sciences, Columbia University, 3Department of Biology, The City College of New York

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول الخطوات المطلوبة لإجراء التهجين الفلوري في التفاعل المتسلسل التهجيني في الموقع (HCR-FISH) في الفصوص البصرية لذبابة الفاكهة الميلانوغاستر . تم تفصيل إجراءات تصميم المجسات، والتهجين، والتضخيم، وتركيب الأنسجة لتسهيل تصور الفص البصري المتطور.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فهم التطور العصبي يتطلب توصيفا دقيقا لمتى وأين تعبر الجينات. لطالما مكنت تقنيات مثل التهجين الموضعي من تصور تعبير الجينات في الأنسجة النامية. على الرغم من أن التهجين الموضعي يستخدم على نطاق واسع في أجنة ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر ، إلا أن تطبيقه في تطور النظام البصري محدود بسبب عدة تحديات تقنية. على سبيل المثال، غالبا ما تخترق المجسات الطويلة الفص البصري بشكل سيء، والبروتوكولات التي تعتمد على مراسلات محفزة قابلة للانتشار، مثل بيروكسيداز الفجل الحار، غالبا ما تعطي نسب إشارة إلى ضوضاء منخفضة في التحضيرات الكاملة. يتغلب التهجين الفلوري المتسلسل في التفاعل التهجيني في الموقع (HCR-FISH) على العديد من هذه القيود ويتيح اكتشاف إشارات أكثر متانة. كما في FISH التقليدي، تتهجن أحاديات الحمض النووي إلى تسلسلات RNA داخل الأنسجة. أما في HCR-FISH، فتشكل مجسات المضخمات المتقاربة فلورية هياكل مستقرة ذات دبابيس حادة تحفز بلمرة مونومرات إضافية، مما يؤدي إلى تضخيم شدة الإشارة. كما يسمح استخدام مجموعات المجسات متعددة الشبكات باستخدام أوليجونوكليوتيدات أقصر (~45 نيوتوكيوتيدات، مقارنة بما يصل إلى 1000 نيوكليوتيد في العينات التقليدية FISH)، مما يحسن اختراق المجس وينتج تلوينا أكثر تجانسا في العينات الكاملة. تصف هذه المقالة بروتوكول HCR-FISH المحسب لفص البصري في دروسوفيلا . يتكيف البروتوكول مع أساليب HCR-FISH الحالية من خلال تحسين ظروف التثبيت وزيادة تركيزات المجس والدبوس الشعري لتحسين شدة الإشارة واختراق الأنسجة. يتم توفير قوائم المواد الكيميائية والإجراءات خطوة بخطوة. كما تعرض تطبيقات محتملة في علم الأعصاب التطوري، بما في ذلك تصور الخلايا العصبية حديثي الولادة، وتوصيف أنماط التعبير الجيني في الحالات التي تفشل فيها الطرق التقليدية، مثل البروتينات الموسومة ذاتيا أو تلوين الأجسام المضادة، في توفير معلومات كافية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فهم كيفية تجميع الدماغ يتطلب تحديد تنوع أنواع الخلايا الموجودة ومجموعات الجينات المعبر عنها داخل كل نوع خلية1. مكنت التطورات الحديثة في تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية الباحثين من معالجة هذه الأسئلة بدقة عالية2. ومع ذلك، فإن العديد من أساليب الخلية الواحدة لا تحفظ المعلومات المكانية، مما يتطلب إجراء تجارب إضافية لرسم خريطة تجمعات الخلايا النسخية إلى مواقعها داخل الدماغ النامي.

أنظمة التعبير الجيني الثنائية مثل GAL4-UAS يمكن أن توفر معلومات موقعية لكنها ليست كمية3. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تعجب التأخيرات بين التعبير الجيني واكتشاف المبلغين أنماط التعبير ذات الصلة الفسيولوجية خلال المراحل المبكرة من التطور. التلوين المناعي هو نهج آخر شائع الاستخدام لتحديد أنماط التعبير الخاصة بالأنسجة4. ومع ذلك، غالبا ما تكون البروتينات المفرزة منتشرة ويصعب تحديد موقعها بدقة.

طرق تصنيف النيوكليوتيدات، مثل التهجين في الموقع (ISH)، استخدمت أيضا على نطاق واسع للحصول على معلومات مكانية عن التعبير الجيني5. في ISH، ترتبط الأوليجوننيوكليوتيدات الموسومة بالحمض النووي الريبي المكمل العكسي محل الاهتمام. استخدمت طرق ISH المبكرة مجسات الحمض النووي الموسومةبالإشعاع 6، بينما تضمنت البروتوكولات اللاحقة ملصقات أكثر أمانا مثل الديغوكسيجينين، والفلورسين، والرودامين 7,8,9. قام العلماء بسرعة بتكييف ISH لاستخدامه في ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر، حيث تم تطبيقه لتوصيف تنظيم كروموسومات البوليتينات ورسم خرائط أنماط تعبير جينات الفجوة مثل الظهر المنحني في الأجنة الكاملة10,11.

على الرغم من فائدته الواسعة، إلا أن عدة قيود تقنية أعاقت اعتماد ISH في التحضيرات السميكة مثل الفص البصري اليرقي. اعتمدت العديد من بروتوكولات الميدانية على مراسلين محفزين قابل للانتشار، مثل بيروكسيداز الفجل الحار، الذي غالبا ما أدى إلى انخفاض نسب الإشارة إلى الضوضاء12. بالإضافة إلى ذلك، استخدمت العديد من الطرق مجسات طويلة تستهدف تسلسلات مفردة لتحسين الخصوصية. على الرغم من فعاليتها في أجنة ذبابة الفاكهة وكروموسومات البوليتين، إلا أن المجسات الطويلة تخترق دماغ اليرقات بشكل سيء وغالبا ما تنتج علامات غير متساوية 10,11,13.

تطوير تقنية ISH الفلورية أحادية الجزيئة (smFISH) والتهجين الفلوري بتفاعل التهجين المتسلسل في الموقع (HCR-FISH) عالج العديد من هذه القيود14,15. باستخدام مجموعات من المجسات القصيرة المبلطة عبر منطقة جينية واحدة، يقلل smFISH من متوسط طول المسبار من حوالي 1000 NT إلى حوالي 40 NT16. هذا يحسن بشكل كبير اختراق المجس مع الحفاظ على شدة إشارة قوية. يحسن HCR-FISH نسب الإشارة إلى الضوضاء بشكل أكبر باستخدام مجسات مضخمات متزامنة فلورية تزيد من دقة الموقع وتضخم إخراج الإشارة. ومن المهم أن خطوة التضخيم هذه تبدو وكأنها تتدرج خطيا مع تركيز النسخ، مما يمكن من قياس كمي لمستويات التعبير الجيني17.

يبدأ HCR-FISH بمجسات مبادر مكملة لتسلسل الهدف. تحتوي هذه الأوليجوننيوكليوتيدات غير الموسومة على تسلسل مبادر أحادي السلسلة يرتبط بمجال الإدخال لمسبار مضخم H1 الموسوم بالفلورية. تعتمد مضخمات H1 بنية حادة تحافظ على عدم النشاط التحفيزي حتى ترتبط بتسلسل المبدئ. عند الربط، يفتح مضخم H1 ويكشف عن تسلسل يرتبط بمسبار شريك، H2. هذا التفاعل يفتح دبوس H2 الشعري، مما يسمح له بربط مسبار H1 آخر (الشكل 1)15. دورات الارتباط المتكررة ب H1/H2 تولد بوليمر مستقر يعزز إشارة الفلورة مع تقليل الضوضاء الخلفية. نظرا لأن كل تسلسل مبادر خاص بزوج H1/H2 المقابل، يمكن استخدام عدة مجسات ذات تسلسلات مبادر وفلوروفورات مميزة في نفس الوقت لتسمية عدة جينات داخل نفس العينة.

figure-introduction-1
الشكل 1: تمثيل رسومي لسير عمل HCR-FISH. تتكاثر مجسات الحمض النووي التي تحتوي على تسلسلات المبادر إلى نسخة RNA مستهدفة. ترتبط دبابيس الحمض النووي الموسومة فلورية بتسلسل المبادر وتخضع لعملية بلمرة متتالية لتشكيل سلاسل تضخيم مزدوجة السلسلة مستقرة. يحسن الترافق المباشر للفلوروفور تضخيم الإشارة ونسبة الإشارة إلى الضوضاء. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

وقد زادت التحسينات الأخيرة في HCR-FISH من فائدته بشكل أكبر. تصميم مسبار المبادر المنقسم يحسن خصوصية المضخم، والأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بمبدئي HCR تتيح الكيمياء المناعية النسية وHCR-FISH18 في نفس الوقت. بالإضافة إلى ذلك، تسمح خيارات الفلوروفور الموسعة الآن بتصوير متعددي لما يصل إلى 10 جينات في نفس الوقت19,20.

على الرغم من أن تجارب إثبات المفهوم الأولية ل HCR-FISH أجريت على سمك الزرد (Danio rerio)، إلا أن الطريقة اكتسبت استخداما واسعا في العديد من الأنظمة، خاصة في الكائنات غير النموذجية حيث الأجسام المضادة مكلفة أوغير متوفرة. كما أن تخليق المجسات يوفر بديلا أسرع لتوليد الأجسام المضادة، والذي قد يتطلب شهورا من التطوير. وبالتالي، يوفر HCR-FISH نهجا سريعا للتحقق من صحة الجينات المرشحة التي تم تحديدها من خلال مجموعات بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية21. حتى في الكائنات النموذجية الجينية الراسخة، يوفر HCR-FISH طريقة قيمة لرسم خرائط الخلايا العصبية حديثة الولادة مكانيا عندما يفشل مبلغو GAL4 أو الكيمياء المناعية في تصنيف مجموعات الخلايا المحددة بشكل كاف.

تصف هذه المقالة بروتوكول HCR-FISH المحسن لليرقة في المرحلة الثالثة من الفص البصري ذبابة الفاكهة. يتكيف البروتوكول مع طرق نشرت سابقا في كائنات أخرى لاستخدامها في نظام رؤية ذبابة الفاكهة 22. تم تحسين ظروف التثبيت المستخدمة عادة في كيمياء الهيستوهيولوجيا المناعية لذبابة الفاكهة (ذبابة الفاكهة) لتطبيقات FISH. تمت زيادة تركيزات المجس ودبوس الشعر لتحسين كثافة الإشارة واختراق الأنسجة. تم استخدام أنابيب PCR بدلا من الألواح الموضعية لتقليل استهلاك المواد وتسهيل التعامل مع عينات الأنسجة الصغيرة. بالإضافة إلى ذلك، تم تقصير أوقات الغسيل والتهجين لاستيعاب حجم دماغ ذبابة الفاكهة الأصغر مقارنة بأنظمة الحشرات الأخرى المستخدمة عادة في HCR-FISH.

تظهر التطبيقات التمثيلية كيف يمكن لهذا النهج أن يوفر معلومات موقعية لمجموعات عصبية محددة أثناء التطور. تشير هذه التجارب إلى أن بعض النصوص المكتوبة، مثل القطع المفاجئة، يمكن اكتشافها في وقت أبكر باستخدام HCR-FISH مقارنة بصبغ الأجسام المضادة أو خطوط المبلغ. كما تناقش التحديات المحتملة، واستراتيجيات استكشاف المشكلات، وتطبيقات HCR-FISH لدراسة تطور النظام البصري في ذبابة الفاكهة .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء جميع تجارب ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر وفقا لإرشادات كلية مدينة نيويورك، وجامعة كولومبيا، وجامعة نيويورك بشأن العناية واستخدام الكائنات البحثية. الأدوات البحثية المستخدمة في هذا البروتوكول مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير المخازن

ملاحظة: جهز جميع الكواشف في أنابيب خالية من النوكلياز باستخدام أطراف الفلتر.
ملاحظة: ارتد القفازات طوال فترة الإجراء. نظف أسطح العمل باستخدام محلول تنظيف RNase قبل البدء.

  1. تحضير حلول خالية من النوكليز
    1. جهز 1x PBS-T عن طريق تخفيف 20x PBS، ترايتون X-100، وجليسين في ماء خال من النوكلياز إلى تركيزات نهائية 1x PBS، 1٪ (v/v) ترايتون X-100، و1 mM جلايسين.
    2. جهز 5 مرات SSCT عن طريق تخفيف 20 مرة SSC و Tween-20 في ماء خال من النوكلياز لتحضير 5x SSC تحتوي على 0.1٪ (v/v) Tween-20.
    3. قم بتخفيف 20x PBS في ماء خال من النوكلياز لتحضير 1x PBS.

2. مجسات التصميم

  1. لتصميم المجسات تجاريا، اختر الشكل المخصص للنوع المعني، وترتيب المجسات مع المضخم المطلوب باستخدام واجهة الويب الخاصة بالبائع.
    ملاحظة: كيميائيات مسبار HCR التجارية وتسلسلات المبادر مملوكة ومملوكة براءة اختراع من شركة Molecular Instruments.
    1. قم بتعديل المنطقة المستهدفة في واجهة الويب إذا كان هناك رغبة في اكتشاف خاص بالنص أو قبل الكشف عن mRNA.
    2. طلب حوالي 20 مسبارا للنصوص المعبر عنها بشكل كبير. استخدم حتى 40 مجبارا للنسخ منخفضة الوفرة في تحضيرات ذبابة الفاكهة الكاملة.
      ملاحظة: اطلب أوليغوس متخصصة للنسخ القصيرة التي تستوعب مواقع ربط مجسات أقل.
  2. لتصميم المجسات يدويا، قم بتنزيل تسلسل FASTA للنص المستهدف. تحديد ما إذا كان يجب استهداف شكل واحد أو جميع أشكال الجين.
    ملاحظة: إعطاء الأولوية للأكسونات المكونة أو الأشكال المتساوية المعبر عنها التي تم تحديدها من مجموعات بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي لتحسين الإشارة.
    1. عند تصميم مجسات للكشف قبل ال mRNA، صمم مجسات تمتد عبر وصلات الإنترون-إكسون. تصميم مجسات تمتد عبر وصلات التوصيلات لاكتشاف النسخ الناضجة. استخدم المجسات الإنترونيكية لاكتشاف النسخ الناشئة داخل النوى.
      ملاحظة: قد لا تتزامن المجسات الإنترونية مع نسخ السيتوبلازم الناضجة وقد تتطلب علامات إضافية لتحديد الهوية.
    2. حدد حجم مجموعة المجسات. استخدم ما لا يقل عن حوالي 5 مجسات للنصوص القصيرة عندما لا يمكن تصميم مجموعات مجسات أكبر. استخدم 20 مجبارا للتطبيقات القياسية وحوالي 40 مجبارا لتحقيق الحساسية المثلى في عينات التركيب الكامل18,23.
    3. إذا صممت مجباراتك الخاصة، استخدم تسلسلات 25nt مفصولة بفاصل 2 نقطة أساس وأضف تسلسلات المبادر المنقسمة إلى نهاية 5 أقدام لكل أوليغو.
      ملاحظة: على الرغم من أن تسلسلات المبادر المنقسمة من الجيل الأول متاحة للجمهور، إلا أن تسلسلات المبادر التجارية من الجيل القادم هي18 ملكية خاصة.
    4. إذا كنت تصمم مجباراتك الخاصة، تحقق من صحة تسلسلات المجسات. تأكد من أن المجسات داخل كل مجموعة لها درجات حرارة انصهار متشابهة. تأكد من هويتك بنسبة 100٪ بين المجسات.
      ملاحظة: تجنب المناطق الغنية ب G القوية وحافظ على محتوى GC مماثل بين المجسات24. تقليل التسلسلات المتكررة وتقييم الارتباط خارج الهدف باستخدام BLAST25.
    5. استخدم برامج تصميم المجسات المتاحة للجمهور عند الاقتضاء26,27.
      ملاحظة: قد لا تعيد أدوات التصميم مفتوحة المصدر إنتاج الأداء الأمثل لخطوط أنابيب تصميم المسبار التجارية.

3. تشريح، تصحيح، ودمج الأدمغة قبل التهجين

  1. حاجز التهجين قبل الدفء إلى 37 درجة مئوية.
    تحذير: يحتوي مخزن التهجين المجسبي على الفوراميد. أمسك تحت غطاء بخار كيميائي وارتدى معدات الحماية الشخصية المناسبة.
  2. يتم تخفيف كل مجسات مضبوطة على تركيز نهائي 1 ميكرومولار باستخدام ماء مقطر خال من النوكليز.
  3. أليكوت حوالي 250 ميكرولتر من PBS الخالي من النوكلياز على طبق تشريح.
  4. انقل يرقة من المرحلة الثالثة المتجولة إلى PBS باستخدام الملقط. أمسك البطن بملقط واحد وأمسك خطاطيف الفم بزوج ثان. اسحب خطاطيف الفم بعيدا عن الجسم لعزل الدماغ والحبل العصبي البطني (VNC).
  5. إزالة الأجسام الدهنية والغدد اللعابية مع الاحتفاظ ب VNC. نقل الأدمغة المقسمة إلى أنبوب يحتوي على 600 ميكرولتر من PBS الخالي من النوكلياز البارد جدا.
    ملاحظة: حافظ على غمر الفصوص البصرية طوال فترة التشريح لمنع جفاف الأنسجة.
  6. كرر التشريح حتى يتم جمع حوالي ستة فصوص بصرية. التشريح الكامل خلال 20 دقيقة لتقليل تدهور الأنسجة.
  7. أضف 200 ميكرولتر من 16٪ بارافورمالديهيد (PFA) لتحقيق تركيز نهائي يبلغ 4٪ PFA. اقلب الأنبوب بلطف لخلط واحتضنه لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    تحذير: PFA سام ومسبب للطفرات. أمسك تحت غطاء بخار كيميائي أثناء ارتداء القفازات.
  8. أزل المثبت من العينات ووضع النفايات الكيميائية المخصصة. غسل العينات ثلاث مرات باستخدام 600 ميكرولتر من PBS البارد الخالي من النوكلياز، باستخدام طبق تشريح لالتقاط محاليل الغسيل.
    ملاحظة: افحص محليلات الغسيل بحثا عن فقدان الأنسجة واسترجع أي أدمغة متحركة تحت مجهر تشريح.
  9. نقل الأدمغة إلى أنبوب PCR يحتوي على 100 ميكرولتر من مخزن التهجين المجسوب المسبق الدافئ.
    اخلط بلطف عن طريق تحريك الأنبوب وحضانه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تأكد من بقاء الأدمغة مغمورة ولا تلتصق بجدران الأنابيب.

4. هجين المجسات

  1. جهز محلول مسبار بسعة 4 نانومتر بإضافة 0.4 بيمولول من كل مجموعة مجسات إلى مخزن التهجين المجسي لحجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر.
    ملاحظة: زيادة تركيز المجس حتى 16 نانومتر إذا كانت شدة الإشارة منخفضة في التلوين الأولي.
  2. أزل حاجز ما قبل التهجين دون إزعاج الأنسجة. أضف محلول المجس المخفف إلى كل عينة.
  3. حضن عينات عند 37 درجة مئوية على جهاز نوتاتور لمدة 16–24 ساعة.

5. تضخيم إشارة المجس

  1. اجعل مخزن التضخيم إلى درجة حرارة الغرفة. تحضير حوالي 200 ميكرولتر من مخزن التضخيم لكل عينة.
  2. توازن مخزن الغسيل. مخزن الغسيل الدافئ إلى 37 درجة مئوية باستخدام حمام مائي.
    تحذير: يحتوي مبروب واش بافر على الفورمايد. المقبض تحت غطاء بخار كيميائي.
  3. قم بإزالة محلول المجس وخزنها عند -20 درجة مئوية لإعادة الاستخدام.
    ملاحظة: أعد استخدام محاليل المجسات حتى تنخفض شدة التلوين.
  4. اغسل عينات أربع مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في مخزن غسيل مسبقا مسخن عند 37 درجة مئوية. اغسل العينات مرتين لمدة 5 دقائق لكل منها في درجة حرارة الغرفة 5x SSCT.
  5. أضف 100 ميكرولتر من مخزن التضخيم بدون دبابيس شعرية. حضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  6. سخن جهاز الدراجة الحرارية إلى 95 درجة مئوية. أضف 2 ميكرولتر من كل مخزن دبوس شعر بحجم 3 ميكرومتر إلى أنابيب PCR منفصلة. جهز أنبوبا واحدا لكل نوع من دبابيس الشعر.
    ملاحظة: زيادة تركيز المضخم إذا أدى التلوين إلى ظهور نقاط متفرقة أو نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة.
  7. حضن دبابيس الشعر عند 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية. احم الأنابيب من الضوء واحتضن الأنابيب في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تقل عن 30 دقيقة.
  8. جهز محلول التضخيم. ادمج الدبابيس الشعرية في مخزن التضخيم إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر لكل عينة.
  9. إزالة مخزن التضخيم من العينات. أضف مخزن تضخيم يحتوي على دبابيس شعرية.
    حضن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة على جهاز نوتاتور محمي من الضوء (ملفوف بورق الألمنيوم).
  10. إزالة محلول التضخيم. اغسل العينات مرتين لمدة 5 دقائق في 150 ميكرولتر من 5x SSCT. اغسل العينات ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في 150 ميكرولتر من 5x SSCT على جهاز نوتاتور. قم بغسلتين قصيرتين في PBS خال من النوكليز لإزالة المغسلة.

6. تركيب العقول للتصوير

  1. ثبت ملصق فاصل تصوير على شريحة زجاجية. اضغط بلطف بطرف الملقط السفلي لإزالة فقاعات الهواء المحبوسة.
  2. اقسم الدماغ عبر الحبل العصبي البطني باستخدام الملقط.
  3. ضع الدماغ في مركز الفاصل بجي. وجه النسيج جانبيا بحيث يكون الفص البصري متجها للأعلى.
  4. أضف كمية كافية من وسط تثبيت مضاد التدرج (حوالي 25 ميكرولتر) لملء البئر دون إدخال فقاعات هواء. وزع وسط التثبيت بشكل متساو باستخدام الملقط.
  5. ضع غطاء فوق العينة وأغلق بطلاء الأظافر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بالنسبة للعلماء الذين يدرسون علم الأعصاب التطوري، يوفر HCR-FISH طريقة قوية لتصور أنماط التعبير الجيني وتحديد المواقع المكانية للخلايا العصبية النامية داخل الفص البصري ذبابة الفاكهة .

في الفص البصري ذبابة الفاكهة (الشكل 2A)، تنشأ الخلايا العصبية داخل عصبة النخاع من خلايا جذعية عصبية (الخلايا العصبية) مشتقة من ظهارة عصبية ذات نمط مكاني تسمى مركز التكاثر الخارجي (OPC) (الشكل 2B)

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الدراسة تكيفا ل HCR-FISH لاستخدامه في الفص البصري لليرقات ذبابة الفاكهة الميلانوغاستر . غالبا ما تؤدي طرق التهجين التقليدي في الموقع أداء ضعيفا في نسيج الدماغ اليرقي الكامل بسبب محدودية اختراق المجس وانخفاض شدة الإشارة. البروتوكول المعروض هنا يحسن عدة خطوات حاسمة لتحسين جودة التلوين في الفص البصري المتطور. تم تكييف ظروف التثبيت المستخدمة عادة في الكيمياء المناعية لذبابة الفاكهة للحفاظ على شكل الأنسجة مع الحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. زيادة تركيزا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه لا توجد لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون كلود ديسبلان على توفير الوصول إلى أجهزة القياس الجزيئية HCR-FISH ومسبار dpp-GAL4؛ خط طيران UAS-Stinger. كما يشكر المؤلفون أنيش أشاريا وهاري تشوي من شركة Molecular Instruments على الملاحظات الفنية والمناقشات المتعلقة بتنفيذ HCR-FISH. تم تكييف هذا البروتوكول من منهجيات HCR-FISH المنشورة وغير المنشورة سابقا التي طورتها ميغ يونغر22، هانتر ويتبيك، بوغدان سيريريبريينيكوف، أماندا أراوجو غوميز فيريرا، ين-تشونغ تشين، ويانكشي زينغ. حظي بوغدان سيريبريينيكوف بدعم برنامج علوم الحدود البشرية (LT000010/2020-L). حصلت جينيفر مالين على دعم من منحة R00 من المعاهد الوطنية للصحة EY032269.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
10% Tween-20Bio-Rad Laboratories1662404NA
20x PBS, pH7.4Growcells.comMRGF-63962.74M NaCl, 53.7 mM KCl, 20.3 mM Na2HPO4, 29.4 mM KH2PO4 
20x SSCQuality Biological351-003-1313M NaCl, 0.3M Sodium Citrate
37 °C incubatorFisher Scientific (Isotemp)15-015-2633NA
37 °C water bathFisher ScientificFSGPD15DNA
Aluminum foilReynolds Wrap/Fisher Brand15-078-291NA
Antibody: Mouse-anti-AbruptDSHBAbrupt; RRID: AB_528344 Dilution: 1:20
Antibody: Chicken anti-GFPMillipore SigmaCatalog# 06-896; RRID: AB-619712Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-GFPLife Technologies#11122; RRID: AB_221569Dilution: 1:500
Antibody: Rabbit anti-DllGenscript/Desplan lab-Dilution: 1:200
Antibody: Rat anti-NCadherinDSHBDN-Ex #8, RRID: AB_528121Dilution: 1:50
Antibody: Rabbit anti-SoxNGenscript/Desplan lab-Dilution: 1:200
Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jamGift from D. Godt-Dilution: 1:2,000
Antibody: Donkey anti-Rat 405Jackson ImmunoResearchCode # 712-475-150; RRID: AB_2340680Dilution: 1:100
Antibody: Donkey anti-Chicken 488Jackson ImmunoResearchCode #703-545-155; RRID: AB_2340375Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Mouse 488Jackson ImmunoResearchCode #715-545-151; RRID: AB_2341099Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit 488Jackson ImmunoResearchCode #711-545-152; RRID: AB_2313584Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit A555Thermo ScientificCatalog #A-31572; RRID: AB_162543Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat Cy3Jackson ImmunoResearchCode #712-165-153; RRID: AB_2340667Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647Jackson ImmunoResearchCode #706-605-148; RRID: AB_2340476Dilution: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat 647Jackson ImmunoResearchCode #712-605-153; RRID: AB_2340694Dilution: 1:200
Antifade mountantThermo Fisher ScientificS36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant)Other slowfades will work as well, including ones with DAPI (S36936)
Confocal MicroscopeZeissLSM-880NA
Cover slips (22 x 30)VWR16004-332NA
Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAGBDSC38626; RRID: BDSC_38626NA
Fly: D. melanogaster: Canton SBDSC64349; RRID: BDSC_64349NA
Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4BDSC1553; RRID: BDSC_1553NA
Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTBBDSC83660; RRID: BDSC_83660NA
Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP;BDSC32198; RRID: BDSC_32198NA
Fly: D. melanogaster: UAS-StingerBDSC84277; RRID: BDSC_84277NA
Fly: D. melanogaster:  wit-KO-Gal4BDSC600136; RRID: BDSC_600136NA
ForcepsDumont#5 or #55sNA
Glass slidesVWR16005-106NA
GlycineMillipore SigmaG7126-10MGNA
HCR Amplification bufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR-Gold AmplifiersMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR HiFi ProbesMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR Probe Hybridization BufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitContains formamide
HCR Probe Wash BufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitContains formamide
Nail polish (clear)Electron Microscopy Sciences72180NA
Nuclease-free water (not DEPC-treated)Thermo Fisher ScientificAM9937NA
Nutating mixerCorning/Fisher Scientific10-320-100NA
Paraformaldehyde, 16% (w/v)Electron Microscopy Sciences15710Toxic
PCR Machine/Thermal CyclerBio-Rad1851148 (C1000 Touch Thermal Cycler)NA
PCR pull-apart tube strips with dome cap strips (0.2 mL) USA Scientific#1402-2400NA
Petri dishes (150 x 15 mm; for making dissecting dishes)Fisher ScientificFB0875714NA
RNase ZAPThermoFisher ScientificAM9780NA
Slide spacer stickersSUNJinIS016 (iSpacer stickers (0.2 mm deep))NA
Sylgard elastomer kit (for making dissecting dishes)Fisher ScientificNC9285739NA
Triton X-100Merck Millipore SigmaX100NA

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

233 233
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة