مقالة منهجية

مقايسة استنبات مشترك تعتمد على التصوير في الوقت الحقيقي لتقدير القتل الاستماتي لعضوانيات ورمية مشتقة من المرضى بوساطة الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم

128 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71688

⸱

سبتمبر 3, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Englander Institute for Precision Medicine, Weill Cornell Medicine, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medicine, 4Department of Systems and Computational Biomedicine, Weill Cornell Medicine

في هذه المقالة

ملخص

يوفر هذا البروتوكول منهجية للتصوير الحي للخلايا القائمة على الصور لقياس السمية الخلوية التي تتوسطها الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TIL) ضد العضوانيات الورمية المشتقة من المرضى، مما يتيح تحليلاً حركياً في الوقت الفعلي للموت الخلوي المبرمج من أجل التوصيف المناعي الوظيفي وتقييم العلاجات المعدلة للمناعة.

الملخص

يعد فهم القدرة الوظيفية للخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TILs) على التعرف على الخلايا الورمية ذاتية المنشأ والقضاء عليها أمراً محورياً في تطوير العلاج المناعي الشخصي. يهدف هذا البروتوكول إلى تقديم طريقة للتصوير المعتمد على الصور للخلايا الحية، والتي تقيس القتل الاستماتي المعتمد على caspase-3 والوسيط بواسطة TILs ضد العضوانيات الورمية المشتقة من المرضى (PDTOs) في الوقت الفعلي. تدمج هذه الطريقة الإجراءات المعتمدة لعزل وتوسيع PDTOs وTILs مع نظام استزراع مشترك ثلاثي الأبعاد وموحد وكشف مؤتمت للاستماتة يعتمد على الفلورة.

يتم توزيع العضويات الورمية في أطباق ذات 96 بئرًا متوافقة مع التصوير، وتُوسم بعلامة ورمية حمراء، بينما تُضاف الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TILs) الموسعة بنسب محددة من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة في وجود ركيزة فلورية خضراء يتم تفعيلها بواسطة caspase-3. يتم تصوير المزارع المشتركة كل 4 h باستخدام نظام تحليل الخلايا الحية لالتقاط قنوات تباين الطور والفلورة المزدوجة. يحدد التحليل الكمي للصور التراكيب الورمية الموجبة لللون الأحمر، ويحسب نسبة الأجسام الورمية الميتة استماتياً والموجبة للونين الأحمر والأخضر معاً بمرور الوقت. يتم تضمين المكررات التقنية والبيولوجية المناسبة، جنباً إلى جنب مع خط الأساس، والاستماتة التلقائية، وعناصر تحكم سلبية وإيجابية للقتل لضمان دقة المقايسة.

من خلال الحفاظ على التغاير الورمي ضمن البنية ثلاثية الأبعاد للـ PDTOs مع تمكين القياس الكمي الطولي، يوفر هذا البروتوكول نظاماً ذا صلة فسيولوجياً للتوصيف الوظيفي للتفاعلات بين الأورام والخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TIL) الخاصة بالمريض، واستقصاء العوامل المعدلة للمناعة التي تعزز المناعة المضادة للأورام.

المقدمة

لقد شهد العلاج المناعي للسرطان تحولاً جذرياً بفضل تطوير مثبطات نقاط التفتيش المناعية (ICIs) التي تستهدف مسارات بروتين الموت الخلوي المبرمج 1/رابط الموت المبرمج 1 (PD-1/PD-L1) والبروتين 4 المرتبط بالخلايا التائية اللمفاوية السامة للخلايا (CTLA-4)، والتي تعمل على تنشيط الاستجابات المضادة للأورام التي تتوسطها الخلايا التائية الداخلية عبر أنواع متعددة من الأورام الصلبة1,2,3. وعلى الرغم من الاستجابات المستدامة لدى مجموعة فرعية من المرضى، إلا أن معظمهم لا يحققون فائدة سريرية ملموسة، ولا تزال هناك حاجة ملحة لمؤشرات حيوية تنبؤية معتمدة لتحديد المستجيبين للعلاج بشكل استباقي. لذا، تعد المقايسات الوظيفية التي تقيس بشكل مباشر قتل الأورام بوساطة الخلايا التائية أدوات بالغة الأهمية لاكتشاف المؤشرات الحيوية والتقييم قبل السريري للمجموعات العلاجية المصممة لتعزيز الاستجابات المناعية السامة للخلايا.

لقد استُخدمت فحوصات السمية الخلوية التقليدية على نطاق واسع لتقدير القتل بوساطة المناعة، بما في ذلك قياس تحرر الكروم-51، وتحديد كمية لاكتات ديهايدروجيناز (LDH)، وفحوصات حيوية الخلايا المعتمدة على لومينيسنس ATP مثل CellTiter-Glo، ولكنها تعطي قياسات إجمالية لنقطة زمنية واحدة تفتقر إلى الدقة المكانية والزمانية4,5,6. وبالمثل، فإن فحوصات القتل المعتمدة على قياس التدفق الخلوي عند نقطة النهاية تحدد كمية موت الخلايا في نقطة زمنية ثابتة، وهي غير مناسبة بشكل كافٍ لتنسيقات الزراعة ثلاثية الأبعاد. علاوة على ذلك، فإن الخطوط الخلوية الورمية ثنائية الأبعاد، والمستخدمة على نطاق واسع في هذه الفحوصات، لا تحاكي بشكل كامل التغاير المتأصل في الأورام الأولية المأخوذة من المرضى.

لقد ظهرت العضوانيات الورمية المشتقة من المرضى (PDTOs) كمنصة ذات صلة سريرياً خارج الجسم الحي (ex vivo)، حيث تحافظ بشكل أكثر دقة على التغيرات الجينومية، والتباين الخلوي، والأنماط الظاهرية للاستجابة الدوائية للورم الأصلي مقارنة بنماذج الخطوط الخلوية التقليدية7,8,9,10,11,12. وقد أظهرت الدراسات الحديثة إمكانية زراعة العضوانيات الورمية المشتقة من المرضى (PDTOs) بشكل مشترك مع خلايا مناعية ذاتية لنمذجة الاستجابات المناعية المضادة للأورام ex vivo؛ ومع ذلك، تعتمد معظم المنهجيات المنشورة على قياسات الحيوية النهائية أو تحليلات التصوير البؤري التي تتطلب جهداً مكثفاً، مما يحد من الإنتاجية التجريبية ويمنع المراقبة الديناميكية لاستجابة القتل13,14,15,16.

نصف هنا مقايسة استزراع مشترك تعتمد على الصور وبوقت حقيقي، وذلك للحصول على قراءات كمية مشتقة من الصور لسمية الخلايا التائية الخلوية ضد أورام عضوية مشتقة من المرضى (PDTOs) وموسومة فلوريسنتياً. تعتمد هذه الطريقة على المجهر الفلوريسنتي بنظام التصوير المتقطع (time-lapse) مقترناً بركيزة فلوريسنتية يتم تنشيطها بواسطة caspase-3 لإنشاء منحنيات حركية لموت الخلايا المبرمج بدقة العضو العضوي الواحد على مدار نافذة رصد تتراوح بين 12 و36 ساعة. وبالمقارنة مع مقايسات سمية الخلايا التقليدية، توفر هذه المنصة العديد من المزايا التقنية: فهي تحافظ على البنية الورمية ثلاثية الأبعاد طوال فترة المقايسة، وتحدد الديناميكيات الزمنية لتحفيز موت الخلايا المبرمج، وتستوعب نسباً محددة من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة، ولها تطبيقات مستقبلية محتملة في تنسيقات فحص الأدوية متوسطة الإنتاجية، بما في ذلك مثبطات نقاط التفتيش المناعية والعوامل الموجهة التي يتم اختبارها منفردة أو بالاشتراك. هذا البروتوكول مخصص للباحثين العاملين في مجال المناعة الورمية، والطب الدقيق الوظيفي، وبيولوجيا الخلايا التائية، ويمكن تنفيذه في المختبرات المجهزة بالبنية التحتية القياسية لزراعة الأنسجة ونظام تصوير فلوريسنتي للخلايا الحية.

تعد عمليات عزل واستزراع العضوانيات الورمية المشتقة من المرضى (PDTOs) والخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TILs) المتوافقة معها من عينات الأورام البشرية منهجيات راسخة ومنشورة على نطاق واسع. وقد تم التحقق بدقة من بروتوكولات قوية تصف التفكيك الميكانيكي والإنزيمي للورم، والدمج ثلاثي الأبعاد في مصفوفة الغشاء القاعدي، وتوسيع العضوانيات على المدى الطويل، والعزل الموازي والتوسع ex vivo للخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم عبر أنواع متعددة من الأورام. وتحافظ هذه الطرق بشكل موثوق على التباين الخلوي للورم، وبنيته، والخصوصية المناعية، وقد تم تكييفها في أنظمة الاستزراع المشترك لتقييم التفاعلات بين الورم والجهاز المناعي. وبناءً على ذلك، تم إجراء عزل وتوسيع العضوانيات والخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم في هذه الدراسة وفقاً لبروتوكولات منشورة ومثبتة مسبقاً، دون إجراء تعديلات جوهرية ما لم يُذكر خلاف ذلك.

البروتوكول

لقد أجرينا جميع الإجراءات التي تتضمن أنسجة أورام بشرية وخلايا ليمفاوية متسللة إلى الورم (TILs) وفقاً لموافقة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB#1305013903) ولوائح السلامة البيولوجية المؤسسية، وحصلنا على موافقة مستنيرة مكتوبة قبل الحصول على الأنسجة. وكانت الجهة المانحة للموافقة هي مجلس المراجعة المؤسسية في كلية وايل كورنيل للطب (المدرج باسم Institutional Review Board (IRB), Weill Cornell Medicine, New York, NY)، بموجب البروتوكول رقم 1305013903. وتشمل العينات المشمولة في هذا البروتوكول أنسجة الأورام المتبقية التي تم الحصول عليها من جراحات الرعاية القياسية أو الإجراءات البحثية بعد التقييم الباثولوجي الروتيني؛ والأنسجة المجمدة المؤرشفة أو الأنسجة المثبتة بالفورمالين والمطمورة في البارافين (FFPE) الموجودة في كلية وايل كورنيل الطبية أو المؤسسات الأخرى؛ والدم، الذي يتم منه عزل وتخزين الخلايا الوحيدة ذات النواة في الدم المحيطي (PBMCs) والمصل والبلازما؛ ومسحات الفم أو اللعاب أو البول أو الأنسجة الحميدة المستخدمة كضوابط في بعض الحالات؛ وبالنسبة للمشاركين المسجلين في برنامج التشريح السريع، يتم جمع الأنسجة عند التشريح الذي يتم إجراؤه في غضون 6 h (حتى 24 h) من الوفاة. وقد تم تكثير خلايا TILs المستخدمة في هذه الدراسة من عينات أنسجة الأورام الموصوفة أعلاه. كما تم إزالة المعرفات الشخصية من جميع العينات البيولوجية، والتي تم ربطها بهوية المشارك فقط من خلال رقم تعريف مريض فريد وفقاً لمعايير HIPAA والمعايير المؤسسية؛ ولم يتم إعادة تحديد البيانات إلا في وقت إنشاء التقارير. وأجريت جميع التجارب تحت ظروف مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL-2) في كابينة سلامة بيولوجية معتمدة من الفئة الثانية. وتم التخلص من المواد الخطرة بيولوجياً وفقاً للسياسة المؤسسية. راجع جدول المواد والملف التكميلي 1 للاطلاع على المواد وتحضير المحاليل المنظمة والأوساط المستخدمة في هذا العمل.

1. الوسم الفلوري وإعادة تكوين العضوانيات الورمية المشتقة من المرضى (PDTOs) (الشكل 1)

  1. إزالة Matrigel القديم وبدء تفكيك الخلايا.
    1. ضع طبق الزرع في كابينة السلامة البيولوجية (BSC). اشفط الوسط من الآبار بعناية دون تعكير قطرات Matrigel.
    2. أضف 1–2 mL من إنزيم تفكيك الخلايا بدرجة حرارة الغرفة لكل بئر. استخدم ماصة P1000 وكاشطة خلايا معقمة للسحب والدفع بشكل متكرر لتفكيك قطرات Matrigel تماماً.
    3. انقل خليط الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL مُسمى. أضف 1 mL إضافياً من إنزيم تفكيك الخلايا إلى كل بئر لغسل الخلايا المتبقية وانقلها إلى نفس الأنبوب. اضبط الحجم لضمان تجميع 5 mL على الأقل من الإنزيم لكل بئر. أغلق الأنبوب ورجه يدوياً للمزج جيداً.
  2. التفكيك الإنزيمي
    1. ضع الأنبوب في حمام مائي بدرجة حرارة 37 °C. حضن العينة لمدة 10 min ورج الأنبوب يدوياً كل 2–3 min لتعزيز التفكيك. راقب بصرياً للتأكد من التفكك الكامل.
    2. بمجرد التفكك، قم بالطرد المركزي بسرعة 300 × g لمدة 3 min عند 4 °C. افحص الأنبوب بعد الطرد المركزي.
    3. إذا لم تتكون كريسّة (pellet) وظلت سحابة Matrigel موجودة، أضف المزيد من إنزيم تفكيك الخلايا. رج الأنبوب وأعده إلى الحمام المائي لمدة 3–5 min. إذا لم تتكون الكريسّة بعد، ضع الأنبوب على الثلج لمدة 3 min للسماح للمصفوفة بالترسب.
  3. عد الخلايا وتقييم حيويتها
    1. اشفط السائل الطافي دون تعكير الكريسّة. أضف 10 mL من وسط الغسيل +++.
    2. قم بالطرد المركزي بسرعة 300 × g لمدة 3 min عند 4 °C. أعد تعليق الكريسّة في 1 mL من PBS. قم بالتجنيس بلطف للحصول على معلق من الخلايا المفردة.
    3. امزج 15 µL من معلق الخلايا مع 15 µL من Trypan Blue بتركيز 0.4%. ضع 10 µL في كل حجرة من شريحة العد. عد الخلايا الحيوية باستخدام عداد آلي أو مقياس خلايا (hemocytometer).
    4. حافظ على الخلايا على الثلج أثناء العد. أضف طبقاً معالجاً بـ 6 آبار وغير مخصص للأنسجة عند 37 °C للتدفئة تمهيداً لعملية الاستزراع لاحقاً.
  4. الوسم الفلوري للخلايا الورمية
    1. اضبط تركيز الخلايا ليكون 1 × 106 خلايا حيوية/mL في PBS.
    2. أعد تكوين صبغة CellTrace Far Red باستخدام 20 µL من DMSO لتحضير محلول مخزون بتركيز 1 mM. استخدم جهاز الفورتكس ثم قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة.
    3. أضف 1 µL من المحلول المخزون (1 mM) لكل 1 mL من معلق الخلايا (1 × 106 خلايا/mL)، مما يعطي تركيز صبغ نهائي قدره 1 µM. اقلب الأنبوب بلطف للمزج. حضن العينة لمدة 30 min عند 37 °C بعيداً عن الضوء.
    4. أضف 5 أحجام من PBS لغسل الصبغة. قم بالطرد المركزي بسرعة 300 × g لمدة 5 min. اغسل مرتين باستخدام PBS.
    5. قيم كفاءة الوسم. تعمل كريسّة الخلايا الملونة بصرياً كمعيار قبول نوعي.
    6. حدد الحيوية بعد الصبغ عن طريق استبعاد Trypan Blue وسجل الحيوية الملحوظة (80%).
      ​ملاحظة: انتقل إلى مرحلة التضمين فقط إذا أظهرت كريسّة الخلايا تلوناً موحداً وكانت الحيوية بعد الصبغ ≥80%.
  5. إنشاء معلق المصفوفة الخلوية ثلاثي الأبعاد
    1. أعد تعليق الكريسّة في حجم مناسب من الوسط الخاص بالزرع بناءً على حجم الكريسّة (على سبيل المثال، لـ 900,000 خلية، أضف 500 µL من الوسط؛ ولـ 1.8 مليون خلية، أضف 1,000 µL من الوسط).
    2. أضف Matrigel مبرداً بنسبة 1:2 (وسط:مصفوفة) ليكون التركيز النهائي لـ Matrigel هو 67%. امزج جيداً ولكن بلطف لتجنب تكون الفقاعات (الهدف المعتاد: 300,000 خلية لكل بئر في طبق 6 آبار).
  6. توزيع قطرات المصفوفة ثلاثية الأبعاد
    1. باستخدام ماصة 200 µL، وزع قطرات بحجم 100 µL: 5 قطرات لكل بئر في أطباق 6 آبار. ضع الأطباق في حضانة بدرجة حرارة 37 °C لمدة 5 min.
    2. اقلب الأطباق رأساً على عقب وحضنها لمدة 40 min إضافية لإتمام عملية البلمرة. أكد وجود الخلايا المضمنة بواسطة المجهر.
    3. أضف 4 mL من الوسط لكل بئر (طبق 6 آبار) وأعد الأطباق إلى الحضانة. استزرع العينات لمدة 72 h للسماح بتكوين عضوانيات (organoids) بحجم 100–300 µm.

2. تحضير العضويات لاختبار القتل

  1. إذابة مصفوفة الغشاء القاعدي مع الحفاظ على بنية العضوانيات ثلاثية الأبعاد.
    1. أخرج أطباق العضوانيات من الحاضنة وانقلها إلى كابينة السلامة البيولوجية. اسحب وسط الزرع بعناية من كل بئر دون تحريك قباب Matrigel.
      ملاحظة: خصص بئراً واحداً واتركه دون مساس من أجل التفكيك الكامل وعد الخلايا الورمية (انظر القسم 2.2).
    2. أضف 1 mL من محلول استعادة الخلايا (Cell Recovery Solution) المبرد بالثلج مباشرة إلى كل بئر لإذابة مصفوفة الغشاء القاعدي. قم بتفتيت القباب ميكانيكياً باستخدام ماصة P1000 وكاشطة خلايا معقمة حتى تنفصل المصفوفة تماماً عن سطح الطبق.
    3. انقل المعلق من ما يصل إلى ثلاثة آبار إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL مُصنف مسبقاً ومحفوظ على الثلج. أضف 8 mL إضافية من محلول استعادة الخلايا المبرد بالثلج إلى الأنبوب. ضع الأنبوب أفقياً على جهاز هزاز (rocker) عند درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة لضمان الإذابة الكاملة للمصفوفة.
      ملاحظة: احمِ العينات من الضوء إذا تم إجراء وسم فلوري.
    4. بعد التحضين، قم بالطرد المركزي عند 300 × g لمدة 3 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. اسحب السائل الطافي بعناية وبشكل كامل دون تحريك كتلة العضوانيات.
    5. أعد تعليق الكتلة برفق في وسط PDTO كامل باستخدام عملية سحب وماصة ذات فتحة واسعة وببطء للحفاظ على بنية العضوانيات ثلاثية الأبعاد سليمة.
      هام: تجنب السحب المفرط بالماصة أو استخدام جهاز الخلط الدوامي (vortexing)، لأن ذلك يؤدي إلى تدمير البنية ثلاثية الأبعاد.
      إذا كانت المصفوفة المتبقية مرئية بعد الطرد المركزي، كرر التحضين في محلول استعادة الخلايا البارد لمدة إضافية تتراوح بين 10-15 دقيقة، ثم أعد الطرد المركزي وأعد التقييم.
  2. تحديد عدد الخلايا الورمية الحية وضبط تركيز معلق العضوانيات.
    1. قم بتفكيك البئر المحفوظ تماماً باستخدام إنزيم تفكيك الخلايا كما هو موضح في القسم 1. حضّن العينة عند 37 °C لمدة 5-7 دقائق مع إجراء عملية التفتيت (trituration) على فترات متقطعة.
    2. قم بمعادلة المحلول باستخدام وسط PDTO كامل. قم بالطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 دقائق، ثم أعد التعليق في 1 mL من الوسط.
    3. امزج 15 µL من معلق الخلايا مع 15 µL من صبغة Trypan Blue بتركيز 0.4%. قم بعدّ الخلايا الحية باستخدام مقياس الخلايا (hemocytometer) أو عداد آلي.
    4. بناءً على عدد الخلايا الحية، احسب التخفيف المطلوب للوصول إلى 200,000 خلية حية/mL في وسط PDTO كامل.
      ملاحظة: مثال على الحساب: للوصول إلى هدف 20,000 خلية ورمية لكل بئر في 100 µL، يلزم تركيز عمل يبلغ 200,000 خلية/mL. في حال زرع طبق تصوير كامل يحتوي على 96 بئراً (60 بئراً داخلية)، يكون إجمالي حجم المقايسة المطلوب 6 mL (100 µL × 60 بئراً)، ولكن مع إضافة 20% كحجم ميت (dead volume)، يتم تحضير 7.2 mL. وبناءً على ذلك، يكون عدد الخلايا المطلوب هو 6 mL × 200,000 خلية/mL = 1.2 × 106 خلية و 7.2 mL × 200,000 خلية/mL = 1.44 × 106 خلية.
  3. زرع العضوانيات لمقايسة القتل
    ​ملاحظة: استخدم أطباق تصوير ذات 96 بئراً بجدران سوداء وقاع شفاف. ازرع كل حالة في ثلاث مكررات تقنية على الأقل.
    1. باستخدام ماصة متعددة القنوات، وزع 100 µL من معلق العضوانيات في كل بئر لتحقيق 20,000 خلية ورمية حية لكل بئر.
    2. املأ الآبار الخارجية من الطبق بـ 200 µL من محلول PBS المعقم لتقليل التبخر وتأثيرات الحواف.
    3. تأكد بصرياً من التوزيع الموحد تحت المجهر.
    4. اترك العضوانيات تستقر عند درجة حرارة 37 °C لمدة 10-30 دقيقة قبل إضافة الخلايا التائية (T cells).
  4. الحفاظ على التوسع المستمر للعضوانيات.
    1. خذ معلق الخلايا المنفردة الناتج أثناء عملية العد. أعد تعليق الخلايا في وسط خاص بالزرع، ثم أضف Matrigel مبرداً للوصول إلى تركيز نهائي قدره 67%.
    2. ازرع الخلايا في أطباق تعليق ذات 6 آبار مسخنة مسبقاً بمعدل 100,000 خلية لكل بئر. قم بعملية البلمرة والتغطية بالأوساط كما هو موضح في القسم 1، ثم أعدها إلى الحاضنة لمواصلة التوسع.

3. تحضير الخلايا التائية المتفاعلة مع الورم

  1. توسيع وجمع الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TILs)
    1. عزل وتوسيع الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم من عينات الورم باستخدام بروتوكولات سبق تأسيسها13,14.
    2. تسجيل الخصائص التالية لكل تحضير من الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم: الحيوية بعد التوسيع: ≥80% (استبعاد صبغة Trypan Blue)؛ نقاء CD3⁺: ≥85%؛ توزيع CD4⁺/CD8⁺: ≥30% من خلايا T من نوع CD8⁺، مع توثيق نسبة CD4:CD8؛ مدة التوسيع وظروف الزرع: 10–14 يوماً في وسط RPMI-1640 كامل مضاف إليه 10% مصل بشري AB وIL-2 بشري مؤتلف (600 IU/mL) في ظروف خالية من الخلايا المغذية؛ النمط الظاهري للتنشيط/الإنهاك: PD-1 ≤ 50%، وTIM-3 ≤ 30%، وLAG-3 ≤ 20% من خلايا CD3⁺ في وقت المقايسة؛ علامات التنشيط (مثل CD69 أو CD25) قابلة للكشف بعد التحفيز؛ دليل على التفاعلية الورمية: نشاط قابل للقياس ومحدد للمستضد بواسطة مقايسة وظيفية واحدة على الأقل (مثل زيادة إنتاج IFN-γ، أو زيادة تنظيم CD137/4-1BB، أو إزالة حبيبات CD107a، أو السميّة الخلوية ضد خلايا الورم ذاتية المنشأ).
    3. التأكد من أن كل PDTO قد تم استزراعه مشتركاً حصرياً مع تحضير الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم ذاتية المنشأ الخاصة به.
      ملاحظة: يُفضل استخدام استراتيجيات التوسيع الخالية من الخلايا المغذية للحفاظ على مجموعات CD8+ السامة للخلايا. قد تؤدي البروتوكولات التي تستخدم خلايا PBMC مغذية مشعة إلى تحيز التوسيع نحو خلايا T من نوع CD4+. تحافظ الأنظمة الخالية من الخلايا المغذية على خلايا CD8+ T بشكل أفضل.
      يجب الحد من توسيع الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم بحد أقصى 14 يوماً لتجنب الأنماط الظاهرية للإنهاك وفقدان الوظيفة السامة للخلايا.
    4. في يوم المقايسة، تُجمع خلايا T من دوارق الزرع. تُنقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية سعة 15 mL. تُفصل مركزياً عند 300 × g لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يُشفط الطافي تماماً.
  2. تحضير خلايا T للمقايسة الوظيفية.
    1. إعادة تعليق الراسب من الخطوة 3.1.4 في 1 mL من وسط خلايا T الأساسي (RPMI 1640 + 10% FBS + 1% Pen/Strep).
      ملاحظة: التأكد من أن الوسط لا يحتوي على IL-2، أو IL-15، أو سيتوكينات، أو حبيبات anti-CD3/CD28، أو خلايا مغذية.
      ​تنبيه هام: إن وجود سيتوكينات متبقية أو حبيبات تنشيط سيؤدي إلى تعزيز السميّة الخلوية بشكل اصطناعي ويؤدي إلى تضليل تفسير المقايسة.
    2. تحديد تركيز الخلايا وحيويتها باستخدام Trypan Blue. يتم المتابعة فقط إذا كانت الحيوية ≥ 80%.
  3. تحضير نسب الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة (E:T).
    1. تحديد نسبة E:T على أنها خلايا T:خلايا ورمية.
      ملاحظة: يتم تقدير عدد الخلايا الورمية المستخدم لحساب نسبة E:T من بئر مرجعي مفكك بالكامل تمت معالجته بالتوازي (القسم 2.2). وبما أن العضوانيات تُزرع كهياكل ثلاثية الأبعاد سليمة، فلا يمكن تحديد أعداد الخلايا الورمية مباشرة داخل آبار الاستزراع المشترك الفردية دون تعطيل المقايسة. يتم تطبيق تركيز الخلايا الورمية التقديري الذي تم الحصول عليه من البئر المرجعي بشكل موحد على جميع الآبار المحضرة من نفس معلق العضوانيات المجمع.
      1. للحصول على نسبة E:T تبلغ 2:1 مع 20,000 خلية ورمية لكل بئر، أضف 40,000 خلية T لكل بئر. يتم تحضير خلايا T بتركيز 400,000 خلية/mL لإضافة 100 µL لكل بئر؛ وبالتالي، 400,000 خلية/mL × 0.1 mL = 40,000 خلية.
      2. في حال زرع لوحة تصوير كاملة من 96 بئراً (الـ 60 بئراً الداخلية)، يكون حجم خلايا T المطلوب 6 mL، ومع وجود حجم ميت بنسبة 20%، يصبح حجم خلايا T هو 7.2 mL.
        خلايا T المطلوبة: 6 mL × 400,000 خلية/mL = 2.4 × 106 خلية
        7.2 mL × 400,000 خلية/mL = 2.88 × 106 خلية
        ملاحظة: تخضع نسبة E:T التقديرية للتباين المتأصل المرتبط بزراعة العضوانيات ثلاثية الأبعاد، بما في ذلك التباين في حجم العضوانيات (عادة 100–300 µm في القطر)، وفقدان الخلايا أثناء إذابة Matrigel والغسل (القسم 2.1)، والتباين الطفيف في استخدام الماصات وترسيب الخلايا أثناء تحضير اللوحة.
        ​لتقليل التباين، يتم زرع ثلاثة مكررات تقنية على الأقل لكل حالة، واستخدام رؤوس ماصات واسعة الفتحة وإعادة تعليق لطيفة للحفاظ على سلامة العضوانيات، والتأكد بصرياً من التوزيع الموحد للعضوانيات عبر الآبار قبل إضافة خلايا T (القسم 2.3).
  4. تحضير كاشف الكشف عن caspase-3.
    1. استخدام ركيزة Caspase-3؛ التركيز المخزون: 200 µM لتحضير محلول عمل عن طريق إضافة الركيزة مباشرة إلى معلق خلايا T لتحقيق تركيز نهائي قدره 2 µM في معلق خلايا T. يُمزج بلطف.
      ملاحظة: يجب الحماية من الضوء في جميع الأوقات.
  5. اختياري: فحص العقاقير أو دراسات التعديل المناعي
    ​ملاحظة: يمكن تكييف هذه المقايسة لتقييم مثبطات الجزيئات الصغيرة (مثل مثبطات الكيناز، والمعدلات الأيضية)، ومثبطات نقاط التفتيش المناعية (مثل anti-PD-1، وanti-PD-L1)، والعلاجات المدمجة.
    1. تحضين العقاقير مسبقاً مع العضوانيات لمدة 24–72 ساعة قبل تفكيك المصفوفة وإضافة خلايا T، أو إضافتها بالتزامن مع خلايا T.
    2. تضمين ضوابط تحتوي على المذيب فقط (vehicle-only) لكل حالة.
    3. في حال اختبار مثبطات نقاط التفتيش المناعية، يتم التأكد من تعبير الهدف (مثل PD-L1) على العضوانيات وPD-1 على خلايا T قبل المقايسة.

4. إنشاء المزارع المشتركة وعناصر التحكم التجريبية.

  1. إعداد المزرعة المشتركة
    1. أخرج لوحة تصوير العضوانيات ذات الـ 96 بئراً من الحاضنة وانقلها إلى كابينة السلامة الحيوية. أعد تعليق معلق الخلايا التائية المُحضّر (القسم 3) برفق مباشرة قبل الزرع لضمان التوزيع المتجانس (الشكل 2A).
    2. باستخدام ماصة متعددة القنوات، أضف 100 µL من معلق الخلايا التائية (الذي يحتوي على ركيزة الكاسباز بتركيز 2 µM) إلى كل بئر يحتوي على 100 µL من العضوانيات. بعد الإضافة، انقر على اللوحة برفق من 2-3 مرات لضمان توزيع الخلايا بالتساوي.
      ملاحظة: تجنب لمس قاع البئر لمنع تدمير العضوانيات. لا تستخدم تقنية السحب والدفع بالماصة داخل الآبار؛ حيث إن التحريك المفرط يؤدي إلى تدمير سلامة العضوانيات وتغيير حركية تسلل الخلايا التائية.
    3. انقل اللوحة فوراً إلى نظام تصوير الخلايا الحية لتقليل تقلبات درجة الحرارة.
      ​ملاحظة: التركيزات النهائية داخل البئر بعد الخلط بنسبة 1:1: إن دمج 100 µL من معلق العضوانيات (في وسط العضوانيات الكامل) مع 100 µL من معلق الخلايا التائية (في وسط الخلايا التائية الأساسي) يؤدي إلى خفض تركيز كل مكون إلى النصف. التركيزات النهائية هي: B27 Supplement بنسبة 0.5X؛ Nicotinamide بتركيز 5 mM؛ بديل الجلوتامين بنسبة 0.5X؛ Penicillin/Streptomycin بتركيز 50 U/mL / 50 µg/mL؛ HEPES بتركيز 5 mM؛ N-Acetylcysteine بتركيز 0.625 mM؛ Primocin بتركيز 50 µg/mL؛ FGF-Basic (FGF-2) بتركيز 0.5 ng/mL؛ FGF-10 بتركيز 10 ng/mL؛ PGE2 بتركيز 0.5 µM؛ SB202190 بتركيز 5 µM؛ EGF بتركيز 25 ng/mL؛ Y-27632 بتركيز 5 µM؛ A-83-01 بتركيز 250 nM؛ NRG1 بتركيز 5 ng/mL؛ Noggin و R-Spondin بنسبة 5% v/v لكل منهما؛ FBS (من وسط الخلايا التائية) بنسبة 5%؛ ركيزة caspase-3 بتركيز نهائي 1 µM داخل البئر.
      1. قم بتكوين نظام الالتقاط الحركي في برنامج تصوير الخلايا الحية عن طريق تحديد Scan on Schedule لتمكين التصوير المتكرر على مدار مدة المقايسة الكاملة (الشكل 3B)، واختر نوع مسح Standard للتوافق بين التباين والفلورة (الشكل 3C)، وحدد القنوات Phase و Green و Red عند تكبير 10× مع أوقات التقاط محسنة لكل قناة (الشكل 3D).
      2. اضبط وقت التقاط الفلورة (وقت التعريض) لكل قناة على 300–400 ms تقريباً لكل من القناتين الخضراء والحمراء، وتأكد من اختيار العدسة الشيئية 10× (معايرة الصورة 1.24 µm/px عند 10×).
        ملاحظة: تم الحصول على مجموعة البيانات التمثيلية باستخدام نظام تحليل الخلايا الحية المذكور (راجع جدول المواد). تم إجراء تحليل الصور باستخدام Basic Analyzer مع تعريف تحليل محفوظ (باسم red-green-overlap-Bladder).
      3. اضبط الآبار لالتقاط أربع صور لكل بئر داخلي في اللوحة ذات الـ 96 بئراً، مع تكرار المسحات كل 2 h لمدة تصل إلى 36 h (الشكل 3A,E).
      4. ابدأ تحليل الصور عن طريق إنشاء new Analysis Definition وتفعيل القنوات Phase و Green و Red (الشكل 4A,B).
      5. قم بتحسين معاملات تقسيم القناة الحمراء، بما في ذلك area thresholds و edge exclusion filters، لعزل أجسام الورم عن الحطام والأجسام المزدوجة (الشكل 4C).
      6. بالنسبة للقناة الحمراء (الورم، CellTrace Far Red)، اضبط Segmentation Type على Surface Fit with a Threshold of 2.0 RCU؛ وفعّل Edge Split with Edge Sensitivity = 0؛ واضبط Hole Fill = 0 µm2 و Adjust Size = 0 pixels؛ وطبق minimum object Area filter بمقدار 50 µm2 (دون تطبيق مرشحات للمساحة القصوى أو اللامركزية أو الكثافة).
      7. بالنسبة للقناة الخضراء (NucView 488 caspase-3/7)، أنشئ التقسيم الأخضر مع ضبط Segmentation Type على Surface Fit وبـ Threshold قدره 2.0 GCU؛ وفعّل Edge Split with Edge Sensitivity = 0؛ واضبط Hole Fill = 0 µm2 و Adjust Size = 0 pixels؛ ولا تطبق مرشحات المساحة أو الكثافة.
      8. حدد قراءة موت الخلايا المبرمج في الورم بأنها الأجسام الموجبة المزدوجة (Green + Red). لا تطبق أي مرشحات إضافية للمساحة أو الكثافة على التداخل. تحقق من صحة معايير التداخل مقابل آبار التحكم في الموت المبرمج التلقائي والقتل الإيجابي، ثم طبق تعريف التحليل بشكل موحد على جميع الآبار.
      9. قم بتكوين مقاييس التحليل لكلتا القناتين لقياس نسبة الأجسام المبرمجة الموجبة المزدوجة (حمراء/خضراء)؛ وراجع تراكبات التقسيم للتحقق من التحديد الدقيق لأجسام الورم (الشكل 4D).
      10. حدد أوقات المسح والآبار لتغطية جميع النقاط الزمنية التجريبية (الشكل 4E)، وتأكد من أن التحليلات المكتملة متاحة للمراجعة وتصدير البيانات في جداول أو رسوم بيانية (الشكل 4F,G).
      11. قم بتصدير بيانات التحليل على مستوى الجسم ولكل بئر (لكل نقطة زمنية) لإجراء القياسات الكمية اللاحقة.

النتائج

تم إنشاء مزارع العضوانيات الورمية المستخدمة في النتائج المعروضة هنا وتوسيعها لما بعد الممر الخامس، وحُفظت في أكثر من 6 أنابيب حفظ بالتجميد بتركيز 1 × 106 عدد الخلايا لكل أنبوبة، مع إعادة توسيع المزارع بعد الإذابة لكل مقايسة. تم التأكد من الهوية الظهارية الخبيثة والخلو من فرط نمو الخلايا الظهارية الطبيعية أو الخلايا السدوية عن طريق التسلسل المستهدف، الذي أظهر الاحتفاظ بالطفرات الجسدية الموجودة في الورم الأصلي، ومن خلال التضمين النسيجي، الذي أظهر مورفولوجيا عضوانية متوافقة مع باثولوجيا الورم الأصلي؛ كما تم التأكد من خلو جميع الخطوط من الميكوبلازما قبل الاستخدام. تم تحديد واستبعاد المزارع التي أظهرت مورفولوجيا ظهارية طبيعية أو فشلت في الاحتفاظ بالسمات الجزيئية للورم الأصلي، مما قلل من التلوث غير الورمي في المقايسة.

جميع النتائج المعروضة (الشكل 1، والشكل 2، والشكل 3، والشكل 4، والشكل 5) تم استخلاصها من زوج واحد متطابق من العضوانيات واللمفاويات التائية المرتشحة إلى الورم (TIL) مشتق من مريض واحد مصاب بسرطان الرئة الغدي. تم الحصول على عينة الورم من استئصال جراحي أُجري دون علاج مساعد سابق، واستُخدمت العضوانيات في الممر 21. تم الحفاظ على العضوانيات في المزرعة لمدة 12 أسبوعًا تقريبًا من العزل الأولي وحتى المقايسة الموضحة (الممر 21). يُعتبر تاريخ استئصال الورم من المعلومات الصحية المحمية، وبالتالي لم يتم ذكره.

بعد إعادة التوسع، يتم استعادة العضويات الورمية المشتقة من المريض (PDTOs) وعدّها وتوزيعها في أطباق تصوير مكونة من 96 بئراً. يتم تحضير اللمفاويات المتسللة إلى الورم (TILs) بالتوازي بنسبة 2:1 من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة، مع إضافة ركيزة NucView 488 caspase-3 مباشرة قبل إعداد الزراعة المشتركة (الشكل 2A). وتُظهر الصور التمثيلية من بئر واحد في نقطة زمنية متوسطة المخرجات المتوقعة لأربع قنوات: حيث يؤكد تباين الطور وجود العضويات والخلايا المناعية (الشكل 2B)، ويحدد الفلورسنت الأخضر إشارة الموت الخلوي المبرمج المنشطة بواسطة caspase-3 (الشكل 2C)، بينما يحدد الفلورسنت الأحمر بشكل انتقائي العضويات الورمية الموصومة بـ CellTrace Far Red (الشكل 2D)، ويكشف التراكب المدمج عن الأجسام الورمية الميتة المبرمج المزدوجة الإيجابية للأحمر والأخضر، وهي القراءة الأساسية للمقايسة (الشكل 2E). ومن المتوقع ظهور إشارة خضراء تلقائية ضئيلة داخل الهياكل الإيجابية للون الأحمر في حالة عدم وجود قتل بوساطة TILs. ولغرض القياس الكمي، يتم التعبير عن العضويات مزدوجة الإيجابية للأحمر والأخضر (الميتة مبرمجاً) كنسبة مئوية من PDTOs الميتة مبرمجاً، ويتم رسمها بيانياً بمرور الوقت كمتوسط ± SEM، مع تأكيد دقة تحديد الهياكل الورمية من خلال تراكبات التجزئة (الشكل 4D).

في تجربة تمثيلية تم فيها اختبار ستة جزيئات صغيرة بتركيز 1 µM، أظهر العقار 4 والعقار 5 ارتفاعاً في موت الخلايا المبرمج مقارنة بالمادة الناقلة اعتباراً من 24 h تقريباً (الشكل 5A; ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001)؛ وتعد هذه المقارنة ضمن تجربة تمثيلية واحدة. وتوفر مخططات الكمان عند نقطة النهاية 36 h رؤية تكميلية لتوزيع الاستجابة عبر المكررات، مما يوضح أن العقار 4 والعقار 5 يحققان أكبر الزيادات في الـ PDTOs التي تعاني من موت الخلايا المبرمج في هذه التجربة التمثيلية، بينما يظهر العقار 3 انخفاضاً اسمياً في استجابة القتل، وهو ما يتفق مع نشاط محتمل مثبط للمناعة (الشكل 5B).

للتأكد من أن موت الخلايا المبرمج المقاس يعكس القتل المعتمد على الخلايا الليمفاوية المتسللة إلى الورم (TIL) بدلاً من السُميّة الخلوية المباشرة للعقار أو الإشارات المشتقة من الخلايا المؤثرة، تم تقييم مركب ممثل (Drug 5) في ثلاث مجموعات متوازية: الزراعة المشتركة (TIL + organoid)، وأشباه الأعضاء فقط (بدون TIL)، والخلايا التائية فقط، على مدار فترة زمنية مدتها 36 h (الشكل 5C).

أظهرت مجموعة الزراعة المشتركة تراكماً تدريجياً ومعتمداً على الوقت لـ PDTOs المبرمج موتها، حيث وصلت النسبة إلى 19.2 ± 1.0% بحلول الساعة 36 (المتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط، n = 6 آبار)، بينما ظلت مجموعة العضوانيات فقط (بدون TIL) منخفضة طوال الوقت، وارتفعت إلى 4.0 ± 0.3% فقط عند الساعة 36 (n = 3 آبار)، وهي إشارة أقل بمقدار 4.8 ضعفاً. وظلت مجموعة التحكم بالخلايا التائية فقط عند المستوى الأساسي طوال الفترة الزمنية (0.0%؛ n = 3 آبار)، وهو ما يتفق مع كون العضوانيات الورمية فقط هي التي تم وسمها فلوروسينياً، مما يؤكد أن القراءة لا تصدر عن الخلايا المؤثرة. ومعاً، تعزل هذه المجموعات صافي القتل المبرمج المعتمد على TIL فوق المستوى الأساسي للورم وحده. ونظراً لأن مجموعة العضوانيات فقط قد تم الحصول عليها في وجود الدواء، فإنها تعمل أيضاً كمجموعة تحكم للدواء بالإضافة إلى الورم (بدون TIL): فمع وجود الدواء وغياب TILs، ظل الموت الخلوي المبرمج منخفضاً (4.0 ± 0.3% عند الساعة 36)، مما يشير إلى أن زيادة القتل في مجموعة الزراعة المشتركة المطابقة لا يمكن تفسيرها من خلال السُمية الخلوية المباشرة للعضوانيات لهذا المركب. تم إنشاء مجموعة مطابقة للدواء وحده للعقار 5 فقط؛ وبالنسبة للمركبات المتبقية، يوصف ارتفاع الموت الخلوي المبرمج بالتالي على أنه تأثير مشترك لا يمكن عزوه بعد تحديداً إلى التعزيز المناعي، ويُعتبر وجود تحكم بالدواء وحده لكل مركب خطوة تحقق مطلوبة.

جميع البيانات التي تدعم نتائج هذه الدراسة متاحة دون قيود. وقد تم إيداع سلسلة صور الفاصل الزمني الخام، وملفات التصدير على مستوى الكائنات، وملفات تعريف تحليل Incucyte، وإعدادات معاملات التجزئة، والبيانات الوصفية، والبيانات الإحصائية المصدرية التي يستند إليها الشكل 5 في مستودع عام وهي متاحة مجانًا بموجب رخصة مفتوحة doi: 10.5281/zenodo.21676769. كما تتوفر البيانات المصدرية على مستوى الكائنات، وخرائط الأطباق، وإعدادات التجزئة، وملف تعريف التحليل المستخدم لإنشاء الشكل 5 في الملف التكميلي 2.

عملية إعادة تكوين العضوانيات: يوضح المخطط معلق الخلايا الفردية، والتلوين، والزراعة في قباب Matrigel.
الشكل 1: الوسم الفلوري وإعادة التكوين ثلاثي الأبعاد لعضوانيات الأورام المشتقة من المرضى. (A) نظرة عامة تخطيطية لسير عمل تحضير PDTO: يتم فصل العضوانيات من Matrigel، وتفكيكها إلى معلق خلايا فردية، ووسمها بصبغة CellTrace Far Red، وإعادة تعليقها في مصفوفة Matrigel، وزراعتها كقطرات ثلاثية الأبعاد لمدة 72 h لإعادة التوسع قبل مقايسة الزراعة المشتركة. (B) صورة تمثيلية لكتل الخلايا الموسومة في أنابيب سعة 15 mL تظهر تلوناً مرئياً يشير إلى نجاح التلوين بـ CellTrace Far Red. (C) صورة تباين طوري تظهر قطرة Matrigel تحتوي على عضوانيات ورمية أعيد توسيعها بعد زراعتها لمدة 72 h. (D) صورة تراكبية فلورية تظهر عضوانيات ورمية موسومة باللون الأحمر (CellTrace Far Red)، مما يؤكد سلامة المورفولوجيا ثلاثية الأبعاد للعضوانية والوسم الفلوري الموحد قبل إعداد مقايسة الزراعة المشتركة. تم التقاط الصور بتكبير 10×. أشرطة المقياس = 800 µm (C) و 400 µm (D). الاختصار: PDTO = patient-derived tumor organoid. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط سير عمل مقايسة العضوانيات مع الخلايا اللمفاوية المتسللة للورم؛ صبغة NucView 488؛ قياس الموت الخلوي المبرمج؛ نظام Incucyte.
الشكل 2. سير عمل مقايسة الزراعة المشتركة وصور فلورية ممثلة لقتل العضوانيات الورمية بواسطة الخلايا اللمفاوية المتسللة للورم (TIL). (أ) مخطط لسير عمل مقايسة الزراعة المشتركة الكاملة يوضح مسارين متوازيين للتحضير: (المسار العلوي) استعادة العضوانيات من Matrigel، والعد، والزراعة في أطباق تصوير ذات 96 بئراً؛ (المسار السفلي) توسيع الخلايا اللمفاوية المتسللة للورم (TIL)، وإعادة تعليقها، وإضافتها مع ركيزة caspase-3. يلتقي المساران في إعداد الزراعة المشتركة في طبق ذو 96 بئراً يتم تحميله في نظام تصوير الخلايا الحية للاستحواذ الحركي والتحليل الآلي. صور ممثلة من بئر زراعة مشتركة في نقطة زمنية واحدة: (ب) تباين الطور، (ج) قناة الفلورة الخضراء التي تظهر إشارة NucView 488 المنشطة بواسطة caspase-3 في الخلايا التي تمر بالموت الخلوي المبرمج، (د) قناة الفلورة الحمراء التي تظهر العضوانيات الورمية المحددة بـ CellTrace Far Red، و (هـ) تراكب الفلورة المدمج الذي يوضح الأجسام الورمية الموتة إيجابية الصبغتين باللونين الأحمر والأخضر. تم الحصول على الصور بتكبير 10×. شريط المقياس = 400 µm. الاختصار: TIL = الخلايا اللمفاوية المتسللة للورم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تكوين المسح الآلي؛ واجهة الإعدادات؛ الحصول على البيانات؛ تحليل التصوير؛ دليل البرنامج.
الشكل 3. إعداد مسح الجهاز وتكوين معاملات الحصول على البيانات للتصوير الحي للخلايا. (أ) لوحة تحكم جدولة الجهاز تظهر مسحاً نشطاً مع خريطة الصفيحة وخصائص المسح بما في ذلك نوع الوعاء، وقنوات التصوير، والعدسة الشيئية، ومدة المسح، وجدول الحصول على البيانات. (ب) مربع حوار تكرار المسح أم مرة واحدة؟ مع تحديد المسح وفقاً للجدول لتمكين التصوير الحركي الطولي على مدار مدة المقايسة الكاملة. (ج) لوحة اختيار نوع المسح مع اختيار وضع قياسي، مما يدعم تطبيقات تحليل تباين الطور والتحليل القائم على الفلورة. (د) لوحة إعدادات المسح التي تحدد قنوات التصوير (الطور، الأخضر، الأحمر)، وأوقات الحصول على البيانات لكل قناة، واختيار العدسة الشيئية 10×. (هـ) لوحة نمط المسح تظهر اختيار الآبار للآبار الداخلية في صفيحة ذات 96 بئراً مهيأة لأخذ أربع صور لكل بئر مع تقدير لمدة المسح. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

سير عمل برنامج تحليل الصور؛ إعداد صور المجهر؛ مسح/تكامل البيانات؛ مخطط تعليمي.
الشكل 4. إعداد جهاز تصوير الخلايا الحية وسير عمل تحليل الصور باستخدام برنامج متكامل. (A) واجهة بدء التحليل التي تظهر اختيار إنشاء تعريف تحليل جديد لبدء مسار تحليل جديد. (B) لوحة اختيار قناة الصورة مع تفعيل القنوات الطورية، والخضراء، والحمراء للاستحواذ على الفلورة المزدوجة. (C) واجهة تعريف التحليل التي تعرض معلمات تقسيم القناة الحمراء، بما في ذلك عتبات المساحة الدنيا والقصوى، واستبعاد الحواف، وفلاتر الحطام المستخدمة لتحديد أجسام الورم. (D) واجهة تعريف التحليل التي تظهر مقاييس التحليل المكونة لكل من القناتين الخضراء والحمراء مع تراكب تقسيم تمثيلي يؤكد التحديد الدقيق لبنى الورم المبرمج ذات الإيجابية المزدوجة للأحمر/الأخضر. (E) واجهة وقت المسح واختيار البئر المستخدمة لجدولة الاستحواذ المتكرر على الصور عبر الآبار الداخلية لصفيحة التصوير ذات 96 بئراً. (F) اختيار تعريف التحليل المكتمل تحت ملف الصورة. (G) عرض ملخص التحليل المكتمل الذي يعرض معلومات الوعاء، ونوع التحليل، والمقاييس المتاحة، وخيارات تصدير البيانات، بما في ذلك رسم بياني للصفيحة الدقيقة، ورسم بياني، وتصدير جدولي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

رسم بياني لاستجابة موت الخلايا المبرمج للعقار: المجرى الزمني، تحليل المخطط الكماني، اختبار العقاقير على العضيّات، فعالية العلاج.
الشكل 5. تحليل نموذجي لتأثيرات العقاقير ذات الجزيئات الصغيرة على قتل العضيّات الورمية بوساطة TIL. (أ) منحنيات القتل الحركية التي توضح النسبة المئوية لـ PDTOs التي تعرضت لموت الخلايا المبرمج بمرور الوقت مقارنةً بظروف علاجية متعددة بالجزيئات الصغيرة ومجموعة التحكم بالناقل، ممثلة كمتوسط ± SEM. (ب) مخططات كمانية توضح تحليل نقطة النهاية عند 36 ساعة كنهج رسومي بديل لتصور توزيع استجابات موت الخلايا المبرمج عبر ظروف العلاج، مما يتيح مقارنة وصفية بين المزارع المشتركة المعالجة بالعقار ومجموعة التحكم بالناقل ضمن هذه التجربة النموذجية. (ج) ضوابط الاعتماد على TIL لمركب نموذجي (Drug 5): النسبة المئوية لـ PDTOs التي تعرضت لموت الخلايا المبرمج خلال مجرى زمني مدته 36 h للمزارع المشتركة (TIL + العضيّة)، ومجموعة العضيّات فقط (بدون TIL)، ومجموعة الخلايا التائية فقط، مما يؤكد أن إشارة موت الخلايا المبرمج تعتمد على TIL ولا تنشأ من الخلايا المؤثرة (المزارع المشتركة n = 6 آبار؛ العضيّات فقط والخلايا التائية فقط n = 3 آبار؛ متوسط ± SEM). الاختصارات: PDTO = عضيّة ورمية مشتقة من المريض؛ TIL = الخلايا اللمفاوية المتسللة للورم؛ SEM = الخطأ المعياري للمتوسط. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الملف التكميلي 1: تحضير الأوساط والمحاليل المنظمة.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الملف التكميلي 2. بيانات المصدر وملفات التحليل الخاصة بالشكل 5. يحتوي مجلد ZIP هذا على بيانات المصدر على مستوى الكائن، وخرائط الأطباق، وإعدادات التقسيم، وملف تعريف التحليل المستخدم لإنشاء تحليلات فحص المركبات وضوابط العقار 5 (Drug 5) في الشكل 5. يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

المناقشة

يصف هذا البروتوكول منهجية للتصوير الحي للخلايا القائم على الصور لتقييم التفاعلات السامة للخلايا بين العضوانيات الورمية المشتقة من المرضى (PDTOs) والخلايا الليمفاوية المتسللة إلى الورم (TILs) المتوافقة معها. ومن خلال دمج البنية الورمية ثلاثية الأبعاد، والمؤثرات المناعية الذاتية، وقياسات تنشيط caspase-3 في الوقت الفعلي، يتيح هذا النظام تقييماً ديناميكياً لموت الخلايا الورمية المبرمج تحت ظروف ذات صلة فسيولوجياً. يجمع سير العمل بين طرق توسيع العضوانيات وTILs المعتمدة وظروف الزراعة المشتركة الخاضعة للتحكم والقياس الكمي الآلي القائم على الصور، مما يوفر نهجاً قائماً على الصور للدراسات الوظيفية المناعية. ونظراً لأن خطوات عزل وتوسيع PDTO وTILs الأولية تُنفذ وفقاً لبروتوكولات منشورة سابقاً بدلاً من وصفها بالكامل هنا، فإن إعادة إنتاج سير العمل هذا بالكامل تتطلب مراجعة تلك المراجع المصدرية بالإضافة إلى هذا البروتوكول.

تكمن إحدى نقاط القوة الرئيسية لهذا النهج في الحفاظ على التغاير الجوهري للأورام داخل العضوانيات. فخلافاً لأنظمة الطبقة الأحادية ثنائية الأبعاد، تحافظ العضوانيات على البنية ثلاثية الأبعاد والتفاعلات بين الخلايا الورمية. وعند استزراعها مشتركاً مع الخلايا اللمفاوية المتسللة للورم (TILs) المتطابقة، يسمح ذلك بتقييم تسلل الخلايا التائية، والقتل المعتمد على التلامس، والاستجابات الحركية بمرور الوقت. كما يتيح استخدام ركيزة فلورية منشطة بـ caspase-3 قياس الموت الخلوي المبرمج بشكل مباشر بدلاً من الاعتماد على مؤشرات غير مباشرة مثل فقدان الاندماج الخلوي أو مقاييس الحيوية النهائية القائمة على ATP.

تحدد عدة معلمات حرجة نجاح التجربة. وتعد سلامة العضوانيات (Organoids) عند الزرع أمرًا أساسيًا؛ حيث قد يؤدي الهضم المفرط أثناء تفكيك الورم الأولي أو التفكك الميكانيكي المفرط أثناء إعداد المزرعة المشتركة إلى تفتيت العضوانيات، مما يؤدي إلى زيادة اصطناعية في أعداد الأجسام الحمراء وتغيير حسابات الموت الخلوي المبرمج (apoptosis). كما أن التوزيع المتسق لأحجام العضوانيات يحسن من دقة التجزئة (segmentation) ويقلل من التباين بين الآبار. وبالمثل، يجب الحفاظ على نسب دقيقة من الخلايا المؤثرة إلى الخلايا المستهدفة (E:T) عبر المكررات، حيث أن العد غير الدقيق للخلايا التائية (T-cell) أو تكتلها يؤدي إلى تباين في حركية القتل. ويقلل إعادة التعليق برفق مباشرة قبل الزرع من هذه المشكلة. وقد تم تقييم نسبة E:T واحدة فقط (2:1) في مجموعة البيانات التمثيلية المعروضة، بما يتوافق مع معيار التشغيل القياسي المعتمد في بروتوكول مختبرنا. وبشكل عام، يُتوقع أن تؤدي نسب E:T الأعلى إلى زيادة قتل الورم بناءً على الأدبيات الراسخة حول سمية الخلايا التائية، ويظل التعيير الرسمي لهذه المعلمة اتجاهًا للتحقق المستقبلي من هذه المنصة. ويمثل اختيار ومعايرة معلمات التجزئة خطوة حاسمة أخرى؛ حيث يجب أن تستبعد عتبات الحد الأدنى والحد الأقصى لحجم الأجسام الحطام مع التقاط هياكل الورم السليمة؛ إذ تؤدي العتبات المتساهلة للغاية إلى تضخيم أعداد الأورام، بينما تؤدي العتبات التقييدية للغاية إلى تقدير عبء الورم بأقل من قيمته الحقيقية. كما يجب التحقق من معايير التداخل للإشارات الحمراء والخضراء باستخدام كل من ضوابط الموت الخلوي المبرمج التلقائي وضوابط القتل الإيجابية، ويجب تطبيقها باتساق عبر جميع الآبار لتجنب الانحياز في حسابات النسبة المئوية للموت الخلوي المبرمج.

إن إدراج الضوابط المناسبة يعزز من إمكانية تفسير النتائج. تحدد الآبار التي تحتوي على الورم فقط استقرار الفلورة الحمراء الأساسية، بينما تحدد ضوابط الورم بالإضافة إلى الركيزة كمية الموت الخلوي المبرمج التلقائي والمستقل عن النشاط المناعي. وتحدد ضوابط الخلايا التائية فقط إشارة كاسبيز الخلفية الناشئة عن اللمفاويات الميتة. أما ضوابط الموت الخلوي المبرمج الإيجابية فتؤكد فعالية الركيزة وتصادق على عتبات التجزئة. تكتسب هذه الضوابط أهمية خاصة عند مقارنة أزواج الورم والخلايا اللمفاوية المتسللة للورم (TIL) المستقلة، حيث يمكن أن تختلف معدلات الموت الخلوي المبرمج الأساسية بين خطوط العضوانيات.

توفر هذه المنصة القائمة على التصوير عدة مزايا مقارنة بمقاييس السُمية الخلوية التقليدية، مثل تحرر الكروم أو قياسات الحيوية القائمة على ATP عند نقطة النهاية. يتيح التصوير في الوقت الفعلي مراقبة مستمرة وغير مدمرة للتفاعلات بين الورم والجهاز المناعي، مما يسمح بدقة حركية في رصد القتل بوساطة الخلايا المناعية. وعلى عكس مقاييس نقطة النهاية، التي توفر قياساً تراكمياً واحداً وقد تخفي أحداث السُمية الخلوية العابرة أو المتسلسلة، فإن التصوير الطولي يميز بين الاستجابات السُمية الخلوية المبكرة والسريعة وبين الموت الخلوي المبرمج المتأخر أو التدريجي. ويسمح هذا التحليل الزمني بتحديد مراحل الكمون المرتبطة بتنشيط الخلايا التائية أو ارتشاحها، وفترات ذروة القتل، ومراحل الاستقرار التي قد تعكس إنهاك الخلايا التائية أو مقاومة الخلايا المستهدفة. كما تؤدي القياسات المتكررة من نفس البئر إلى تقليل التباين بين العينات وتلغي الحاجة إلى استخدام ألواح متوازية في نقاط زمنية متعددة. ونظراً لأنه يتم قياس العبء الورمي والتحول إلى الموت الخلوي المبرمج في وقت واحد عند كل فاصل زمني، يصبح التقييس الديناميكي ممكناً، مما يحسن الدقة مقارنة بمقاييس التحلل الكلي التي لا يمكنها التمييز بين القتل المناعي وموت الخلايا التلقائي. وبشكل جماعي، يوفر هذا النهج تقييماً للوظيفة السُمية الخلوية يكون أكثر إفادة من الناحية الفسيولوجية وأكثر قابلية للتفسير من الناحية الميكانيكية مقارنة بالمقاييس التقليدية ذات النقطة الزمنية الواحدة.

ومع ذلك، يجب مراعاة عدة قيود. على الرغم من أن العضوانيات الورمية المشتقة من المرضى تحاكي البنية الورمية الأصلية بشكل أدق من المزارع التقليدية ثنائية الأبعاد، إلا أنها لا تنمذج المكونات السدوية أو الوعائية أو النقوية للبيئة المجهرية للورم بشكل كامل. بالإضافة إلى ذلك، يوفر التصوير بتكبير 10× إنتاجية كافية للتحليل الطولي ولكن قد لا يتمكن من تحليل التفاعلات على مستوى الخلية الواحدة داخل العضوانيات ذات التكدس الكثيف. ويمكن للتصوير بتكبير أعلى أن يحسن الدقة المكانية ولكنه يقلل من مجال الرؤية وإنتاجية المقايسة. وتقوم هذه المقايسة تحديداً بقياس الموت الخلوي المبرمج للخلايا الورمية المعتمد على caspase-3. أما السمية الخلوية بوساطة الخلايا التائية التي تحدث عبر آليات غير معتمدة على caspase، بما في ذلك النخر أو النخر المبرمج، فلا يتم اكتشافها بواسطة هذه القراءة، وبالتالي يجب تفسيرها ضمن نطاق المقايسة. بالإضافة إلى ذلك، فإن تفكيك الخلايا المفردة ووسمها وإعادة توسيعها لمدة 72 h قد يؤدي من حيث المبدأ إلى اختيار مجموعات فرعية؛ ومع ذلك، فإن الهياكل التي يتراوح حجمها بين 100–300 µm والتي تعيد التشكل خلال هذه الفترة تحتفظ بالبنية ثلاثية الأبعاد متعددة الخلايا للعضوانيات الأصلية، ولم يلاحظ أي تغير مورفولوجي واضح مقارنة بالمزارع الأصلية، على الرغم من عدم إجراء مقارنة رسمية للتكوين النسيلي قبل وبعد إعادة التوسع. لا تتضمن الدراسة الحالية معياراً لضبط إيجابي دوائي، مثل مثبط نقاط التفتيش المناعية (على سبيل المثال، anti-PD-1) في زوج من العضوانيات–TIL من نوع PD-L1⁺/PD-1⁺، مع التعزيز المتوقع للقتل، لمعايرة المدى الديناميكي للمقايسة رسمياً؛ ويعد إدراج مثل هذا العامل المعزز للمناعة كمرجع خطوة تحقق تالية مهمة، ويجب تفسير نتائج المركبات المقارنة الواردة هنا بناءً على ذلك. وقد أُجريت ضابطة مطابقة للدواء وحده (بدون TIL) للمركب Drug 5 فقط في هذه الأمثلة؛ ولا يمكن عزو التعزيز النسبي في موت الخلايا إلى المركبات الأخرى التي تفتقر إلى ضابطة الدواء وحده لكل مركب. كما لم يتم إجراء تحقق متعامد على نفس العينة لهذه القراءة القائمة على الصور مقابل مقياس معياري مستقل لموت الخلايا، مثل صبغ Annexin V باستخدام قياس التدفق الخلوي أو التأكيد المجهري بؤري الموضع للخلية الواحدة، وقد تم تحديد ذلك كخطوة تالية رئيسية لترسيخ خصوصية القراءة المزدوجة الإيجابية باللونين الأحمر/الأخضر17.

ثمة اعتبار إضافي يتمثل في أن تألق صبغة CellTrace Far Red يتخفف تدريجياً مع كل جولة من انقسام الخلايا الورمية. وبناءً على ذلك، فإن التكاثر خلال فترة استعادة العضوانيات (organoid) التي تستمر لمدة 72 h ونافذة التصوير اللاحقة قد يؤدي إلى خفض شدة التألق في النقاط الزمنية المتأخرة، مما قد يقلل من عدد الأجسام الورمية الموجبة لـ CellTrace القابلة للكشف، ويزيد بشكل طفيف من النسبة المئوية المحسوبة للموت الخلوي المبرمج (apoptosis) نتيجة انخفاض قيمة المقام. ولمراقبة هذا العامل المربك المحتمل، تم تتبع عدد الأجسام الموجبة لـ CellTrace Far Red طولياً طوال فترة التصوير، كما تم تقييم الآبار للكشف عن أي انخفاض جوهري في الإشارة الموجبة للون الأحمر بشكل مستقل عن تنشيط caspase-3/7 المرتبط بالموت الخلوي المبرمج. ولم يُلاحظ أي فقدان كبير غير مفسر للأجسام الموجبة لـ CellTrace خلال نافذة التصوير، مما يشير إلى أن تخفف الصبغة من غير المرجح أن يكون مساهماً رئيساً في التغيرات الملحوظة في قياسات الموت الخلوي المبرمج. ومع ذلك، يظل هذا قصوراً متأصلاً في تتبع الخلايا الورمية القائم على تخفف التألق، ويجب أخذه في الاعتبار عند تفسير قياسات النقاط الزمنية المتأخرة.

يمثل التباين البيولوجي بين العينات المستمدة من المرضى مصدر قوة وتحدياً في آن واحد لمنصة المقايسة هذه. وبينما يعكس هذا التباين عدم التجانس الورمي ذو الصلة سريرياً، يجب أن يراعي التصميم التجريبي المناسب التباين البيولوجي عند تحديد حجم الدراسة ومتطلبات التكرار. ينبغي اعتبار كل زوج فريد من الورم والخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TIL) مكرراً بيولوجياً مستقلاً، في حين تُستخدم المكررات التقنية لتقييم تباين المقايسة داخل العينة الواحدة. تعكس مجموعة البيانات التمثيلية الموضحة في الشكل 5 زوجاً واحداً من العضوانيات والخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (organoid–TIL) تم تحليله في ثلاث مكررات تقنية؛ وبناءً على ذلك، فإن تحليل التباين ثنائي الاتجاه للقياسات المتكررة (two-way repeated-measures ANOVA) المعروض يصف تباين المقايسة داخل تلك العينة الفردية، ولا ينبغي تفسيره على أنه تقييم للتباين البيولوجي بين المرضى. يجب تحديد عدد أزواج العضوانيات والخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (organoid–TIL) المستقلة المطلوبة لكل دراسة باستخدام حسابات القوة الاستشرافية بناءً على حجم التأثير المتوقع، والتباين البيولوجي، والأهداف التجريبية. كما يجب إدراج المكررات التقنية لقياس دقة المقايسة، ولكن لا ينبغي اعتبارها بدائل للمكررات البيولوجية المستقلة.

قد تدمج التعديلات المستقبلية لهذا البروتوكول حصار نقاط التفتيش المناعية، أو تعديل السيتوكينات، أو مثبطات الجزيئات الصغيرة، أو الاضطرابات الجينية لتحليل الآليات التي تنظم السمية الخلوية بوساطة الخلايا التائية. كما يمكن أن يؤدي التكامل مع ترانسكريبتوميك الخلية الواحدة أو التصوير المكاني إلى تعزيز الرؤى الميكانيكية بشكل أكبر. بالإضافة إلى ذلك، قد يتيح التكيف مع تنسيقات 384-well عالية الإنتاجية تطبيقات فحص الأدوية. وتعد هذه المنصة أيضاً قابلة للتكيف بسهولة لتقييم علاجات الخلايا التائية ذات مستقبلات المستضد الخيمرية (CAR-T) بدلاً من الخلايا الليمفاوية المتسللة إلى الورم (TILs) متعددة النسيلة، وهو ما يتطلب فقط تأكيد تعبير المستضد المستهدف على PDTOs قبل الزراعة المشتركة، مع الإدراج المناسب لعضوانيات ضابطة سالبة المستضد لتأكيد الخصوصية الموجهة نحو الهدف18,19,20.

باختصار، يوفر هذا البروتوكول طريقة كمية تعتمد على الصور لقياس السمية الخلوية التي تتوسطها الخلايا اللمفاوية المتسللة إلى الورم (TIL) ضد العضويات الورمية ذاتية المنشأ في الوقت الفعلي. ويضمن الاهتمام الدقيق بسلامة العضويات، وثبات نسب الخلايا المؤثرة، وعتبات التجزئة التي تم التحقق من صحتها، والضوابط المناسبة، الحصول على قياس كمي موثوق. هذا النظام قابل للتطبيق على نطاق واسع في دراسات المناعة الورمية، وتعديل نقاط التفتيش المناعية، وتحسين العلاج بالخلايا التبني، والتنميط المناعي الوظيفي الشخصي.

الإفصاحات

يعمل B.D.H. كمؤسس مشارك ومستشار لشركة Faeth Therapeutics. ويمتلك O.E. حصصًا في شركتي Volastra Therapeutics وOwkin، ولكن ليس لهذا أي علاقة بهذا المشروع. ولم تقدم أي من شركات Faeth Therapeutics أو Volastra Therapeutics أو Owkin أي تمويل، أو مواد، أو معدات، أو برمجيات، أو ملكية فكرية، أو مدخلات في تصميم الدراسة لهذا العمل. ويعلن بقية المؤلفين عدم وجود أي تضارب في المصالح.

إفصاح عن استخدام الذكاء الاصطناعي:
خلال إعداد هذا العمل، استخدم المؤلف (المؤلفون) Claude لتحرير اللغة. وبعد استخدام هذه الأداة/الخدمة، قام المؤلف (المؤلفون) بمراجعة المحتوى وتحريره حسب الحاجة، ويتحمل (يتحملون) المسؤولية الكاملة عن محتوى المقال المنشور.

شكر وتقدير

نحن نعرب عن امتناننا لمعهد إنجلاندر للطب الدقيق في كلية وايل كورنيل للطب، لدعمهم السخي وإتاحة الوصول إلى الموارد المؤسسية. كما حظي هذا العمل بدعم من منحة برنامج MERIT / مؤسسة التميز الطبي (رقم الجائزة 61500857)، الممنوحة لكل من Olivier Elemento وBenjamin D. Hopkins. ولم يكن للممول أي دور في تصميم الدراسة، أو جمع البيانات، أو التحليل، أو إعداد المخطوطة. كانت خطوط إنتاج HEK293T المفرزة لبروتينات Noggin وR-Spondin هدية كريمة من مختبر Yu Chen (مركز ميموريال سلون كيترينج للسرطان) وقد تم إنتاجها كما هو موضح سابقاً21.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنابيب مخروطية سعة 15 mLCorning430791جمع الخلايا والطرد المركزي
أطباق 6-آبار غير معالجة لزراعة الأنسجةGreiner Bio-One657185زراعة وتوسيع العضوانيات ثلاثية الأبعاد (3D organoids)
A-83-01 (مثبط TGF-beta)Tocris Bioscience2939وسط العضوانيات الكامل
Advanced DMEM/F12Thermo Fisher Scientific12634010مكون من مكونات الوسط
مكمل B27 (50X)، خالي من المصلThermo Fisher Scientific17504044وسط العضوانيات الكامل
صفيحة دقيقة ذات جدران سوداء وقاع بصري، 96 بئر، سوداء، سطح TCNunc165305صفيحة تصوير الخلايا الحية لاختبار القتل
محلول استعادة الخلايا (Cell Recovery Solution)Corning354253إذابة Matrigel بالتبريد مع الحفاظ على بنية العضوانيات ثلاثية الأبعاد
طقم CellTrace Far Red لتكاثر الخلاياThermo Fisher ScientificC34564الوسم الفلوري للخلايا الورمية (القناة الحمراء)
خزانة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية (Class II Biosafety Cabinet)Thermo Fisher Scientific1375 (1300 Series A2, 4 ft)التعامل العقيم بمستوى السلامة البيولوجية BSL-2
حضانة CO2 (بدرجة حرارة 37 °C، ونسبة 5% CO2، مرطبة)Thermo Fisher Scientific51030400 (Heracell VIOS 160i)توسيع العضوانيات وحضانة المزارع المشتركة
عداد الخلايا الآلي Countess 3Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)AMQAX2000عد الخلايا/التحقق من حيويتها آلياً (يستخدم مع شرائح Countess، C10312)
شرائح عد Countess (أو مقياس خلايا hemocytometer)Thermo Fisher ScientificC10312عد الخلايا آلياً
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، معقمSigma-AldrichD2650إعادة تحضير صبغة CellTrace Far Red
محلول ملحي منظم بالفوسفات من دولبيكو (PBS)، تركيز 1X، بدون Ca2+/Mg2+Corning21-040-CVRإعادة تعليق الخلايا للعد والوسم بالصبغة
مصل جنين البقر (FBS)، مثبط حرارياًThermo Fisher Scientific16140071مكون من مكونات الوسط
مكمل GlutaMAX-I (100X)Thermo Fisher Scientific35050061مكون من مكونات الوسط
GraphPad Prism (v10.6.1)GraphPad Software / DotmaticsVersion 10.6.1التحليل الإحصائي (two-way RM ANOVA) والرسم البياني
خطوط خلايا منتجة HEK293T (تفرز Noggin و R-Spondin)Yu Chen Lab, Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC)Gift (see Gao et al., Cell 2014)إنتاج الوسط المشروط (القسم 0.2)؛ هدية من مختبر Yu Chen (MSKCC)؛ تم إنتاجها وفقاً لـ Gao et al., Cell 2014, DOI: 10.1016/j.cell.2014.08.016
HEPES (محلول بتركيز 1 M)Thermo Fisher Scientific15630080مكون من مكونات الوسط
Human Recombinant FGF-10Thermo Fisher ScientificPHG0204وسط العضوانيات الكامل
Human Recombinant FGF-Basic (FGF-2)Thermo Fisher ScientificPHG0261وسط العضوانيات الكامل
برنامج Incucyte الأساسي (v2024B)SartoriusIntegrated software v2024Bجدولة الحصول على الصور والتقسيم/التحليل الآلي
نظام Incucyte S3 لتحليل الخلايا الحيةSartorius4647جهاز تصوير الخلايا الحية (37 °C، 5% CO2)؛ الحصول على صور بالتباين الطوري + فلورة مزدوجة
مجهر فلوري/تباين طوري مقلوبNikonEclipse Ts2-FLمراقبة جودة العضوانيات وتأكيد التقسيم البصري
مجمد مختبري (−20 °C / −80 °C)Thermo Fisher ScientificTSX40086A (TSX Series −86 °C)تخزين حصص عوامل النمو والأوساط المشروطة
هزاز مختبري / منصة اهتزاز (متوافقة مع 4 °C)Benchmark ScientificB3D2300 (BenchRocker 3D)إذابة المصفوفة في محلول استعادة الخلايا البارد (القسم 2.1)
مصفوفة الغشاء القاعدي Matrigel، منخفضة عوامل النموCorning356231مصفوفة ثلاثية الأبعاد لتضمين وتوسيع العضوانيات
Mouse Recombinant EGFPeproTech315-09وسط العضوانيات الكامل
N-AcetylcysteineSigma-AldrichA9165وسط العضوانيات الكامل
NicotinamideSigma-AldrichN0636وسط العضوانيات الكامل
Noggin (أوساط مشروطة أو معاد تركيبها)Lab-prepared aliquot—وسط العضوانيات الكامل
NRG1 (Neuregulin-1 / Heregulin)R&D Systems396-HBوسط العضوانيات الكامل
ركيزة NucView 488 Caspase-3 (محلول مخزون 200 µM)Biotium30029الكشف في الوقت الفعلي عن تنشيط caspase-3 (قراءة الموت الخلوي المبرمج، القناة الخضراء)
محلول بنسيلين-ستربتوميسين (100X)Thermo Fisher Scientific15140122مكون من مكونات الوسط
PGE2 (Prostaglandin E2)Sigma-AldrichP0409وسط العضوانيات الكامل
PrimocinInvivoGenant-pm-1وسط العضوانيات الكامل
جهاز طرد مركزي مبرد (دلو متأرجح، 300 × g، 4 °C)Eppendorf022628187 (Centrifuge 5810 R, A-4-62 rotor)خطوات التفكيك والغسل بالطرد المركزي
وسط RPMI 1640Thermo Fisher Scientific11875093وسط أساسي لإعادة تعليق الخلايا التائية (T-cell)
R-Spondin (أوساط مشروطة أو معاد تركيبها)Lab-prepared aliquot—وسط العضوانيات الكامل
SB202190 (مثبط p38 MAPK)Sigma-AldrichS7076وسط العضوانيات الكامل
StaurosporineSigma-AldrichS4400ضابط قتل إيجابي؛ عامل محفز للموت الخلوي المبرمج لتأكيد فعالية ركيزة caspase
نظام Stericup للترشيح الفراغي المعقم (0.22 µm)MilliporeSigma (Merck)S2GPU05REترشيح/إنتاج الأوساط المشروطة لـ Noggin و R-Spondin (القسم 0.2)
كاشط خلايا معقم (Sterile Cell Scraper)Corning3008التفكيك الميكانيكي لقباب Matrigel
محلول تريبان بلو (Trypan Blue)، 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061تقييم الحيوية عبر استبعاد الصبغة
إنزيم TrypLE Express (1X)Thermo Fisher Scientific12604021التفكيك الإنزيمي لـ Matrigel والعضوانيات
حمام مائي (37 °C)Thermo Fisher ScientificTSGP05 (Precision GP 05)التفكيك الإنزيمي وتدفئة الأوساط
Y-27632 (مثبط ROCK)Sigma-AldrichY0503وسط العضوانيات الكامل

المراجع

  1. Reck M, et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2016;375(19):1823-33.
  2. Larkin J, et al. Overall survival in patients with advanced melanoma who received nivolumab versus investigator’s choice chemotherapy in CheckMate 037: a randomized, controlled, open-label phase III trial. J Clin Oncol. 2018;36(4):383-90.
  3. Weber J, et al. Adjuvant nivolumab versus ipilimumab in resected stage III or IV melanoma. N Engl J Med. 2017;377(19):1824-35.
  4. Karimi MA, et al. Measuring cytotoxicity by bioluminescence imaging outperforms the standard chromium-51 release assay. PLoS One. 2014;9(2):e89357.
  5. Kaja S, Payne AJ, Naumchuk Y, Koulen P. Quantification of lactate dehydrogenase for cell viability testing using cell lines and primary cultured astrocytes. Curr Protoc Toxicol. 2017;72:2.26.1-2.26.10.
  6. Crouch SPM, Kozlowski R, Slater KJ, Fletcher J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J Immunol Methods. 1993;160(1):81-8.
  7. Pauli C, et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discov. 2017;7(5):462-77.
  8. Lee SH, et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 2018;173(2):515-28.e17.
  9. Dijkstra KK, et al. Challenges in establishing pure lung cancer organoids limit their utility for personalized medicine. Cell Rep. 2020;31(5):107588.
  10. Veninga V, Voest EE. Tumor organoids: opportunities and challenges to guide precision medicine. Cancer Cell. 2021;39(9):1190-201.
  11. Wang HM, et al. Using patient-derived organoids to predict locally advanced or metastatic lung cancer tumor response: a real-world study. Cell Rep Med. 2023;4(2):100911.
  12. Betge J, et al. The drug-induced phenotypic landscape of colorectal cancer organoids. Nat Commun. 2022;13(1):3135.
  13. Dijkstra KK, et al. Generation of tumor-reactive T cells by co-culture of peripheral blood lymphocytes and tumor organoids. Cell. 2018;174(6):1586-98.e12.
  14. Cattaneo CM, et al. Tumor organoid-T-cell coculture systems. Nat Protoc. 2020;15(1):15-39.
  15. Votanopoulos KI, et al. Model of patient-specific immune-enhanced organoids for immunotherapy screening: feasibility study. Ann Surg Oncol. 2020;27(6):1956-67.
  16. Harter MF, et al. Analysis of off-tumour toxicities of T-cell-engaging bispecific antibodies via donor-matched intestinal organoids and tumouroids. Nat Biomed Eng. 2024;8(4):345-60.
  17. Gelles JD, Chipuk JE. Robust high-throughput kinetic analysis of apoptosis with real-time high-content live-cell imaging. Cell Death Dis. 2016;7(12):e2493.
  18. Schnalzger TE, et al. 3D model for CAR-mediated cytotoxicity using patient-derived colorectal cancer organoids. EMBO J. 2019;38(12):e100928.
  19. Ehlen L, et al. Lung tumouroids as a testing platform for precision CAR T cell therapy. Nat Biomed Eng. 2026;10:815-31.
  20. Logun M, et al. Patient-derived glioblastoma organoids as real-time avatars for assessing responses to clinical CAR-T cell therapy. Cell Stem Cell. 2025;32(2):181-90.e4.
  21. Gao D, et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 2014;159(1):176-87.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

3

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.