تصوير مطيافية الكتلة لخلية واحدة باستخدام التأين الكهربائي بالرذاذ الكهربائي بالإزالة المقترنة بمطياف الكتلة Orbitrap

ملخص

يصف هذا البروتوكول تصوير الطيف الكتلي لخلايا OVCAR-8 باستخدام التأين الكهربائي بالامتصاص المقترن بمطياف الكتلة Orbitrap لتحليل الأيض عالي الدقة المكانية.

الملخص

يتيح تصوير التأين الكهربائي بالرش الكهربائي والتصوير الطيفي الكتلي (DESI–MSI) التصوير الجزيئي المحيط والخالي من المصفوفات مع تحضير العينة بالحد الأدنى من التحضير. يصف هذا البروتوكول سير عمل لأنظمة MSI أحادية الخلية لخلايا OVCAR-8 باستخدام DESI مرتبط بمطياف الكتلة Orbitrap. يدمج النظام رشاش DESI، وواجهة مطياف كتلة معدلة، ومرحلة XYZ بمحرك، ولوحة عرض بصرية للتصوير المكاني عالي الدقة. تزرع الخلايا على ألواح زجاجية شبكية، وتغسل بمحلول أمونيوم لتقليل تداخل الملح، وتجفف، وتحلل في الظروف المحيطة. يتم توصيل المذيب باستمرار باستخدام نظام كروماتوغرافي النانو-سائل، ويتم تنظيم غاز النيتروجين السحابي للحفاظ على استقرار الرذاذ. يصف البروتوكول أيضا التصوير النقطي، والتحكم في البكسلات، وتسجيل الصور من البصري إلى الكتلة لتحديد الموقع الخلوي الواحد. تمكن دقة الكتلة العالية والدقة الكتلية التي يوفرها اكتشاف أوربيتراب من تمييز الأنواع الجزيئية ذات الصلة الوثيقة وتدعم التحليل الأيضي الخلوي الواحد. يوفر هذا البروتوكول استراتيجية قابلة للتكيف لتنفيذ MSI خلية واحدة عالية الدقة باستخدام منصات مطياف الكتلة من Orbitrap المتعددة.

المقدمة

يسعى علم الأيض إلى توصيف شامل للمستقلبات الصغيرة الجزيئات التي تعكس الحالة الوظيفية للأنظمة البيولوجية 1,2,3,4,5. نظرا لأن المستقلبات هي منتجات مباشرة للنشاط الإنزيمي، فهي توفر قراءة ديناميكية للنمط الخلوي والتنظيم الكيميائي الحيوي. ومع ذلك، تعتمد سير العمل الأيضية التقليدية عادة على طرق استخراج جماعي تربط الإشارات عبر آلاف إلى ملايين الخلايا، مما يحجب التباين الخلوي ^6,7,8.

تعالج أيض الخلية الواحدة هذا القيد من خلال تمكين التنميط الجزيئي على مستوى الخلايا الفردية، مما يكشف عن التنوع الأيضي داخل مجموعات معقدة ويحسن الفهم الآلي لتطور المرض، والاستجابة للأدوية، وتمايز الخلايا. يعد مطيافية الكتلة (MS) أداة لا غنى عنها للتحليل الجزيئي للعينات البيولوجية. التطورات الحديثة في تقنيات التصلب المتعدد، بما في ذلك تحضير العينات، وتركيب الأجهزة، وتحليل البيانات، تمكن إجراء دراسات أيض التصلب المتعدد على مستوى الخلية^{الواحدة} 9,10,11,12.

التصوير المتعدد-متعدد (MSI)، الذي يتيح التحليل الجزيئي المحلي للعينات البيولوجية، يدمج حركة العينة الدقيقة، وأخذ العينة المنخفضة، والتأين الفعال، وتصور البيانات من خلال الحصول على طيف كتلة كامل عند كل إحداثي مكاني محدد عبر سطح العينة^12،13،14. يتم إعادة بناء صور MS عن طريق رسم شدة قيم نسبة الكتلة إلى الشحنة المختارة (m/z) عبر إحداثيات x–y، مما يحافظ على المعلومات الكيميائية المكانية داخل الأنظمة البيولوجية المعقدة 12,13,15,16,17,18. يتطلب تحقيق أيض خلية واحدة محلية منصات تحليلية قادرة على الحفاظ على تحديد الموقع الجزيئي مع الحفاظ على الحساسية ودقة الكتلة الكافية لاكتشاف الأنواع منخفضة^الوفرة 9,12,19,20.

يشكل MSI أحادي الخلية تحديات إضافية لأن الخلايا الفردية عادة ما يتراوح قطرها بين 5 إلى 20 ميكرومتر ^8,21. على هذا المقياس المكاني، فإن وفرة المحللين لكل حدث أخذ عينات محدودة للغاية. لذلك، فإن عدة عوامل، بما في ذلك التحكم الدقيق في حركة العينة، تقليل أخذ العينات، كفاءة التأين العالية، وانتقال الأيونات بكفاءة، هي عوامل متساوية في الأهمية للحصول على معلومات جزيئية قابلة للتفسير من الخلايا^{الفردية 14,22}. الامتصاص/التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) – MSI، وهي تقنية تعتمد على الفراغ تستخدم بشكل روتيني في دراسات MSI ذات دقة مكانية عالية، تتطلب ترسيب المصفوفة وتشغيل الفراغ؛ ومع ذلك، يمكن أن يؤدي تبلور المصفوفة في MALDI إلى إزالة التمركز التحليلي والتغير على مقياس الخلية الواحدة 23,24,25,26,27. على النقيض من ذلك، تعمل طرق MSI المحيطة تحت ظروف محيطة، وتحافظ العينات على حالات كيميائية شبه أصلية لأن تحضير العينة يتطلب القليل أو لا يكون. من بين طرق MSI المحيطة، تم استخدام DESI²⁸، النانو-DESI²¹، النانو-DESI²⁹ بمساعدة الهوائي، ومسبار واحد 8,30,31,32,33,34,35، سابقا في دراسات MSI أحادية الخلية. على الرغم من أن التقنيات المعتمدة على استخراج السوائل الدقيقة، بما في ذلك النانو-ديسي، والنانو ديسي المدعوم بالهواء الهوائي، والمجس الأحادي، توفر كفاءة عالية في أخذ عينات وتأين، إلا أنها تعتمد على الحفاظ على جسر سائل مستقر عند طرف مسبار العينة، في حين أن اضطراب جسر السائل، مثل تغيرات شكل السطح أو انسداد المجسات، يمكن أن يؤثر على جودة تجارب MSI ^{5,8، 21، 30، 35}.

DESI هي تقنية تأين محيطية حيث تصطدم قطرات المذيب المشحونة بسطح، وتستخرج المحللات، وتولد قطرات ثانوية تحتوي على نوع مؤين³⁶. يوفر DESI عينة غير تلامسية وخالية من الانسدادات مع توافق مع سير عمل التصوير القائم على النقطة، مما يجعله مناسبا جدا لرسم الخرائط الجزيئية عالية الدقة ومتعددة الأيونات للخلايا المفردة المعرفة بصريا عند اقترانها بمنصات أوربيراب عالية القدرة 20,37,38,39,40. يستخدم DESI على نطاق واسع في تصوير الأنسجة لكنه نادرا ما تم تطبيقه على MSI أحادي الخلية، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى التحديات التقنية^20,28. أظهرت الدراسات الحديثة باستخدام نظام تجاري يتكون من مطياف ووترز ديسي XS مرتبط بمطياف كتلة دوري من نوع SELECT SERIES أن دقة خلية واحدة يمكن تحقيقها لخطوط خلايا متعددة. يتطلب تحقيق دقة مكانية عالية في DESI–MSI تحكما منسقا في كفاءة التأين، ونقل الأيونات، ومعدل الاستحواذ، ومحاذاة الرشاش 12,20,28. على وجه الخصوص، أدى التقدم في تصميم أجيال جديدة من رشاشات DESI، بما في ذلك DESI XS وتأين التركيز الكهربائي بالتدفق الكهربائي (DEFFI)، إلى تقليل مساحة العينة^{بشكل كبير 41,42}. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يؤدي تقليل معدلات تدفق المذيبات، مثل معدلات التدفق النانو-لتر في الدقيقة التي توفرها مضخات الكروماتوغرافيا النانوية السائلة (LC)، إلى تحسين الحبس المكاني بشكل كبير لتحقيق التحديد الجزيئي لخلية واحدة²⁸. على الرغم من أن هذا النهج حقق دقة MSI لخلية واحدة، إلا أنه يعتمد على أجهزة من مورد محدد (Waters). لذا يتطلب التنفيذ الأوسع لتقنية DESI–MSI أحادية الخلية استراتيجيات يمكن دمجها مع مطياف الكتلة عالية الدقة المتوفرة على نطاق واسع، مثل أنظمة أوربيتراب، لتوفير حساسية عالية ودقة كتلية وقدرة حل. يوفر دمج DESI مع مطياف الكتلة Orbitrap فرصا جديدة في دراسات MSI الخلية الواحدة، بما في ذلك تمييز الأنواع المتقاربة ومتساوية الضغط في مستخلصات الخلايا المعقدة 20,43,44.

يصف هذا البروتوكول استراتيجية معيارية لدمج بخاخ Waters DESI XS مع مطياف الكتلة Orbitrap لدراسات MSI أحادية الخلية. يدمج سير العمل أغطية شبكية لتثبيت الخلايا والارتباط البصري، ومرحلة XYZ آلية لمسح النقط النقطي المحكم، وتوصيل المذيبات على نطاق نانوي لتكوين الرش المستقر، والكشف عالي الدقة عبر أوربيتراب. على الرغم من اختيار مطياف الكتلة Thermo Orbitrap Tribrid Lumos كمنصة، إلا أن العديد من نماذج مطياف الكتلة الأخرى من Orbitrap المجهزة بهندسات متوافقة مع واجهة المصدر قد يتم قترنها بتكوينات DESI XS مخصصة مماثلة بعد التكييف الميكانيكي المناسب والتحسين.

البروتوكول

تم الحصول على خلايا OVCAR-8 من مجموعة زراعة الأنواع الأمريكية (ATCC). تم تنفيذ جميع إجراءات زراعة الخلايا وفقا لإرشادات السلامة الحيوية المؤسسية. تم اختبار الخلايا بشكل روتيني للكشف عن تلوث الفطر الفطري باستخدام مجموعة كشف الميكوبلازما وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

ملاحظة: قم بجميع الإجراءات وفقا لإرشادات السلامة البيولوجية المؤسسية. ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة. التعامل مع المذيبات العضوية في غطاء بخار كيميائي.

1. زراعة وتحضير خلايا OVCAR-8 على أغطية شبكية

1. تحضير وسط كامل عن طريق إضافة وسط RPMI-1640 مع 10٪ مصل أبقار جنيني و1٪ بنسلين-ستربتومايسين. سخن المتوسط إلى 37°C.
2. الحفاظ على خلايا OVCAR-8 في أطباق زراعة الخلايا بحجم 10 سم تحتوي على 10 مل من وسط كامل. حضن الخلايا عند 37°C في حاضنة رطبة بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون_.
3. المرور عبر الخلايا عندما يكون حوالي 80٪ من سطح الزراعة مشغولا بصريا بالخلايا الملتصقة، عادة كل يومين تحت ظروف الزراعة الموصوفة.
   1. استنشق الوسط من طبق الزراعة بحجم 10 سم واغسل الخلايا مرة واحدة ب 5 مل من محلول ملحي مخبأ بفوسفات 1×.
   2. أضف 2 مل من حمض التربسين–الإيثيلين إيثيلين ديامين تترا أسيتيك 0.25٪ إلى طبق الزراعة. حضن الخلايا عند 37°C لمدة تقارب 3 دقائق، أو حتى تنفصل معظم الخلايا بشكل واضح عن سطح الزراعة عند فحصها تحت المجهر.
   3. أضف 8 مل من الوسط الكامل المسخن مسبقا إلى الطبق لتثبيط التربسين. باستخدام ماصة مصلية بسعة 10 مل، قم بعمل ماصة بلطف لتعليق الخلية للأعلى والأسفل حوالي 15–20 مرة لتشتت الخلايا.
   4. انقل 1 مل من نظام التعليق إلى 9 مل من الوسط الكامل الطازج.
   5. عد الخلايا باستخدام عداد خلوي آلي. تحميل 10 ميكرولتر من تعليق الخلية المعلقة مباشرة في شريحة العد دون تخفيف إضافي وإجراء عد الخلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: لم تستخدم أصباغ البقاء الخلوية مثل تريبان بلو في هذا البروتوكول. تقييم حالة الخلية بصريا من خلال مراقبة شكل الخلية والارتباطها قبل التريبسين.
4. زرع الخلايا على الأغطية.
   1. قم بتخفيف الخلايا إلى تركيز نهائي ~1 × 10⁶ خلايا/مل باستخدام وسط كامل. احسب الحجم المطلوب لتعليق الخلية باستخدام C₁V₁ = C₂V₂، حيث C₁ هو تركيز الخلية المحسوب، V₁ هو حجم تعليق الخلية المطلوب، C₂ هو التركيز المستهدف، وV₂ هو الحجم النهائي المطلوب.
   2. ضع ألواح زجاجية مشبكة فردية بقطر 28 مم مع تباعد شبكة 50 ميكرومتر داخل آبار من صفيحة ذات 6 آبار.
      ملاحظة: قم بعمل أغطية زجاجية قبل استخدامها في زراعة الخلايا. ضع جانب الشبكة مواجها للأسفل لتقليل التداخل مع نمو الخلايا.
   3. أضف 2 مل من الوسط الكامل و200 ميكرولتر من تعليق الخلية (~2 × 10⁵ خلايا/بئر) إلى كل بئر. اهز صفيحة الست آبار بلطف بنمط "X" لتوزيع الخلايا بشكل متساو على سطح الغطاء.
   4. حضن الخلايا لمدة تقارب 15–20 ساعة للسماح بارتباط الخلايا.
      ملاحظة: راقب شكل الخلايا بشكل روتيني باستخدام المجهر لضمان نمو الخلايا الطبيعي. افحص احتمال وجود تلوث بالميكوبلازما باستخدام مجموعة كشف الميكوبلازما إذا كانت الخلايا تنمو بشكل سيء.

2. غسل الخلايا باستخدام محلول فورمات الأمونيوم (AF)

ملاحظة: حضر محلول تركيز قوي جديد قبل كل استخدام.

1. جهز محلول غسيل إيزوتونيك AF مباشرة قبل الاستخدام. يزن 0.45 جرام من الرجفان الأذيني ويذيب في 50 مل من الماء بدرجة LC/MS لتحضير تركيز نهائي للرجفان الأذيني 0.14 متر (0.9٪ بالأفق/بضغط). لا تقم بتعديل درجة الحموضة ^5,45.
   ملاحظة: استخدم محلول الرجفان الأذيني المحضر حديثا في نفس يوم التحضير. حافظ على المحلول باردا جدا (0°C–4°C) حتى الاستخدام.
2. استنشق وسط الزراعة من كل بئر في صفيحة الستة آبار. أضف فورا 2 مل من محلول التيار القوي البارد لكل بئر.
3. باستخدام ملقط معقم، ارفع بلطف كل غطاء يحتوي على خلايا ملتصقة من البئر مع الحفاظ على السطح المغطى بالخلايا مواجها للأعلى. ضع الغطاء لفترة وجيزة لمدة 2–3 ثوان في بئر منفصل مملوء مسبقا بمحلول بارد 0.9٪ AF بمقدار 2 مل.
4. كرر عملية الشطف ليصبح مجموع غسلتين باستخدام محلول رجفان أذيني طازج لكل شطف. بعد الشطف النهائي، قم بإزالة غطاء الغطاء من محلول الفواصل الصناعي واتركه ليجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة داخل غطاء بخار كيميائي لمدة تتراوح بين 20–30 دقيقة قبل تحليل DESI–MSI.
   ملاحظة: اشطف الخلايا بلطف لتجنب إزعاجها أثناء عملية الغسيل.

3. تصنيع واجهة MS معدلة تعتمد على FAIMS

1. قم بتفكيك محول مصدر مصدر الأيونيات في إلكترود FAIMS Pro للوصول إلى منطقة القطب الداخلي. تأكد من أن المحول متوافق مع مطياف الكتلة Thermo Orbitrap المزودة بتكوين واجهة FAIMS Pro.
2. إزالة مكونات أقطاب FAIMS بما في ذلك الأسلاك الداخلية، ومجموعات الأقطاب، وحلقات O، والهياكل الداخلية الداعمة. احتفظ بغلاف الغلاف الخارجي، وشحافة التركيب، ودبوس كشف الواجهة المطلوب للتعرف على مقياس طياف الكتلة للمحول.
3. تعديل الفتحة الدائرية باستخدام إجراءات التشغيل القياسية في ورش الماكينات. قم بتكبير الفتحة حتى توفر مساحة كافية حول مجموعة مدخل/قمع الأيونات البارزة من أوربيتراب.
4. قم بتنعيم وإزالة الأوصاف من الحافة المعالجة بعد القص. تأكد من أن الفتحة المعدلة تسمح بوضع محول الغلاف دون عوائق على مطياف الكتلة.
5. قم بتعديل طول ساقي محول الغلاف باستخدام المنشار. قم بقص الأرجل إلى طول نهائي يقارب 2 1/4 بوصة للسماح بالاتصال مع لوحة الخبز البصرية.
   ملاحظة: استخدم أدوات التشغيل المناسبة وتجنب إتلاف السلامة الهيكلية للهيكل المتبقي.
6. جهز لوحة تقوية بصرية من الألمنيوم (10 إنش × 12 إنش × 0.5 إنش، فتحات 1/4 إنش إلى 20 بوصة). ضع لوحة التبريد أفقيا تحت محول FAIMS المعدل.
7. استخدم حامل تثبيت لتوصيل محول FAIMS المعدل بلوحة التبريد البصرية. قم بقص الحوامل حسب الحاجة لتقليل الوزن والسماح بوضع اللوح المناسب بالنسبة لمدخل أوربيتراب.
8. قم بتثبيت واجهة FAIMS المعدلة على لوحة التجميع البصرية باستخدام أجهزة تثبيت متوافقة ميكانيكيا مع نمط الفتحة القابلة للضغط 1/4"-20 على لوحة التجميع. ضمان استقرار التموضع أثناء تجارب التصوير.
   ملاحظة: تأكد من تثبيت الواجهة بشكل صارم لتقليل الاهتزاز أثناء حركة المسرح وجمع البيانات.
9. قم بقطع أخدود ضحل في لوحة الخبز البصرية مباشرة تحت منطقة اتصال غلاف FAIMS بشكل ماكين. حجم ووضع الأخدود لتوفير مساحة كافية للجلوس المستقر ومحاذاة غلاف FAIMS المعدل بالنسبة لمدخل أوربيتراب.
   ملاحظة: قم بحجم الأخدود ليتناسب مع قاعدة محول FAIMS وتحسين قابلية التكرار الموضعية.
10. محاذاة الواجهة المثبتة مع مدخل مطياف الكتلة. تأكد من أن الحواف المثبتة مثبتة تثبت بشكل صحيح على الجهاز وأن لوحة البرمجة البصرية تبقى مستوية تحت الواجهة.
11. تحقق من أن الفتحة الدائرية المعدلة توفر مساحة غير عوائق حول مجموعة مدخل/قمع أيونات أوربيتراب قبل تركيب رشاش DESI.

4. تجميع رشاش DESI وواجهة Orbitrap

1. ركب بخاخ DESI على الإعداد المدمج الذي يتكون من إطار FAIMS المخصص، ومرحلة XYZ المحركة، ومنظم الغاز، ولوح البرمجة البصري. استخدم مرحلة آلية تتحكم بها وحدة تحكم CONEX-MFACC.
2. عرف المحور x كاتجاه مسح النقطي من اليسار إلى اليمين، وعرف المحور y كاتجاه خطي من الأعلى إلى الأسفل. حدد موضع محور z قبل الالتقاط وحافظ عليه ثابتا أثناء التصوير.
3. استخدم نطاق حركة المسرح حوالي 1 مم في اتجاه x و1 مم في اتجاه y. لا تطبق حركة محور z أثناء الاستحواذ.
4. ضع بخاخ DESI بزاوية تقارب 70° بالنسبة لسطح العينة. ضع العينة مباشرة تحت الرشاش ووضع طرف الرشاش بالقرب من مدخل أوربيراب قدر الإمكان دون ملامسة جسدية.
5. قم بتوصيل معدن التأريض من DESI بمصدر أرضي تحت مطياف الكتلة. التحكم في حركة النقطي باستخدام برنامج التحكم في المرحلة (الشكل 1).
   ملاحظة: بخاخ DESI المستخدم في هذه الدراسة متوفر فقط للمستخدمين الذين يستخدمون أجهزة DESI–MSI.
6. استخدم وحدة تحكم مرحلة XYZ بمحرك لحركة المرحلة وتحديد المواقع. قم بتوصيل خط الجهد، وخط غاز النيتروجين، وخط المذيب، وخط التأريض قبل التشغيل.
7. تركيب أنبوب نقل أيونات من الفولاذ المقاوم للصدأ مصمم خصيصا (1/16 بوصة OD × 0.033 بوصة ID) مصمم ليتناسب مع مدخل مصدر أيونات Orbitrap. ضع أنبوب نقل الأيونات بحيث يتماشى مباشرة مع مدخل أوربيراب مع تمديده للخارج بما يكفي للسماح بالوصول غير المعوق إلى عمود DESI.
   ملاحظة: خصص أنبوب نقل الأيونات وفقا لتكوين مطياف الكتلة. تصنيع أنبوب نقل الأيونات باستخدام إجراءات التشغيل المناسبة.
8. استخدم أنبوب نقل أيونات بهندسة منحنية لتحسين تموضع رشاش DESI بالنسبة لسطح العينة ومدخل أوربيتراب.
9. محاذاة الرشاش بزاوية تقارب 70° بالنسبة لسطح العينة بحيث يتقاطع عمود رش DESI مع منطقة مدخل أوربيراب دون ملامسة سطح العينة.
10. تعريف عمود رش مستقر من خلال وجود أطياف كتلة مستقرة وقيم مستوى مطبع متسق (NL) أثناء الاستحواذ. قم بضبط وضع الرشاش حتى يتم ملاحظة إشارة أيونية مستقرة.
11. اضبط مسافة الرشاش إلى السطح إلى حوالي 1.0–1.5 مم كشرط بداية. قم بضبط موقع الرشاش يدويا مع مراقبة قيم NL لتحقيق أعلى إشارة أيونية مستقرة.

الشكل 1. إعداد تصوير مطياف الكتلة المتكامل بإزالة الامتصاص (DESI)–تصوير الطيف الكتلي (MSI) مرتبط بمطياف الكتلة Orbitrap. يتم تركيب رشاش DESI على منصة متكاملة تتكون من محول مطياف تنقل الأيونات الموجي غير المتماثل عالي الحقل (FAIMS)،  ومرحلة XYZ محركة، ومنظم غاز، ولوحة خبز بصرية. يتم توصيل المذيب باستخدام نظام كروماتوغرافيا نانوي سائل، ويتم تزويد غاز النيتروجين بحوالي 12 psi لتثبيت الرش. كما يوضح الشكل اتصال جهد التأين، وخط المذيب، وموقع الرشاش بالنسبة لمدخل أوربيتراب. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

5. ضبط ظروف توصيل المذيب والرش

1. تحضير مذيب رش طازج يتكون من الميثانول/الماء/حمض الفورميك (98:2:0.1، v/v/v) قبل تحليل DESI–MSI.
   ملاحظة: قد تستخدم أنظمة مذيبات متوافقة مع DEI أخرى، بما في ذلك المذيبات القائمة على الأسيتونيتريل ونسب مختلفة من الميثانول إلى الماء، بعد التحسين. تم استخدام حمض الميثانول/الماء/الفورميك (98:2:0.1، v/v/v) كشرط بدء قياسي في هذا البروتوكول لأنه وفر تكوين عمود مستقر وتقليل انتشار المذيبات وإشارات دهنية بوضع الأيون الموجب القابلة للتكرار خلال تجارب DESI–MSI أحادية الخلية.
   تحذير: الميثانول قابل للاشتعال وسام. حمض الفورميك يسبب التآكل. تعامل المذيبات في غطاء بخار كيميائي.
2. توصيل المذيب باستخدام نظام Ultimate 3000 nano-LC الذي يعمل كمضخة مذيب متساوية النفس عند 750 nL/min للتجارب المبلغ عنها. وصل مخرج nano-LC بخاخ DESI باستخدام أنبوب PEEK (1/16 بوصة OD × 0.005 بوصة ID).
3. تركيب عمود كربون 18 (مثل ببتيد nanoEase M/Z BEH؛ 130 أوغو، 1.7 ميكرومتر، 300 ميكرومتر × 150 مم) في خط لتوفير ضغط عكسي كاف لتكوين الرش المستقر عند معدلات تدفق منخفضة.
4. اضبط طريقة مطياف الكتلة على وضع الأيونات الموجب مع كشف أوربيتراب، جهد رش 0.85 كيلوفولت، دقة أوربيرتراب 120,000 عند م/z 200، ونطاق م/z بين 150–1200.
5. اضبط هدف AGC المعياري إلى 100٪، وأقصى وقت حقن إلى 100 مللي ثانية، وعدسة التردد اللاسلكي إلى 45٪، والمسح المجهري على 1. تعطيل عزل الرباعي الأقطاب وتجزئة المصدر.
6. تزويد غاز غلاف النيتروجين من مولد نيتروجين أو مصدر نيتروجين سائل عند حوالي 12 psi لتثبيت عمود رش DESI. استخدم ضغط التشغيل الابتدائي 12 psi وقم بإجراء تعديلات يدوية طفيفة فقط إذا لزم الأمر لتحسين قيم NL والحفاظ على طيف كتلة مستقر.

6. تنفيذ التصوير النقطي والتحكم في البكسل

1. حدد منطقة ذات اهتمام تحتوي على خلايا منفردة مرئية بصريا باستخدام الألواح الشبكية كمرجع. اختر خلايا معزولة مع فصل بصري واضح عن الخلايا المجاورة، وشكل ملتصق سليم، ولا يوجد تداخل واضح مع الحطام أو مجموعات الخلايا.
2. حدد منطقة الراستر باستخدام برنامج وحدة تحكم المرحلة Fance⁴⁶. اضبط حجم خطوة الراستر إلى 0.01 مم، وسرعة المسرح إلى 0.01 مم/ثانية، ووقت البقاء على 20 ثانية.
3. استخدم المسح النقطي من اليسار إلى اليمين عبر كل خط متبوعا بالتحرك إلى السطر التالي في اتجاه y. اضبط حجم الخطوة المتعامدة بين خطوط النقط النقطية إلى 10 ميكرومتر.
4. ضبط سرعة المرحلة وفقا لمعدل اكتساب أوربيراب لتحقيق بعد بكسل اتجاه المسح المطلوب (مثل حوالي 2.5–6.5 ميكرومتر). احسب بعد بكسل اتجاه المسح باستخدام العلاقة التالية: بعد بكسل اتجاه المسح = سرعة المرحلة × وقت الاكتساب لكل مسح.
5. باستخدام سرعة مرحلة 0.01 مم/ثانية (10 ميكرومتر/ث)، يمكنك التقاط 376 مسحا ضوئيا على مدى 102 ثانية لإنتاج زمن اكتساب يبلغ 0.271 ثانية لكل مسح وبعد بكسل في اتجاه المسح حوالي 2.7 ميكرومتر. مزامنة حركة المسرح واكتساب طيف الكتلة عن طريق ضبط توقيت اكتساب أوربيراب لأقصر قليلا من معايير توقيت حركة المسرح والإقامة المجمعة.
   ملاحظة: يتم تحديد بعد البكسل المتعامد بواسطة حجم الخطوة المبرمجة والقيود الفيزيائية والميكانيكية للمرحلة، بينما يحكم بعد اتجاه المسح سرعة المرحلة ومعدل اكتساب الطيف.
6. جمع بيانات التصوير عبر نطاق الكتلة المختار حتى اكتمال منطقة الراستر المحددة مسبقا. بالنسبة لمنطقة تصوير بحجم 1 مم × 1 مم يتم الحصول عليها باستخدام خطوة خطية بمقدار 0.01 مم وسرعة مرحلة 0.01 مم/ثانية، فإن إجمالي وقت الالتقاط هو حوالي 4–5 ساعات.
7. إنشاء ملفات بيانات RAW أثناء الاستحواذ وإيقاف الاستحواذ بعد إكمال إحداثيات النقطي x–y المحددة ومدة طريقة الأداة المقابلة. تحت ظروف وضع الأيون الموجب الموضحة هنا، عادة ما يولد كل خط نقطي ملف RAW بسعة حوالي 50 ميجابايت، مما ينتج عنه حوالي 5 جيجابايت بيانات إجمالية ل 101 خط راستر.

7. تسجيل الصورة من البصرية إلى MS

1. التقاط صور سbrightfield للخلايا في منطقة الشبكة المحددة بعد غسل وتجفيف AF وقبل الحصول على DESI باستخدام مجهر سbrightfield مزود بهدف 10×.
2. تحويل ملفات RAW إلى ملفات mzML باستخدام msConvert من ProteoWizard⁴⁸. حول ملفات mzML إلى صيغة imzML باستخدام محول imzML⁴⁹.
3. استخدم إعدادات تحويل المركز المركزي/الملف الشخصي المتوافقة مع تنسيق البيانات المكتسبة. قم بتحميل ملفات imzML مباشرة إلى METASPACE (https://metaspace2020.eu)⁵⁰ لعرض الصور.
4. لا تطبق التطبيع أو إزالة نقاط الاتصال أو تصحيحات إضافية لمعالجة الصور قبل التصور. قم بمحاذاة الصور البصرية وصور الميكروسوفت يدويا باستخدام معالم الشبكة كمراجع موقعية.
5. قم بتكبير الصورة البصرية باستخدام أبعاد الصورة المعروفة وتباعد الشبكة. يقوم بتراكب صورة التصلب المتعدد يدويا لتقييم التوافق بين مواقع الخلايا المرئية بصريا وإشارات الأيونات الموضعية.
6. تأكيد تحديد موقع الخلية المفردة من خلال التوافق البصري بين الخلايا المعزولة في صورة الحقل الساطع وتوزيعات أيونات التصلب المتعدد.

النتائج

ينتج التنفيذ الناجح لهذا البروتوكول مجموعات بيانات DESI–MSI حيث تتوافق خلايا منفردة محددة بصريا مكانيا مع إشارات أيونية جزيئية محلية (الشكل 2). تمكن صور المجهر الدقيقة التي تم الحصول عليها قبل تحليل DESI–MSI التعرف البصري على خلايا OVCAR-8 الفردية وتسهل تسجيل الصور من البصريات إلى MS باستخدام الانزلاق الغطاء الشبكي كمرجع موقعي. تظهر صور الأيونات الممثلة DESI–MSI توزيعات أيونية محلية ترتبط مكانيا بالخلايا الفردية المحددة في صورة الحقل الساطع المقابلة (الشكل 2A–2D).

الشكل 2. مقارنة بين مجهر الحقل الساطع ومؤشر MSI لخلايا OVCAR-8. (أ) صورة مجهرية بحقل برايتفيلد لخلايا OVCAR-8 تم الحصول عليها بتكبير 10×. (B–D) تم التقاط صور MS باستخدام DESI–MSI بحجم بكسل 5.5 ميكرومتر × 10 ميكرومتر. توزيعات الأيونات التمثيلية موضحة ل (B) m/z 317.111، (C) m/z 808.562، و(D) m/z 788.616. شريط المقياس = 50 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تولد الخلايا الفردية أطياف كتلة كاملة تحتوي على عدة أيونات وجزيئات صغيرة مرتبطة بالدهون. بدلا من الاعتماد على علامة جزيئية واحدة، تظهر كل خلية ملفا جزيئيا متعدد الأيونات يعمل كبصمة كيميائية. تظهر صور الأيونات التمثيلية عند m/z 317.111، m/z 808.562، وm/z 788.616 توزيعات جزيئية غير متجانسة عبر الخلايا المجاورة، مما يشير إلى تباين أيضي قابل للقياس على مستوى الخلية المفردة (الشكل 2B–2D). أشارت التعليقات المعتمدة على METASPACE إلى أن الأيونات التي تم اكتشافها عند m/z 808.562 وm/z 788.616 كانت مرتبطة بشكل أساسي بأنواع الدهون الفوسفاتيديلكولينية والفوسفاتيديل إيثانولامين، في حين أن m/z 317.111 كانت تتوافق مع عدة جزيئات صغيرة مرشحة وأنواع مرتبطة بالثنائي البتايد. تظهر هذه النتائج أن المنصة تتيح اكتشاف الخصائص الجزيئية الموقعة مكانيا من خلايا منفردة محددة بصريا تحت ظروف محيطة. تم تقديم نتائج إضافية، بما في ذلك الأنواع المشروحة بشكل مبدئي، والأنواع المحددة بالتصلب المتعدد/التصلب المتعدد، وصور التصلب المتعدد الممثلة، وأطياف الكتلة، في الدراسات^{السابقة 20}.

تتكون منصة DESI–MSI المدمجة من رشاش DESI، ومحول FAIMS معدل، ومرحلة XYZ بمحرك، ولوح تجمع بصري مركب بجانب مدخل أوربيتراب (الشكل 1). يتيح هذا الإعداد توصيل المذيب بشكل مستقر، والتحكم في حركة المرحلة، ومحاذاة عمود رش DESI مع مدخل مطياف الكتلة لتجارب التصوير أحادي الخلية المحيطة. يمكن أنبوب نقل الأيونات المخصص الموضح في الشكل 3 من نقل الأيونات بين منطقة مصدر DESI ومدخل أوربيتراب. تسهل هندسة الشعيرات الدموية المنحنية تحديد موقع رشاش DESI بالنسبة لسطح العينة ومنطقة السحب مع الحفاظ على نقل الأيونات غير المعوق.

الشكل 3. أنبوب نقل أيونات مخصص ل Orbitrap MSI. صورة لأنبوب نقل الأيونات المصنوع خصيصا المستخدم لربط بخاخ DESI بمطياف الكتلة Orbitrap Fusion Lumos. يظهر الشكل هندسة الشعيرات الدموية الناقلة المنحنية وتركيب التركيب المستخدم لنقل الأيونات خلال تجارب MSI أحادية الخلية المحيطة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

يوضح الشكل 4 محول FAIMS المعدل المدمج مع لوحة التخزين البصرية ومرحلة XYZ المحركة. تظهر الصورة العلوية (الشكل 4A) موقع المرحلة العينة والمحول المعدل بالنسبة لمدخل أوربيتراب، بينما تظهر الصورة السفلية (الشكل 4B) حوامل التثبيت ومجموعة المسرح المستخدمة لدعم منصة التصوير. الاستقرار الميكانيكي للتجميع المدمج مهم للحفاظ على حركة نقطية ثابتة وتقليل انحراف الموقع أثناء التقاط الصور.

الشكل 4. محول مطياف حركة الموجة غير المتماثل عالي الحقل (FAIMS) المدمج مع لوحة التنقل البصرية ومرحلة XYZ المحركة. (أ) العرض العلوي للمحول المعدل المركب بجانب مدخل أوربيتراب ومرحلة العينة. (ب) عرض الأسفل يظهر الحوامل المعدلة، ولوح التبريد البصري، وتجميع المرحلة الآلية XYZ المستخدم لدعم ومحاذاة منصة التصوير. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تمكن الدقة العالية من الكتلة التي يوفرها الكشف عبر أوربيراب من التمييز بين أنواع الدهون المتقاربة والمتساوية الضغط، مما يحسن الخصوصية الجزيئية وتباين الصورة مقارنة بالأنظمة ذات الدقة المنخفضة في الكتلة. يمكن تحقيق أبعاد بكسل صغيرة من خلال مزامنة سرعة المرحلة ومعدل اكتساب الطيف. على سبيل المثال، تم تحقيق أبعاد بكسل صغيرة مثل 2.7 ميكرومتر × 10 ميكرومتر باستخدام منصات أوربيراب سريعة الاكتساب ومعلمات نقطية محسنة⁴². يتيح التصوير المكاني عالي الدقة تحديد جزيئات الخلايا المتجاورة مع تقليل تداخل الإشارات بين المناطق الخلوية المجاورة.

تتميز تجارب DESI–MSI الناجحة بظروف رش مستقرة، وكثافة أيونات ثابتة عبر خطوط النقطة، وتحديد موقع مكاني للإشارات الجزيئية التي تتوافق مع الخلايا الفردية في الصورة البصرية. قد تؤدي التجارب غير المثالية إلى توزيعات أيونية منتشرة، أو انخفاض كثافة الإشارة، أو أنماط نقطية غير متسقة، أو فقدان التمركز الخلوي بسبب تكوين الرش غير المستقر، أو محاذاة غير صحيحة للرذاذ، أو انتشار مفرط للمذيبات، أو حركة عينة أثناء الاكتساب. تحسين محاذاة الرش، ومعدل تدفق المذيب، وسرعة المرحلة، وتحديد موقع العينة بعناية يحسن الدقة المكانية واستقرار إشارة الأيونات خلال تجارب التصوير على خلية واحدة.

المناقشة

يتيح هذا البروتوكول من استخدام DESI–MSI أحادي الخلية المحيط باستخدام مطياف الكتلة Orbitrap عالية الدقة من خلال دمج التحكم الدقيق في المرحلة، وتوصيل المذيبات على نطاق النانو، والاستهداف البصري، وتحليل الكتلة عالية الدقة المكانية. يعالج دمج هذه العناصر العديد من الحواجز التقنية التي حدت تاريخيا من تطبيق DESI–MSI على مستوى الخلية الواحدة. على وجه الخصوص، يمكن التحكم المنسق في استقرار الرش، وانتقال الأيونات، وتوقيت الاكتساب الكشف الموثوق للإشارات الجزيئية من أحجام أخذ عينات صغيرة جدا تتوافق مع الخلايا الفردية. عامل أساسي يتحكم في الأداء في هذا السير هو استقرار واحتواء عمود رش DESI. عند الدقة المكانية على مستوى الميكرومتر، يمكن أن تؤثر الاضطرابات الصغيرة في معدل تدفق المذيب أو ضغط الغاز أو وضع الرشاش بشكل كبير على مساحة العينة الفعالة. استخدام توصيل المذيبات على نطاق نانوي مع الضغط العكسي المناسب يحسن من استقرار الرش ويقلل من انتشار المذيبات، مما يعزز الدقة المكانية. بالإضافة إلى ذلك، فإن الحفاظ على مسافة وزاوية متسقة بين الرشاش والسطح أمر بالغ الأهمية لكفاءة التأين القابلة لإعادة إنتاجها. حتى الانحرافات الطفيفة في الهندسة يمكن أن تؤدي إلى تباين كبير في شدة الإشارة، خاصة عند تحليل عينات خلوية غير متجانسة. عمليا، تم تحسين ظروف رش DESI تجريبيا من خلال مراقبة إجمالي تيار الأيونات، والاستقرار الطيفي، وقيم NL (عادة حول 10⁵ إلى 10^{6) أثناء} الاكتساب. تم تحقيق جودة الإشارة القابلة للتكرار من خلال الضبط التكراري لموقع الرشاش، وثبات تدفق المذيب، وضغط الغاز، ومحاذاة عمود DESI بالنسبة لمدخل أوربيتراب.

تمثل كفاءة انتقال الأيونات قيدا رئيسيا آخر على مقياس الخلية الواحدة لأن وفرة التحليل منخفضة بطبيعتها داخل الخلايا الفردية. على هذه المقاييس المكانية، قد يصبح انتقال الأيونات الفعال قيدا عمليا أكبر من كفاءة التأين في بعض التطبيقات، لأن جزءا صغيرا جدا فقط من الأيونات المفككة يصل في النهاية إلى مدخل مطياف الكتلة. لذلك، فإن النقل الفعال للأيونات من منطقة أخذ العينات إلى مدخل مطياف الكتلة أمر ضروري. يوفر محول FAIMS المعدل المستخدم في هذا البروتوكول واجهة بين مصدر رش DESI ومطياف الكتلة الحراري، مما يسمح بالتوافق مع عدة نماذج أجهزة، بما في ذلك منصات سلسلة Orbitrap Tribrid وExploris وAstral. كما أن دمج محول FAIMS المعدل مع لوحة البرمجة البصرية يوفر الاستقرار الميكانيكي، مما يقلل من عدم المحاذاة أثناء تجارب التصوير الممتدة. التزامن بين حركة المسرح واكتساب الطيف الكتلي ضروري بنفس القدر لتحقيق دقة مكانية عالية. في DESI–MSI، يتم التحكم في بعد البكسل في اتجاه المسح بالعلاقة بين سرعة المرحلة ومعدل الاستحواذ، بينما يتم تعريف البعد المتعامد بحجم الخطوة المبرمج. التحكم الدقيق في هذه المعايير يتيح أخذ عينات دقيقة. نظرا لأن العديد من الخلايا الثديية تتراوح عادة بين حوالي 5–20 ميكرومتر قطرا، فإن أبعاد البكسل التي تقترب من بضعة ميكرومتر فقط مطلوبة لتقليل تداخل الإشارات بين الخلايا المجاورة وتحسين تحديد مواقع الخصائص الجزيئية في المناطق الخلوية الفردية. ومع ذلك، لا يتوافق حجم البكسل الاسمي بالضرورة مع البصمة الحقيقية لأخذ العينة، لأن تفاعل عمود المذيب مع سطح العينة يمكن أن يؤدي إلى انتشار جانبي وتداخل جزئي للإشارة بين البكسلات المجاورة. لذلك يجب تفسير أبعاد البكسلات المبلغ عنها في سياق الدقة المكانية الفعالة بدلا من التعريفات الهندسية البحتة. تم تصميم أنبوب نقل الأيونات المخصص المستخدم في هذه الدراسة وفقا لهندسة أنبوب نقل الأيون القياسي للحفاظ على خصائص انتقال الأيونات مع تمكين التكامل مع تكوين مصدر DESI.

تعد مطياف الكتلة العالية والدقة العالية التي توفرها أجهزة مطيافية الكتلة من أوربيراب ضرورية لحل الخليط المعقد من المستقلبات والدهون الموجودة داخل الخلايا الفردية. تم توضيح العديد من الميزات الجزيئية التي تم اكتشافها بشكل مبدئي باستخدام قياسات كتلة دقيقة وتحليل METASPACE. نظرا لأن تعيينات المرشحين المتعددة قد تتوافق مع قيمة m/z واحدة مقاسة، فإن التحقق الإضافي من MS/MS واستراتيجيات تأكيد جزيئية متعامدة قد تعزز التعرف الجزيئي في الدراسات المستقبلية. في وضع الأيونات الموجبة، غالبا ما تهيمن أنواع الفسفوليبيدات على أطياف DESI ذات قيم m/z متقاربة أو متساوية الضغط. يتيح الكشف عالي الدقة بواسطة أوربيراب التمايز بين هذه الأنواع، مما يحسن الخصوصية الجزيئية ويقلل من الغموض الطيفي. تعد هذه القدرة مهمة بشكل خاص في تحليلات الخلايا الواحدة، حيث قد يؤدي الاعتماد على عدد محدود من الأيونات إلى سوء تفسير التغاير الخلوي. تشير هذه القدرة على التكيف إلى أن استراتيجيات مماثلة قد تكون قابلة للتطبيق على منصات مطيافية الكتلة الأخرى باستخدام واجهات مقابلة مع تعديلات مناسبة. على الرغم من هذه المزايا، يجب النظر في عدة قيود. أولا، مصدر DESI المستخدم في العمل الحالي متاح فقط للمستخدمين الذين لديهم أنظمة DESI–MSI، وبالتالي قد يكون بناء أنظمة DESI spr/Orbitrap محدودا بتوفر مصادر DESI. ومع ذلك، يمكن أيضا تطبيق أجهزة DESI بديلة، بما في ذلك DEFFI، لدراسات MSI عالية الدقة^{المكانية 42,47}. ثانيا، يتطلب تنفيذ هذه المنصة تخصيصا كبيرا، بما في ذلك تصنيع واجهات الأجهزة وتصنيع مكونات التثبيت. قد تحد هذه المتطلبات من إمكانية الوصول للمختبرات التي لا تملك خبرة في تطوير الأجهزة أو تصنيع الأجهزة الميكانيكية. في التطبيق الحالي، خدم غلاف واجهة FAIMS كمنصة ميكانيكية مريحة لتثبيت مجموعة رشاش DESI بالنسبة لمدخل أوربيتراب. وبالتالي، فإن تنفيذ التكوين الموصوف أكثر عملية للمختبرات التي لديها إمكانية الوصول إلى أنظمة أوربيراب المتوافقة مع FAIMS ودعم التشغيل الآلي الأساسي. ومع ذلك، يمكن تحقيق المفهوم الأوسع للربط الآلي لمصادر DESI مع مداخل أوربيراب باستخدام تصاميم بديلة دون تعديل عتاد واجهة FIMS. ثالثا، رغم أن معدلات تدفق المذيبات المنخفضة تحسن الحبس المكاني، إلا أنها قد تقلل أيضا من العائد الأيوني الكلي، مما يتطلب تحسينا دقيقا لتحقيق توازن بين الحساسية والدقة المكانية.

اعتبار مهم آخر هو إمكانية إزالة التمركز التحليلي أثناء أخذ العينات. على الرغم من أن DESI يعمل في ظروف محيطة ولا يتطلب تطبيق مصفوفة، إلا أن تفاعل قطرات المذيب مع سطح العينة يمكن أن يؤدي إلى إعادة توزيع المحللات، خصوصا للأنواع عالية الذوبان. لذلك، فإن تقليل حجم المذيب وتحسين ظروف الرش أمران حاسمان للحفاظ على السلامة المكانية على مستوى الخلية الواحدة. وبالمثل، يمكن لإجراء الغسيل باستخدام فورمات الأمونيوم المتساوية التوتر أن يقلل من كبت الأيونات المرتبطة بالملح مع الحفاظ على سلامة الخلايا والحفاظ على أنواع الخلايا، كما تم الإبلاغ عنه سابقا في سير عمل التصلب المتعدد الأحادي الخلية⁵.

قد تحسن التطورات المستقبلية أداء هذه المنصة وقابليتها للتطبيق. على سبيل المثال، يمكن التكامل مع أنظمة جمع البيانات الأسرع أن يتيح أحجام بكسل فعالة أصغر وتجارب MSI ذات معدل نقل أعلى. قد يقلل تطبيق أنظمة محاذاة آلية أو التحكم في التغذية الراجعة في الوقت الحقيقي من التغير ويحسن قابلية التكرار. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يعزز دمج هذا النهج مع تقنيات تكميلية، مثل التصوير الفلوري أو استراتيجيات الوسم المستهدفة، من تعزيز تحديد نوع الخلايا وتمكين التحليلات متعددة الوسائط.

بعيدا عن الاعتبارات التقنية، فإن هذه المنصة لها آثار واسعة على البحث البيولوجي والطبي الحيوي. تتيح القدرة على توصيف الملفات الجزيئية على مستوى الخلايا الفردية في الظروف المحيطة فرصا جديدة لدراسة التباين الخلوي في الأنظمة المعقدة. تم تطبيق DESI–MSI بنجاح بالفعل على مستوى الأنسجة في دراسات البيئات الدقيقة للأورام، والأمراض العصبية، والتفاعلات بين المضيف والممرض، ومجموعات الخلايا المقاومة للأدوية 12,15,16,35. قد يؤدي توسيع DESI–MSI إلى مستوى الخلية المفردة إلى تحسين القدرة على تحديد التباين الكيميائي الموضعي بين الخلايا المجاورة، وتحديد مجموعات خلوية نادرة، واكتشاف علامات جزيئية قد تكون مخفية في قياسات الأنسجة الكبيرة. ومع ذلك، أجريت هذه الدراسة باستخدام نموذج مبسط لزراعة الخلايا أحادية الطبقة، وهناك حاجة إلى دراسات إضافية لإثبات التوافق مع أنظمة بيولوجية معقدة أخرى، بما في ذلك نماذج الخلايا المختلفة، والأنسجة، والأورعضويات، والثقافات ثلاثية الأبعاد. قد يوفر سير العمل الحالي أساسا لتوسيع قياسات DESI عالية الدقة المكانية نحو بيئات بيولوجية متزايدة التجانس بعد مزيد من التحقق والتحسين. نظرا لأن هذه الطريقة تحافظ على السياق المكاني مع توفير معلومات جزيئية مفصلة، يمكن أن تكون جسرا بين الأساليب المعتمدة على التصوير وأنظمة الأوميكس. باختصار، يضع هذا البروتوكول إطارا مرنا وقابلا للتكيف لتحقيق DESI–MSI بدقة خلية واحدة على مطياف الكتلة Orbitrap. من خلال معالجة التحديات الرئيسية المتعلقة بكفاءة التأين، ونقل الأيونات، والتحكم المكاني، ودقة الكتلة، يمكن هذا النهج من توصيف جزيئي مفصل للخلايا الفردية. بينما هناك حاجة لمزيد من التحسين والتحقق من الصحة، توفر المنهجية أساسا لتوسيع استخدام MSI المحيط في دراسات الأيض الخلوي الواحد والمكاني.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
−80 °C freezer	Eppendorf New Brunswick	U700	Storage of biological samples before preparation.
6" vertical bracket for breadboards, 1/4"-20 holes (2 pieces)	Millipore Sigma	VB01A	Mechanical support and stabilization of the custom sprayer-mount assembly
Acetonitrile	Fisher Chemical	240744	Organic solvent for DESI-compatible solvent preparation and optimization
Ammonium formate	Thermo Fisher Scientific	401152500	Preparation of isotonic ammonium formate wash buffer for cell washing prior to DESI–MSI
Brightfield microscope	Fisher Scientific	12575252	Optical imaging and visualization of adherent cells before DESI–MSI acquisition
C18 column	Waters	186009259	In-line backpressure generation for stable nano-flow DESI spray formation
Copper wire	N/A	N/A	Electrical connection and grounding during sprayer-mount fabrication
DESI XS sprayer	Waters	700014033	Ambient DESI ionization source for single-cell DESI–MSI experiments
Epoxy resin	Devcon	20945	Mechanical stabilization and fixation of custom sprayer-mount components
FAIMS Pro electrode ion source housing adaptor	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Modification and fabrication of the custom Orbitrap-compatible DESI interface
Formic acid	Ward’s Science	470301-120	Acid modifier for DESI spray solvent preparation
Methanol	Fisher Chemical	A456-4 Optima	Organic solvent for DESI spray solvent preparation
Gas regulator	Millipore Sigma	23831-U	Regulation of nitrogen sheath-gas pressure during DESI operation
Gridded glass coverslip	Ibidi	10817	Cell culture substrate and positional reference for optical-to-MS image registration
Grounding wire	N/A	N/A	Electrical grounding connection for DESI sprayer and interface assembly
Incubator	HeraCell	51026282	Maintenance of mammalian cell cultures under controlled temperature and CO2 conditions
LC/MS-grade water	Thermo Fisher Scientific	W6500	Preparation of ammonium formate wash buffer and DESI spray solvent
METASPACE platform	METASPACE	https://metaspace2020.eu	Cloud-based MS image visualization and spatial metabolomics data analysis
Modified FAIMS interface	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Customized interface for coupling the DESI sprayer with Orbitrap mass spectrometers
Motorized XYZ stage	Newport Corporation	CONEX-MFACC	Controlled raster-stage movement during DESI–MSI acquisition
MycoAlert PLUS mycoplasma detection kit	Lonza	LT07-703	Routine monitoring of mycoplasma contamination in cultured cells
Nano-liquid chromatography system	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	Nano-flow solvent delivery system for DESI spray generation
Optical breadboard	Thorlabs	MB1012	Mechanical support platform for DESI sprayer and modified interface assembly
Orbitrap Fusion Lumos mass spectrometer	Thermo Fisher Scientific	UVPD	High-resolution Orbitrap mass spectrometer for DESI–MSI data acquisition
PEEK tubing	IDEX	1535	Solvent-line connection between nano-LC system and DESI sprayer
Penicillin–streptomycin	Gibco	15140-122	Antibiotic supplement for mammalian cell culture medium
Phosphate-buffered saline (PBS)	VWR	0780-50L	Washing solution for cultured cells during passaging
RPMI-1640 medium	Gibco	11875093	Mammalian cell culture medium for maintenance of OVCAR-8 cells
Stage-control software	Lasken Group	Version 6	Software control of raster scanning, stage movement, and imaging acquisition parameters
Stainless steel tubing	MicroGroup	316H16H	Custom-fabricated ion transfer tubing (1/16" OD, 0.033" ID) for Orbitrap interface integration
Syringe, 250 µL	Hamilton	1725LTN250UL	Solvent loading and nano-flow solvent delivery
Synthetic fetal bovine serum (FBS)	HyClone	SH3006603	Serum supplement for preparation of complete mammalian cell culture medium
TC20 Automated Cell Counter	Bio-Rad Laboratories	1450102EDU	Automated counting of cultured cells before seeding on coverslips
Tissue culture dish, 100 mm	Fisher Scientific	FB012924	Expansion and maintenance of adherent OVCAR-8 cell cultures
Trypsin-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072	Enzymatic detachment of adherent cells during passaging
UV-curing resin	Prime Dental	6.03	Fabrication and stabilization of custom DESI sprayer-mount components
Xcalibur software	Thermo Fisher Scientific	4.7	Instrument control, Orbitrap method setup, and mass spectral data acquisition