يصف هذا البروتوكول كيفية إنشاء والتحقق من صحة مقايسة مراسلة لوسيفيراز STAT6 مستقرة في الخلايا الظهارية للمجاري التنفسية البشرية. تتيح هذه الطريقة الفحص الفعال للمواد السامة البيئية ومكونات تلوث الهواء التي تعدل نشاط STAT6 تحت ظروف in vitro مضبوطة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إنشاء مقايسة تقرير STAT6 لفحص السموم البيئية التي تؤثر على التهاب الممرات الهوائية التحسسي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يُعد الالتهاب التحسسي للمجاري التنفسية المرتبط بتلوث الهواء مصدر قلق متزايد للصحة العامة. وقد تعمل الإنترلوكين-4 (IL-4) والإنترلوكين-13 (IL-13)، اللذان ينشطان مسار محول الإشارة ومنشط النسخ 6 (STAT6)، وهو وسيط مركزي في الالتهاب التحسسي للمجاري التنفسية، على تعديل السمية التنفسية للملوثات. تصف الدراسة الحالية إنشاء والتحقق من صحة مقايسة تقريرية لـ STAT6 باستخدام اللوسيفيراز في الخلايا الظهارية للمجاري التنفسية البشرية لتقييم السموم البيئية التي تعدل إشارات STAT6. تم نقل تقرير لوسيفيراز مستجيب لـ STAT6 إلى خلايا الظهارة الشعبية البشرية 16HBE14o− باستخدام ناقل فيروسي بطيء، تلا ذلك تحسين عملية الاختيار باستخدام البوروميسين وتحديد تعددية العدوى، ثم العزل أحادي النسيلة عن طريق التخفيف المحدود. تم اختيار مستنسخ مستقر يتميز بحث قوي وقابل للتكرار عبر الممرات المتتالية. وتم التحقق من استجابة التقرير عن طريق التحفيز بـ IL-4/IL-13، كما تم تأكيد الاعتماد على STAT6 باستخدام مثبطات انتقائية لـ STAT6 و STAT5 و STAT3. تم قياس أداء المقايسة عن طريق تحليل عامل Z′، والذي أشار إلى فصل إشارات قابل للتكرار. علاوة على ذلك، طُبقت المقايسة على مكونات فردية لتلوث الهواء، حيث أدى benzo[b]fluoranthene والمواد الجسيمية إلى زيادة نشاط تقرير STAT6 بشكل ملحوظ. توفر هذه الطريقة نهجاً قابلاً للتوسيع لقياس نشاط STAT6 في الخلايا الظهارية للمجاري التنفسية ولتحديد أولويات السموم البيئية التي تعدل إشارات التحسس في المجاري التنفسية.
المقدمة
يمثل تلوث الهواء أحد أكثر تحديات الصحة العامة العالمية إلحاحاً، لما له من آثار صحية عميقة وتداعيات اجتماعية واقتصادية. ويُصنف حالياً كثاني أهم عامل خطر يؤدي إلى الوفاة، حيث يتسبب في 8.1 مليون حالة وفاة سنوياً1,2,3. ومن بين الملوثات المنقولة جواً، تشكل الجسيمات الدقيقة التي يقل قطرها عن 2.5 ميكرومتر (PM2.5) الخطر الصحي الأكبر نظراً لقدرتها على التغلغل بعمق في الجهاز التنفسي4,5. وقد ارتبط التعرض المرتفع لـ PM2.5 بشكل مستمر بتدهور وظائف الرئة وزيادة معدلات دخول المستشفيات بسبب الأمراض التنفسية6. كما تشهد معدلات انتشار الأمراض الالتهابية التحسسية، بما في ذلك الربو والتهاب الأنف التحسسي والتهاب الجلد التأتبي، زيادة في جميع أنحاء العالم، وترتفع بشكل غير متناسب في المدن الكبرى شديدة التلوث4.
تحدث أمراض الممرات الهوائية التحسسية، مثل الربو التأطفي، بشكل أساسي من خلال استجابة التهابية من النوع 2، وتتميز بارتفاع مستويات السيتوكينات interleukin‑4 (IL‑4) و interleukin‑13 (IL‑13) وتنشيط مسار إشارات Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6)7. وفي الخلايا الظهارية للممرات الهوائية، تؤدي عملية فسفرة STAT6 التي يحفزها IL-4 و IL-13 إلى تعزيز الإفراز المفرط للمخاط واختلال الحاجز الظهاري، مما يجعل STAT6 وسيطاً مركزياً في اعتلالات الممرات الهوائية التحسسية وهدفاً علاجياً هاماً8,9. وتشير الأدلة التجريبية من النماذج الفأرية إلى أن التعرض لـ PM2.5 وثاني أكسيد الكبريت يزيد من إشارات STAT6 ويفاقم التهاب الممرات الهوائية التحسسي10,11. ومع ذلك، لم يتم تقييم ما إذا كانت مكونات تلوث الهواء الفردية تؤثر بشكل مباشر على النشاط النسخي لـ STAT6 في الخلايا الظهارية للممرات الهوائية البشرية بشكل منهجي.
يتكون تلوث الهواء من خليط كيميائي معقد من المكونات، بما في ذلك المواد الجسيمية، والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات (PAHs)، والمعادن الثقيلة، والأملاح غير العضوية، والتي لا تزال مساهماتها الفردية في تنشيط STAT6 في الممرات الهوائية غير محددة بدقة12,13. إن المنهجيات الحالية لقياس نشاط STAT6 في الخلايا الظهارية للممرات الهوائية، مثل مقايسات الفسفرة النهائية أو أنظمة المراسل القائمة على عفن التحول المؤقت، ليست مهيأة للفحص الكيميائي واسع النطاق. وبناءً على ذلك، فإن وجود منصة مراسل STAT6 خلوية مستقرة في الخلايا الظهارية للممرات الهوائية البشرية من شأنه أن يوفر أداة قابلة للتوسع لتحديد المركبات المشتقة من التلوث التي تعدل إشارات الحساسية في الممرات الهوائية. يصف هذا البروتوكول تطوير والتحقق من صحة مقايسة مراسل لوسيفيريز STAT6 مستقرة في خلايا الممرات الهوائية الظهارية 16HBE14o−، مما يتيح التقييم الكمي لتنشيط STAT6 من أجل الفحص المنهجي للعينات البيئية والسموم الكيميائية الفردية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
لا ينطبق الحصول على موافقة أخلاقية للمشاركين البشريين لأن هذه الدراسة استخدمت خط الخلايا الظهارية الشعبية البشرية 16HBE14o− المعتمد.
1. إنتاج خلايا 16HBE14o− خلايا تعبر باستقرار عن مراسل نشاط STAT6
ملاحظة: يقدم الشكل 1 نظرة عامة على سير العمل.
- زراعة الخلايا
ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الإجراءات باستخدام تقنية التعقيم داخل كابينة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية (Class II biosafety cabinet). تأكد من خلو الخلايا من تلوث الميكوبلازما قبل الاستخدام.- حافظ على خلايا 16HBE14o− في وسط أساسي أدنى (minimum essential medium) مكمل بـ 10% مصل جنين البقر و1% بنسلين-ستريبتومايسين. حضن الخلايا عند 37 °C في جو رطب يحتوي على 5% CO2، واستبدل وسط الزراعة كل يومين.
- اترك الخلايا حتى تصل إلى حالة تلاقي تقريبية بنسبة 80%. اشفط وسط الزراعة واغسل الطبقة الخلوية أحادية الطبقة مرة واحدة باستخدام محلول ملحي منظم بالفوسفات (phosphate-buffered saline).
- أضف كمية كافية من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات لتغطية الطبقة الخلوية أحادية الطبقة وحضن الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 °C. اشفط المحلول الملحي المنظم بالفوسفات تماماً.
ملاحظة: استخدم تحضين المحلول الملحي المنظم بالفوسفات لمدة 20 دقيقة لتسهيل تفكيك الوصلات الخلوية المحكمة التي تشكلها هذه السلالة الخلوية. تمثل هذه المدة تعديلاً تم تحسينه داخلياً. - أضف كمية كافية من محلول تريبسين-إيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك (trypsin–ethylenediaminetetraacetic acid) بتركيز 0.25% لتغطية الطبقة الخلوية أحادية الطبقة. حضن الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 °C.
ملاحظة: راقب انفصال الخلايا باستخدام مجهر ضوئي مقلوب. انقر بلطف على وعاء الزراعة عند الضرورة لتسهيل الانفصال. - أضف ما يقرب من خمسة أضعاف حجم محلول التريبسين-إيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك من وسط الزراعة الكامل لإنهاء النشاط الإنزيمي. استخدم الماصة لخلط المعلق بلطف للحصول على معلق من الخلايا المفردة.
- انقل معلق الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. قم بطرد المعلق مركزياً عند 300 × g لمدة 5 دقائق عند 25 °C.
- اشفط الطافي بعناية وأعد تعليق كتلة الخلايا في وسط زراعة جديد. قم بتجانس المعلق بلطف وتأكد من وجود معلق من الخلايا المفردة تحت مجهر ضوئي مقلوب.
- قم بعد الخلايا باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer) واضبط تركيز الخلايا وفقاً للكثافة المطلوبة للتجربة اللاحقة. استخدم نسبة تقسيم روتينية 1:8.
ملاحظة: ارجع إلى الجدول التكميلي 1 والجدول التكميلي 2 لمعرفة مساحات النمو لأوعية الزراعة والأحجام المقابلة من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات ومحلول التريبسين-إيثيلين ديامين رباعي حمض الأسيتيك.
- تحديد السُمّية الخلوية المستحثة بالبوروميسين
ملاحظة: اختر المضاد الحيوي وفقاً لجين المقاومة الذي يشفره التركيب الفيروسي الغدي (lentiviral construct).- ازرع خلايا 16HBE14o− بكثافة 2 × 104 خلية لكل بئر في طبق زراعة مكون من 96 بئراً يحتوي على 100 µL من وسط الزراعة الكامل في كل بئر. حضن الخلايا طوال الليل.
- استبدل وسط الزراعة بوسط جديد يحتوي على بوروميسين بتراكيز نهائية تبلغ 0.5 أو 1 أو 2 أو 4 µg/mL. جهز أطباقاً منفصلة للنقاط الزمنية 24 و48 و72 ساعة.
- أضف 5 µL من كاشف عد الخلايا إلى كل بئر. حضن الطبق لمدة ساعة واحدة عند 37 °C.
ملاحظة: تجنب إدخال فقاعات الهواء في الآبار، لأنها قد تتداخل مع قياسات الامتصاص. - قس الامتصاص عند 450 nm باستخدام 650 nm كطول موجي مرجعي. رج الطبق لمدة 15 ثانية مباشرة قبل تسجيل الامتصاص في وضع نقطة النهاية (endpoint mode).
- احسب حيوية الخلايا14 باستخدام المعادلة 1.
حيث:
ملاحظة: حدد العينة الضابطة على أنها خلايا غير معالجة، والفراغ على أنه وسط خالٍ من الخلايا يحتوي على كاشف المقايسة. اختر أدنى تركيز من البوروميسين الذي يقضي تماماً على الخلايا غير المنقولة جينياً خلال 48-72 ساعة.
- تحديد تعدد العدوى الأمثل (optimal multiplicity of infection)
تنبيه: تعامل مع الجسيمات الفيروسية الغدية تحت ظروف المستوى الثاني من السلامة البيولوجية (Biosafety Level 2) في مرفق مسجل للمستوى الثاني من السلامة البيولوجية ووفقاً للوائح السلامة البيولوجية المؤسسية. قم بإجراء جميع عمليات مناولة الفيروسات داخل كابينة سلامة بيولوجية من الفئة الثانية. غطِ المستهلكات الملوثة بالفيروس والانسكابات بمحلول تبييض بتركيز 10% لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل التخلص منها كنفايا ذات خطر بيولوجي.
ملاحظة: قم بتحسين تعدد العدوى (multiplicity of infection) لأنه يؤثر مباشرة على كفاءة النقل الجيني.- احسب الحجم المطلوب من المخزون الفيروسي الغدي15 باستخدام المعادلة 2.
حيث:
ملاحظة: كان العيار الوظيفي للمخزون الفيروسي الغدي المراسل لـ STAT6 luciferase المستخدم في هذا البروتوكول 5 × 107 وحدة نقل/مل. بالنسبة لـ 2 × 104 خلية مستهدفة، فإن MOI قدره 20 يقابل 8 µL من المخزون الفيروسي الغدي لكل بئر. يجب إعادة حساب حجم الفيروس للمحضرات الفيروسية ذات العيارات المختلفة. - ازرع خلايا 16HBE14o− بكثافة 2 × 104 خلية لكل بئر في طبق أبيض بـ 96 بئراً وقاعدة شفافة يحتوي على 100 µL من وسط الزراعة الكامل في كل بئر. حضن الخلايا طوال الليل حتى تصل إلى تلاقٍ تقريبي بنسبة 80%.
- استبدل وسط الزراعة بوسط جديد يحتوي على 5 µg/mL من البوليبرين (polybrene) وفيروس STAT6 luciferase reporter الغدي بـ MOIs تبلغ 1 و5 و10 و20. قم بتضمين بئر ضابط وهمي (mock-control) غير منقول جينياً لا يحتوي على فيروس غدي.
ملاحظة: احسب الحجم الفيروسي الغدي المطلوب لكل MOI من العيار الوظيفي للمخزون. - حضن الخلايا مع الجسيمات الفيروسية الغدية لمدة 48 ساعة. استبدل وسط النقل الجيني بوسط زراعة جديد وحضن الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية.
- استبدل وسط الزراعة بوسط جديد يحتوي على إنترلوكين-4 وإنترلوكين-13 بتركيز 10 ng/mL لكل منهما. حضن الخلايا لمدة 24 ساعة.
- أضف 25 µL من كاشف مقايسة اللوسيفيراز (luciferase assay reagent) إلى كل بئر16. احمِ الطبق من الضوء وحضنه لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- رج الطبق خطياً لمدة 20 ثانية. قس التألق الحيوي في وضع نقطة النهاية باستخدام قراءة كاملة للطبق وإعداد كسب (gain setting) قدره 120.
تنبيه: سجل التألق الحيوي في غضون ساعة واحدة من إضافة كاشف مقايسة اللوسيفيراز لالتقاط أقصى إشارة. اتبع تعليمات السلامة والمناولة الخاصة بالشركة المصنعة للكاشف.
ملاحظة: استخدم نفس قارئ الأطباق الدقيقة متعدد الأنماط وإعدادات الاستحواذ لجميع قياسات الامتصاص والتألق الحيوي.
- احسب الحجم المطلوب من المخزون الفيروسي الغدي15 باستخدام المعادلة 2.
- اختيار الخلايا المنقولة جينياً
- ازرع خلايا 16HBE14o− بكثافة 2 × 105 خلية/مل في طبق زراعة مكون من 24 بئراً. حضن الخلايا طوال الليل.
- استبدل وسط الزراعة بوسط جديد يحتوي على فيروس STAT6 luciferase reporter الغدي بـ MOI قدره 20 و5 µg/mL من البوليبرين. حضن الخلايا لمدة 48 ساعة.
- استبدل وسط النقل الجيني بوسط زراعة جديد. حضن الخلايا لمدة 24 ساعة إضافية.
- اشفط وسط الزراعة وأضف وسطاً جديداً يحتوي على 1 µg/mL من البوروميسين. حضن الخلايا لمدة 5 أيام، مع استبدال وسط الاختيار كل يومين.
- استمر في عملية الاختيار بالبوروميسين حتى يتم القضاء على جميع الخلايا في البئر الضابط الوهمي غير المنقول جينياً.
ملاحظة: اترك 24 ساعة على الأقل بعد النقل الجيني قبل تطبيق الاختيار بالمضاد الحيوي للسماح بالتعبير عن جين المقاومة.
- عزل المستنسخات الخلوية المفردة عن طريق التخفيف المحدود
- قم بفصل وعد خلايا STAT6 reporter المختارة بالبوروميسين. جهز معلقاً من الخلايا المفردة بكثافة 5 خلايا/مل عن طريق التخفيف المتسلسل.
ملاحظة: امنع تكتل الخلايا أثناء التخفيف. مرر المعلق عبر مصفاة خلايا عند الضرورة. - وزع 200 µL من معلق الخلايا في كل بئر من طبق زراعة مكون من 96 بئراً للحصول على كثافة متوسطة تبلغ حوالي خلية واحدة لكل بئر.
- افحص كل بئر باستخدام مجهر مقلوب في غضون 24 ساعة وحدد الآبار التي تحتوي على خلية واحدة. استبعد الآبار التي تحتوي على أكثر من خلية واحدة أو بؤر خلوية متعددة منفصلة مكانياً.
- راقب الآبار المختارة خلال الأسبوع الأول لتأكيد النمو المستنسخ. استبدل وسط الزراعة كل 3 أيام.
- قم بتوسيع كل مستنسخ في طبق 96 بئراً الأصلي لمدة 20 يوماً تقريباً أو حتى تصل الخلايا إلى حالة التلاقي. انقل كل مستنسخ بالتتابع إلى طبق مكون من 6 آبار ثم إلى قارورة زراعة T-25.
ملاحظة: ازرع الخلايا في طبق 6 آبار لمدة 6 أيام تقريباً قبل نقلها إلى قارورة T-25، أو انقلها عندما تصل إلى حالة التلاقي المناسبة.
نقطة توقف: استمر في توسيع المستنسخات أو قم بحفظها بالتبريد بكثافة 1 × 106 خلية لكل أنبوب في 1 مل من وسط الحفظ بالتبريد الذي يحتوي على 90% مصل جنين البقر و10% ثنائي ميثيل سلفوكسيد. - ازرع كل مستنسخ موسع بكثافة 2 × 105 خلية/مل في طبق أبيض بـ 96 بئراً وقاعدة شفافة. حضن الخلايا طوال الليل.
- استبدل وسط الزراعة بوسط جديد يحتوي على IL-4 وIL-13 بتركيز 10 ng/mL لكل منهما. حضن الخلايا لمدة 24 ساعة.
- قس نشاط اللوسيفيراز كما هو موضح في الخطوات 1.3.6-1.3.7. قارن نشاط المراسل المستحث بين المستنسخات الفردية.
- كرر مقايسة اللوسيفيراز عبر زيادة عدد ممرات الخلايا. اختر المستنسخات التي تحافظ على نشاط مراسل ثابت مستحث بالسيتوكينات عبر الممرات.
ملاحظة: تم اختيار المستنسخ 3 بسبب تألقه الحيوي القاعدي المنخفض وقدرته على الحفاظ على إشارة تنشيط ثابتة مستحثة بالسيتوكينات عبر الممرات المتسلسلة.
- قم بفصل وعد خلايا STAT6 reporter المختارة بالبوروميسين. جهز معلقاً من الخلايا المفردة بكثافة 5 خلايا/مل عن طريق التخفيف المتسلسل.
2. إنشاء والتحقق من صحة مقايسة مراسل نشاط STAT6
ملاحظة: يقدم الشكل 2 نظرة عامة على سير العمل.
- التحقق من صحة مقايسة مراسل نشاط STAT6
- قم بزراعة خلايا مراسل STAT6 بكثافة 2 × 105 cells/mL في طبق أبيض بـ 96 بئر ذو قاع شفاف، باستخدام 100 µL من وسط استزراع كامل لكل بئر. قم بتحضين الخلايا طوال الليل.
- استبدل وسط الاستزراع بوسط جديد يحتوي على IL-4 و IL-13 بتركيزات نهائية تبلغ 10 ng/mL لكل منهما. أضف المثبطات الانتقائية في وقت واحد كما يلي: 100 nM من AS1517499 (مثبط STAT6)، أو 2.5 µM من AC-4-130 (مثبط STAT5)، أو 2.5 µM من Stattic (مثبط STAT3).
- أضف ضابطاً للمذيب يحتوي على 0.1% من dimethyl sulfoxide (DMSO). قم بتحضين الخلايا لمدة 24 h.
- حدد حيوية الخلايا باستخدام مقايسة عد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 1.2.3-1.2.5.
- قم بقياس نشاط luciferase كما هو موضح في الخطوات 1.3.6-1.3.7.
- قم بتطبيع إشارة التألق الحيوي لكل بئر بناءً على حيوية الخلايا المقابلة لها. عبّر عن القيم المُطبعة بالنسبة لمجموعة الضبط المعالجة بالسيتوكينات.
ملاحظة: قد يؤدي انخفاض حيوية الخلايا إلى تقليل إشارة luciferase بشكل مستقل عن نشاط STAT6. لا تقم بتفسير نشاط المراسل إلا بعد التأكد من أن حيوية الخلايا مقبولة.
- تقييم متانة المقايسة
- قم بتقييم متانة المقايسة عن طريق حساب عامل Z′-factor باستخدام 21 بئراً مكررة لكل من مجموعتي الضبط الموجبة والسالبة.
- احسب عامل Z′-factor باستخدام المعادلة 3.
حيث أن:
ملاحظة: يشير وجود قيمة Z′-factor بين 0.5 و 1.0 إلى أن المقايسة مناسبة للفحص عالي الإنتاجية.
3. تطبيق مقايسة مراسل STAT6 لفحص السموم البيئية
تحذير: يجب التعامل مع الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات وأملاح المعادن الثقيلة كمواد سامة ومسرطنة محتملة. استخدم معدات الوقاية الشخصية المناسبة، وأجرِ جميع العمليات داخل خزانة استخلاص كيميائية معتمدة، وتخلص من المواد الملوثة وفقاً لإجراءات النفايات الخطرة المعتمدة في المؤسسة.
- مسح السموم البيئية
- ازرع خلايا مراسل STAT6 بكثافة 2 × 105 خلية/مل في طبق أبيض ذو قاع شفاف يحتوي على 96 بئراً باستخدام 100 µL من وسط استزراع كامل لكل بئر. تُحضن الخلايا طوال الليل.
- استبدل وسط المزرعة بوسط جديد يحتوي على كل مركب اختباري بالتركيز النهائي المطلوب، وهو 10 µM لهذا البروتوكول، وتُعالج الخلايا في غياب IL-4 وIL-13.
- تضمين مجموعة ضابطة سالبة تحتوي على 0.1% من ثنائي ميثيل سلفوكسيد، ومجموعة ضابطة موجبة تحتوي على IL-4 وIL-13 بتركيز 10 نانوغرام/مل لكل منهما. تُحضن الخلايا لمدة 24 ساعة.
- حدد حيوية الخلايا باستخدام مقايسة عد الخلايا كما هو موضح في الخطوات 1.2.3-1.2.5.
- قم بقياس نشاط لوسيفيراز (luciferase) كما هو موضح في الخطوات 1.3.6-1.3.7.
- قم بتطبيع إشارة التألق من كل بئر بالنسبة لقيمة حيوية الخلايا المقابلة لها. ثم عبّر عن النتيجة المطببعة بالنسبة لمجموعة الضابطة السالبة.
- يُستبعد من تفسير نشاط مراسل STAT6 المركبات التي تقلل من حيوية الخلايا إلى أقل من 80%.
ملاحظة: يجب اعتبار إشارات المراسل التي يتم الحصول عليها في ظل ظروف سامة للخلايا غير موثوقة، لأن انخفاض حيوية الخلايا قد يؤدي إلى تغيير التألق بشكل مستقل عن نشاط مسار STAT6.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتحديد التركيز الأمثل من البوروميسين (puromycin) للاختيار المستقر، عولجت خلايا 16HBE14o− الأصلية بتركيزات متزايدة من البوروميسين (0.5–4 µg/mL)، وقُيمت حيوية الخلايا بعد 24 و48 و72 ساعة باستخدام مقايسة حيوية الخلايا. قلل البوروميسين من حيوية الخلايا بطريقة تعتمد على الجرعة والوقت، حيث خفضت جميع التركيزات الحيوية إلى أقل من 20% بعد 48–72 ساعة (الشكل 3). وكان التركيز 1 µg/mL هو أدنى تركيز أدى إلى القضاء تماماً على الخلايا غير المنقولة، مما خفض إشارة الحيوية المتبقية إلى حوالي 4.5% خل...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
لا يُعد مسار إشارات IL-4/IL-13–JAK–STAT6 هدفاً علاجياً هاماً فحسب، بل هو أيضاً محرك رئيسي في إمراضية الأمراض التحسسية، بما في ذلك الربو والتهاب الأنف التحسسي22. يصف هذا البروتوكول مقايسة مراسل بسيطة ومستقرة تعتمد على خط خلوي لتحديد معدلات نشاط STAT6. ويمكن تطبيق هذه المقايسة لتقييم التأثيرات المعدلة لـ STAT6 لمجموعة واسعة من المركبات البيئية، وهي قابلة للتكيف بسهولة مع الفحص عالي الإنتاجية، كما هو موضح في دراسة فحص إثبات المفهوم (الشكل 8). ومن خلال الجمع بين مراسل لوس...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يصرح المؤلفون بعدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل المجلس الوطني للبحوث في تايلاند (NRCT) (منحة رقم N42A680388)، كما أن هذا المشروع البحثي مدعوم من جامعة ماهيدول (صندوق البحوث الاستراتيجية: 2025) (منحة رقم 35). تم إنشاء الشكلين 1 و2 باستخدام BioRender.com (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| تربسين-إيديتات (Trypsin-EDTA) بتركيز 0.25% | Gibco | 25200072 | كاشف تفكيك الخلايا |
| أنبوب طرد مركزي مخروطي سعة 15 مل | Corning | CLS430791 | أنبوب طرد مركزي من البولي بروبيلين معقم |
| 16HBE14o- خط خلوي ظهاري قصبي بشري | هدية من الدكتورة Nawiya Huipao (جامعة Prince of Songkla، تايلاند) والأستاذ الدكتور Dieter C. Gruenert (جامعة California San Francisco، الولايات المتحدة الأمريكية) | معرف مورد الموارد: CVCL_0112 | سلالة خلايا ظهارية شعبية بشرية (الممر 35)–40)؛ تم التأكد من خلوها من الميكوبلازما (mycoplasma)، كما أنها تحتفظ بمورفولوجيا الخلايا الظهارية التنفسية المتمايزة وخصائص الحاجز الخلوي. المرجع: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47. |
| طبق زراعة أنسجة شفاف ذو قاع مسطح ومعالج، يحتوي على 24 بئراً | Corning | 3527 | طبق زراعة الخلايا |
| طبق زراعة أنسجة معالج، شفاف، مسطح القاع، مكون من 6 عيون | Corning | 3516 | طبق زراعة الخلايا |
| لوحة ميكروية من البوليسترين ذات 96 بئر شفافة وقاع مسطح ومعالجة للاستزراع النسيجي | Corning | 3599 | لوحة مقايسة حيوية الخلية |
| لوحة ميكروية من البوليسترين بـ 96 بئراً، ذات لون أبيض وقاع شفاف، ومعالجة لاستزراع الأنسجة | Corning | 3610 | لوح مقايسة التألق الضوئي |
| AC-4-130 (مثبط STAT5) | MedChemExpress | HY-124500 | مثبط انتقائي لبروتين STAT5 |
| AS1517499 (مثبط STAT6) | MedChemExpress | HY-100614 | مثبط STAT6 الانتقائي |
| بنزو[b]فلورانثين | AccuStandard | H-128N | الهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات |
| كابينة السلامة البيولوجية، الفئة الثانية | Nuaire | NU-543-400E | لإجراءات استنبات الخلايا المعقمة |
| كلوريد الكادميوم (CdCl2) | سيجما | 202908 | مركب معدني ثقيل |
| طقم عد الخلايا-8 (CCK-8) | MedChemExpress | HY-K0301 | مقايسة حيوية الخلايا |
| دورق زراعة الخلايا، 25 سم² (T-25) | Corning | 430639 | دورق زراعة الأنسجة |
| أول أكسيد الكربون2 حاضنة | Nuaire | NU-5710E | يُحفظ عند 37 °C، 5% CO22، جو مرطب |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) | سيجما | D2650 | المذيب (بتركيز نهائي 0.1%) والمادة الواقية من التجميد (10%) |
| مصل الجنين البقري (FBS) | سيجما | F7524 | مكمل الوسط (10%) ووسط الحفظ بالتجميد (10%) |
| مقياس كرات الدم (Hemocytometer) | BOECO | BOE14 | العد اليدوي للخلايا |
| مجهر ضوئي مقلوب بتباين الطور | ZEISS | بريموفيرت (Primovert) | ملاحظة مورفولوجيا الخلايا |
| نظام مقايسة اللوسيفيريز (خطوة واحدة) | BPS Bioscience | 60690 | مقايسة لوسيفيراز المراسلة |
| كلوريد الزئبق (HgCl2) | سيجما | 215465 | مركب فلزي ثقيل |
| قارئ الأطباق الدقيقة | BioTek | Synergy Neo2 | جهاز قراءة الأطباق الدقيقة متعدد الأنماط/مقياس لومينومتر يتم التحكم به بواسطة برنامج Gen5 (الإصدار 3.08.01). تم قياس الامتصاصية عند 450 نانومتر مع مرجع عند 650 نانومتر بعد 15–رجّ خطي لمدة 20 ثانية. قياس التألق بدلالة وضعية نقطة النهاية باستخدام كسب كاشف يبلغ 120 بعد الرج الخطي لمدة 20 ثانية. |
| وسط إيجل الأساسي الأدنى (MEM) | Gibco | 11095-080 | وسط زراعة أساسي |
| كبريتات النيكل (NiSO4) | شركة طوكيو للصناعات الكيميائية (Tokyo Chemical Industry) | N1203 | مركب معدني ثقيل |
| الجسيمات الدقيقة (PM) | المعهد الوطني للمعايير والتكنولوجيا | SRM 2975 | مادة مرجعية قياسية للجزيئات العالقة |
| بنسلين-ستربتوميسين (100×) | Gibco | 15140122 | مكمل مضاد حيوي (بتركيز نهائي 1%) |
| محلول ملحي منظم بمادة الفوسفات (PBS) | Gibco | 18912014 | محلول غسيل منظم |
| بوليبرين | سيجما | TR-1003-G | معزز ترانسدكشن الفيروسات البطيئة |
| بيوروميسين | MedChemExpress | HY-B1743A | مضاد حيوي لاختيار الخلايا المستقرة |
| إنترلوكين-13 البشري المؤتلف | Thermo Fisher Scientific | A42526 | سيتوكين للتحفيز |
| إنترلوكين-4 البشري المؤتلف | Thermo Fisher Scientific | A42602 | سيتوكين للتحفيز |
| فيروس لنتيفيروسي مراسل لـ STAT6 باللوسيفيريز | BPS Bioscience | 78799 | بناء مراسل فيروسي بطيء؛ عيار المخزون 5 × 107 وحدة تيربوزين/مل |
| ستاتيك (مثبط STAT3) | MedChemExpress | HY-13818 | مثبط انتقائي لـ STAT3 |
المراجع
- Organisation for Economic Co-operation and Development. The Economic Consequences of Outdoor Air Pollution. OECD Publishing; Paris; 2016.
- Thailand Pollution Control Department. Air Quality Assessments for Health and Environment Policies in Thailand. Thailand Pollution Control Department; Bangkok; 2018.
- Health Effects Institute. State of Global Air Report 2024. Available at: https://www.stateofglobalair.org/resources/report/state-global-air-report-2024
- State of Global Air. Trends in Air Quality and Health Impacts: Insights from Central, South, and Southeast Asia. 2025. Available at: https://www.stateofglobalair.org/
- Shi X. Acute effects of air pollution on human health in China: Evidence and prospects. China CDC Wkly. 2021;3(45):941-942.
- Tsai YG, et al. Long-term PM2.5 exposure impairs lung growth and increases airway inflammation in Taiwanese school children. ERJ Open Res. 2025;11(4).
- Walford HH, Doherty TA. STAT6 and lung inflammation. JAKSTAT. 2013;2(4):e25301.
- Moonwiriyakit A, et al. GPR120/FFAR4 stimulation attenuates airway remodeling and suppresses IL-4- and IL-13-induced airway epithelial injury via inhibition of STAT6 and Akt. Biomed Pharmacother. 2023;168:115774.
- Pelaia C, et al. Biological therapy of severe asthma with dupilumab, a dual receptor antagonist of interleukins 4 and 13. Vaccines (Basel). 2022;10(6).
- Yang Y, et al. Continuous exposure to PM2.5 exacerbates ovalbumin-induced asthma in mouse lung via the JAK-STAT6 signaling pathway. Adv Clin Exp Med. 2020;29(7):825-832.
- Li X, Huang L, Wang N, Yi H, Wang H. Sulfur dioxide exposure enhances Th2 inflammatory responses via activation of the STAT6 pathway in asthmatic mice. Toxicol Lett. 2018;285:43-50.
- Reiss R, et al. Evidence of health impacts of sulfate- and nitrate-containing particles in ambient air. Inhal Toxicol. 2007;19(5):419-449.
- Li R, et al. Key toxic components and sources affecting oxidative potential of atmospheric particulate matter using interpretable machine learning: Insights from fog episodes. J Hazard Mater. 2024;465:133175.
- Posimo JM, et al. Viability assays for cells in culture. J Vis Exp. 2014;(83):e50645.
- Baumlin-Schmid N, Salathe M, Fregien NL. Optimal lentivirus production and cell culture conditions necessary to successfully transduce primary human bronchial epithelial cells. J Vis Exp. 2016;(113).
- Nozeret K, Pernin A, Buddelmeijer N. Click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein N-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening. J Vis Exp. 2020;(159).
- Rolling C, Treton D, Pellegrini S, Galanaud P, Richard Y. IL-4 and IL-13 receptors share the γc chain and activate STAT6, STAT3, and STAT5 proteins in normal human B cells. FEBS Lett. 1996;393(1):53-56.
- Deimel LP, Li Z, Roy S, Ranasinghe C. STAT3 determines IL-4 signalling outcomes in naïve T cells. Sci Rep. 2021;11(1):10495.
- Wingelhofer B, et al. Pharmacologic inhibition of STAT5 in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2018;32(5):1135-1146.
- McMurray JS. A new small-molecule STAT3 inhibitor. Chem Biol. 2006;13(11):1123-1124.
- Chiba Y, Todoroki M, Nishida Y, Tanabe M, Misawa M. A novel STAT6 inhibitor, AS1517499, ameliorates antigen-induced bronchial hypercontractility in mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2009;41(5):516-524.
- Zhang X, et al. The immunogenetic landscape of allergic rhinitis: From cellular effectors to gene regulation and targeted therapies. Int J Biol Sci. 2026;22(3):1322-1345.
- Yu H, Li Q, Kolosov VP, Perelman JM, Zhou X. Interleukin-13 induces mucin 5AC production involving STAT6/SPDEF in human airway epithelial cells. Cell Commun Adhes. 2010;17(4-6):83-92.
- White SR, Martin LD, Stern R, Laxman B, Marroquin BA. Expression of IL-4/IL-13 receptors in differentiating human airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010;299(5):L681-L693.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تم نشر هذه المقالة
الفيديو قريباً