مقالة منهجية

منصة تحفيز مغناطيسية نانوية للتحفيز الميكانيكي عن بُعد والقابل للتحكم لخلايا شوان مع التصوير البؤري المتزامن في الوقت الفعلي

21 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71685

⸱

سبتمبر 8, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, 2Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, 3International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin Universit, 4Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

في هذه المقالة

ملخص

يقدم هذا البروتوكول منصة تحفيز مغناطيسي نانوية متوافقة مع المجهر، تدمج جسيمات نانوية فائقة المغناطيسية فلورية، ومغناطيس كهربائي معاير، وتصويراً بؤرياً في الوقت الفعلي لتحفيز خلايا شوان عن بُعد وبشكل يمكن التحكم فيه، ومراقبة استجاباتها الحسية الميكانيكية ديناميكياً.

الملخص

تنظم القوى الميكانيكية السلوك الخلوي بشكل حاسم، ومع ذلك تعتمد العديد من الطرق الحالية للتحفيز الميكانيكي على الاتصال الفيزيائي المباشر أو البيئات خارج الخلوية المصممة اصطناعيًا، مما يحد من مرونتها في دراسات الخلايا الحية الديناميكية. نقدم هنا منصة تحفيز نانوي مغناطيسي للتحفيز الميكانيكي عن بُعد وبدون تلامس وبشكل يمكن التحكم فيه لخلايا شوان in vitro. يتيح هذا الإعداد المتكامل التحفيز المغناطيسي عن بُعد والتصوير المتزامن للخلايا الحية في نفس الجلسة التجريبية. تصف هذه المخطوطة تحضير الجسيمات النانوية المغناطيسية فائقة المغناطيسية الفلورية (SPIONs)، وبخيار إضافي، الجسيمات النانوية المغناطيسية الوظيفية التي تستهدف الأكتين (f-SPIONs)، وبناء ومعايرة جهاز تحفيز كهرومغناطيسي متوافق مع المجهر، وتقدير القوى المغناطيسية على مستوى الجسيم الواحد والخلية الواحدة، ودمج التحفيز المغناطيسي مع التصوير المجهري البؤري في الوقت الفعلي. تعد خلايا شوان خلايا دبقية حساسة للغاية للميكانيكا وتلعب أدوارًا أساسية في تطور الأعصاب الطرفية وصيانتها وإصلاحها. يعد الرصد في الوقت الفعلي لاستجاباتها للتحفيز الميكانيكي أمرًا بالغ الأهمية لفهم كيفية تأثير القوى الميكانيكية على تنظيم الهيكل الخلوي والسلوك الخلوي. توفر هذه المنصة سير عمل قابل للتكرار لدراسة الميكانيكا الحيوية لخلايا شوان، ويمكن تكييفها مع أنواع أخرى من الخلايا المستجيبة ميكانيكيًا والأنظمة متعددة الخلايا.

المقدمة

تنظم الإشارات الميكانيكية مجموعة واسعة من العمليات الخلوية، بما في ذلك الالتصاق، والهجرة، والتكاثر، والتمايز، واللدونة المظهرية1,2,3. وقد أظهرت الدراسات في علم الأحياء الميكانيكي أن كلًا من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية تظهر حساسية واستجابة ميكانيكية ملحوظة طوال فترة النمو4,5,6,7. وللبحث في كيفية استشعار الخلايا للقوة والاستجابة لها، تم تطوير عدة مناهج تجريبية، تشمل مجهر القوة الذرية (AFM)، وشفط الماصة الدقيقة، والملاقط الضوئية، وأنظمة الزرع القائمة على التمدد، والمنصات المائعية الدقيقة8,9,10,11,12. وقد ساهمت هذه التقنيات بشكل كبير في تطوير دراسة تحويل الإشارات الميكانيكية. ومع ذلك، فإن العديد منها يتطلب اتصالاً فيزيائيًا مباشرًا بالخلايا أو يعتمد على بيئات ميكانيكية اصطناعية محددة مسبقًا، مما يجعلها أقل ملاءمة للتحفيز عن بُعد، والقابل للتحكم الديناميكي، والمتوافق مع التصوير.

يوفر تسليم القوة بوساطة الجسيمات النانوية المغناطيسية استراتيجية بديلة للتحفيز الميكانيكي عن بُعد13,14,15,16,17,18. ونظرًا لأن معظم الأنسجة البيولوجية تظهر استجابة مغناطيسية منخفضة، يمكن للمجالات المغناطيسية المطبقة خارجيًا أن تخترق العينات البيولوجية دون تلامس مباشر، وتؤثر بشكل انتقائي على الجسيمات المستجيبة مغناطيسيًا والتي يتم إيصالها إلى الخلايا أو الأنسجة. وفي وجود تدرج في المجال المغناطيسي، تتعرض هذه الجسيمات لقوى توجيهية يمكن استخدامها لفرض اضطرابات ميكانيكية على المستوى دون الخلوي، أو الخلوي، أو مستوى النسيج8,9. ويعد هذا النهج جذابًا لأنه غير تلامسي، وقابل للضبط، ومتوافق مع التصوير الحي، ومن المحتمل أن يكون قابلاً للتوسع ليشمل أنظمة بيولوجية أكثر تعقيدًا.

تُعد خلايا شوان (Schwann cells) خلايا دبقية شديدة الحساسية للميكانيكا19,20، وتلعب أدواراً حاسمة في تطور الأعصاب الطرفية وصيانتها وإصلاحها21,22. وتعتبر الملاحظة الديناميكية لاستجابات خلايا شوان للتحفيز الفيزيائي أمراً هاماً لفهم كيفية تنظيم القوة لتنظيم الهيكل الخلوي وسلوك الخلية. ومع ذلك، فإن العديد من أنظمة توصيل القوة التقليدية لا تتوافق بسهولة مع المجهر عالي الدقة في الوقت الفعلي. ولمعالجة هذا القصور، قمنا بتطوير منصة تشغيل مغناطيسية نانوية تجمع بين جسيمات مغناطيسية فائقة فلورية (f-SPIONs) تستهدف هيكل الأكتين الخلوي، وجهاز كهرومغناطيسي مخصص متوافق مع منصة المجهر البؤري، وإطار عمل كمي لتقدير القوة. يتيح هذا الإعداد المتكامل التحفيز المغناطيسي عن بُعد والتصوير المتزامن للخلايا الحية في نفس الجلسة التجريبية.

يتضمن سير العمل الموصوف هنا تحضير الجسيمات المغناطيسية الفائقة الفلورية (SPIONs)، والوظيفية الاختيارية القائمة على الفالويدين لاستهداف الأكتين لإنتاج f-SPIONs، وتوصيف الجسيمات النانوية، وبناء الجهاز الكهرومغناطيسي ومعايرة المجال، وتقدير القوة المغناطيسية، والتحفيز المغناطيسي المدمج مع التصوير البؤري في الوقت الفعلي. وعلى الرغم من تحسين هذه المنصة هنا لخلايا شوان، إلا أنها قد توفر إطاراً عملياً للدراسات ذات الصلة في الأنظمة الحية الأخرى المستجيبة ميكانيكياً.

البروتوكول

استخدمت التجارب الموصوفة في هذا البروتوكول خط خلايا شوان جرذان معتمداً (RSC96) ولم تتضمن مشاركين بشريين أو حيوانات حية. أُجريت هذه الدراسة كجزء من مشروع بحثي أوسع يتضمن تجارب على الحيوانات، والذي تمت الموافقة عليه من قبل لجنة رعاية الحيوان وأخلاقياته في المستشفى الأول بجامعة جيلين (رقم الموافقة 202-045).

1. تحضير الجسيمات الفائقة المغناطيسية الفلورية

  1. تخليق جسيمات Fe₃O₄ النانوية المطلية بحمض الأوليك.
    ملاحظة: تم تخليق جسيمات Fe₃O₄ النانوية المطلية بحمض الأوليك عن طريق التحلل الحراري كما هو موصوف سابقاً20,23.
    1. أضف 2 mmol من Fe(ac)₃، و6 mmol من حمض الأوليك، و6 mmol من الأوليل أمين، و5 mmol من 1,2-hexadecanediol إلى 20 mL من بنزيل إيثر في دورق تفاعل.
    2. قلّب الخليط تحت جو من النيتروجين لمدة 15 min حتى يتم الحصول على محلول طليعي متجانس.
    3. سخن الخليط إلى 20 °C بمعدل 20 °C/min.
    4. حافظ على التفاعل عند 20 °C لمدة 30 min.
    5. ارفع درجة الحرارة إلى 265 °C وقم بتكثيف المزيج (Reflux) لمدة 30 min.
    6. اترك خليط التفاعل ليبرد طبيعياً حتى درجة حرارة الغرفة.
    7. اجمع جسيمات Fe₃O₄ النانوية عن طريق الفصل المغناطيسي.
    8. اغسل الجسيمات النانوية 3 مرات باستخدام الإيثانول.
    9. أعد تشتيت الجسيمات النانوية المنقاة في التولوين.
  2. تجميع الجسيمات الفائقة Fe₃O₄·Cy3.5.
    ملاحظة: تم تحضير الجسيمات الفائقة Fe₃O₄·Cy3.5 كما هو موصوف سابقاً20,24,25.
    1. شتت 28 mg من جسيمات Fe₃O₄ النانوية المطلية بحمض الأوليك في 4 mL من التولوين في دورق مستدير القاع ثلاثي العنق سعة 50 mL.
    2. حضّر طوراً مائياً يحتوي على 12.5 mg من دوديسيل كبريتات الصوديوم و3 mg من Cyanine 3.5 (Cy 3.5) في 12.5 mL من الماء.
    3. امزج معلق جسيمات Fe₃O₄ النانوية في التولوين (28 mg في 4 mL؛ 7 mg/mL) مع محلول المادة الخافضة للتوتر السطحي/الصبغة المائية لتكوين مستحلب دقيق من الزيت في الماء.
    4. اخلط جيداً حتى يتم الحصول على مستحلب مستقر.
    5. سخن الدورق المستدير القاع ثلاثي العنق إلى 60 °C وقلبه باستمرار بسرعة 30 rpm لمدة 6 h.
      ملاحظة: لا يلزم إجراء عملية تبخير تحت ضغط منخفض أو تبخير دوار.
    6. بخر التولوين تحت الظروف الموصوفة أعلاه لتحفيز تجمع جسيمات Fe₃O₄ النانوية. وباستخدام ماصة نقل مخصصة للاستخدام مرة واحدة، انقل كمية صغيرة من المحلول إلى أنبوب اختبار واتركه لفترة. يشير عدم حدوث انفصال في الأطوار إلى إزالة التولوين تماماً.
    7. انقل معلق الجسيمات الفائقة Fe₃O₄·Cy3.5 إلى أنابيب طرد مركزي سعة 15 mL. قم بإجراء الطرد المركزي عند 2,370 × g لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة لجمع الجسيمات الفائقة، وتخلص بعناية من السائل الطافي دون تعكير الرواسب.
    8. أعد تشتيت الرواسب في ماء منزوع الأيونات فائق النقاء وقم بإجراء الطرد المركزي مرة أخرى عند 2,370 × g لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السائل الطافي وكرر إجراء الغسل ثلاث مرات لإزالة بقايا صبغة Cy3.5 الحرة ودوديسيل كبريتات الصوديوم.
  3. تغطية الجسيمات الفائقة بالبوليدوبامين (PDA).
    ملاحظة: تم تحضير الجسيمات الفائقة المطلية بالبوليدوبامين كما هو موصوف سابقاً20,26.
    1. قم بإجراء الطرد المركزي لمعلق الجسيمات الفائقة Fe₃O₄·Cy3.5 عند 2,370 × g لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة، وتخلص من السائل الطافي.
    2. أعد تشتيت الرواسب في محلول Tris المنظم بتركيز 10 mM (pH 8.5).
    3. أضف 26 mg من مونومر الدوبامين إلى المعلق.
    4. قلّب الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 h تحت ظروف قلوية.
    5. قم بإجراء الطرد المركزي للمعلق عند 2,370 × g لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة.
    6. أزل السائل الطافي وأعد تشتيت الرواسب في ماء فائق النقاء للحصول على جسيمات Fe₃O₄·Cy3.5@PDA (SPIONs).
  4. إضفاء وظائف على الجسيمات باستخدام phalloidin-Alexa Fluor 350 (اختياري).
    ملاحظة: تم إضفاء وظائف سطحية على الجسيمات الفائقة باستخدام phalloidin-Alexa Fluor 350 المتاح تجارياً20.
    1. حضّر 5 mL من محلول مائي يحتوي على 10 units من phalloidin-Alexa Fluor 350.
    2. أضف 20 µL من معلق Fe₃O₄·Cy3.5@PDA الذي يحتوي على 2 mg من الجسيمات إلى المحلول.
    3. قلّب الخليط بلطف في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 h.
    4. قم بإجراء الطرد المركزي للخليط عند 2,370 × g لمدة 5 min في درجة حرارة الغرفة.
    5. تخلص من السائل الطافي وأعد تشتيت الرواسب في ماء منزوع الأيونات.
    6. خزّن تركيبة Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@phalloidin (f-SPIONs) النهائية محمية من الضوء حتى وقت الاستخدام.

2. توصيف الجسيمات النانوية

  1. تحديد المورفولوجيا والحجم.
    1. تحضير عينات الجسيمات النانوية للفحص بالمجهر الإلكتروني النافذ (TEM) أو المجهر الإلكتروني النافذ عالي الدقة (HRTEM) وفقاً لمتطلبات الجهاز.
    2. التقاط الصور لتحديد المورفولوجيا العامة للجسيمات، وبنية اللب والقشرة، ومتوسط القطر (الشكل 1).
    3. تحضير معلقات مائية من الجسيمات النانوية لتحليل تشتت الضوء الديناميكي (DLS).
    4. قياس القطر الهيدروديناميكي ومؤشر تشتت الحجم (PDI).
    5. مقارنة نتائج المجهر الإلكتروني ونتائج DLS لتقييم تجانس التركيبة والسلوك الغروي.
  2. تحديد الخصائص المغناطيسية.
    1. تحضير عينات جافة أو مركزة من الجسيمات النانوية مناسبة للتحليل باستخدام جهاز التداخل الكمي فائقة التوصيل (SQUID).
    2. تسجيل منحنيات التخلف المغناطيسي عند 30 K.
    3. تحديد مغنطة التشبع، والمغنطة المتبقية، والقوة القسرية.
    4. التأكد من أن الجسيمات تظهر سلوكاً بارامغناطيسياً فائقاً مع مغنطة متبقية وقوة قسرية ضئيلتين.
  3. تحديد خصائص الفلورة.
    1. تحضير معلق f-SPION في ماء منزوع الأيونات فائق النقاء ونقل المعلق إلى كوفيت من الكوارتز.
    2. تسجيل أطياف التألق الضوئي باستخدام مطياف الفلورة.
    3. التأكد من أن إشارة الفلورة تظل قابلة للكشف بعد الغسل وإعادة التعليق.
  4. التحقق من التمركز المرتبط بالأكتين عند استخدام التركيبة المستهدفة.
    1. الحصول على خلايا RSC96.
      ملاحظة: تم الحصول على خلايا RSC96 المستخدمة في هذه الدراسة، وهي سلالة خلايا شوان جرذ تحولت تلقائياً تم تأسيسها من خلال الزراعة طويلة الأمد لخلايا شوان أولية من الجرذ، من بنك الخلايا التابع للأكاديمية الصينية للعلوم، شنغهاي، الصين (CSTR: 19375.09.3101RATGNR6)، وقد أظهرت النتائج خلوها من تلوث الميكوبلازما والفطريات. تم استخدام الخلايا في الممرات من 3 إلى 10.
    2. زراعة الخلايا في وسط Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) المدعم بـ 10% مصل جنين البقر (FBS) و1% محلول بنسلين-ستربتوميسين (10 U/mL بنسلين و 10 µg/mL ستربتوميسين).
    3. استزراع خلايا RSC96 بكثافة 1 × 105 خلية لكل طبق مجهري لزراعة الخلايا بحجم 35 مم، وزراعتها لمدة 24 h عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% CO₂ للسماح بالتصاق الخلايا.
    4. سحب وسط الزراعة الموجود، وغسل الخلايا مرتين بمحلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)، وإضافة وسط زراعة كامل يحتوي على 15 µg/mL من f-SPIONs. تحضين الخلايا مع f-SPIONs لمدة 12 h.
    5. سحب وسط الزراعة وغسل الخلايا مرتين بمحلول PBS مبرد بالثلج يحتوي على 1 mM من الديفيروكزامين لإزالة الجسيمات غير الممتصة تماماً.
    6. التقاط صور مجهرية بؤرية لتقييم التوزيع داخل الخلايا للجسيمات. ضبط معاملات التصوير على فتحة صغيرة (pinhole) بمقدار 1 وحدة إيري (AU) وخطوة z بمقدار 0.43 µm للحصول على مقاطع بصرية عالية الدقة للهياكل داخل الخلايا.
    7. فحص ما إذا كانت الجسيمات تظهر تركيزاً في المناطق الخلوية المرتبطة بالأكتين.

3. بناء ومعايرة جهاز التحفيز الكهرومغناطيسي (الشكل 2)

  1. قم بتجميع الجهاز الكهرومغناطيسي.
    1. قم ببناء نظام ملفات كهرومغناطيسي مدمج بحجم يتناسب مع منصة المجهر البؤري وغرفة الخلايا الحية (الشكل 2-أ,B).
    2. قم بتوصيل الملف بمصدر طاقة قابل للتحكم أو بمصدر تيار خارجي.
    3. قم بمحاكاة بيئة المجال المغناطيسي المتدرج عددياً باستخدام برنامج COMSOL Multiphysics 4.3b (الشكل 2ج,د).
    4. تأكد من أن المغناطيس الكهربائي يولّد مجالاً مغناطيسياً متدرجاً (GMF) مقابلاً تحت تيارات دخل مختلفة (الشكل 2G).
  2. قياس كثافة التدفق المغناطيسي ومعايرة المجال المغناطيسي المتدرج.
    1. ضع المغناطيس الكهربائي بجانب طبق الزرع، بحيث يكون طرف القطب موجهاً نحو مركز الطبق وعلى بعد 1 مم من الجدار الخارجي للطبق (الشكل 2E,ف).
    2. حافظ على هذا التكوين الهندسي النسبي بين المغناطيس الكهربائي وطبق الزرع خلال جميع تجارب تحفيز القوة المغناطيسية والتصوير اللاحقة للخلايا الحية.
    3. استخدم مقياس غاوس الرقمي لقياس كثافة التدفق المغناطيسي في مواقع محددة مسبقاً ضمن منطقة التحفيز، مع استخدام شبكة تحديد المواقع الموجودة في قاع طبق الزرع كمرجع مكاني.
    4. احسب تدرج المجال المحلي من التغير المكاني في كثافة التدفق المغناطيسي.
    5. قم بمعايرة والتحقق من صحة تدرج المجال المغناطيسي المحاكى عددياً باستخدام قيم تدرج المجال المغناطيسي المقاسة والمحسوبة تجريبياً.

4. تقدير القوى المغناطيسية التي توفرها المنصة.

  1. عرّف نموذج تقدير القوة.
    1. استخدم معادلة القوة للجسيمات النانوية المغناطيسية في مجال مغناطيسي غير منتظم27,28:
      معادلة التوازن الساكن، F=(m·∇)B، حول التفاعل مع المجال المغناطيسي، للاستخدام التعليمي.
    2. بافتراض المحاذاة فائقة البارامغناطيسية مع المجال المسلط، يتم تبسيط المعادلة إلى
      معادلة القوة المغناطيسية \(F_{\text{f-SPION}}=m\frac{dB}{dr}\)؛ صيغة لدراسة المجال المغناطيسي.
      حيث:
      ف هل القوة المغناطيسية النانوية
      م هو عزم الثنائي القطب المغناطيسي
      معادلة Nabla B، رمز حساب المتجهات، يوضح التدفق المغناطيسي في مخطط فيزيائي. تدرج المجال المغناطيسي
      dB/dr هو تدرج المجال المغناطيسي (T/m) الذي يولده جهاز توليد المجال المغناطيسي المقابل.
    3. استخدم تدرج المجال المقاس من الجهاز المعاير في جميع الحسابات.
  2. تقدير القوة المؤثرة على جسيم نانوي واحد.
    1. تحديد متوسط أبعاد الجسيمات من صور المجهر الإلكتروني النافذ عالي الدقة (HRTEM).
    2. احسب حجم القلب المغناطيسي بافتراض هندسة كروية.
    3. قم بتقدير الحجم المغناطيسي النوعي لـ Fe₃O₄ بناءً على الكسر المغناطيسي للنواة.
    4. احسب عزم ثنائي القطب المغناطيسي وفقاً لـ صيغة حساب الكتلة الكيميائية \(m=\rho \cdot V \cdot M_m\)، معادلة الحسابات الكمية.
      حيث:
      ممتر يمثل المغنطة الكتلية لجسيمات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية الوظيفية (f-SPIONs) (16 A·m2/كجم) تحت شدة المجال المحددة؛
      ρ هل كثافة Fe₃O₄ (5.24 جم/سم³3).
      ​V هل حجم النواة المغناطيسية من Fe₃O₄ داخل كل جسيم نانوي من أكسيد الحديد الفائق المغناطيسية والمطعم بالفلور (f-SPION) هو (5.89 × 10⁻17 سم3).
    5. اضرب عزم ثنائي القطب في تدرج المجال المقاس لتقدير القوة المؤثرة على جسيم نانوي واحد (معادلة قوة التوازن الاستاتيكي Ff-SPION؛ رمز؛ استخدام تعليمي.).
  3. تقدير امتصاص الجسيمات النانوية لكل خلية شوان.
    1. قم باستزراع خلايا شوان من سلالة RSC96 بكثافة 5 × 105 عدد الخلايا لكل بئر في أطباق المجهر لزراعة الخلايا مقاس 35 مم.
    2. تُحضن الخلايا لمدة 24 ساعة في ظروف الزرع القياسية.
    3. استبدل الوسط بوسط جديد يحتوي على 15 µg/mL جسيمات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية الوظيفية (f-SPIONs).
    4. تُحضن الخلايا لمدة 12 ساعة إضافية.
    5. اغسل الخلايا مرتين بمحلول ملحي منظم بالفوسفات مبرد بالثلج ويحتوي على 1 ملي مولار من الديفيروكسامين.
    6. جمع الخلايا وعدّها.
    7. قياس محتوى الحديد داخل الخلايا باستخدام مطيافية الانبعاث الذري بالبلازما المقترنة حثياً (ICP-AES).
    8. احسب عدد الجسيمات الممتصة داخلياً لكل خلية عن طريق قسمة متوسط كتلة الحديد لكل خلية على كتلة الحديد لكل جسيم. معادلة الامتصاص الخلوي لجسيمات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية (n_cell^f-SPIONs) في أبحاث التصوير الطبي..
  4. تقدير القوة المسلطة على خلية شوان واحدة.
    1. احسب القوة على مستوى الخلية وفقاً لـ
      معادلة التوازن الساكن، F_cell=n^f-SPIONs_cell·F_f-SPION، صيغة؛ تحليل توازن القوى.
      حيث:
      معادلة قوة التوازن الاستاتيكي Ff-SPION؛ رمز؛ استخدام تعليمي. هي القوة المغناطيسية المؤثرة على جسيم نانوي واحد من أكسيد الحديد المغناطيسي الوظيفي (f-SPION).
      معادلة تركيز جسيمات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية (SPION)، \( n^\text{f-SPIONs}_\text{cell} \)، الترميز العلمي، مخطط توضيحي. هو عدد جسيمات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية الوظيفية (f-SPIONs) التي تم استيعابها داخل كل خلية.
      فخلية هي القوة المغناطيسية المؤثرة على خلية واحدة.
    2. سجل القيمة الناتجة على أنها القوة المغناطيسية التقديرية المؤثرة على خلية شوان واحدة (فخلية).
    3. وضح بجلاء أن القيمة هي تقدير قائم على نموذج وليست قياساً مباشراً للقوة داخل الخلية.

5. دمج التحفيز المغناطيسي مع التصوير بالمجهر البؤري الماسح بالليزر (CLSM) في الوقت الحقيقي

  1. تحميل خلايا شوان بالجسيمات النانوية المغناطيسية.
    1. قم باستزراع خلايا شوان في أطباق زراعة ibidi المتوافقة مع التصوير أو في غرف زراعة مائعية دقيقة.
    2. اترك الخلايا حتى تلتصق وتتعافى.
    3. استبدل الوسط الموجود بوسط زراعة جديد يحتوي على 15 µg/mL جسيمات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية الوظيفية (f-SPIONs).
    4. تُحضن الخلايا لمدة 12 ساعة للسماح بتحميل جسيمات f-SPION.
    5. افحص مورفولوجيا الخلايا قبل المتابعة.
  2. إزالة الجسيمات غير الممتصة داخلياً.
    1. قم بإزالة الوسط الذي يحتوي على الجسيمات النانوية.
    2. اغسل الخلايا مرتين بمحلول PBS المحتوي على 1 mM من الديفيروكسامين (deferoxamine).
    3. استبدل محلول الغسيل بوسط زراعة للخلايا الحية متوافق مع التصوير.
    4. تحقق من انخفاض خلفية الجسيمات خارج الخلوية قبل التصوير.
  3. دمج جهاز المغناطيس الكهربائي مع نظام التصوير بالمجهر confocal الليزري الماسح (CLSM).
    1. قم بتجميع المغناطيس الكهربائي مع غرفة زراعة الخلايا الحية، مع وضع المغناطيس الكهربائي في موقعه الذي تمت معايرته مسبقاً.
    2. ضع غرفة زراعة الخلايا الحية المُجمعة على منصة المجهر البؤري (confocal microscope)الشكل 3). تأكد من وضع طبق الزرع ضمن منطقة التحفيز الفعالة (الشكل 3أ).
    3. قم بتنشيط المغناطيس الكهربائي وفقاً للمعلمات المحددة مسبقاً، وتحقق من التعرض الفعال للمجال المغناطيسي المتدرج ضمن منطقة طبق الزرع (الشكل 3B).
    4. تحقق من قدرة العدسة الشيئية على الوصول إلى المستوى البؤري دون أي تداخل.
    5. تأكد من أن الجهاز لا يعيق وضع العدسة الشيئية أو حركة المنصة.
    6. مع مراعاة الحرارة المتولدة أثناء تشغيل المغناطيس الكهربائي، قم بضبط إعدادات درجة الحرارة لمكونات غرفة الخلايا الحية وفقاً لظروف الزرع المثلى المحددة مسبقاً لضمان بيئة داخلية من 37 °C و5% من ثاني أكسيد الكربون (CO₂)الشكل 3ج).
    7. تأكد من أن النظام بأكمله يعمل بشكل طبيعي ومستقر.
  4. الكالسيوم الوظيفي2التصوير بالـ ⁺ في الخلايا الحية.
    1. تُحضن الخلايا في محلول كريبس-رينجر (الرقم الهيدروجيني 7.4) المحتوي على 3 µM فلور-4 AM و0.1% Pluronic F-127 عند 37 °C لمدة 30 دقيقة.
    2. بعد الحضن، اغسل المزارع مرتين باستخدام المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS)، ثم انقلها إلى منصة تصوير الخلايا الحية في نظام المجهر confocal الماسح الليزري (CLSM) للتصوير (الشكل 4أ).
    3. باستخدام شبكة تحديد المواقع الموجودة في قاع طبق زراعة ibidi، قم بتصوير خمسة مواقع محددة مسبقاً.
    4. قسّم كل مجال تصوير بالتساوي إلى 25 منطقة، واختر من 0 إلى 3 خلايا من كل منطقة لإجراء القياس الكمي للفلورة، وذلك بناءً على الكثافة الفعلية للخلايا داخل تلك المنطقة.
    5. حدد المخطط الخارجي الكامل لخلية فردية كمنطقة اهتمام (ROI)، وراقب استجابة الكالسيوم المستحثة مغناطيسياً عن طريق تحليل التغيرات في شدة الفلورسنت (ΔF) ضمن منطقة الاهتمام.
    6. احسب التغير في شدة الفلورية وفق المعادلة ΔF = (Fتحفيز - F0). خذ في الاعتبار التغير في شدة الفلورة قبل التحفيز وبعده (ΔF/F0تجاوز 10%، تُعد حدث استجابة للكالسيوم.
      ملاحظة: Fغير محفز تمثل شدة الفلورة قبل التحفيز بالقوة المغناطيسية، F0 تمثل شدة الفلورية الأساسية، و Fتحفيز تمثل شدة الفلورة المستحثة بعد التحفيز بالقوة المغناطيسية.
    7. لتصحيح الخلفية، اطرح متوسط شدة فلورة الخلفية المقاسة في منطقة خالية من الخلايا من قيمة شدة الفلورة لكل منطقة اهتمام (ROI).
    8. أجرِ ثلاث تجارب مستقلة، بحيث يتضمن كل منها طبق استنبات واحدًا.
  5. أجرِ التصوير بالفاصل الزمني وطبّق التحفيز المغناطيسي أثناء التصوير.
    1. اضبط معلمات التصوير بالفاصل الزمني (time-lapse imaging) على النحو التالي: فاصل زمن الاستحواذ 2.1 ثانية لكل إطار، ومدة استحواذ إجمالية تبلغ 650 ثانية، وتصوير مقطعي بصري قياسي عالي الدقة باستخدام 1 AU.
    2. أثناء التصوير الخلوي، يتم التقاط الصور بشكل مستمر لمدة 50 ثانية دون إدخال تيار كهربائي، وذلك لتسجيل شدة فلورية الكالسيوم داخل الخلايا في حالة عدم وجود تحفيز بالقوة المغناطيسية (Fغير محفز) (الشكل 2H و الشكل 4B).
    3. قم بتطبيع شدة الفلورة المسجلة خلال أول 50 ثانية، وعرّفها على أنها شدة الفلورة المرجعية (F₀).0).
    4. بعد ذلك، يتم تطبيق تيار دخل ثابت قدره 3.0 أمبير على المغناطيس الكهربائي، مما يعرض خلايا شوان المحملة بالجسيمات النانوية المغناطيسية لمجال مغناطيسي متدرج قدره 3.25 تسلا/متر، وبذلك تخضع هذه الخلايا لتحفيز بالقوة المغناطيسية. ويستمر التصوير بالفاصل الزمني لمدة 10 دقائق لتسجيل شدة فلورة الكالسيوم داخل الخلايا أثناء التحفيز بالقوة المغناطيسية (Fتحفيز) (الشكل 2H و الشكل 4ج).
    5. احسب كمياً التغير في شدة الفلورة كقيمة ΔF/F0 (الشكل 4D,هـ).
  6. إجراء التحليل الإحصائي وتحليل Ca2بيانات الفلورة⁺.
    1. احسب قيمة الوسيط لـ ΔF/F₀ لكل خلية عبر السلسلة الزمنية التي تم تحليلها، واستخدم هذه القيمة كقيمة Ca على مستوى الخلية.2مقياس الاستجابة ⁺.
    2. أجرِ ثلاث تجارب مستقلة لكل حالة تجريبية، بحيث يتم استخدام طبق زرع واحد لكل حالة في كل تجربة. قم بتجميع الخلايا التي تم تحليلها عبر التجارب الثلاث المستقلة لغرض العرض الوصفي، مع تحديد قيمة n كإجمالي عدد الخلايا التي تم تحليلها في كل مجموعة.
    3. قيّم التوزيع الطبيعي لبيانات ΔF/F₀ على مستوى الخلية باستخدام اختبار كولموغوروف-سميرنوف.
    4. نظرًا لأن الكالسيوم (Ca)2إذا كانت بيانات استجابة الفلورة غير موزعة توزيعاً طبيعياً، فاعرض البيانات في صورة الوسيط والمدى الربيعي (IQR).
    5. حلل الفروق بين المجموعات باستخدام اختبار فريدمان (Friedman test) غير المعلمي، متبوعاً باختبارات ويلكوكسون للرتب الموقعة (Wilcoxon signed-rank tests) لإجراء المقارنات الزوجية، وفقاً لما تم الإبلاغ عنه سابقاً.
    6. ضع في اعتبارك P < 0.05 للإشارة إلى الدلالة الإحصائية.

النتائج

أظهر مجهر الإلكترونات النافذ عالي الدقة (HRTEM) أن التركيبة النهائية للجسيمات النانوية امتلكت لباً مغناطيسياً متكتلاً وغلافاً خارجياً بعد تعديل السطح (الشكل 1). بلغ متوسط القطر الإجمالي لجسيمات f-SPIONs النهائية 63.36 ± 16.65 nm، مع لب مغناطيسي غني بـ Fe₃O₄ يبلغ قطره حوالي 56.60 ± 6.19 nm، وغلاف خارجي يتكون من البوليدوبامين والـ phalloidin-Alexa Fluor 350 بمتوسط سمك يبلغ حوالي 5.79 ± 1.36 nm. وأكدت هذه النتائج نجاح بناء بنية جسيم فائق مناسبة للتنشيط المغناطيسي والتصوير القائم على الفلورة.

أظهر تحليل التخلف المغناطيسي أن الجسيمات أبدت سلوكاً بارامغناطيسياً فائقاً واضحاً، مع تخلّف مغناطيسي وقوة قسرية ضئيلتين. وتحت تأثير مجال مغناطيسي مسلط قدره 10,0 Oe (1.0 T)، وصل مغناطيس التشبع لديها إلى حوالي 35 A·m2/kg (الشكل 5). وفي غياب تدرج المجال المغناطيسي، أظهرت جسيمات f-SPIONs قدرة جيدة على التشتت في وسط مائي (الشكل 6A). وعند تعريضها لمجال مغناطيسي متدرج، أظهرت جسيمات f-SPIONs استجابة مغناطيسية حساسة (الشكل 6B). كما أكد تحليل الفلورة أن الجسيمات احتفظت بقابلية الكشف الضوئي بعد عمليات التصنيع وتعديل السطح (الشكل 7).

تم دمج جهاز التحفيز الكهرومغناطيسي بنجاح في نظام تصوير الخلايا الحية (الشكل 3). وأظهرت معايرة المجال المغناطيسي أن الجهاز قد ولّد مجالاً مغناطيسياً متدرجاً ومستقراً عبر منطقة زراعة الخلايا (الشكل 2E,F)، حيث بلغ المجال المغناطيسي المتدرج في المختبر حوالي 3.25 T/m وفقاً للتكوين التجريبي الحالي (الشكل 2G).

أظهر التصوير البؤري (Confocal imaging) تحميلًا فعالًا للجسيمات النانوية المغناطيسية الفلورية داخل خلايا شوان (الشكل 7). وبعد عملية الغسل، ظلت إشارة الفلورة مرتبطة بشكل أساسي بالخلايا بدلاً من الجسيمات الحرة في الوسط. وبالنسبة للتركيبة المستهدفة للأكتين، أظهر التصوير البؤري أيضًا تركز الجسيمات في المناطق الخلوية المرتبطة بالأكتين.

أظهر التصوير البؤري المتسارع (Time-lapse confocal imaging) إمكانية إجراء التحفيز المغناطيسي والتصوير الحي للخلايا ضمن نفس سير العمل التجريبي، مع الحفاظ على وصول بصري مستقر إلى الخلايا طوال فترة التحفيز (الشكل 2H والشكل 4A).

ربط ملخص كمي بشكل أكبر بين تصميم الجسيمات النانوية، ومعايرة الجهاز، والتحميل الخلوي. تحت تأثير المجال المغناطيسي المتدرج في المختبر بقيمة 3.25 T/m، قُدرت القوة المغناطيسية المؤثرة على جسيم f-SPION واحد بنحو 1.59 × 10-5 pN. وبناءً على القياس الكمي للحديد داخل الخلايا، استوعبت كل خلية شوان من نوع RSC96 حوالي 9.30 ± 2.8 × 103 جسيم، وهو ما يتوافق مع إجمالي قوة مغناطيسية تقديرية تبلغ حوالي 0.15 ± 0.05 pN لكل خلية.

مقارنةً بالفلورة المرجعية، أظهرت خلايا RSC96 ديناميكيات نشطة لـ Ca2+ وزيادة ملحوظة في إشارات فلورة Ca2+ تحت تأثير التحفيز المغناطيسي بوساطة f-SPIONs (الشكل 4D). وكشف التحليل الكمي لإشارات فلورة Ca2+ أن التغير في شدة فلورة Ca2+ (ΔF/F0) داخل خلايا RSC96 في مجموعة التحفيز المغناطيسي (62.96 [35.07–91.67]) كان أعلى بكثير مما كان عليه في مجموعة التحكم العادية (-5.74 [-15.6–1.20])، ومجموعة التحكم بـ f-SPIONs (-16.70 [-2.02–-12.0])، ومجموعة التحكم بالمجال المغناطيسي المتدرج (-12.90 [-21.24–-6.97]) (الشكل 4E).

بنية الجسيمات النانوية في صور المجهر الإلكتروني النافذ (TEM)؛ تحليل بالمجهر الإلكتروني يوضح تفاصيل تكتل الجسيمات النانوية.
الشكل 1المورفولوجيا وبنية اللب والغلاف لجسيمات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية الموظيفية (f-SPIONs) بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ عالي الدقة (HRTEM). (A) تتميز جسيمات f-SPIONs بأنها كروية الشكل وتظهر بنية نموذجية من النوع (لب-قشرة)، حيث يتكون اللب المغناطيسي الداخلي من جسيمات Fe₃O₄ النانوية وCy3.5.B) تكون القشرة الخارجية من PDA وphalloidin-Alexa Fluor 350. وتظهر الصور في اللوحة B مناظر مكبرة ممثلة للمناطق المحددة بمربعات حمراء في اللوحة A، حيث تشير الخطوط والأسهم البيضاء إلى سمك القشرة المقاس. يمثل شريط القياس في اللوحة B مسافة 10 نانومتر. تم إجراء ثلاثة قياسات مستقلة، حيث جرى تحليل ما مجموعه 680 جسيماً نانوياً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط لجهاز كهرومغناطيسي بسلك نحاسي وقلب حديدي؛ عمليات محاكاة للمجال المغناطيسي؛ رسم بياني للمجال.
الشكل 2بناء ومعايرة وتشغيل المغناطيس الكهربائي المخصص للتحفيز المغناطيسي للخلايا الحية. (A,B) لُفّ ملف المغناطيس الكهربائي حول قلب حديدي باستخدام سلك نحاسي مطلي بالمينا بقطر 1.1 مم، وبإجمالي 410 لفة. بلغ القطر الخارجي للملف 60 مم، والقطر الداخلي 20 مم، وطوله 10 مم، ومقاومته للتيار المستمر حوالي 1.2 Ω. بلغت قياسات طرف القطب 13.0 مم × 12.0 مم × 3.0 مم (الطول × العرض × الارتفاع)، وصُنِع من مادة البيرمالوي 1J50.سي,دلم يتجاوز الحد الأقصى لتيار دخل المغناطيس الكهربائي 3 أمبير. وعند تيار دخل قدره 3 أمبير، تولد تدرج في المجال المغناطيسي يبلغ 6.7 تسلا/متر تقريبًا بالقرب من طرف القطب.هـ,ف) توزيع المجال المغناطيسي المتدرج داخل طبق الزرع بالقرب من طرف القطب عند تيار دخل قدره 3 A. تم توليد تدرج متوسط للمجال المغناطيسي الساكن يبلغ 3.25 T/m تقريباً عبر منطقة التصوير الخلوي. (ج) تدرجات المجال المغناطيسي المتولدة عن المغناطيس الكهربائي عند تيارات دخل مختلفة تبلغ 1 أمبير، و2 أمبير، و3 أمبير. (هـ) بروتوكول التصوير الزمني المتقطع للخلايا الحية، وتطبيق التيار، والتعريض لمجال مغناطيسي متدرج في هذه الدراسة. تم الحصول على الصور الزمنية المتقطعة بشكل مستمر لمدة 50 ثانية بدون إدخال تيار. بعد ذلك، تم تطبيق تيار مستمر وثابت بقدر 3.0 أمبير، واستمر التصوير الزمني المتقطع لمدة 10 دقائق. DC: التيار المستمر. GMF: المجال المغناطيسي المتدرج. تم اقتباس اللوحات E وF وG بإذن من Liu et al.20. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

غرفة استزراع الخلايا الحية مع تصوير مجهري بمسح ليزري متحد البؤر (CLSM)، ومغناطيس كهربائي، وسخانات، وتجهيزات تيار مستمر.
الشكل 3دمج المغناطيس الكهربائي في غرفة زراعة الخلايا الحية. (A) مغناطيس كهربائي مدمج ومصمم خصيصاً، وُضع في الموقع المُعاير داخل غرفة زراعة الخلايا الحية لتعريض منطقة طبق زراعة الخلايا لمجال مغناطيسي متدرج.Bإعداد متكامل لنظام التصوير بالمجهر البؤري الماسح بالليزر (CLSM)، ومنصة التحفيز النانوي المغناطيسي، ومصدر طاقة خارجي للتيار المستمر.سييضمن تحسين إعدادات درجة الحرارة للمكونات الفردية لغرفة زراعة الخلايا استقرار درجة الحرارة داخل طبق الزراعة أثناء تشغيل المغناطيس الكهربائي.د( ) معلمات ضبط درجة الحرارة للمكونات الفردية لغرفة زراعة الخلايا. CLSM: المجهر البؤري الماسح بالليزر. PV: القيمة المقاسة. SV: القيمة المحددة. Top Heater: درجة حرارة سخان الغطاء العلوي. Stage heater: درجة حرارة تسخين منصة المجهر وقاع غرفة الزراعة. Bath heater: درجة حرارة الحمام المائي. Lens heater: درجة حرارة سخان العدسة الشيئية. Temp sensor: درجة الحرارة الفعلية المقاسة بواسطة مسبار درجة الحرارة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط التحفيز النانوي المغناطيسي؛ جسيمات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغنطة الوظيفية (f-SPIONs)، أيونات الكالسيوم، مجهر التباين التفاضلي (DIC microscopy)، نتائج الفلورة.
الشكل 4صور تمثيلية لاستجابات الكالسيوم في خلايا شوان تحت تأثير تحفيز القوة المغناطيسية. (A) سير عمل متكامل للتحفيز المغناطيسي وقياس الكالسيوم في الخلايا الحية2+ التصوير في منصة التحفيز النانوي المغناطيسي. (B) مستوى الكالسيوم الأساسي2+ صورة الفلورة التي تم الحصول عليها قبل التحفيز المغناطيسي (Fغير محفز). (سي) كالسيوم2+ صورة الفلورة التي تم الحصول عليها بعد التحفيز المغناطيسي (Fتحفيز)، مما يوضح التغير في شدة الفلورة (ΔF). (دقياس الكالسيوم ذو الدقة الزمنية2+ تتبع الإشارات التي تمت مراقبتها قبل التحفيز المغناطيسي وبعده.هـ) التحليل الكمي ومقارنة التغيرات في الكالسيوم (Ca)2+ الفلورية (ΔF/F₀) بين المجموعات التجريبية المختلفة. DIC: تباين التداخل التفاضلي. Fغير محفز: شدة الفلورة قبل التحفيز بالقوة المغناطيسية. F0: شدة الفلورية المرجعية. Fتحفيز: شدة الفلورة المستحثة بعد التحفيز بالقوة المغناطيسية. ΔF: التغير في شدة الفلورة. يمثل "Normal" مجموعة الضبط الطبيعية، ويمثل "f-SPIONs+GMF" مجموعة التحفيز النانوي المغناطيسي، ويمثل "f-SPIONs" مجموعة الضبط الخاصة بـ f-SPIONs، ويمثل "GMF" مجموعة الضبط الخاصة بالمجال المغناطيسي المتدرج. أُجريت ثلاث تجارب مستقلة، بواقع طبق زرع واحد لكل حالة تجريبية في كل تجربة. وبالنسبة لكل خلية، استُخدمت القيمة الوسيطة لـ ΔF/F₀ عبر السلاسل الزمنية التي تم تحليلها كمقياس للاستجابة على مستوى الخلية. تُعرض البيانات في صورة الوسيط والمدى الربيعي (IQR)، ويشير n إلى العدد الإجمالي للخلايا التي تم تحليلها عبر التجارب الثلاث المستقلة. أُجري التحليل الإحصائي باستخدام اختبار فريدمان (Friedman test) متبوعاً باختبار ويلكوكسون للرتب الموقعة (Wilcoxon signed-rank test)، كما ورد سابقاً في دراسة Liu et al. تم اقتباس البيانات الكمية في اللوحة E بإذن من Liu et al.20. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

رسوم بيانية للمغنطة مقابل المجال، حلقة التخلف المغناطيسي عند 30 كلفن، تحليل الخواص المغناطيسية، مخطط.
الشكل 5الخصائص فائقة المغناطيسية لجسيمات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية الوظيفية (f-SPIONs). (A) حلقة التلاكؤ المغناطيسي لجسيمات f-SPIONs، والتي تُظهر سلوكاً بارامغناطيسياً فائقاً نموذجياً. (B) عرض مكبّر لحلقة التلاكؤ بالقرب من المجال المغناطيسي الصفري. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تجربة المجال المغناطيسي: ملف مع قارورة. تأثير تشغيل/إيقاف المجال المغناطيسي العام (GMF) على التشتت (مؤشر تشتت تعدد القياسات PDI: 0.16).
الشكل 6القابلية للتشتت المائي والاستجابة للمجال المغناطيسي المتدرج لجسيمات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية الوظيفية (f-SPIONs). (Aفي حالة عدم وجود مجال مغناطيسي متدرج، تظل جزيئات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية الوظيفية (f-SPIONs) منتشرة بشكل جيد في الوسط المائي.B) عند تطبيق المجال المغناطيسي المتدرج، تهاجر جسيمات أكسيد الحديد النانوية الفائقة المغناطيسية الوظيفية (f-SPIONs) وتتراكم بسرعة على طول اتجاه تدرج المجال. GMF: المجال المغناطيسي المتدرج. PDI: مؤشر تشتت تعدد الأحجام. يشير السهم إلى اتجاه المجال المغناطيسي المتدرج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تصوير الخلايا باستخدام جسيمات Fe3O4 النانوية؛ مجهر فلوري يوضح دمج صور DIC وCy3.5 والفالويدين.
الشكل 7تصوير الفلورة باستخدام المجهر البؤري الماسح (CLSM) لعملية استيعاب جسيمات أكسيد الحديد النانوية الفائقة المغناطيسية الوظيفية (f-SPION) داخل خلايا شوان. (Aتصوير خلايا شوان باستخدام المجهر confocal (CLSM) بعد الحضانة المشتركة مع جسيمات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغنطة الوظيفية (f-SPIONs)15 µg/mLلمدة 12 ساعة ثم الغسل اللاحق (ثقب دبوسي = 1 AU؛ خطوة Z = 0.43 µm)، مما يُظهر الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا والحد الأدنى من خلفية الجسيمات خارج الخلوية. (B) تم الكشف عن فلورة حمراء في قناة Cy3.5 (طول موجة الإثارة/الانبعاث: 561-568/607 نانومتر)، مما يشير إلى وجود جسيمات أكسيد الحديد النانوية فائقة المغناطيسية الوظيفية (f-SPIONs) الموصومة بـ Cy3.5 داخل خلايا شوان.سي) تم رصد فلورة زرقاء في قناة Alexa Fluor 350 (طول موجة الإثارة/الانبعاث: 350-360 نانومتر/40-460 نانومتر)، مما يدعم نجاح دمج وحدة الوظيفية phalloidin-Alexa Fluor 350.د) صورة مدمجة تظهر تداخلاً مكانياً كبيراً بين إشارتي الفلورة الحمراء والزرقاء، مما يتفق مع النجاح في بناء الجسيمات الفائقة المغناطيسية-الفلورية. DIC: تباين التداخل التفاضلي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

تُعرف جسيمات أكسيد الحديد النانوية على نطاق واسع بأنها مواد نانوية مغناطيسية ذات توافق حيوي ملائم. وباعتبارها عوامل تباين مستخدمة بكثرة في التصوير بالرنين المغناطيسي، فقد طُبقت جسيمات Fe₃O₄ النانوية ذات المغناطيسية الفائقة بشكل مكثف في التشخيص التصويري السريري29,30. وفي دراسة حديثة أجرتها مجموعتنا20، ثبت أن f-SPIONs تظهر سمية خلوية منخفضة للغاية وأماناً حيوياً ممتازاً. وقد قامت منصة التحفيز المغناطيسي النانوي، التي تم بناؤها باستخدام f-SPIONs كمشغلات ميكانيكية بالتنسيق مع مغناطيس كهربائي يمكن التحكم فيه، بتنشيط ديناميكيات الهيكل الخلوي في خلايا شوان بفعالية، وحفزت فتح قناة Piezo1 الأيونية الحساسة للميكانيكا، وأدت إلى تدفق Ca2⁺ عبر الغشاء، مما عزز لاحقاً "إعادة برمجة" التعبير الجيني والتغيرات المظهرية في الخلايا20.

تعتبر عدة خطوات مهمة بشكل خاص للتنفيذ الناجح لهذه المنصة. الخطوة الحرجة الأولى هي تحضير الجسيمات النانوية؛ إذ يجب أن تظل الجسيمات موزعة جيداً، ومستجيبة مغناطيسياً، وقابلة للكشف بصرياً بعد عمليات التخليق وتعديل السطح. ومن شأن التكتل في أي مرحلة أن يقلل من اتساق الامتصاص الخلوي، ويغير الخصائص المغناطيسية الفعالة، ويؤثر سلباً على جودة تصوير الخلايا الحية.

تتمثل الخطوة الحرجة الثانية في إجراء تحميل الخلايا وغسلها. يجب أن يكون تركيز الجسيمات النانوية ووقت الحضانة كافيين لإحداث تحميل داخل خلوي يمكن اكتشافه دون التسبب في تراكم مفرط خارج الخلايا أو الإضرار بمورفولوجيا الخلايا. ويُعد الإزالة التامة للجسيمات غير المستوعبة والجسيمات المرتبطة بالغشاء أمراً ضرورياً، خاصة عند استخدام التصوير الفلوري لتقييم التموضع داخل الخلايا. إذ يمكن أن يؤدي الغسيل غير الكافي إلى تفسير خاطئ لأنماط التموضع، وقد يؤدي أيضاً إلى تشويه تقديرات القوة على مستوى الخلية.

تتمثل الخطوة الحرجة الثالثة في المحاذاة الهندسية لجهاز التحفيز المغناطيسي بالنسبة للعينة. ونظراً لأن القوة المغناطيسية تعتمد بشكل مباشر على تدرج المجال المحلي، يجب أن يظل الموضع النسبي للملف الكهرومغناطيسي ومستوى العينة متسقاً مع تكوين المعايرة. إذ يمكن أن تؤدي التغييرات الطفيفة في المسافة بين الملف والعينة أو في المحاذاة إلى تغيير ظروف التحفيز الفعالة.

يمكن تعديل المنصة وفقاً للسؤال البيولوجي المطروح. عندما يكون التحميل المغناطيسي العام وتوصيل القوة كافيين، يمكن استخدام الجسيمات فائقة الصغر الفلورية المغلفة بـ PDA (SPIONs) دون الحاجة إلى وظيفية استهداف الأكتين. أما عندما يكون التموضع تحت الخلوي بالقرب من المناطق الغنية بالأكتين مطلوباً، فيمكن استخدام التركيبة الوظيفية بـ phalloidin (f-SPIONs) بدلاً من ذلك. وتعد هذه النمطية ميزة عملية لهذه المنصة.

تنطوي التقنية الحالية على عدة قيود. أولاً، يمثل عدد الجسيمات المغناطيسية المحسوب التي تم امتصاصها لكل خلية قيمة متوسطة للمجتمع الخلوي، بينما يُظهر تحميل الجسيمات على مستوى الخلية الواحدة تباينًا لا مفر منه. ثانياً، إن قيم القوة المغناطيسية الواردة في هذه الدراسة هي تقديرات قائمة على نماذج وليست قياسات مباشرة للأحمال الميكانيكية داخل الخلايا. ثالثاً، صُمم هذا البروتوكول وطُوّر بشكل أساسي لخلايا شوان (Schwann cells) المستزرعة في ظروف التصوير المختبرية (in vitro). أما في أنظمة زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد الكثيفة والأنسجة، فقد يتطلب الأمر تحسيناً جوهرياً لأن امتصاص الجسيمات النانوية، وتوزيعها داخل الخلايا، والوصول البصري، والاقتران الميكانيكي قد تختلف عما هي عليه في المزارع ثنائية الأبعاد. وأخيراً، فإن استراتيجية استهداف الأكتين الاختيارية تزيد من احتمالية تموضع الجسيمات في المناطق المرتبطة بالأكتين، ولكنها لا تضمن استهدافاً موحداً أو محدداً لجميع الهياكل الغنية بالأكتين داخل الخلايا الحية.

على الرغم من هذه القيود، توفر منصة التحفيز المغناطيسي النانوي الحالية عدة مزايا منهجية متميزة مقارنة بتقنيات توصيل القوة الموجودة. فعلى سبيل المثال، يتيح مجهر القوة الذرية (AFM) تطبيق قوة موضعية دقيقة، ولكنه يتطلب اتصالاً ميكانيكياً مباشراً بالهدف، ولا يمكن دمجه دائماً بسهولة مع التصوير طويل الأمد للخلايا الحية8. ويمكن للأنظمة المعتمدة على التمدد والركائز المهندسة توفير إشارات ميكانيكية على مستوى مجموعة الخلايا، لكنها تعتمد على واجهات مواد محددة مسبقاً وليست مناسبة تماماً لتوصيل القوة إلى داخل الخلايا عن بُعد10. وتوفر الملاقط الضوئية دقة مكانية عالية لتطبيق القوة، ولكنها تنطوي على مخاطر حدوث تلف في الأنسجة ناتج عن الليزر8. أما الطرق المعتمدة على الماصات الدقيقة فهي بسيطة التشغيل نسبياً، ولكنها تتسم بانخفاض الإنتاجية ودقة القوة12. وتعد الأنظمة الموائعية الدقيقة مفيدة في توليد بيئات ميكانيكية دقيقة محددة، مثل إجهاد القص والضغط الموائعي، ولكنها تواجه تحديات تقنية في إعادة إنتاج البيئات الخلوية المعقدة ودمج أنماط متعددة من التحفيز الميكانيكي11. وفي المقابل، تدمج المنصة الحالية التحفيز عن بُعد وبدون تلامس، والتحريك المغناطيسي القابل للتحكم، وتتبع الجسيمات القائم على الفلورة، والتوافق المباشر مع التصوير البؤري في الوقت الفعلي ضمن سير عمل واحد.

يمكن تكييف الاستراتيجية العامة ذاتها مع أنواع أخرى من الخلايا المستجيبة ميكانيكياً ونماذج بيولوجية أكثر تعقيداً. كما يمكن توسيع نطاقها لتشمل أنظمة متعددة الخلايا أكثر كثافة مثل العضويات العصبية، أو الكيسات الظهارية، أو الظهارات الشبيهة بخلايا كلية كلب مادين-داربي (MDCK). وفي مثل هذه الحالات، ستكون هناك حاجة إلى تحسينات إضافية لضمان اختراق الجسيمات وتوزيعها وتقدير القوة في العينات ثلاثية الأبعاد المترابطة ميكانيكياً. ورغم هذه التحديات، فإن سير العمل الحالي يوفر أساساً عملياً للتطوير الأوسع لاستراتيجيات التحفيز المغناطيسي الميكانيكي في الأنظمة الحية.

الإفصاحات

يقر المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح المالية.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منح رقم 82571677 و 82001304 لـ Y.W.)، والبرنامج الخاص للمواهب الطبية والرعاية الصحية في مقاطعة جيلين (منحة رقم JLSRCZX2025-134 لـ Y.W.)، ومشروع برنامج بيثون بجامعة جيلين (منحة رقم 2024B19 لـ Y.W.). يشكر المؤلفون كلية الكيمياء بجامعة جيلين (المختبر الوطني الرئيسي للبنية والمواد فوق الجزيئية)، ومعهد تشانغتشون للكيمياء التطبيقية التابع للأكاديمية الصينية للعلوم، للمساعدة في تصميم وتخليق وتوصيف المواد النانوية. كما يشكر المؤلفون معهد الطب الانتقالي في المستشفى الأول بجامعة جيلين للمساعدة في تصوير CLSM.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1,2-هكساديكانيديولSigma-Aldrich213748درجة تقنية، 90%؛ يُستخدم في تخليق التحلل الحراري
ibidi مقاس 35 ملم µ-أطباقibidi80156تُستخدم لزراعة خلايا شوان وتصويرها
بنزيل إيثرSigma-Aldrich108014%98؛ مذيب للحديد (Fe)3O4 تخليق الجسيمات النانوية
المجهر الليزري الماسح البؤريNikonAXR (Ti2-E)تُستخدم للتصوير الفلوري وتصوير الخلايا الحية 
مغناطيس كهربائي مخصصمصمم خصيصاًنظرًا لعدم توفر نص مصدر، يرجى تزويدي بالنص الإنجليزي المراد ترجمته وسأقوم بتحويله إلى اللغة العربية وفقًا للمعايير العلمية والأكاديمية المحددة.مغناطيس كهربائي أحادي القطب مدمج لتوليد مجال مغناطيسي متدرج في المختبر 
حمض سيانين 3.5 الكربوكسيليDuofluor Inc.D10128صبغة فلورسنتية تُستخدم للكشف عن الحديد (Fe)3أو4·تجميع الجسيمات الفائقة Cy3.5؛ الوزن الجزيئي 593.20؛ تُحفظ في درجة حرارة -20 °C، مع الحماية من الضوء 
ملح ميسيلات الديفيروكسامينSigma-AldrichD9533عامل مخلبي للحديد يُستخدم لإزالة الحديد غير المُدمج داخلياً والمرتبط بالغشاء
مقياس غاوس الرقميمغناطيس WEITEWT103تُستخدم لقياس كثافة التدفق المغناطيسي ومعايرة المجال المغناطيسي المتدرج الذي يولده المغناطيس الكهربائي المخصص.
هيدروكلوريد الدوبامينSigma-AldrichH8502≥98% (كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة)؛ يُستخدم لطلاء البولي دوبامين
جهاز تشتت الضوء الديناميكيMalvern InstrumentsZetasizer Nano-ZSتُستخدم لقياس القطر الهيدروديناميكي ومؤشر التشتت المتعدد (PDI) 
Fluo-4 AM Invitrogen, Thermo Fisher ScientificF14201مؤشر الكالسيوم المستخدم لقياس Ca في الخلايا الحية2+ التصوير
مقياس الطيف الفلوريShimadzuRF-6000تُستخدم لتوصيف التألق الضوئي 
مجهر إلكتروني نافذ عالي الدقةJEOLJEM-F200تُستخدم لتصوير مورفولوجيا الجسيمات النانوية ونواتها باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ عالي الدقة (HRTEM)–البنية القشرية 
مقياس طيف الانبعاث الذري ببلازما مقترنة حثياًPerkinElmerOptima 3300 DVتُستخدم لتقدير كمية الحديد داخل الخلايا
أسيتيل أسيتونات الحديد (III)، Fe(acac)3Sigma-AldrichF30097%؛ طليعة للحديد (Fe)3أو4 تخليق الجسيمات النانوية
حاضنة فوقية للمنصة لتصوير الخلايا الحيةTOKAI HITTENP&أول أكسيد الكربون2تُستخدم للتصوير البؤري لخلية حية أثناء التحفيز المغناطيسي 
حمض الأوليكSigma-AldrichO1008≥99% (كروماتوغرافيا غازية)؛ ربيطة سطحية للحديد (Fe)3أو4 تخليق الجسيمات النانوية
أوليل أمينSigma-AldrichO7805درجة تقنية، 70%؛ ربيطة لتخليق الجسيمات النانوية
فالوليدين–Alexa Fluor 350Invitrogen, Thermo Fisher ScientificA22281كاشف وظيفي اختياري لاستهداف الأكتين 
بلورونيك F-127 Invitrogen, Thermo Fisher ScientificP3000MPتُستخدم لتسهيل تحميل Fluo-4 AM لقياس أيونات الكالسيوم (Ca) في الخلايا الحية2+ التصوير الطبي
مصدر طاقة تيار مستمر منظم قابل للبرمجةتونغمنeTM-L605SPL (60 فولت، 5 أمبير)تُستخدم لتغذية المغناطيس الكهربائي المخصص لتوليد مجال مغناطيسي متدرج في المختبر (in vitro)
خلايا شوان RSC96بنك الخلايا التابع للأكاديمية الصينية للعلوملا ينطبقسلالة خلايا شوان المشتقة من الجرذ 
دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS)Sigma-Aldrich436143كاشف ACS، ≥99.0%؛ عامل خافض للتوتر السطحي لمستحلب دقيق من نوع زيت في ماء
مقياس المغناطيسية SQUIDQuantum Design Inc.MPMS-XLتُستخدم لقياس التخلف المغناطيسي عند درجة حرارة 300 كلفن 
التولوينSigma-Aldrich244511لامائي، 99.8%؛ مذيب لتجميع الجسيمات الفائقة
المجهر الإلكتروني النافذFEIEP 5018/40، Tecnai Spirit Biotwinتُستخدم لفحص البنية الدقيقة للأنسجة الخلوية والعصبية 

المراجع

  1. Cheng B, et al. Mechanobiology across timescales. Nat Rev Phys. 2025;7:621-44.
  2. Di X, et al. Cellular mechanotransduction in health and diseases: from molecular mechanism to therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:282.
  3. Pillai EK, Franze K. Mechanics in the nervous system: from development to disease. Neuron. 2024;112(3):342-61.
  4. Franze K. The mechanical control of nervous system development. Development. 2013;140(15):3069-77.
  5. Franze K, Guck J. The biophysics of neuronal growth. Rep Prog Phys. 2010;73:094601.
  6. Moore SW, Sheetz MP. Biophysics of substrate interaction: influence on neural motility, differentiation, and repair. Dev Neurobiol. 2011;71(11):1090-101.
  7. Franze K, Janmey PA, Guck J. Mechanics in neuronal development and repair. Annu Rev Biomed Eng. 2013;15:227-51.
  8. Sun W, et al. Biophysical approaches for applying and measuring biological forces. Adv Sci (Weinh). 2022;9(5):e2105254.
  9. Mohammed D, et al. Innovative tools for mechanobiology: unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:162.
  10. Constantinou I, Bastounis EE. Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging. Trends Biotechnol. 2023;41:939-50.
  11. Polacheck WJ, Li R, Uzel SGM, Kamm RD. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 2013;13(12):2252-67.
  12. Li Z, et al. Non-invasive acquisition of mechanical properties of cells via passive microfluidic mechanisms: a review. Biomicrofluidics. 2021;15(3):031501.
  13. Xiao Y, Du J. Superparamagnetic nanoparticles for biomedical applications. J Mater Chem B. 2020;8(3):354-67.
  14. Yang X, et al. Nanotechnology enables novel modalities for neuromodulation. Adv Mater. 2021;33(52):e2103208.
  15. Semeano AT, et al. Effects of magnetite nanoparticles and static magnetic field on neural differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 2022;18(4):1337-54.
  16. Lee B, et al. Design of oxide nanoparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 2025;10:252-67.
  17. Kim YJ, et al. Magnetoelectric nanodiscs enable wireless transgene-free neuromodulation. Nat Nanotechnol. 2025;20:121-31.
  18. Signorelli L, Hescham SA, Pralle A, Gregurec D. Magnetic nanomaterials for wireless thermal and mechanical neuromodulation. iScience. 2022;25(11):105401.
  19. Liu T, Wang Y, Lu L, Liu Y. SPIONs-mediated magnetic actuation promotes nerve regeneration by inducing and maintaining repair-supportive phenotypes in Schwann cells. J Nanobiotechnology. 2022;20:159.
  20. Liu T, et al. f-SPION-mediated magnetic stimulation induces reparative Schwann cell reprogramming via cytoskeletal dynamics-gated activation of Piezo1. J Nanobiotechnology. 2026;24:298.
  21. Jessen KR, Mirsky R, Lloyd AC. Schwann cells: development and role in nerve repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(7):a020487.
  22. Jessen KR, Mirsky R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. J Physiol. 2016;594(13):3521-31.
  23. Sun S, Zeng H. Size-controlled synthesis of magnetite nanoparticles. J Am Chem Soc. 2002;124(28):8204-5.
  24. Zhuang J, Wu H, Yang Y, Cao YC. Controlling colloidal superparticle growth through solvophobic interactions. Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(12):2208-12.
  25. Bai F, et al. A versatile bottom-up assembly approach to colloidal spheres from nanocrystals. Angew Chem Int Ed Engl. 2007;46(35):6650-3.
  26. Tang L, et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(43):15344-9.
  27. Tay A, Kunze A, Murray C, Di Carlo D. Induction of calcium influx in cortical neural networks by nanomagnetic forces. ACS Nano. 2016;10(2):2331-41.
  28. Tay A, Di Carlo D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Lett. 2017;17(2):886-92.
  29. Cheng FY, et al. Characterization of aqueous dispersions of Fe(3)O(4) nanoparticles and their biomedical applications. Biomaterials. 2005;26(7):729-38.
  30. Lee N, et al. Iron oxide-based nanoparticles for multimodal imaging and magnetoresponsive therapy. Chem Rev. 2015;115(19):10637-89.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.