مقالة منهجية

إنشاء مقايسة تقرير STAT6 لفحص السموم البيئية التي تؤثر على التهاب الممرات الهوائية التحسسي

108 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71694

⸱

أغسطس 25, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء والتحقق من صحة مقايسة مراسلة لوسيفيراز STAT6 مستقرة في الخلايا الظهارية للمجاري التنفسية البشرية. تتيح هذه الطريقة الفحص الفعال للمواد السامة البيئية ومكونات تلوث الهواء التي تعدل نشاط STAT6 تحت ظروف in vitro مضبوطة.

الملخص

يُعد الالتهاب التحسسي للمجاري التنفسية المرتبط بتلوث الهواء مصدر قلق متزايد للصحة العامة. وقد تعمل الإنترلوكين-4 (IL-4) والإنترلوكين-13 (IL-13)، اللذان ينشطان مسار محول الإشارة ومنشط النسخ 6 (STAT6)، وهو وسيط مركزي في الالتهاب التحسسي للمجاري التنفسية، على تعديل السمية التنفسية للملوثات. تصف الدراسة الحالية إنشاء والتحقق من صحة مقايسة تقريرية لـ STAT6 باستخدام اللوسيفيراز في الخلايا الظهارية للمجاري التنفسية البشرية لتقييم السموم البيئية التي تعدل إشارات STAT6. تم نقل تقرير لوسيفيراز مستجيب لـ STAT6 إلى خلايا الظهارة الشعبية البشرية 16HBE14o− باستخدام ناقل فيروسي بطيء، تلا ذلك تحسين عملية الاختيار باستخدام البوروميسين وتحديد تعددية العدوى، ثم العزل أحادي النسيلة عن طريق التخفيف المحدود. تم اختيار مستنسخ مستقر يتميز بحث قوي وقابل للتكرار عبر الممرات المتتالية. وتم التحقق من استجابة التقرير عن طريق التحفيز بـ IL-4/IL-13، كما تم تأكيد الاعتماد على STAT6 باستخدام مثبطات انتقائية لـ STAT6 و STAT5 و STAT3. تم قياس أداء المقايسة عن طريق تحليل عامل Z′، والذي أشار إلى فصل إشارات قابل للتكرار. علاوة على ذلك، طُبقت المقايسة على مكونات فردية لتلوث الهواء، حيث أدى benzo[b]fluoranthene والمواد الجسيمية إلى زيادة نشاط تقرير STAT6 بشكل ملحوظ. توفر هذه الطريقة نهجاً قابلاً للتوسيع لقياس نشاط STAT6 في الخلايا الظهارية للمجاري التنفسية ولتحديد أولويات السموم البيئية التي تعدل إشارات التحسس في المجاري التنفسية.

المقدمة

يمثل تلوث الهواء أحد أكثر تحديات الصحة العامة العالمية إلحاحاً، لما له من آثار صحية عميقة وتداعيات اجتماعية واقتصادية. ويُصنف حالياً كثاني أهم عامل خطر يؤدي إلى الوفاة، حيث يتسبب في 8.1 مليون حالة وفاة سنوياً1,2,3. ومن بين الملوثات المنقولة جواً، تشكل الجسيمات الدقيقة التي يقل قطرها عن 2.5 ميكرومتر (PM2.5) الخطر الصحي الأكبر نظراً لقدرتها على التغلغل بعمق في الجهاز التنفسي4,5. وقد ارتبط التعرض المرتفع لـ PM2.5 بشكل مستمر بتدهور وظائف الرئة وزيادة معدلات دخول المستشفيات بسبب الأمراض التنفسية6. كما تشهد معدلات انتشار الأمراض الالتهابية التحسسية، بما في ذلك الربو والتهاب الأنف التحسسي والتهاب الجلد التأتبي، زيادة في جميع أنحاء العالم، وترتفع بشكل غير متناسب في المدن الكبرى شديدة التلوث4.

تحدث أمراض الممرات الهوائية التحسسية، مثل الربو التأطفي، بشكل أساسي من خلال استجابة التهابية من النوع 2، وتتميز بارتفاع مستويات السيتوكينات interleukin‑4 (IL‑4) و interleukin‑13 (IL‑13) وتنشيط مسار إشارات Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6)7. وفي الخلايا الظهارية للممرات الهوائية، تؤدي عملية فسفرة STAT6 التي يحفزها IL-4 و IL-13 إلى تعزيز الإفراز المفرط للمخاط واختلال الحاجز الظهاري، مما يجعل STAT6 وسيطاً مركزياً في اعتلالات الممرات الهوائية التحسسية وهدفاً علاجياً هاماً8,9. وتشير الأدلة التجريبية من النماذج الفأرية إلى أن التعرض لـ PM2.5 وثاني أكسيد الكبريت يزيد من إشارات STAT6 ويفاقم التهاب الممرات الهوائية التحسسي10,11. ومع ذلك، لم يتم تقييم ما إذا كانت مكونات تلوث الهواء الفردية تؤثر بشكل مباشر على النشاط النسخي لـ STAT6 في الخلايا الظهارية للممرات الهوائية البشرية بشكل منهجي.

يتكون تلوث الهواء من خليط كيميائي معقد من المكونات، بما في ذلك المواد الجسيمية، والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAHs)، والمعادن الثقيلة، والأملاح غير العضوية، والتي لا تزال مساهماتها الفردية في تنشيط STAT6 في الممرات الهوائية غير محددة بدقة12,13. إن المنهجيات الحالية لقياس نشاط STAT6 في الخلايا الظهارية للممرات الهوائية، مثل مقايسات الفسفرة النهائية أو أنظمة المراسل القائمة على عفن التحول المؤقت، ليست مهيأة للفحص الكيميائي واسع النطاق. وبناءً على ذلك، فإن وجود منصة مراسل STAT6 خلوية مستقرة في الخلايا الظهارية للممرات الهوائية البشرية من شأنه أن يوفر أداة قابلة للتوسع لتحديد المركبات المشتقة من التلوث التي تعدل إشارات الحساسية في الممرات الهوائية. يصف هذا البروتوكول تطوير والتحقق من صحة مقايسة مراسل لوسيفيريز STAT6 مستقرة في خلايا الممرات الهوائية الظهارية 16HBE14o−، مما يتيح التقييم الكمي لتنشيط STAT6 من أجل الفحص المنهجي للعينات البيئية والسموم الكيميائية الفردية.

البروتوكول

لا ينطبق الحصول على موافقة أخلاقية للمشاركين البشريين لأن هذه الدراسة استخدمت خط الخلايا الظهارية الشعبية البشرية 16HBE14o− المعتمد.

1. إنتاج خلايا 16HBE14o− خلايا تعبر باستقرار عن مراسل نشاط STAT6

ملاحظة: يقدم الشكل 1 نظرة عامة على سير العمل.

  1. زراعة الخلايا
    ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الإجراءات باستخدام تقنية التعقيم داخل كابينة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية (Class II biosafety cabinet). تأكد من خلو الخلايا من تلوث الميكوبلازما قبل الاستخدام.
    1. حافظ على خلايا 16HBE14o− في وسط أساسي أدنى (minimum essential medium) مكمل بـ 10% مصل جنين البقر و1% بنسلين-ستريبتومايسين. حضن الخلايا عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% CO2، واستبدل وسط الزراعة كل يومين.
    2. اترك الخلايا حتى تصل إلى حالة تلاقي تقريبية بنسبة 80%. اشفط وسط الزراعة واغسل الطبقة الخلوية أحادية الطبقة مرة واحدة باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات (phosphate-buffered saline).
    3. أضف كمية كافية من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات لتغطية الطبقة الخلوية أحادية الطبقة وحضن الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 °C. اشفط المحلول الملحي المنظم بالفوسفات تماماً.
      ملاحظة: استخدم تحضين المحلول الملحي المنظم بالفوسفات لمدة 20 دقيقة لتسهيل تفكيك الوصلات الخلوية المحكمة التي تشكلها هذه السلالة الخلوية. تمثل هذه المدة تعديلاً تم تحسينه داخلياً.
    4. أضف كمية كافية من محلول تريبسين-إيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك (trypsin–ethylenediaminetetraacetic acid) بتركيز 0.25% لتغطية الطبقة الخلوية أحادية الطبقة. حضن الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 °C.
      ملاحظة: راقب انفصال الخلايا باستخدام مجهر ضوئي مقلوب. انقر بلطف على وعاء الزراعة عند الضرورة لتسهيل الانفصال.
    5. أضف ما يقرب من خمسة أضعاف حجم محلول التريبسين-إيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك من وسط الزراعة الكامل لإنهاء النشاط الإنزيمي. استخدم الماصة لخلط المعلق بلطف للحصول على معلق من الخلايا المفردة.
    6. انقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بطرد المعلق مركزياً عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 25 °C.
    7. اشفط الطافي بعناية وأعد تعليق كتلة الخلايا في وسط زراعة جديد. قم بتجانس المعلق بلطف وتأكد من وجود معلق من الخلايا المفردة تحت مجهر ضوئي مقلوب.
    8. قم بعد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) واضبط تركيز الخلايا وفقاً للكثافة المطلوبة للتجربة اللاحقة. استخدم نسبة تقسيم روتينية 1:8.
      ملاحظة: ارجع إلى الجدول التكميلي 1 والجدول التكميلي 2 لمعرفة مساحات النمو لأوعية الزراعة والأحجام المقابلة من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات ومحلول التريبسين-إيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك.
  2. تحديد السُمّية الخلوية المستحثة بالبوروميسين
    ملاحظة: اختر المضاد الحيوي وفقاً لجين المقاومة الذي يشفره التركيب الفيروسي الغدي (lentiviral construct).
    1. ازرع خلايا 16HBE14o− بكثافة 2 × 104 خلية لكل بئر في طبق زراعة مكون من 96 بئراً يحتوي على 100 µL من وسط الزراعة الكامل في كل بئر. حضن الخلايا طوال الليل.
    2. استبدل وسط الزراعة بوسط جديد يحتوي على بوروميسين بتراكيز نهائية تبلغ 0.5 أو 1 أو 2 أو 4 µg/mL. جهز أطباقاً منفصلة للنقاط الزمنية 24 و48 و72 ساعة.
    3. أضف 5 µL من كاشف عد الخلايا إلى كل بئر. حضن الطبق لمدة ساعة واحدة عند 37 °C.
      ملاحظة: تجنب إدخال فقاعات الهواء في الآبار، لأنها قد تتداخل مع قياسات الامتصاص.
    4. قس الامتصاص عند 450 nm باستخدام 650 nm كطول موجي مرجعي. رج الطبق لمدة 15 ثانية مباشرة قبل تسجيل الامتصاص في وضع نقطة النهاية (endpoint mode).
    5. احسب حيوية الخلايا14 باستخدام المعادلة 1.
      معادلة حيوية الخلايا، OD450-650 للعينات والضابط والفراغ؛ صيغة لتحليل المقايسة الحيوية.
      حيث:
      معادلة الامتصاص OD450-650، طريقة الطرح، المستخدمة في القياس الطيفي، صيغة.
      صيغة الكثافة الضوئية (OD450-650) لتحليل الامتصاص في تجارب الطيف.
      معادلة الكثافة الضوئية، OD450-650blank=OD450blank-OD650blank، لتحليل البيانات الطيفية.
      ملاحظة: حدد العينة الضابطة على أنها خلايا غير معالجة، والفراغ على أنه وسط خالٍ من الخلايا يحتوي على كاشف المقايسة. اختر أدنى تركيز من البوروميسين الذي يقضي تماماً على الخلايا غير المنقولة جينياً خلال 48-72 ساعة.
  3. تحديد تعدد العدوى الأمثل (optimal multiplicity of infection)
    تنبيه: تعامل مع الجسيمات الفيروسية الغدية تحت ظروف المستوى الثاني من السلامة البيولوجية (Biosafety Level 2) في مرفق مسجل للمستوى الثاني من السلامة البيولوجية ووفقاً للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية. قم بإجراء جميع عمليات مناولة الفيروسات داخل كابينة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية. غطِ المستهلكات الملوثة بالفيروس والانسكابات بمحلول تبييض بتركيز 10% لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التخلص منها كنفايا ذات خطر بيولوجي.
    ملاحظة: قم بتحسين تعدد العدوى (multiplicity of infection) لأنه يؤثر مباشرة على كفاءة النقل الجيني.
    1. احسب الحجم المطلوب من المخزون الفيروسي الغدي15 باستخدام المعادلة 2.
      صيغة حساب MOI، نسبة الجسيمات الفيروسية إلى الخلايا المستهدفة، معادلة البيولوجيا الجزيئية.
      حيث:
      صيغة عيار الفيروس الوظيفي، T_virus = TU/mL، معادلة لتحليل بيانات أبحاث علم الفيروسات.
      معادلة حجم الفيروس، V_virus=حجم الفيروس بالملل، صيغة، دراسة فيروسية، طريقة الحساب
      توازن استاتيكي، معادلة: N_cells = عدد الخلايا المستهدفة، مخطط للاستخدام في الأبحاث التعليمية.
      ملاحظة: كان العيار الوظيفي للمخزون الفيروسي الغدي المراسل لـ STAT6 luciferase المستخدم في هذا البروتوكول 5 × 107 وحدة نقل/مل. بالنسبة لـ 2 × 104 خلية مستهدفة، فإن MOI قدره 20 يقابل 8 µL من المخزون الفيروسي الغدي لكل بئر. يجب إعادة حساب حجم الفيروس للمحضرات الفيروسية ذات العيارات المختلفة.
    2. ازرع خلايا 16HBE14o− بكثافة 2 × 104 خلية لكل بئر في طبق أبيض بـ 96 بئراً وقاعدة شفافة يحتوي على 100 µL من وسط الزراعة الكامل في كل بئر. حضن الخلايا طوال الليل حتى تصل إلى تلاقٍ تقريبي بنسبة 80%.
    3. استبدل وسط الزراعة بوسط جديد يحتوي على 5 µg/mL من البوليبرين (polybrene) وفيروس STAT6 luciferase reporter الغدي بـ MOIs تبلغ 1 و5 و10 و20. قم بتضمين بئر ضابط وهمي (mock-control) غير منقول جينياً لا يحتوي على فيروس غدي.
      ملاحظة: احسب الحجم الفيروسي الغدي المطلوب لكل MOI من العيار الوظيفي للمخزون.
    4. حضن الخلايا مع الجسيمات الفيروسية الغدية لمدة 48 ساعة. استبدل وسط النقل الجيني بوسط زراعة جديد وحضن الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية.
    5. استبدل وسط الزراعة بوسط جديد يحتوي على إنترلوكين-4 وإنترلوكين-13 بتركيز 10 ng/mL لكل منهما. حضن الخلايا لمدة 24 ساعة.
    6. أضف 25 µL من كاشف مقايسة اللوسيفيراز (luciferase assay reagent) إلى كل بئر16. احمِ الطبق من الضوء وحضنه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    7. رج الطبق خطياً لمدة 20 ثانية. قس التألق الحيوي في وضع نقطة النهاية باستخدام قراءة كاملة للطبق وإعداد كسب (gain setting) قدره 120.
      تنبيه: سجل التألق الحيوي في غضون ساعة واحدة من إضافة كاشف مقايسة اللوسيفيراز لالتقاط أقصى إشارة. اتبع تعليمات السلامة والمناولة الخاصة بالشركة المصنعة للكاشف.
      ملاحظة: استخدم نفس قارئ الأطباق الدقيقة متعدد الأنماط وإعدادات الاستحواذ لجميع قياسات الامتصاص والتألق الحيوي.
  4. اختيار الخلايا المنقولة جينياً
    1. ازرع خلايا 16HBE14o− بكثافة 2 × 105 خلية/مل في طبق زراعة مكون من 24 بئراً. حضن الخلايا طوال الليل.
    2. استبدل وسط الزراعة بوسط جديد يحتوي على فيروس STAT6 luciferase reporter الغدي بـ MOI قدره 20 و5 µg/mL من البوليبرين. حضن الخلايا لمدة 48 ساعة.
    3. استبدل وسط النقل الجيني بوسط زراعة جديد. حضن الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية.
    4. اشفط وسط الزراعة وأضف وسطاً جديداً يحتوي على 1 µg/mL من البوروميسين. حضن الخلايا لمدة 5 أيام، مع استبدال وسط الاختيار كل يومين.
    5. استمر في عملية الاختيار بالبوروميسين حتى يتم القضاء على جميع الخلايا في البئر الضابط الوهمي غير المنقول جينياً.
      ملاحظة: اترك 24 ساعة على الأقل بعد النقل الجيني قبل تطبيق الاختيار بالمضاد الحيوي للسماح بالتعبير عن جين المقاومة.
  5. عزل المستنسخات الخلوية المفردة عن طريق التخفيف المحدود
    1. قم بفصل وعد خلايا STAT6 reporter المختارة بالبوروميسين. جهز معلقاً من الخلايا المفردة بكثافة 5 خلايا/مل عن طريق التخفيف المتسلسل.
      ملاحظة: امنع تكتل الخلايا أثناء التخفيف. مرر المعلق عبر مصفاة خلايا عند الضرورة.
    2. وزع 200 µL من معلق الخلايا في كل بئر من طبق زراعة مكون من 96 بئراً للحصول على كثافة متوسطة تبلغ حوالي خلية واحدة لكل بئر.
    3. افحص كل بئر باستخدام مجهر مقلوب في غضون 24 ساعة وحدد الآبار التي تحتوي على خلية واحدة. استبعد الآبار التي تحتوي على أكثر من خلية واحدة أو بؤر خلوية متعددة منفصلة مكانياً.
    4. راقب الآبار المختارة خلال الأسبوع الأول لتأكيد النمو المستنسخ. استبدل وسط الزراعة كل 3 أيام.
    5. قم بتوسيع كل مستنسخ في طبق 96 بئراً الأصلي لمدة 20 يوماً تقريباً أو حتى تصل الخلايا إلى حالة التلاقي. انقل كل مستنسخ بالتتابع إلى طبق مكون من 6 آبار ثم إلى قارورة زراعة T-25.
      ملاحظة: ازرع الخلايا في طبق 6 آبار لمدة 6 أيام تقريباً قبل نقلها إلى قارورة T-25، أو انقلها عندما تصل إلى حالة التلاقي المناسبة.
      نقطة توقف: استمر في توسيع المستنسخات أو قم بحفظها بالتبريد بكثافة 1 × 106 خلية لكل أنبوب في 1 مل من وسط الحفظ بالتبريد الذي يحتوي على 90% مصل جنين البقر و10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد.
    6. ازرع كل مستنسخ موسع بكثافة 2 × 105 خلية/مل في طبق أبيض بـ 96 بئراً وقاعدة شفافة. حضن الخلايا طوال الليل.
    7. استبدل وسط الزراعة بوسط جديد يحتوي على IL-4 وIL-13 بتركيز 10 ng/mL لكل منهما. حضن الخلايا لمدة 24 ساعة.
    8. قس نشاط اللوسيفيراز كما هو موضح في الخطوات 1.3.6-1.3.7. قارن نشاط المراسل المستحث بين المستنسخات الفردية.
    9. كرر مقايسة اللوسيفيراز عبر زيادة عدد ممرات الخلايا. اختر المستنسخات التي تحافظ على نشاط مراسل ثابت مستحث بالسيتوكينات عبر الممرات.
      ملاحظة: تم اختيار المستنسخ 3 بسبب تألقه الحيوي القاعدي المنخفض وقدرته على الحفاظ على إشارة تنشيط ثابتة مستحثة بالسيتوكينات عبر الممرات المتسلسلة.

2. إنشاء والتحقق من صحة مقايسة مراسل نشاط STAT6

ملاحظة: يقدم الشكل 2 نظرة عامة على سير العمل.

  1. التحقق من صحة مقايسة مراسل نشاط STAT6
    1. قم بزراعة خلايا مراسل STAT6 بكثافة 2 × 105 cells/mL في طبق أبيض بـ 96 بئر ذو قاع شفاف، باستخدام 100 µL من وسط استزراع كامل لكل بئر. قم بتحضين الخلايا طوال الليل.
    2. استبدل وسط الاستزراع بوسط جديد يحتوي على IL-4 و IL-13 بتركيزات نهائية تبلغ 10 ng/mL لكل منهما. أضف المثبطات الانتقائية في وقت واحد كما يلي: 100 nM من AS1517499 (مثبط STAT6)، أو 2.5 µM من AC-4-130 (مثبط STAT5)، أو 2.5 µM من Stattic (مثبط STAT3).
    3. أضف ضابطاً للمذيب يحتوي على 0.1% من dimethyl sulfoxide (DMSO). قم بتحضين الخلايا لمدة 24 h.
    4. حدد حيوية الخلايا باستخدام مقايسة عد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 1.2.3-1.2.5.
    5. قم بقياس نشاط luciferase كما هو موضح في الخطوات 1.3.6-1.3.7.
    6. قم بتطبيع إشارة التألق الحيوي لكل بئر بناءً على حيوية الخلايا المقابلة لها. عبّر عن القيم المُطبعة بالنسبة لمجموعة الضبط المعالجة بالسيتوكينات.
      ملاحظة: قد يؤدي انخفاض حيوية الخلايا إلى تقليل إشارة luciferase بشكل مستقل عن نشاط STAT6. لا تقم بتفسير نشاط المراسل إلا بعد التأكد من أن حيوية الخلايا مقبولة.
  2. تقييم متانة المقايسة
    1. قم بتقييم متانة المقايسة عن طريق حساب عامل Z′-factor باستخدام 21 بئراً مكررة لكل من مجموعتي الضبط الموجبة والسالبة.
    2. احسب عامل Z′-factor باستخدام المعادلة 3.
      معادلة التوازن الاستاتيكي، صيغة Z-factor، التعبير الرياضي لمراقبة جودة المقايسة.
      حيث أن:
      معادلة التوازن الاستاتيكي، σₚ تشير إلى الانحراف المعياري في الضابط، توضيح لصيغة تعليمية.
      معادلة الانحراف المعياري، σn، المستخدمة في التحليل الإحصائي لدقة الضبط السالب.
      المعادلة μ<sub>p</sub>= متوسط إشارة الضبط الموجب؛ مفهوم تحليل البيانات الإحصائية.
      التوازن الاستاتيكي، المعادلة μn= متوسط إشارة الضبط السالب، تحليل تعليمي.
      ملاحظة: يشير وجود قيمة Z′-factor بين 0.5 و 1.0 إلى أن المقايسة مناسبة للفحص عالي الإنتاجية.

3. تطبيق مقايسة مراسل STAT6 لفحص السموم البيئية

تحذير: يجب التعامل مع الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات وأملاح المعادن الثقيلة كمواد سامة ومسرطنة محتملة. استخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة، وأجرِ جميع العمليات داخل خزانة استخلاص كيميائية معتمدة، وتخلص من المواد الملوثة وفقاً لإجراءات النفايات الخطرة المعتمدة في المؤسسة.

  1. مسح السموم البيئية
    1. ازرع خلايا مراسل STAT6 بكثافة 2 × 105 خلية/مل في طبق أبيض ذو قاع شفاف يحتوي على 96 بئراً باستخدام 100 µL من وسط استزراع كامل لكل بئر. تُحضن الخلايا طوال الليل.
    2. استبدل وسط المزرعة بوسط جديد يحتوي على كل مركب اختباري بالتركيز النهائي المطلوب، وهو 10 µM لهذا البروتوكول، وتُعالج الخلايا في غياب IL-4 وIL-13.
    3. تضمين مجموعة ضابطة سالبة تحتوي على 0.1% من ثنائي ميثيل سلفوكسيد، ومجموعة ضابطة موجبة تحتوي على IL-4 وIL-13 بتركيز 10 نانوغرام/مل لكل منهما. تُحضن الخلايا لمدة 24 ساعة.
    4. حدد حيوية الخلايا باستخدام مقايسة عد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 1.2.3-1.2.5.
    5. قم بقياس نشاط لوسيفيراز (luciferase) كما هو موضح في الخطوات 1.3.6-1.3.7.
    6. قم بتطبيع إشارة التألق من كل بئر بالنسبة لقيمة حيوية الخلايا المقابلة لها. ثم عبّر عن النتيجة المطببعة بالنسبة لمجموعة الضابطة السالبة.
    7. يُستبعد من تفسير نشاط مراسل STAT6 المركبات التي تقلل من حيوية الخلايا إلى أقل من 80%.
      ملاحظة: يجب اعتبار إشارات المراسل التي يتم الحصول عليها في ظل ظروف سامة للخلايا غير موثوقة، لأن انخفاض حيوية الخلايا قد يؤدي إلى تغيير التألق بشكل مستقل عن نشاط مسار STAT6.

النتائج

لتحديد التركيز الأمثل من البوروميسين (puromycin) للاختيار المستقر، عولجت خلايا 16HBE14o− الأصلية بتركيزات متزايدة من البوروميسين (0.5–4 µg/mL)، وقُيمت حيوية الخلايا بعد 24 و48 و72 ساعة باستخدام مقايسة حيوية الخلايا. قلل البوروميسين من حيوية الخلايا بطريقة تعتمد على الجرعة والوقت، حيث خفضت جميع التركيزات الحيوية إلى أقل من 20% بعد 48–72 ساعة (الشكل 3). وكان التركيز 1 µg/mL هو أدنى تركيز أدى إلى القضاء تماماً على الخلايا غير المنقولة، مما خفض إشارة الحيوية المتبقية إلى حوالي 4.5% خلال 48 ساعة (p < 0.0001). ولم يؤدِ زيادة تركيز البوروميسين إلى أي انخفاض إضافي في حيوية الخلايا. وبناءً على ذلك، تم اختيار تركيز 1 µg/mL من البوروميسين لعملية الاختيار اللاحقة للخلايا المنقولة.

لتحسين كفاءة ترنسدكشن الفيروسات البطيئة، تم إجراء ترنسدكشن لخلايا 16HBE14o− باستخدام الفيروس البطيء المراسل للوسيفرز الخاص بـ STAT6 بمضاعفات عدوى (MOIs) بلغت 1 و5 و10 و20 لمدة 48 ساعة، متبوعة بالتحفيز باستخدام IL-4 وIL-13 (بتركيز 10 ng/mL لكل منهما) لمدة 24 ساعة لتنشيط إشارات STAT6. وكما هو موضح في الشكل 4، زادت وحدات اللمعان النسبية (RLUs) بطريقة تعتمد على مضاعفات العدوى (MOI). وقد حقق مضاعف عدوى (MOI) قدره 20 أكبر تحريض للمراسل، مما أدى إلى زيادة في اللمعان بنحو 50 ضعفاً مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المحفزة (p < 0.0001). وبناءً على هذه النتائج، تم اختيار مضاعف عدوى (MOI) قدره 20 للتجارب اللاحقة.

بعد عملية التنقيل والانتخاب باستخدام puromycin تحت الظروف المحسنة، تعرضت الخلايا غير المنقولة لموت خلوي واسع النطاق، بينما حافظت الخلايا المنقولة على شكلها الطبيعي وقدرتها على البقاء (الشكل 5). خضعت الخلايا الناجية لاحقاً لعملية التخفيف المحدود لإنشاء خطوط خلوية أحادية النسيلة من خلايا مراسلة لبروتين STAT6.

تم تقييم ثلاثة خطوط خلوية مراسلة أحادية النسيلة مشتقة من خلايا فردية لقياس نشاط المراسل STAT6. أظهرت جميع المستنسخات وميضاً قاعدياً منخفضاً (<1,000 RLU). أدى التحفيز بواسطة IL-4 وIL-13 إلى استحثاث نشاط مراسل قوي في المستنسخين 2 و3، حيث تجاوز الوميض 20,000 RLU وهو ما يتوافق مع استحثاث يزيد عن 20 ضعفاً (الشكل 6A). أظهر المستنسخ 3 أدنى وميض قاعدي، وبناءً على ذلك تم اختياره لمزيد من التوصيف. تم تقييم نشاط المراسل في المستنسخ 3 عبر ممرات تسلسلية (P9–P21) لتقييم الاستقرار على المدى الطويل. وكما هو موضح في الشكل 6B، ظل استحثاث المراسل المعتمد على STAT6 مستقراً طوال نطاق الممرات التي تم تقييمها. واعتُبر المستنسخ مناسباً للتجارب اللاحقة عندما أظهر معدل نمو طبيعي، ووميضاً قاعدياً أقل من 1,000 RLU تقريباً، واستحثاثاً يزيد عن 20 ضعفاً بعد التحفيز بالسيتوكينات.

نظرًا لأن IL-4 وIL-13 يمكنهما تنشيط أعضاء إضافيين من عائلة STAT، بما في ذلك STAT3 وSTAT5، فقد تم تقييم خصوصية مقايسة المراسل بشكل أكبر17,18. تم تحفيز خلايا مراسل STAT6 باستخدام IL-4 وIL-13 في وجود أو غياب مثبطات انتقائية تستهدف STAT6 أو STAT5 أو STAT3 لمدة 24 h19,20,21. وظلت حيوية الخلايا فوق 90% في جميع ظروف المعالجة (مثبط STAT6 AS1517499 بتركيز 100 nM: 98.4%؛ مثبط STAT5 AC-4-130 بتركيز 2.5 µM: 97.4%؛ مثبط STAT3 Stattic بتركيز 2.5 µM: 96.2%؛ الشكل 7A). أدى تثبيط STAT6 إلى خفض نشاط لوسيفيراز بشكل ملحوظ (p < 0.0001)، بينما لم ينتج عن تثبيط STAT5 أو STAT3 أي تأثير معنوي على نشاط المراسل (p = 0.2593 وp = 0.8857، على التوالي؛ الشكل 7B). وأكدت هذه النتائج أن تنشيط المراسل كان يعتمد بشكل أساسي على STAT6.

تم تقييم متانة المقايسة عن طريق حساب عامل Z′- باستخدام الخلايا المحفزة بـ IL-4 و IL-13 كعنصر تحكم عالي الإشارة، والخلايا المعالجة بمثبط STAT6 كعنصر تحكم منخفض الإشارة. وقد أعطت المقايسة عامل Z′- قدره 0.703 ± 0.097، مما يشير إلى أداء ممتاز للمقايسة، ونطاق إشارة واسع، وملاءمة للفحص عالي الإنتاجية.

أخيرًا، تم تطبيق مقايسة مراسل STAT6 لفحص مكونات بيئية مختارة من المادة الجسيمية لتقييم قدرتها على تعديل إشارات STAT6. بعد 24 h من المعالجة، أدى benzo[b]fluoranthene (10 µM) إلى زيادة نشاط مراسل STAT6 بشكل ملحوظ بنحو 1.75 ضعفاً (p = 0.0006)، بينما زادت المادة الجسيمية (100 µg/mL) من نشاط المراسل بنحو 1.5 ضعفاً (p = 0.0398؛ الشكل 8). وفي المقابل، لم تؤدِّ الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات المتبقية ومركبات المعادن الثقيلة، بما في ذلك CdCl2 وHgCl2 وNiSO4 (بتركيز 10 µM لكل منها)، إلى تغيير نشاط المراسل بشكل ملحوظ. وتثبت هذه النتائج مجتمعة أن مقايسة مراسل STAT6 مستقرة، ومحددة، وقوية، ومناسبة للفحص عالي الإنتاجية للمركبات البيئية التي تعدل إشارات STAT6.

مخطط لنقل الجينات للخلايا؛ مراسل لوسيفيريز STAT6؛ الانتقاء بالمضادات الحيوية؛ تحسين تعدد العدوى (MOI).
الشكل 1: سير العمل لإنتاج خلايا 16HBE14o− المراسلة لـ STAT6. نظرة عامة تخطيطية للبروتوكول الخاص بإنتاج خلايا 16HBE14o− التي تعبر بشكل مستقر عن مراسل لوسيفيريز STAT6. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط توضيحي لعملية مقايسة خلايا مراسل STAT6؛ تحفيز IL4/13، وCCK8، وإضافة لوسيفيراز، والنتائج.
الشكل 2: سير العمل لإنشاء وتطبيق مقايسة مراسل STAT6. نظرة عامة تخطيطية على مقايسة مراسل STAT6 للتحقق من صحة المقايسة وفحص السموم البيئية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط شريطي لحيوية الخلايا يوضح تأثيرات puromycin بتركيزات 0.5-4µg/mL على مدار 24-72 ساعة؛ التحليل الإحصائي.
الشكل 3: تحديد التركيز الأمثل لـ puromycin لاختيار الخلايا المستقرة. عولجت خلايا Parental 16HBE14o− بـ puromycin (بتركيزات 0.5، أو 1، أو 2، أو 4 µg/mL) لمدة 24، أو 48، أو 72 ساعة. وتلقت خلايا المجموعة الضابطة (Vehicle-control) مادة dimethyl sulfoxide (DMSO) بتركيز 0.1%. تم تحديد حيوية الخلايا باستخدام مقايسة حيوية الخلايا. وحُسبت حيوية الخلايا من فرق الامتصاصية بين 450 و 650 nm بعد طرح قيمة البياض (blank) والمعايرة وفقاً لمجموعة الضابطة. البيانات معروضة كمتوسط ± SD من ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة مع مكررات تقنية (n = 3). تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه متبوعاً باختبار Dunnett للمقارنات المتعددة. قيم p للمقارنات مع المجموعة الضابطة موضحة في الشكل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الرسوم البيانية الشريطية للتألق مقابل MOI؛ تحليل بيانات التغير في مضاعفات RLU والقيم الاحتمالية الإحصائية p-values.
الشكل 4: تحسين كفاءة نقل العدوى بالفيروسات الغدية. تم نقل العدوى لخلايا 16HBE14o− باستخدام فيروس غدي مراسل للوسيفيريز STAT6 بمضاعفات عدوى (MOIs) تبلغ 1 أو 5 أو 10 أو 20 لمدة 48 h. وبعد فترة استشفاء مدتها 24 h، تم تحفيز الخلايا باستخدام IL-4 و IL-13 (بتركيز 10 ng/mL لكل منهما) لمدة 24 h. (A) وحدات التألق النسبية (RLUs) في الخلايا التي خضعت لنقل عدوى وهمي والخلايا التي نُقل إليها المراسل عند قيم MOIs المحددة. أُجري التحليل الإحصائي باستخدام اختبار ANOVA أحادي الاتجاه، يليه اختبار Dunnett للمقارنات المتعددة. (B) مضاعفات التحفيز بعد التحفيز بالسيتوكينات بالنسبة إلى مجموعة التحكم غير المحفزة عند MOI 20. أُجري التحليل الإحصائي باستخدام اختبار Student's t-test غير المقترن. تُمثل البيانات كمتوسط ± SD من ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة (n = 3). القيم الاحتمالية p-values موضحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مورفولوجيا الخلايا تحت تأثير البوروميسين؛ صورة مجهرية توضح التباينات بمقياس 50 μm.
الشكل 5: صور ممثلة للخلايا بعد عملية الانتقاء باستخدام البوروميسين. تم نقل الفيروسات البطيئة المراسلة للـ STAT6 luciferase إلى خلايا 16HBE14o− أو عدم نقلها (MOI = 20)، ثم عولجت لاحقاً بـ 1 µg/mL من البوروميسين لمدة 5 أيام. تم التقاط الصور باستخدام مجهر مقلوب بتباين طوري عند تكبير 100× تحت ظروف تصوير متطابقة. شكلت الخلايا الأبوية غير المعالجة طبقة أحادية ظهارية طبيعية (اليسار). وأظهرت الخلايا غير المنقولة والمعالجة بالبوروميسين موتاً خلوياً واسع النطاق وانفصالاً (المنتصف)، بينما ظلت الخلايا المنقولة والمنتخبة بالبوروميسين حية واحتفظت بمورفولوجيا طبيعية (اليمين). شريط المقياس = 50 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

نتائج مقايسة التلألؤ البيولوجي؛ مخطط أعمدة يقارن بين ظروف المجموعة الضابطة وظروف IL في مستنسخات الخلايا والممرات.
الشكل 6: تحديد مستنسخات مراسل STAT6 وتقييم استقرار المراسل. بعد التخفيف المحدود، تم تكثير ثلاثة خطوط خلوية أحادية النسيلة من مراسل STAT6 وتحفيزها باستخدام IL-4 وIL-13 (بتركيز 10 ng/mL لكل منهما) لمدة 24 h. (A) نشاط لوسيفيراز في مستنسخات المراسل الفردية بعد التحفيز بالسيتوكينات مقارنة بالمجموعات الضابطة غير المحفزة. (B) استقرار نشاط مراسل STAT6 في المستنسخ 3 عبر ممرات متسلسلة (P9–P21). البيانات معروضة كمتوسط ± SD من مكررات تقنية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخططات شريطية تقارن نسبة حيوية الخلايا والوميض الموحد في اختبارات الخلايا المعالجة بالأدوية.
الشكل 7: تثبيط انتقائي لنشاط مراسل STAT6 دون التأثير على حيوية الخلايا. تم تحفيز خلايا مراسل STAT6 باستخدام IL-4 و IL-13 (بتركيز 10 ng/mL لكل منهما) لمدة 24 h بوجود مثبط STAT6 وهو AS1517499 (بتركيز 100 nM)، أو مثبط STAT5 وهو AC-4-130 (بتركيز 2.5 µM)، أو مثبط STAT3 وهو Stattic (بتركيز 2.5 µM). تلقت مجموعة التحكم بالمركبة المحفزة بالسيتوكينات 0.1% DMSO. (A) تم تحديد حيوية الخلايا باستخدام اختبار حيوية الخلايا. (B) نشاط لوسيفيراز المعتمد على STAT6 موحداً بالنسبة للتحكم المحفز بالسيتوكينات. البيانات معروضة كمتوسط ± SD من ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة (n = 3). تم توضيح قيم p. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط شريطي لنتائج مقايسة التألق الضوئي المُطبعة لمقارنة المعالجات الكيميائية مع عينات التحكم.
الشكل 8: تقييم التأثيرات المعدِّلة لـ STAT6 بواسطة السموم البيئية. تمت معالجة خلايا المراسل STAT6 لمدة 24 h بالمواد الجسيمية (100 µg/mL) أو السموم البيئية الموضحة، بما في ذلك الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAHs) والمعادن الثقيلة (10 µM لكل منها). تم تطبيع نشاط لوسيفيراز المعتمد على STAT6 بالنسبة لضابط المركب الناقل (0.1% DMSO). يتم عرض البيانات كمتوسط ± SD من ثلاث مكررات بيولوجية مستقلة (n = 3). تم تحديد الدلالة الإحصائية من خلال المقارنة مع ضابط المركب الناقل، وقيم p موضحة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الجدول التكميلي 1: مواصفات وعاء الزرع ومعلمات الممر لزراعة خلايا 16HBE14o−.يرجى النقر هنا لتحميل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: مقارنة بين طرق قياس نشاط STAT6.يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

لا يُعد مسار إشارات IL-4/IL-13–JAK–STAT6 هدفاً علاجياً هاماً فحسب، بل هو أيضاً محرك رئيسي في إمراضية الأمراض التحسسية، بما في ذلك الربو والتهاب الأنف التحسسي22. يصف هذا البروتوكول مقايسة مراسل بسيطة ومستقرة تعتمد على خط خلوي لتحديد معدلات نشاط STAT6. ويمكن تطبيق هذه المقايسة لتقييم التأثيرات المعدلة لـ STAT6 لمجموعة واسعة من المركبات البيئية، وهي قابلة للتكيف بسهولة مع الفحص عالي الإنتاجية، كما هو موضح في دراسة فحص إثبات المفهوم (الشكل 8). ومن خلال الجمع بين مراسل لوسيفيريز ومقايسة موازية لحيوية الخلايا، تتيح هذه الطريقة التقييم الكمي لتعديل مسار STAT6 مع تقليل التأثيرات المربكة الناتجة عن السمية الخلوية الناجمة عن المركبات.

تتمثل السمة المميزة لهذه الطريقة في استخدام خلايا بشرية ظهارية قصيبة 16HBE14o− محولة بشكل مستقر، وهو نوع من الخلايا ذو صلة فسيولوجية حيث يساهم تأشير IL-4/IL-13 الناجم عن الملوثات في التهاب الممرات الهوائية التحسسي. تعاني المناهج الحالية لقياس نشاط STAT6 من قيود عملية هامة؛ حيث يعد الكشف عن فسفرة STAT6 أو البروتينات المستهدفة النهائية عن طريق لطخة ويسترن (Western blotting) أو المقايسة الممتزّة المناعية المرتبطة بالإنزيم (ELISA) عملية تتطلب جهداً كثيفاً وذات إنتاجية منخفضة نسبياً. أما مقايسات المراسل لوسيفيراز القائمة على عفن التحصيل العابر فتقيس نشاط النسخ لـ STAT6 بشكل مباشر، ولكنها تتأثر بتفاوت كفاءة عفن التحصيل، والتباين بين الدفعات، والحاجة إلى تكرار عملية عفن التحصيل في كل تجربة، مما يقلل من إمكانية التكرار والإنتاجية.

يتجاوز خط الخلايا المراسلة المستقر الموصوف في الدراسة العديد من هذه القيود. ونظراً لأن بنية المراسل مدمجة جينومياً ومختارة استنساخياً، يظل تعبير المراسل موحداً عبر مجموعة الخلايا وقابلاً للتكرار عبر الممرات، مما يلغي التباين المرتبط بالترانسفكشن المؤقت. يتم قياس إشارة التألق الحيوي في الخلايا الحية ويمكن توحيدها مع قياس موازٍ لحيوية الخلايا لاستبعاد الشوائب السامة للخلايا. بالإضافة إلى ذلك، فإن المقايسة متوافقة بسهولة مع تنسيق 96 بئراً للتطبيقات متوسطة إلى عالية الإنتاجية. حققت المقايسة معامل Z′-factor قدره 0.703، مما يشير إلى فصل ممتاز بين ضوابط الإشارة العالية والمنخفضة ويؤكد ملاءمتها للفحص عالي الإنتاجية. تتوفر مقارنة للنهج المستخدمة عادةً لقياس نشاط STAT6 في Supplementary Table 2. ومع ذلك، وبما أن المقايسة ترصد تنشيط محفز مستجيب لـ STAT6 بدلاً من تعبير الجينات المستهدفة الداخلية، فإن التحقق المتعامد باستخدام أهداف STAT6 النهائية، مثل MUC5AC و CCL26، يظل أمراً هاماً.

تُعد عدة خطوات حاسمة لنجاح إنشاء وتطبيق مقايسة STAT6 المراسلة. إن تحسين تعدد عدوى الفيروسات lentiviral (MOI) أمر ضروري لأن المدخلات الفيروسية غير الكافية تقلل من كفاءة ترصيف الخلايا، بينما قد يؤدي التعرض الفيروسي المفرط إلى تحفيز الإجهاد الخلوي والتأثير سلبًا على حيوية الخلايا. وبالمثل، يلزم تحسين تركيز اختيار البوروميسين (puromycin) للتخلص من الخلايا غير المرصّفة مع الحفاظ على حيوية الخلايا المراسلة المقاومة. ونظرًا لأن الحساسية لترصيف الفيروسات lentiviral والاختيار بالمضادات الحيوية تختلف باختلاف أنواع الخلايا، فيجب تحسين كلا المعلمتين تجريبياً قبل إنشاء خطوط خلوية مراسلة مستقرة. يُعد الخط الخلوي 16HBE14o− خطاً خلوياً ظهارياً قصبيًا بشريًا مُخلداً يُستخدم على نطاق واسع لدراسة التهاب الممرات الهوائية لأنه يشكل وصلات محكمة وظيفية وينتج المخاط8,23. ويجب أن تعبر الخلايا المختارة لإنشاء المراسل عن مستقبلات IL-4 وIL-13 وظيفية، وأن تحتفظ بمسار إشارات JAK–STAT سليم في المصب24. وقبل إنشاء خطوط مراسلة مستقرة، يجب التحقق من صحة بنية المراسل من خلال تأكيد الاستجابة لتحفيز السيتوكينات، والتثبيط بواسطة مثبطات خاصة بالمسار، وغياب التأثيرات السامة للخلايا في ظل ظروف المقايسة المختارة. تساعد خطوات التحقق هذه في ضمان أن التغيرات في نشاط المراسل تعكس بدقة الإشارات المعتمدة على STAT6 بدلاً من الإجهاد الخلوي غير النوعي.

يجب أيضاً مراعاة العديد من القيود المتعلقة بهذه الطريقة. تندمج النواقل العدسية (Lentiviral vectors) بشكل عشوائي في جينوم المضيف، مما قد يؤدي إلى تباين بين المستنسخات في نشاط المراسل الأساسي، وقابلية التحفيز، واستقرار التعبير على المدى الطويل. بالإضافة إلى ذلك، ونظراً لأن المقايسة تقيس تنشيط محفز مستجيب لـ STAT6، فهي لا تقيم بشكل مباشر تنشيط المستقبلات upstream أو أحداث التأشير الداخلية downstream. كما قد يؤدي الزرع المطول لخلايا المراسل المستقرة إلى إسكات فوق جيني أو انخفاض في تعبير الجين المنقول. وللحد من هذه التأثيرات، ينبغي إنشاء بنوك خلايا رئيسية في ممرات مبكرة، كما يجب التحقق دورياً من استجابة المراسل ضمن نطاق ممرات محدد. علاوة على ذلك، لم يتم التحقق من صحة المقايسة بعد في الخلايا الظهارية المجرى التنفسي البشرية الأولية أو في منصة فحص عالية الإنتاجية مؤتمتة بالكامل. وأخيراً، فإن السموم البيئية التي تم تقييمها في هذه الدراسة تمثل لوحة إثبات مفهوم وليست مكتبة كيميائية شاملة.

يتكون تلوث الهواء، وخاصة الجسيمات الدقيقة (PM2.5)، من خليط معقد من مكونات متنوعة كيميائيًا وفيزيائيًا، بما في ذلك الكربون الأسود، والأملاح غير العضوية، والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات، والمعادن الثقيلة12,13. وتؤدي الاختلافات في مصادر الانبعاثات والمعالجة الجوية إلى فروق جوهرية في تكوين الجسيمات، مما قد يساهم في نتائج صحية ضارة ومتميزة. وبناءً على ذلك، لا يزال تحديد المكونات المحددة المسؤولة عن الاستجابات التحسسية يمثل تحديًا في الدراسات الوبائية والدراسات التي تُجرى in vivo. ويوفر اختبار مراسل STAT6 الموصوف في هذه الدراسة منصة عملية in vitro لفحص نشاط تعديل STAT6 للمواد السامة المنقولة جواً بشكل فردي، أو مستخلصات الجسيمات المحددة المصدر، أو أجزاء الجسيمات المحددة كيميائيًا. وقد يسهل هذا البروتوكول تحديد أولويات المواد السامة المرشحة للدراسات الميكانيكية ويدعم التقييم الموجه للمخاطر لخلائط تلوث الهواء المعقدة.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الوطني للبحوث في تايلاند (NRCT) (منحة رقم N42A680388)، كما أن هذا المشروع البحثي مدعوم من جامعة ماهيدول (صندوق البحوث الاستراتيجية: 2025) (منحة رقم 35). تم إنشاء الشكلين 1 و2 باستخدام BioRender.com (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تربسين-إيديتات (Trypsin-EDTA) بتركيز 0.25%Gibco25200072كاشف تفكيك الخلايا
أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 ملCorningCLS430791أنبوب طرد مركزي من البولي بروبيلين معقم
16HBE14o- خط خلوي ظهاري قصبي بشريهدية من الدكتورة Nawiya Huipao (جامعة Prince of Songkla، تايلاند) والأستاذ الدكتور Dieter C. Gruenert (جامعة California San Francisco، الولايات المتحدة الأمريكية)معرف مورد الموارد: CVCL_0112سلالة خلايا ظهارية شعبية بشرية (الممر 35)–40)؛ تم التأكد من خلوها من الميكوبلازما (mycoplasma)، كما أنها تحتفظ بمورفولوجيا الخلايا الظهارية التنفسية المتمايزة وخصائص الحاجز الخلوي. المرجع: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
طبق زراعة أنسجة شفاف ذو قاع مسطح ومعالج، يحتوي على 24 بئراًCorning3527طبق زراعة الخلايا
طبق زراعة أنسجة معالج، شفاف، مسطح القاع، مكون من 6 عيونCorning3516طبق زراعة الخلايا
لوحة ميكروية من البوليسترين ذات 96 بئر شفافة وقاع مسطح ومعالجة للاستزراع النسيجيCorning3599لوحة مقايسة حيوية الخلية
لوحة ميكروية من البوليسترين بـ 96 بئراً، ذات لون أبيض وقاع شفاف، ومعالجة لاستزراع الأنسجةCorning3610لوح مقايسة التألق الضوئي
AC-4-130 (مثبط STAT5)MedChemExpressHY-124500مثبط انتقائي لبروتين STAT5
AS1517499 (مثبط STAT6)MedChemExpressHY-100614مثبط STAT6 الانتقائي
بنزو[b]فلورانثينAccuStandardH-128Nالهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات
كابينة السلامة البيولوجية، الفئة الثانيةNuaireNU-543-400Eلإجراءات استنبات الخلايا المعقمة
كلوريد الكادميوم (CdCl2)سيجما202908مركب معدني ثقيل
طقم عد الخلايا-8 (CCK-8)MedChemExpressHY-K0301مقايسة حيوية الخلايا
دورق زراعة الخلايا، 25 سم² (T-25)Corning430639دورق زراعة الأنسجة
أول أكسيد الكربون2 حاضنةNuaireNU-5710Eيُحفظ عند 37 °C، 5% CO22، جو مرطب
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجماD2650المذيب (بتركيز نهائي 0.1%) والمادة الواقية من التجميد (10%)
مصل الجنين البقري (FBS)سيجماF7524مكمل الوسط (10%) ووسط الحفظ بالتجميد (10%)
مقياس كرات الدم (Hemocytometer)BOECOBOE14العد اليدوي للخلايا
مجهر ضوئي مقلوب بتباين الطورZEISSبريموفيرت (Primovert)ملاحظة مورفولوجيا الخلايا
نظام مقايسة اللوسيفيريز (خطوة واحدة)BPS Bioscience60690مقايسة لوسيفيراز المراسلة
كلوريد الزئبق (HgCl2)سيجما215465مركب فلزي ثقيل
قارئ الأطباق الدقيقةBioTekSynergy Neo2جهاز قراءة الأطباق الدقيقة متعدد الأنماط/مقياس لومينومتر يتم التحكم به بواسطة برنامج Gen5 (الإصدار 3.08.01). تم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر مع مرجع عند 650 نانومتر بعد 15–رجّ خطي لمدة 20 ثانية. قياس التألق بدلالة وضعية نقطة النهاية باستخدام كسب كاشف يبلغ 120 بعد الرج الخطي لمدة 20 ثانية.
وسط إيجل الأساسي الأدنى (MEM)Gibco11095-080وسط زراعة أساسي
كبريتات النيكل (NiSO4)شركة طوكيو للصناعات الكيميائية (Tokyo Chemical Industry)N1203مركب معدني ثقيل
الجسيمات الدقيقة (PM)المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجياSRM 2975مادة مرجعية قياسية للجزيئات العالقة
بنسلين-ستربتوميسين (100×)Gibco15140122مكمل مضاد حيوي (بتركيز نهائي 1%)
محلول ملحي منظم بمادة الفوسفات (PBS)Gibco18912014محلول غسيل منظم
بوليبرينسيجماTR-1003-Gمعزز ترانسدكشن الفيروسات البطيئة
بيوروميسينMedChemExpressHY-B1743Aمضاد حيوي لاختيار الخلايا المستقرة
إنترلوكين-13 البشري المؤتلفThermo Fisher ScientificA42526سيتوكين للتحفيز
إنترلوكين-4 البشري المؤتلفThermo Fisher ScientificA42602سيتوكين للتحفيز
فيروس لنتيفيروسي مراسل لـ STAT6 باللوسيفيريزBPS Bioscience78799بناء مراسل فيروسي بطيء؛ عيار المخزون 5 × 107 وحدة تيربوزين/مل
ستاتيك (مثبط STAT3)MedChemExpressHY-13818مثبط انتقائي لـ STAT3

المراجع

  1. Organisation for Economic Co-operation and Development. The Economic Consequences of Outdoor Air Pollution. OECD Publishing; Paris; 2016.
  2. Thailand Pollution Control Department. Air Quality Assessments for Health and Environment Policies in Thailand. Thailand Pollution Control Department; Bangkok; 2018.
  3. Health Effects Institute. State of Global Air Report 2024. Available at: https://www.stateofglobalair.org/resources/report/state-global-air-report-2024
  4. State of Global Air. Trends in Air Quality and Health Impacts: Insights from Central, South, and Southeast Asia. 2025. Available at: https://www.stateofglobalair.org/
  5. Shi X. Acute effects of air pollution on human health in China: Evidence and prospects. China CDC Wkly. 2021;3(45):941-942.
  6. Tsai YG, et al. Long-term PM2.5 exposure impairs lung growth and increases airway inflammation in Taiwanese school children. ERJ Open Res. 2025;11(4).
  7. Walford HH, Doherty TA. STAT6 and lung inflammation. JAKSTAT. 2013;2(4):e25301.
  8. Moonwiriyakit A, et al. GPR120/FFAR4 stimulation attenuates airway remodeling and suppresses IL-4- and IL-13-induced airway epithelial injury via inhibition of STAT6 and Akt. Biomed Pharmacother. 2023;168:115774.
  9. Pelaia C, et al. Biological therapy of severe asthma with dupilumab, a dual receptor antagonist of interleukins 4 and 13. Vaccines (Basel). 2022;10(6).
  10. Yang Y, et al. Continuous exposure to PM2.5 exacerbates ovalbumin-induced asthma in mouse lung via the JAK-STAT6 signaling pathway. Adv Clin Exp Med. 2020;29(7):825-832.
  11. Li X, Huang L, Wang N, Yi H, Wang H. Sulfur dioxide exposure enhances Th2 inflammatory responses via activation of the STAT6 pathway in asthmatic mice. Toxicol Lett. 2018;285:43-50.
  12. Reiss R, et al. Evidence of health impacts of sulfate- and nitrate-containing particles in ambient air. Inhal Toxicol. 2007;19(5):419-449.
  13. Li R, et al. Key toxic components and sources affecting oxidative potential of atmospheric particulate matter using interpretable machine learning: Insights from fog episodes. J Hazard Mater. 2024;465:133175.
  14. Posimo JM, et al. Viability assays for cells in culture. J Vis Exp. 2014;(83):e50645.
  15. Baumlin-Schmid N, Salathe M, Fregien NL. Optimal lentivirus production and cell culture conditions necessary to successfully transduce primary human bronchial epithelial cells. J Vis Exp. 2016;(113).
  16. Nozeret K, Pernin A, Buddelmeijer N. Click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein N-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening. J Vis Exp. 2020;(159).
  17. Rolling C, Treton D, Pellegrini S, Galanaud P, Richard Y. IL-4 and IL-13 receptors share the γc chain and activate STAT6, STAT3, and STAT5 proteins in normal human B cells. FEBS Lett. 1996;393(1):53-56.
  18. Deimel LP, Li Z, Roy S, Ranasinghe C. STAT3 determines IL-4 signalling outcomes in naïve T cells. Sci Rep. 2021;11(1):10495.
  19. Wingelhofer B, et al. Pharmacologic inhibition of STAT5 in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2018;32(5):1135-1146.
  20. McMurray JS. A new small-molecule STAT3 inhibitor. Chem Biol. 2006;13(11):1123-1124.
  21. Chiba Y, Todoroki M, Nishida Y, Tanabe M, Misawa M. A novel STAT6 inhibitor, AS1517499, ameliorates antigen-induced bronchial hypercontractility in mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2009;41(5):516-524.
  22. Zhang X, et al. The immunogenetic landscape of allergic rhinitis: From cellular effectors to gene regulation and targeted therapies. Int J Biol Sci. 2026;22(3):1322-1345.
  23. Yu H, Li Q, Kolosov VP, Perelman JM, Zhou X. Interleukin-13 induces mucin 5AC production involving STAT6/SPDEF in human airway epithelial cells. Cell Commun Adhes. 2010;17(4-6):83-92.
  24. White SR, Martin LD, Stern R, Laxman B, Marroquin BA. Expression of IL-4/IL-13 receptors in differentiating human airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010;299(5):L681-L693.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

خلايا الظهارة التنفسيةتأشير STAT6مراسل اللوسيفيريزتحفيز IL-4تحفيز IL-13تحليل عامل Zترانسدكشن Lentiviral

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.