تحضير الحويصلات الهجينة الكبيرة والعملاقة أحادية السطح ذات الغلاف الوظيفي من بروتين الغشاء والنظام الوظيفي بين بوليمر وبوليمر ودهون

Nika Otrin; Chee Seng Man; Wenqi Huang; Kai Sundmacher; Lado Otrin

doi:10.3791/71699

مقالة منهجية

تحضير الحويصلات الهجينة الكبيرة والعملاقة أحادية السطح ذات الغلاف الوظيفي من بروتين الغشاء والنظام الوظيفي بين بوليمر وبوليمر ودهون

DOI:

10.3791/71699

⸱

أغسطس 7, 2026

Nika Otrin¹ , Chee Seng Man¹^,² , Wenqi Huang¹ , Kai Sundmacher¹^,²^,³ , Lado Otrin¹

¹Process Systems Engineering, Max Planck Institute for Dynamics of Complex Technical Systems, ²Max Planck School Matter to Life, ³Process Systems Engineering, Otto von Guericke University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر هذا البروتوكول إعادة تشكيل بروتين غشائي بوساطة المغسلة، وهو السيتوكروم bo3 يوبيكوينول أوكسيداز، إلى حويصلات أحادية السطح كبيرة مصنوعة من PDMS-g-PEO وتحويلها إلى حويصيلات عملاقة عبر الاندماج والتشكيل الكهربائي. المقصورات الوظيفية الناتجة القائمة على البوليمر مناسبة للدراسات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية المتقدمة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر الحويصلات التي تتكون من البوليمرات المشتركة الأمفيفيليك، بمفردها أو ممزوجة مع الفوسفوليبيدات، استقرارا ميكانيكيا وكيميائيا أعلى مقارنة بالحويصلات الدهنية التقليدية. وهذا يجعلها هيكلا جذابا، يمكن تطويره وتوسيعه لتمكين تطبيقات محددة، مثل توصيل الأدوية، والاستشعار الحيوي التشخيصي، وبناء الخلايا الصناعية، والمفاعلات الدقيقة والنانوية المستوحاة حيويا. على وجه الخصوص، فإن الوظيفية من خلال دمج البروتينات الغشائية أمر ضروري للعديد من هذه التطبيقات. هنا، نقدم بروتوكولا لتحضير الحويصلات الأحادية السطح الكبيرة الوظيفية (LUVs) من الطعم المشترك-بوليمر PDMS-g-PEO عبر إعادة تشكيل بالمنظفات. علاوة على ذلك، نوضح كيف يمكن تحويل هذه الحويصلات الكبيرة إلى حويصلات أحادية السطح عملاقة (GUVs) باستخدام نهج الاندماج والتشكيل الكهربائي. يغطي البروتوكول تصنيف البروتينات الغشائية بالفلورة، وتحضير بروتينات LUVs من البوليمر والهجينة، وإعادة تكوين بروتينات الغشاء، وتحليل توزيع الحجم عبر تشتت الضوء الديناميكي (DLS)، وتقييم نشاط البروتين عبر قياسات استهلاك الأكسجين، وتحضير GUVs الوظيفية للبروتين، وتحليل إدخال البروتينات ونشاط ضخ البروتونات في GUVs عبر المجهر الكونفوكلي. تظهر النتائج التمثيلية تكوين بروتيو-LUVs أحادية التشتت ذات مؤشر متعدد التشتت (PDI) أقل من 0.2، وتوليد ناجح لبروتيو-GUVs يتراوح قطرها بين 5–35 ميكرومتر. يتم تأكيد نشاط البروتين من خلال قياسات استهلاك الأكسجين في كل من LUVs البوليميري (18.2 نانومول/دقيقة/مل) وLUVs الهجين (26.9 نانومول/دقيقة/مل). يتم قياس كمية إدخال البروتين في GUVs عبر شدة الفلورة، مما ينتج 20.6 ± 3.7 a.u. لجرعات GUVs البوليمرية و26.2 ± 5.0 a.u. للGUVs الهجينة. نشاط ضخ البروتونات في GUVs، الذي يتم مراقبته عبر صبغة مغلفة حساسة للرقم الهيدروجيني، يتوافق مع وظيفة البروتين، حيث يكون ضخ البروتونات الداخلي هو السائد. تدعم نعومة البوليمر الميكانيكية وسماكة الطبقة الثنائية الشبيهة بالدهون (~5.3 نانومتر) إدخال البروتين بكفاءة والحفاظ على وظيفتها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن للكولوليمرات المشتركة للكتل الأمفيفيلية أن تتجمع ذاتيا في محلول مائي إلى أغشية، تنحني تلقائيا وتغلق على نفسها لتشكل حجرات كروية مغلقة بالغشاء تعرف باسم البوليمرسومات (الحويصلات البوليمرية). مقارنة بأغشية الدهون، توفر الحجرات القائمة على البوليمرات مرونة كيميائية أكبر واستقرارا كيميائيا^{معززا 1} وميكانيكي²، مما يجعلها جذابة للغاية لتطبيقات مثل توصيل الأدوية، والمفاعلات النانوية والدقيقة، وبناء خلايا صناعية متينة. كل من مجموعتنا ومجموعات أخرى قامت بعمل الأغشية البوليمرية عن طريق إدخال بروتينات غشائية لإنشاء عضيات وخلايا صناعية 1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . البوليمرات التي تحتوي على نواة بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان) الكارهة للماء (PDMS) مناسبة بشكل خاص لدمج بروتين الغشاء بسبب مرونتها العالية للسلاسل وإمكانية ضبط سمك الغشاء الكاره للماء ليتناسب بشكل أفضل مع مجال البروتين العابر للغشاء⁵. بينما ركز مختبرنا بشكل أساسي على البوليمر المشترك للطعم بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان)-بولي الطعم (أكسيد الإيثيلين) (PDMS-g-PEO)، الذي يشكل أغشية ديناميكية عالية ^4,16,17 وهي أكثر ليونة من طبقات الدهون التقليدية وتظهر سمكا يقارب 5.3 ^{نانومتر 1}، نجحت مجموعات أخرى في استخدام البوليمرات المشتركة الثلاثية البنية على PDMS مثل PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA⁵^,6,7,8,9,10,11 وPEtOz-b-PDMS-b-PEtOz12 لإعادة تكوين البروتين الغشائي. حتى البوليمرات المشتركة ذات الكتلة الثنائية الصلبة نسبيا مثل PBD-b-PEO، خصوصا في الأنظمة الهجينة الممزوجة بالدهون، تم استخدامها لدمج البروتين بنجاح¹³. تبرز هذه الأمثلة مرونة الأغشية البوليمرية كمنصات إعادة تكوين، والتي يمكن أن توفر أيضا استقرارا كيميائيا معززا^وعمرا وظيفيا مطولا للبروتينات الغشائية المدمجة. على الرغم من أن أغشية البوليمر والدهون الهجينة قد لا تتطابق دائما مع الاستقرار الكيميائي لأنظمة البوليمر النقي¹، إلا أنها تقدم حلا وسطا جذابا من خلال الجمع بين المتانة الميكانيكية للبوليمرات والأهمية البيولوجية للدهون. ينتج عن ذلك بيئة غشائية تحاكي الأغشية البيولوجية الأصلية بشكل أوثق مع الحفاظ على المزايا الرئيسية للمواد الصناعية. يمكن أن تقدم هذه البنى الهجينة مزايا إضافية، بما في ذلك تقليل نفاذية البروتونات الناتجة عن إعادة ترتيب النانويين¹ وتكوين المجال داخل الغشاء¹⁵.

توجد عدة تقنيات لإعادة تكوين بروتينات الغشاء إلى حويصلات نانوية الحجم (LUVs)، بما في ذلك إعادة التكوين بالمذيب العضوي (مثل التبخر العكسي، إعادة ترطيب أغشية بروتينات الدهون)، الأساليب الميكانيكية (مثل الصوت، الفرنش برس، التجميد والذوبان)، وإعادة التكوين بالمسحوق (عن طريق إزالة المغسلة أو التخفيف أو الدمج المباشر)¹⁸، واستراتيجيات أحدث مثل النقل المباشر من أقراص النانو البوليمرية المشتركة لحمض الستايرين-ماليك¹⁹. بينما تم دمج البورينات بنجاح في LUVs البوليمرية من خلال الإدخال المباشر، على سبيل المثال، عن طريق إضافة البروتين إلى طبقة البوليمر أثناء إعادة الترطيب⁸. يؤدي هذا النهج عادة إلى انخفاض كفاءة الإدخال للبروتينات الغشائية الأكبر أو الأكثر تعقيدا وغالبا ما يؤدي إلى توجه عشوائي للبروتينات. وبالتالي، تظل إعادة التكوين بالوساطة بالمغسلة، والتي تتضمن إضافة محكومة للمنظف ثم إزالته، الطريقة الأكثر استخداما. كما أنها الاستراتيجية المفضلة لدمج بروتينات أغشائية أكبر في LUVs القائمة على البوليمر، خاصة للبروتينات غير المتماثلة حيث يكون التوجيه المتحكم فيه أمرا بالغ الأهمية للوظيفة. في هذا النهج، تشبع أغشية الحويصلات أولا بالمنظف المفضل (يرمز إلى تركيز المغسلة المشبعة ب R_sat)، أو تذوب جزئيا (تعايش الحويصلات والميسيل)، أو تذوب بالكامل، أي تتحلل إلى ميسيلز (ويرمز إلى تركيز المنظف ب R_سول). يتبع هذا العلاج الغشائي الأولي إضافة البروتين، والحضانة، وإزالة المنظفات¹⁸. يمكن تحقيق الأخير عن طريق الغسيل الكلوي، أو الكروماتوغرافيا بإقصاء الحجم، أو الامتصاص على خرز البوليسترين الكارهة للماء (مثل بيو-بيدز). يتم تحسين اختيار المغسفل، وتركيزه، وطريقة الإزالة لكل نوع من الغشاء والبروتين لتعظيم كفاءة الدمج والتحكم في اتجاه البروتين²⁰.

بينما تعتبر LUVs مناسبة جدا لقياس النشاط الكلي، تتطلب دراسات الحويصلة الواحدة والتحليلات القائمة على المجهر البصري إعادة تشكيل بروتينات الغشاء إلى حويصلات أحادية السطح عملاقة (GUVs). تستخدم خمسة طرق رئيسية لدمج البروتين في الميكروفونات السطحية الطبيعية: التكوين المشترك في وجود البروتين والمذيب العضوي²¹، التكوين المشترك في وجود منظف²²، الإدخال في GUVs المكونة مسبقا عبر تخفيف المغسلة²³، الإدخال عبر دمج الغشاء مع بروتيو-LUVs^16,24، والاندماج-التشكيل الكهربائي²⁵. على الرغم من أن هذه الأساليب قد تم تطبيقها بنجاح على GUVs الدهنية، إلا أن نقلها إلى GUVs الهجينة من البوليمر أو البوليمر/الدهون غالبا ما يكون تحديا. على وجه الخصوص، غالبا ما تؤدي طرق التكوين المشترك وتخفيف المنظفات إلى انخفاض كفاءة الإدخال في أغشية البوليمر أو غير متوافقة مع بعض تركيبات البوليمرات¹⁵. استراتيجيات الاندماج 4,16,24,26,27 التي تعتمد على عوامل فيوزوجينية إضافية قد تكون أيضا إشكالية، حيث يمكن أن تؤثر الدهون الكاتيونية/البوليمرات الاصطناعية أو الببتيدات المسببة للفوزوجين على استقرار بروتين الغشاء، أو تغير خصائص الغشاء، أو تقلل من كفاءة دمج البروتين المستهدف. يتغلب الاندماج والتشكيل الكهربائي على العديد من هذه القيود وقد أثبت أنه طريقة قوية وفعالة لدمج بروتينات الغشاء في بروتينات الغلاف السطحي الهجينة من البوليمر والبوليمر/الدهون ^1,5,15. يتيح هذا النهج دمج البروتينات بشكل محكم مع الحفاظ على سلامة الغشاء ووظائف البروتين، مما يجعله مناسبا بشكل خاص لتوليد GUVs بوليمرية وظيفية للبروتين.

إعادة تشكيل مضخات البروتون إلى حويصلات قائمة على البوليمر أمر ضروري لبناء خلايا صناعية متينة، لأنه يمكن من توليد تدرجات بروتونات عبر الغشاء—وهي العملة الأساسية للطاقة في الأنظمة الحية. من خلال إعادة خلق تحويل الطاقة الكيميائية الأسموزية في بيئة غشائية مصغرة مضبوطة²⁸، يمكن لهذه الحويصلات أن تدفع تخليق ATP، والنقل النشط، والتفاعلات الأيضية، مما يؤسس الأساس الطاقي اللازم لوظيفة ذاتية الحياة وذاتية التأثير. أحد المضخات البروتونية الممثلة المستخدمة في مثل هذه الأنظمة هو السيتوكروم بو₃أوكسيداز من الإشريكية القولونية، وهو إنزيم تنفسي نهائي يربط تقليل الأكسجين بنقل البروتونات عبر الغشاء. نظرا لأن انتقال الإلكترونات وضخ البروتونات مرتبطان ارتباطا وثيقا، يمكن مراقبة نشاطهما في الحويصلات الصناعية كميا إما من خلال استهلاك الأكسجين ^1,20 أو بتتبع تكوين تدرج البروتونات¹.

في هذا البروتوكول، نقدم سير عمل مفصل لتحضير LUVs المعتمدة على PDMS-g-PEO، بما في ذلك الأغشية الهجينة من البوليمر النقي وبوليمر/الدهون، ووظائفها مع بروتينات الغشاء، وتوسعها إلى GUVs، وقياسات نشاط مضخة البروتون المعاد تشكيلها من خلال اختبارات استهلاك الأكسجين السائل وقياسات ضخ البروتون الأحادي الحويصلة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يجب التخلص من جميع النفايات الكيميائية الخطرة الناتجة خلال هذا البروتوكول وفقا للوائح المؤسسية والمحلية.

1. التحضير لبيو-بيدز SM-2

ملاحظة: يتم غسل بيو-بيدز SM-2 مسبقا بالميثانول لإزالة المواد الحافظة والملوثات العضوية قبل امتصاص المنظفات.

ضع ورق الفلتر في قمع زجاجي موضوع فوق كأس زجاجي نظيف أو قارورة.
أضف على الأقل 600 ملغ من Bio-Beads SM-2 إلى القمع (وهو ما يكفي لثلاث مرات إعادة التكوين لكل من LUVs الهجين والبوليمر).
ملاحظة: يتطلب كل إعادة تركيب ما لا يقل عن 90 ملغ من بيو-بيدز SM-2 حسب الخطوة 4.4.1. يمكن إعداد كمية أكبر إذا تم التخطيط لمزيد من إعادة التأسيس.
اغسل الخرزات ثلاث مرات بالميثانول النقي، مع استخدام حجم كاف لغمر الخرزات بالكامل في كل مرة.
تحذير: قم بجميع خطوات التعامل مع الميثانول في غطاء بخار كيميائي.
اغسل الخرز فورا ثلاث مرات بماء ميلي-كيو لإزالة بقايا الميثانول.
ملاحظة: لا تدع الخرزات تجف أثناء عملية الغسيل. عند إزالة محاليل الغسيل، تأكد من بقاء الخرزات رطبة ولا تسمح لها بأن تجف تماما.
انقل الخرزات المغسولة إلى حاوية تخزين مناسبة (مثل أنبوب طرد مركزي معقم بسعة 50 مل من البولي بروبيلين أو زجاجة زجاجية مع غطاء مغلق بإحكام)، أضف ماء ميلي-كيو حتى تغمر الخرزات تماما، وخزنها عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.

2. وسم الفلورة لبروتينات الغشاء

تخفيف البروتين
1. قم بإذابة أوكسيداز السيتوكروم _{بو 3} إلى 2.2 ملغ/مل في محلول HEPES بحجم 20 ملممول يحتوي على 0.05٪ من n-dodecyl β-D-مالتوسيد (DDM) (مع الخصم/الخلف)، pH 8.3. يضمن هذا الرقم الهيدروجيني نسبة كافية من الأمينات الأولية غير البروتونية (التفاعلية) لتحقيق وسم فعال.
  ملاحظة: للحصول على أفضل وضع علامة باستخدام أصباغ ATTO N-hydroxysuccinimidyl (NHS)، حافظ على درجة حموضة العزل بين 8.3 و8.5. بالنسبة للأصباغ الأخرى، اتبع تعليمات الشركة المصنعة بشأن اقتران البروتين، بما في ذلك شروط الموصى بها على التصنيف.
إضافة الصبغة
1. أضف فائض مولي بمقدار ثمانية أضعاف من استستر ATTO 643 N-hydroxysuccinimidyl (NHS) التفاعلي مع الأمين، مذاب عند 2 ملغ/مل في DMSO اللامائي، إلى محلول البروتين.
  ملاحظة: بالنسبة للأصباغ الأخرى، اتبع تعليمات الشركة المصنعة بشأن اقتران البروتين، بما في ذلك الفائض الموصى به من الصبغة إلى البروتين.
2. اخلط بلطف عن طريق النقر على أنبوب الطرد المركزي الدقيق ثلاث مرات لضمان توزيع متجانس للصبغة.
الحضانة
1. حضن خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة (20–25 درجة مئوية) لمدة 1.5 ساعة تحت تحريك خفيف (250 دورة في الدقيقة) في خلاط حراري، وفي الظلام لمنع التبييض الضوئي.
إزالة الصبغة غير المرتبطة
1. توازن عمود Superdex 200 10/300 GL (CV: 23.562 mL) مع حجم عمودي على الأقل (حوالي 48 مل) من مخزن تفريغ البروتين الغشائي (20 mM HEPES، pH 7.5، 200 mM KCl، 0.05٪ DDM (w/v)) بمعدل تدفق 0.3 مل/دقيقة باستخدام نظام تنقية ÄKTA.
  ملاحظة: لإزالة الصبغة الفلورية الزائدة، تكون أعمدة ترشيح الهلام الأقصر (طول السرير 10–20 سم) كافية عموما، خاصة للأصباغ الأقل محبة للماء. توصي شركة تصنيع الصبغة بإزالة الملح باستخدام مصفوفة Sephadex G-25. تم استخدام عمود Superdex 200 10/300 GL في هذه الدراسة بسبب توفر الجهاز.
2. تحميل ما يصل إلى 500 ميكرولتر من البروتين الموسوم باستخدام حلقة شعرية بحجم 1 مل وسحب بنفس المخزن عند 0.3 مل/دقيقة.
3. راقب الاشتر بقياس الامتصاص عند 280 نانومتر للبروتين و643 نانومتر لصبغة ATTO 643.
4. اجمع كسور بحجم 0.5 مل على حجم عمود 1.5. حدد الكسور التي تحتوي على كل من البروتين والصبغة. استخدم مباشرة إذا كان مركزا بما فيه الكفاية، أو ركز باستخدام وحدات مرشح أميكون الطرد المركزي. للتركيز باستخدام مرشحات الأميكون، استخدم مرشحا طرد مركزي بوزن جزيئي 30 كيلو دالتون، وجهاز طرد مركزي عند 14,000 × جرام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
تحديد تركيز البروتين ودرجة الوسم (DOL)
1. قس أطياف الامتصاص للمرافق المنقى.
2. احسب تركيز البروتين ومتوسط عدد جزيئات الصبغة لكل إنزيم باستخدام:
  
  حيث _{يمثل A الحد الأقصى} امتصاص الاقترافا عند أقصى امتصاص للصبغة (λ_abs؛ ATTO 643، λ = 643 نانومتر)، A₂₈₀ هو الامتصاص عند 280 نانومتر (أقصى امتصاص للبروتينات)، ε_بروت هو معامل انقراض المولر لسيتوكروم بو₃ أكسيداز (184,720 M⁻¹سم⁻¹)، ε_الصبغة هو معامل انقراض الصبغة المولارية (150,000 M⁻¹سم⁻¹)، وCF₂₈₀ هو عامل تصحيح لامتصاص ATTO 643 عند 280 نانومتر (0.04).

3. تحضير الحويصلات أحادية السطح الكبيرة (LUVs)

تحضير طبقة رقيقة من البوليمر أو البوليمر/الدهون
1. استخدم ماصات ذات إزاحة إيجابية ذات أطراف مقاومة للمذيبات أو حقن زجاجية محكمة العزل لنقل محاليل البوليمر والدهون وصبغات الفلورية المذابة في الكلوروفورم:الميثانول (2:1، فولت/فولت) إلى قارورة زجاجية نظيفة وفقا للتراكيب المدرجة في الجدول 1.
  تحذير: قم بالتعامل مع المذيبات بالكامل تحت غطاء بخار وارتداء قفازات واقية ونظارات أمان.
2. اخلط المحلول جيدا عن طريق الدوامة اللطيفة مع تثبيت القارورة بشكل عمودي لضمان التجانس.
  تحذير: اضبط سرعة الدوامة بعناية لمنع السائل من الرش أو الرش من القارورة على يديك.
3. تبخر المذيبات العضوية تحت تيار لطيف من النيتروجين داخل غطاء الزجاج لمدة ساعة تقريبا، حتى يتكون طبقة رقيقة منتظمة على جدار القارورة (الشكل 1).
  ملاحظة: ضبط تدفق النيتروجين بحيث يتحرك السائل برفق دون أن يرش الماء؛ التدفق العالي جدا يمكن أن يسبب تكون الفيلم غير المتساو. بعد 5–10 دقائق، يمكن زيادة التدفق قليلا لضمان الجفاف الكامل وانتشار خليط الحويصلات على قاع القارورة.
إعادة ترطيب الفيلم
1. أعد ترطيب الفيلم المجفف ب 1 مل من محلول إعادة الترطيب (1 ملليموتر تريس-HCl، درجة الحموضة 7.5، 200 ملليمولار السكروز) للحصول على تركيز نهائي للأمفيفيل يبلغ 5 ملغ/مل (يعادل 1.67 ملليمولار للبوليمرسومات و2.14 ملليمول للحويصلات الهجينة). إذا تم استخدام البوليمرسومات لإعادة التكوين، أضف محلول إعادة الترطيب ب 0.1٪ كولات الصوديوم.
  تحذير: كولات الصوديوم مهيج خفيف. تجنب التلامس المطول للجلد واستنشاق البودرة. التعامل مع الأمر وفقا لورقة بيانات السلامة الخاصة بالشركة المصنعة (SDS).
2. تدور دوامة بقوة حتى ينفصل الفيلم تماما ويعلق، مكونة حويصات متعددة الصفائح (MLVs).
دورات التجمد والذوبان (الحويصلات الهجينة فقط)
1. يتم تعليق العينات الهجينة في MLV إلى خمس دورات تجميد وإذابة كما يلي: تجميد العينات في النيتروجين السائل لمدة دقيقة واحدة، ثم إذابتها في حمام ماء بدرجة حرارة 35 درجة مئوية حتى تذوب تماما، ودوامة عند 2500–3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية باستخدام هزاز الأنبوب. كرر هذا الإجراء لمدة خمس دورات إجمالا.
  ملاحظة: تجاوز هذه الخطوة للبوليمرسومات النقية.
  تحذير: النيتروجين السائل (−196 درجة مئوية) يمكن أن يسبب حروقا شديدة بسبب التبريد. أمسك في منطقة جيدة التهوية وارتدى معدات الحماية الشخصية المناسبة (قفازات تبريدية، نظارات أمان، ومعطف مختبر). تجنب ملامسة الجلد والعينين.
البثق
1. انقل تعليق الحويصلات إلى جهاز صغير مزود بغشاء بولي كربونات بحجم مسام 100 نانومتر.
2. قم ببثق التعليق 21 مرة للحصول على LUVs متجانسة في الحجم.
  ملاحظة: تأكد من أن خطوة البثق النهائية تترك تعليق LUV في الحقنة المقابلة للحقنة التي تحمل التحميل الأولي. يقلل هذا من تلوث العينة النهائية بحويصلات أكبر أو مواد متبقية قد لا تكون مرت بالكامل عبر الغشاء.
التخزين
1. تخزين تعليق LUV عند 4 درجات مئوية واستخدامه خلال أسبوع للحفاظ على توزيع حجم الحويصلات ومنع التجمع أو نمو الميكروبات في المخزن المحتوي على السكروز.
2. قبل الاستخدام، قم بتجانس تعليق LUV بلطف عن طريق الدوامة.

4. إعادة تكوين بروتين الغشاء إلى LUVs

معالجة ما قبل الحويصلات باستخدام المغسلة
1. انقل 200 ميكرولتر من LUVs إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 2 مل (الشكل 1). عند استخدام LUVs الهجينة، أضف 1 ميكرولتر من كولات الصوديوم 20٪ (مع الفولت) للحصول على تركيز نهائي للمنظف يبلغ 0.1٪ (w/v). عند استخدام LUVs بوليمرية، لا حاجة لمنظف إضافي لأن كولات الصوديوم موجود بالفعل.
  ملاحظة: جهز مخزن المنظف في نفس المخزن المستخدم في التجارب لضمان التوافق مع الحويصلات.
2. اخلط بلطف عن طريق النقر الخفيفة على أنبوب الطرد المركزي الدقيق ثلاث مرات. تجنب التحريك القوي أو الدوامات، التي قد تنتج الرغوة وتسبب فقاعات هواء.
إدخال البروتين إلى الحويصلات المعالجة بالمنظفات
1. أضف سيتوكروم بو₃ أوكسيداز (لقياس النشاط) أو سيتوكروم _{بو 3} أوكسيداز – ATTO 643 (للتصوير الفلوري) إلى الحويصلات غير المستقرة بالمصارف لتحقيق تركيزات البروتين النهائية التالية: للبوليمرسومات، 0.556 ميكرومولار لتجارب LUV و1.112 ميكرومولار لتجارب GUV؛ للحويصيلات الهجينة، 0.714 ميكرومولار لتجارب LUV و1.428 ميكرومولار لتجارب GUV.
  ملاحظة: تتوافق هذه التركيزات مع نسبة مولية للبروتين إلى البوليمر تبلغ 1:3,000 للبروتينات المنخفضة و1:1,500 للبروتينات السطحية السطحية.
2. أضف البروتين ببطء أثناء الخلط بلطف، بهدف توزيعه بشكل متساو في المحلول وتجنب التركيز المفرط محليا.
  ملاحظة: قد يختلف حجم البروتين المضاف بين الأجزاء بسبب اختلافات في تركيز مخزون البروتين.
تجميع مركبات البروتين-المنظيف-البوليمر
1. حضن الخليط عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة مع تحريك خفيف (400 دورة في الدقيقة) في خلاط حراري للسماح بتكوين تجمعات مختلطة من البروتين والمغسل والبوليمر قبل إزالة المنظفات.
إزالة المنظفات
1. إزالة المغسلة بإضافة بيو-بيدز SM-2 (Bio-Rad) بشكل متتالي. أزل 30 ملغ من بيو-بيدز من محلول التخزين، مع التأكد من بقائها رطبة (رطبة ولكن بدون سائل زائد). أضف الخرزات إلى العينة وحضن لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية مع تحريك خفيف عند 600 دورة في الدقيقة في خلط حراري. كرر هذه الخطوة مرتين إضافيتين، ليصبح المجموع 90 ملغ من بيو-بيدز ووقت الحضانة الكلي 1.5 ساعة.
  ملاحظة: استخدم فقط خرز بيولوجي مرطب بالكامل. لا تنقل الخرزات الجافة، أو الخرزات الملتصقة بجدران أنبوب التخزين في Bio-Beads، أو الخرزات الطافية على السطح. إذا التصقت الخرزات بجدار أنبوب تفاعل إعادة التكوين فوق مستوى السائل بعد الإضافة، قم بعمل طرد مركزي مؤقت للأنبوب (مثلا 3–5 ثوان في جهاز الطرد المركزي المصغر على الطاولة) لجمع الخرزات من الأسفل قبل الحضانة.
2. قم بعمل حبيبات الحبيبات الحيوية بالطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة دقيقتين باستخدام جهاز طرد مركزي صغير على سطح الطاولة. اجمع الفائق بعناية دون إزعاج حبيبات الخرز.
  ملاحظة: كبديل للطرد المركزي، دع الخرزات تستقر بالجاذبية لمدة تقارب 5 دقائق، ثم أزل السوبرناتانت بعناية.
التخزين
1. تخزين ب_{bo 3-LUVs} المعاد تكوينها عند 4 درجات مئوية واستخدمها في نفس اليوم لقياس نشاط البروتين.

5. حجم وتشتت LUVs بواسطة تشتت الضوء الديناميكي (DLS)

تحميل LUVs لقياسات DLS
1. انقل 45 ميكرولتر من تعليق LUV أو Proteo-LUV غير المخفف إلى كوفيت كوارتز نظيف. تأكد من أن الكوفيت خال من الغبار أو بصمات الأصابع أو أي بقايا أخرى لتقليل تشتت الضوء.
  ملاحظة: تجنب إدخال فقاعات الهواء، لأنها قد تتداخل مع قياسات DLS. لمنع ظهور فقاعات، قم بعمل الماصة ببطء على طول جدار الكوفيت ولا تطرد آخر قطرة بقوة. إذا تكونت فقاعات صغيرة، دعها ترتفع وتتلاشى قبل القياس.
تحديد حجم وتشتت LUV بواسطة DLS
1. قس القطر الهيدروديناميكي ومؤشر التشتت المتعدد (PDI) باستخدام جهاز DLS مزود بليزر هيليوم-نيون بقطر 633 نانومتر وكشف التشتت العكسي بزاوية ثابتة 173°.
2. قم بإجراء ثلاث قياسات مستقلة على الأقل لكل عينة لضمان قابلية التكرار.
3. تحليل البيانات باستخدام نموذج التوزيع الطبيعي، الأغراض العامة (التوزيع الطبيعي) للحصول على متوسط الحجم ومؤشر التناسل.

6. تحليل استهلاك الأكسجين في المركبات المنخفضة المنخفضة

إعداد درجة الحرارة
1. اضبط غرفة القياس في نظام قطب الأكسجين من نوع كلارك على 22 درجة مئوية والسماح للنظام بالاستقرار.
إضافة المخزن المؤقت
1. أضف 1 مللي مولار من Tris-HCl (pH 7.5)، و200 ملليمول من السكروز إلى غرفة القياس ليصل إجمالي الحجم إلى 1,000 ميكرولتر. اضبط حجم المخزن وفقا لنوع العينة: 942.9 ميكرولتر لبوليمر_bo 3-LUVs و953.7 ميكرولتر للهجين _bo-3-LUVs.
  ملاحظة: الحجم المتبقي سيشغل بواسطة LUVs وخليط DTT/Q₁ للوصول إلى حجم القياس النهائي.
إضافة LUVs
1. أضف مركبات_{بو 3-LUV} إلى غرفة القياس وابدأ التحريك اللطيف باستخدام التحريك المغناطيسي عند 100 دورة في الدقيقة و22 درجة مئوية. اضبط حجم bo 3-LUVs لتحقيق تركيز نظري من أوكسيداز bo₃ يبلغ حوالي 27 نانومتر: 48.6 ميكرولتر لبوليمر_{bo 3-LUVs} و37.8 ميكرولتر للهجين bo 3-LUVs.
  ملاحظة: بالنسبة للتحكم السلبي، استبدل BO 3-LUVs بحجم مكافئ من LUVs الخالية من البروتين بنفس تركيبة وتركيز الدهون والبوليمر. جميع الخطوات اللاحقة تبقى متطابقة.
القياس الأساسي
1. دع تركيز الأكسجين يستقر وقم بالقياس لمدة 3 دقائق تحت التحريك المستمر عند 22 درجة مئوية للحصول على خط أساس مستقر.
تحضير خليط الاختزال / الكينون
1. جهز خليط DTT/Q₁ مباشرة قبل الاستخدام عن طريق خلط 9.6 ميكرولتر من 1 M DTT في ماء Milli-Q مع 0.6 ميكرولتر من 80 mM يوبيكينون-1 (Q₁) في DMSO، ثم قم بعمل دوامة كاملة لضمان التجانس.
تنشيط الإنزيمات
1. تفعيل أوكسيداز_bo3 بإضافة 8.5 ميكرولتر من خليط DTT/Q₁ الطازج إلى غرفة القياس، مما ينتج تركيزات نهائية 8 mM DTT و40 ميكرومولار Q₁.
النسخ المقلدة
1. قس كل عينة ثلاث مرات لضمان قابلية التكرار.
تحليل البيانات
1. ارسم تركيز الأكسجين مقابل الوقت. تحديد ميل الجزء الخطي من المنحنى، والذي يتوافق مع معدل استهلاك الأكسجين.
التقارير
1. أبلغ معدل استهلاك الأكسجين كمتوسط لثلاثة قياسات، مع الانحراف المعياري.

7. تحضير GUVs الوظيفية بالبروتين

تنظيف البلازما لشرائح الزجاج المطلية ب ITO
1. ضع شرائح زجاجية مغطاة بأكسيد القصدير (ITO) داخل منظف البلازما بحيث يكون الجانب الموصل (المطلي ب ITO) مواجها للأعلى. تقوم البلازما بتنظيفها لمدة دقيقة واحدة عند إعداد طاقة عالية ("HI") (230 فولت، أقصى قدرة تردد لاسلكي 18 واط) وضغط يقارب 0.5 مللي بار.
  ملاحظة: يمكن تأكيد نجاح الاشتعال بالبلازما بصريا من خلال ظهور توهج وردي/بنفسجي داخل الحجرة.
الجفاف الجزئي للبروتيو-LUVs
1. اخلط 20 ميكرولتر من LUVs الخالية من البروتين مع 20 ميكرولتر من بروتيو-LUVs التي تحتوي على bo₃ أوكسيداز-ATTO 643 المعاد تشكيله. الدوامة بلطف لضمان خلط متجانس.
2. يتم وضع سبع قطرات بحجم 2 ميكرولتر من تعليق LUV/بروتيو-LUV الناتج بسعة 5 ملغ/ملليتر على السطح الموصل (المطلي ب ITO) لكل شريحة تستخدم للتشكيل الكهربائي (الشكل 2A). وزع القطرات بشكل متساو على سطح 160.6 مم² ، مع الحفاظ على فصلها لتعزيز تكوين الفيلم بشكل منتظم.
  ملاحظة: بالنسبة لأنظمة البوليمر الأخرى، قد يتطلب تركيز LUV وحجم القطرات تحسينا (النطاق النموذجي: 5–100 ملغ/ملتر LUVs؛ 0.2–2 ميكرولتر قطرات).
3. دع القطرات تجف جزئيا عند درجة حرارة الغرفة (∼22 درجة مئوية) ورطوبة ∼20٪ لمدة تقارب 40 دقيقة، أو حتى تتكون حلقة بيضاء عند محيط القطرة (الشكل 2B).
  ملاحظة: الجفاف يعتمد على الرطوبة المحيطة. إذا كانت الرطوبة النسبية فوق 40٪، قم بتمديد وقت الجفاف حسب الحاجة (حتى 20 دقيقة). حدد نقطة النهاية بناء على ظهور حلقة بيضاء عند محيط القطرة بدلا من وقت محدد. تحت ظروف بيئية متسقة (درجة الحرارة والرطوبة)، يمكن تكرار وقت الجفاف المطلوب. تجنب الجفاف الزائد، الذي يظهر على شكل قطرات بيضاء مسطحة تماما وموحدة، لأن ذلك قد يسبب ترسيب البروتين.
تجميع غرفة التشكيل الكهربائي
1. قم بتجميع غرفة التشكيل الكهربائي عن طريق وضع منزلقين مطليين بتقنية ITO (الجوانب المطلية تواجه الداخل) مفصولين بفاصل سيليكون بسماكة 1.81 مم مع قطع من أحد الجانبين، مما يسمح بإضافة أو إزالة المخزن أثناء التعبئة والتجميع.
2. املأ الحجرة بمحلول إعادة الترطيب (1 ملليمولايتر تريس-HCl، درجة حموضة 7.5؛ 200 ملم سكروز).
  للتجارب الحساسة للرقم الهيدروجيني، أضف 10 ميكرومولار بيرانين (8-هيدروكسي بيرين-1,3,6-حمض ثلاثي السلفونيك ثلاثي الصوديوم، HPTS) إلى المخزن المؤقت.
التشكيل الكهربائي
1. تطبيق مجال كهربائي متردد جيبي باستخدام البرنامج التالي: 50 هرتز عند 50، 100، 200، 300، 500، 700، و900 مللي فولت لمدة 6 دقائق لكل منها؛ 50 هرتز عند 1.1 فولت لمدة ساعتين.
  ملاحظة: لتعزيز تكوين بروتيو-GUVs أكبر، يمكن تمديد هذه الخطوة إلى 12 ساعة، و4 هرتز عند 2 فولت لمدة 30 دقيقة لخطوة الانفصال. عندما يحتوي المخزن على 10 ميكرومولايت بيرانين، زد التردد إلى 500 هرتز خلال أول خطوتين لزيادة الجهد.
مجموعة المركبات القديمة
1. افتح الحجرة بعناية باستخدام الملقط واجمع ماصات GUV باستخدام ماصات FineTip Ultra-Micro Pastette (أو ماصات نقل منخفضة القص مكافئة) لتقليل الإجهاد الميكانيكي.
  ملاحظة: تجنب استخدام رؤوس الماصات منخفضة الحجم القياسية التي تقل عن 200 ميكرولتر، لأنها قد تتسبب في تمزق الماصات الأكبر حجما. بدلا من ذلك، يمكن قطع الأطراف القياسية في النهاية لتوسيع الفتحة وتقليل القص أثناء الجمع.
التخزين
1. تخزين بروتيو-GUVs عند 4 درجات مئوية واستخدمها خلال 48 ساعة للحفاظ على نشاط البروتين.
  ملاحظة: يعتمد معدل فقدان النشاط على نوع واستقرار بروتين الغشاء المعاد تشكيله، وكذلك على تركيب الغشاء.

8. المجهر لجرثات GUV الوظيفية البروتينية

إعداد المجهر
1. شغل المجهر الكونفوكلي. إذا كنت تستخدم نظام لايكا، قم بتشغيل برنامج LAS X. بالنسبة لعلامات المجاهر الأخرى، استخدم برنامج الاستحواذ الموصى به من الشركة المصنعة.
2. اختر هدف غمر الزيت بحجم 63× (NA 1.40)؛ قم بتعديل التكبير إلى تكبير أعلى أو أقل إذا لزم الأمر، حسب حجم GUV.
3. افتح قناتين تصويريتين تقابلان الفلوروفورات: رودامين ريد (غشاء) وATTO 643 (بروتين معاد تكوينه).
  ملاحظة: بالنسبة للفلوروفورات ذات الأطياف المتداخلة جزئيا، اختر خطوط ليزر مناسبة ونوافذ كشف ضيقة لتقليل التداخل الطيفي. احصل على كل قناة بشكل متسلسل لمنع تسرب الإشارة وضمان قياس دقيق للفلورة.
ترسيب المركبات الأرضية السطحية
1. ضع عازل سيليكون من نوع الضغط للختم على غطاء زجاجي نظيف بحجم 1.5 (سمك 0.17 مم).
  ملاحظة: للمجاهر العمودية (غير المقلوبة)، قد تستخدم شرائح زجاجية أكثر سماكة.
2. بيبت 60 ميكرولتر من المخزن (1 مللي مولار تريس-HCl، درجة حموضة 7.5؛ 200 ملليمولار جلوكوز) في مركز الفاصل.
3. أضف بلطف 20 ميكرولتر من نظام التعليق GUV فوق المخزن المؤقت.
4. غط الحجرة فورا بشريحة زجاجية ثانية لتجنب التبخر.
5. اترك الشفرات السطحية تترسب لمدة ~5 دقائق قبل التصوير.
الحصول على الصور
1. ركز على أسفل الحجرة لالتقاط مقاطع عرضية لوحدات GUV.
2. التقاط صور لمختلف GUVs في جميع أنحاء الغرفة عن طريق المسح بشكل منهجي من الزاوية العلوية-اليسرى إلى الزاوية السفلية اليمنى (نمط "الأفعى") للحصول على عدد ممثل (~100 GUVs). صور جميع الحويصلات التي تصادفها أثناء الفحص دون اختيار مسبق، بغض النظر عن الحجم أو شدة الفلورة، لتجنب تحيز الانتقاء وضمان قابلية التكرار.
  ملاحظة: تجنب التصوير المتكرر لنفس الأشعة الخضراء لمنع التبييض الضوئي.
تحليل الصور
1. قم بقياس شدة الفلورة للبروتين الموسوم ب ATTO 643 المعاد تشكيله عن طريق رسم خط متعدد على طول غشاء ال GUVs الفردية. عند استخدام برنامج LAS X، اختر Quantify → Line Profile، ثم اختر أداة البوليلاين وتتبع غشاء كل GUV. للحصول على متوسط شدة التألق، افتح الإحصائيات وسجل القيمة المتوسطة. تحليل فقط الشوائب النظيفة وأحادية الطبقات؛ استبعد الحويصلات متعددة الحويصلات والحويصلات المجمعة من التحليل.
  ملاحظة: إذا تم التقاط القياسات في أيام مختلفة، يجب أن يتم تطبيع شدة الفلورة إلى طاقة الليزر، وتقاس تحت إعدادات تصوير متطابقة (الطول الموجي والقدرة الاسمية). لأخذ التغيرات اليومية في خرج الليزر في الاعتبار، يتم تطبيق التطبيع التالي: ، حيث F_a.u. هي شدة الفلورة المقاسة بوحدات عشوائية، وP_{المرجعي} هي قوة الليزر المقاسة في اليوم المرجعي، و هي قوة الليزر المقاسة في يوم الاستحواذ. يفترض هذا التصحيح وجود علاقة خطية بين قوة الليزر وشدة الفلورة تحت ظروف إضاءة غير مشبعة. في هذه الدراسة، تم التقاط جميع الصور في نفس اليوم، وبالتالي لم يكن هناك حاجة لتطبيع الصور.
2. أبلغ عن شدة الفلورة بمتوسط 100 GUV مع الانحراف المعياري المقابل.

9. تحليل ضخ البروتونات في بروتيو-GUVs

إعداد المجهر
1. شغل المجهر الكونفوكلي وشغل برنامج الاستحواذ المناسب (مثل LAS X لأنظمة لايكا).
2. اختر هدف غمر زيت بحجم 63× (NA 1.40). قم بضبط التكبير إلى تكبير أعلى أو أقل إذا لزم الأمر، حسب حجم GUV.
3. قم بتكوين ثلاث قنوات تصوير تتوافق مع الفلوروفورات. بالنسبة لعلامة الرودامين الأحمر (علامة الغشائية)، استخدم إثارة 561 نانومتر ونطاق انبعاث بين 570–620 نانومتر. بالنسبة للبيرانين (صبغة حساسة لدرجة الحموضة مغلفة)، استخدم الإثارة عند 448 نانومتر و405 نانومتر، واجمع الانبعاث عبر 499–551 نانومتر.
  ملاحظة: إذا كان ليزر 458 نانومتر متاحا، استخدمه بدلا من 448 نانومتر لتحفيز الشكل الأساسي (منزوع البروتون) من البرانين.
4. قم بضبط قوة الليزر وكسب الكاشف لتجنب تشبع البكسل وتقليل التبييض الضوئي. حافظ على إعدادات الاستحواذ ثابتة طوال فترة التجربة.
ترسيب المركبات الأرضية السطحية
1. أضف 280 ميكرولتر من المخزن (1 ملليموتر تريس-HCl، رقم الهيدروجينيوم 7.5؛ 200 ملليمولر جلوكوز) إلى بئر واحد من شريحة ذات 8 آبار (إجمالي حجم البئر: ~874 ميكرولتر).
  ملاحظة: لا تستخدم أقل من 200 ميكرولتر، لأن الأحجام التي تقل عن 200 ميكرولتر تزيد من التبخر وانحراف الرقم الهيدروجيني. لا تتجاوز 400 ميكرولتر لتجنب الانسكابات وضمان سهولة استخدام الماصبات. إذا كنت تستخدم صيغة غرفة مختلفة، اضبط الصوت وفقا لذلك. بالنسبة للمجاهر المقلوبة، استخدم شرائح الحجرة المتوافقة بسماكة انزلاق الغطاء #1.5H.
2. أضف بلطف 20 ميكرولتر من نظام تعليق _3-GUV فوق المخزن دون إدخال فقاعات هواء.
  ملاحظة: بالنسبة للتحكم السلبي، استبدل نظام التعليق_بحجم مكافئ (20 ميكرولتر) من الميكروفون الخالي من البروتين من نفس تركيبة الدهون/البوليمر، محضرة وترسبة تحت ظروف متطابقة. هذا الضابط يأخذ في الاعتبار أي تأثيرات غير محددة ل DTT و_Q1 على نسبة فلورة البرانين التي تكون مستقلة عن نشاط أوكسيداز bo₃ .
3. اترك الترسب من الألياف السطحية (GUVs) تتراسب لمدة تقارب 5 دقائق قبل التصوير.
الاستحواذ الأساسي
1. ركز على المستوى السفلي من الغرفة حيث ترسبت مركبات GUV.
2. اضبط التكبير للحصول على 3–6 صور GUV ضمن مجال الرؤية.
3. سجل التألق الأساسي في جميع القنوات لمدة 5 دقائق قبل التفعيل.
تنشيط ضخ البروتونات
1. جهز خليطا جديدا من DTT–Q₁ مباشرة قبل الاستخدام بخلط 4.8 ميكرولتر من 1 M DTT مع 0.3 ميكرولتر من 80 مللي مولار Q₁ في DMSO، ثم الخلط جيدا عن طريق الدوامة.
2. تفعيل أوكسيداز السيتوكروم_{بو 3} عن طريق إضافة 2.6 ميكرولتر من خليط DTT–Q₁ بلطف إلى سطح المحلول دون إدخال طرف الماصة في المخزن المؤقت، مما يؤدي إلى تركيزات نهائية تقارب 8 مللي مولار DTT و40 ميكرومولار Q₁ في الحجرة.
3. مراقبة التألق داخل الحويصات لمدة 30 دقيقة تحت الاكتساب المستمر.
تحليل فلورة البرانين داخل الحويصة
1. لكل GUV، حدد منطقة اهتمام (ROI) داخل تجويف الحويصلة. في برنامج LAS X، اذهب إلى Quantify → Stack Profile، اختر رسم البيضاوي، وارسم ROI دائري داخل كل GUV.
2. لتحديد متوسط شدة الفلورة عند 499–551 نانومتر لكل من الطول الموجي للإثارة (448 نانومتر و405 نانومتر)، افتح الإحصاءات في البرنامج وسجل القيمة المتوسطة.
3. احسب نسبة الفلورة ك R = I₄₄₈/I₄₀₅.
4. رسم النسبة على مدى الزمن للحصول على آثار حركية لتغير الحموضة داخل الحويصل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم التعبير عن سيتوكروم بو₃ أكسيداز الإشريكية القولونية من بلازميد pETcyo في سلالة الإشريكية القولونية C43 (DE3) ΔcyoABCDE وتم تنقيه كما تم وصفه سابقا²⁹. تم استخدام أوكسيداز بو₃ المنقى مباشرة لإعادة التكوين وقياسات النشاط، أو وسم بأصباغ فلورية مثل ATTO 643 (هذه الدراسة) أو أصباغ ATTO^الأخرى ^1,15. بالنسبة للأصباغ شديدة المحبة للماء مثل ATTO 643، تم استخدام عمود بطول 30 سم لتحقيق فصل فعال للصبغة غير المرتبطة عن البروتين الموسوم (الشكل 3A). درجة الوسم (DOL)، التي تحسب من أطياف الامتصاص، تراوحت عادة بين 1.1–1.3 جزيء صبغة لكل إنزيم، اعتمادا على صبغة ATTO المستخدمة. بالنسبة لإكسيداز بو₃ الموسوم ب ATTO 643، كان DOL 1.16 (الشكل 3B).

لإعادة تكوين البروتينات، تم تحضير LUVs أولا عبر إعادة ترطيب الأغشية الرقيقة، تلتها دورات تجميد وإذابة وبثق للحصول على أحجام حويصلات منتظمة. بالنسبة للبوليمرسومات، تم إضافة مسحوق تنظيف لمحلول إعادة الترطيب. تم تحليل توزيعات حجم الحويصلات بواسطة تشتت الضوء الديناميكي قبل إعادة التكوين (الشكل 4، الجدول 2). عادة ما أظهرت كل من LUVs الهجينة والبوليمرية أقطارا متوسطة تتراوح بين 85–95 نانومتر مع توزيعات ضيقة الحجم (PDI < 0.2). من المتوقع أن تكون الحويصلات القائمة على PDMS-g-PEO أصغر قليلا من حجم المسام الاسمي لغشاء البثق. أظهرت البوليمرسومات النموذجية أحجاما متجانسة للغاية، حيث كانت قيم PDI أقل من 0.1، في حين شكلت الحويصلات الهجينة مجموعات متجانسة نسبيا مع قيم PDI أحيانا أعلى من 0.1 ولكن باستمرار أقل من 0.2.

ثم تم إدخال بروتين الغشاء bo3 oxidase في LUVs بوجود منظف (صوديوم كولات في هذه الدراسة). تمت إزالة المنظف لاحقا باستخدام بيو-بيدز. بعد إعادة التكوين، زاد حجم البوليمرسوم بشكل طفيف فقط (الشكل 4A)، بينما بقي حجم الحويصلات الهجينة دون تغيير (الشكل 4B). في كلا النظامين، لوحظت زيادة طفيفة في مؤشر التناسل الشخصي (الجدول 2). من المتوقع أن تتغير مثل هذه التغيرات الطفيفة في الحجم، حيث يمكن أن تعيد الذوبان والإزالة بواسطة المنظفات تنظيم سلاسل البوليمر في الغشاء. تم تقييم نشاط البروتين بقياس استهلاك الأكسجين، والذي يشير إلى ما إذا كان البروتين يحتفظ بالنشاط الوظيفي (الشكل 5A). غياب استهلاك الأكسجين في جهاز التحكم السلبي LUV الخالي من البروتين يؤكد أن الإشارة المرصودة تنشأ تحديدا من نشاط أوكسيداز بو₃. مع إعادة التكوين التي تعبر عن طريق كولات الصوديوم عند التركيزات المستخدمة هنا، كان نشاط البروتين عادة أعلى قليلا في الحويصلات الهجينة مقارنة بالبوليمرسومات (الشكل 5B). لوحظ بعض التباين في نشاط البروتين بين دفعات التنقية وحتى بين الأجزاء داخل نفس الدفعة. لذلك، في الدراسات المقارنة—مثل مقارنة نشاط البروتين عبر أنظمة الأغشية المختلفة—يجب استخدام نفس نسبة البروتين المنقى لضمان الاتساق.

لتوليد PDMS-g-PEO وPDMS-g-PEO وPDMS-g-PEO/صويا GUVs PC، تم استخدام نهج الاندماج والتشكيل الكهربائي. في هذه الطريقة، تم خلط بروتيو-LUVs مع LUVs خالية من البروتين ووضعها على شرائح زجاجية مغطاة ب ITO، تليها جفاف جزئي لتعزيز اندماج الحويصلات وتكوين طبقة بوليمر/بروتين أو بوليمر/دهون/بروتين. أدى نقص الجفاف إلى انخفاض إنتاج بروتيو-GUV، وحجم أصغر من GUV، ووجود LUVs غير مدمجة (بروتيو).

تم تأكيد دمج البروتين الموسوم، بو₃ أوكسيداز–ATTO 643، في الغشاء بنجاح بواسطة المجهر الكونفوكالي بعد ترسيب GUVs في تدرج كثافة السكروز/الجلوكوز (الشكل 6A، B). يمكن تحييز كمية الفلورة المرتبطة بالغشاء باستخدام ملف خط بسيط، حيث تعتمد شدة القياس على الزاوية التي يرسم بها الخط. لتقليل هذا التأثير، تم تقييم شدة الفلورة باستخدام خط متعدد مرسوم على طول كامل محيط الغشاء لكل GUV.

لتقييم الارتباطات المحتملة بين حجم الحويصلات ودمج البروتين، تم تحليل قطر GUV بالتوازي (الشكل 6C، D). عادة ما أظهرت الحويصلات الأكبر حجما (فوق 20 ميكرومتر) تألق أقل في البروتين المرتبط بالغشاء مقارنة بالحويصلات الأصغر. قد يعزى هذا الملاحظة إلى آلية الاندماج–التشكيل الكهربائي: تتكون الحويصلات الأصغر مبكرا وقد تدمج البروتينات بكفاءة أكبر، بينما تنشأ الحويصلات الأكبر من أحداث اندماج لاحقة ونمو الغشاء، مما قد يؤدي إلى تخفيف المواد الفقيرة بالبروتين.

يتم تحديد دمج البروتين بشكل عام بشكل أساسي في المرحلة المبكرة من إعادة التكوين إلى LUVs، خاصة من خلال نوع المغسلة وتركيزه والخطوة التي يضيف. بالنسبة لحويصلات LUV البوليمرية، لوحظ دمج أقل قليلا عند إضافة المغسلة إلى الحويصلات المكونة مسبقا مقارنة بالإضافة أثناء تكوين الحويصلات (خطوة إعادة الترطيب)، مما أدى إلى شدة فلورية تبلغ 18.9 ± 3.9 وحدة وحدة و20.6 ± 3.7 وحدة إلبورية على التوالي (الشكل 6C، D، على اليسار). بالنسبة للأنظمة الهجينة، حيث يضاف المنظف بعد تكوين الحويصلات، يلعب تركيز المنظف دورا ملحوظا: زيادة كولات الصوديوم من 0.015٪ إلى 0.1٪ أدت إلى زيادة ملحوظة في دمج البروتين (22.1 ± 5.2 وحدة وحدة مقابل 26.2 ± 5.0 وحدة إفريقية، الشكل 6C، D، يمين). عند مقارنة أنظمة البوليمر والأنظمة الهجينة، لوحظ عادة دمج أغشائي أعلى قليلا ل bo₃ oxidase في GUVs الهجينة. ويرجع ذلك على الأرجح إلى وجود عيوب تعبئة عند واجهات البوليمر-الدهون، والتي، بالإضافة إلى العيوب الناتجة عن المغسلات، توفر مواقع إدخال مناسبة لبروتينات الغشاء.

باستخدام خطوة التشكيل الكهربائي الثانية لمدة ساعتين، كان متوسط قطر bo₃ GUVs الوظيفية الأوكسيداز حوالي 14–15 ميكرومتر (13.5 ± 3.7 ميكرومتر للميكروبات البوليمرية GUVs و15.4 ± 6.3 ميكرومتر للحويصلات الهجينة)، رغم وجود حويصلات أكبر بشكل ملحوظ (الشكل 6C، D). زيادة مدة الخطوة الثانية للتشكيل الكهربائي إلى 12 ساعة أدى إلى زيادة إجمالية في حجم GUV^بمقدار ^1,27.

كما يتيح بروتوكول الاندماج والتشكيل الكهربائي تغليف الأنواع القابلة للذوبان في الماء، مثل الأصباغ الحساسة للرقم الهيدروجيني (مثل البرانين)، عن طريق إضافة الصبغة إلى مخزن إعادة الترطيب أثناء التكوين الكهربائي (الشكل 7A). عادة ما ينخفض حجم GUV عندما تتكون الحويصلات في وجود أصباغ قابلة للذوبان في الماء. لتعويض هذا التأثير، يجب زيادة التردد خلال خطوات التشكيل الكهربائي الأولية من 50–500 هرتز.

يمكن تغليف صبغة حساسة للرقم الهيدروجيني بنسبة مئوية، مثل البرانين، من مراقبة ضخ البروتونات بمفردها الحويصلة ويوفر نظرة على اتجاه مضخات البروتون. عند تحمض تجويف الحويصلة، تنخفض نسبة الفلورة للبرانين المثار عند 448 نانومتر و405 نانومتر. تعكس هذه النسبة حالة البروتونة للبرانين وبالتالي ترتبط بدرجة حموضة. القياسات النسبية مفيدة، لأنها غير حساسة إلى حد كبير لتغيرات كفاءة تغليف الصبغة والتبييض الضوئي. يظهر مثال على نشاط ضخ البروتونات في الشكل 7B، حيث لوحظ انخفاض في نسبة فلورة البرانين داخل الحويصية (I₄₄₈/I₄₀₅) في GUVs هجينة تحتوي على أوكسيداز bo₃ المعاد تشكيله بعد إضافة DTT المانح للإلكترونات والوسيط الإلكتروني Q₁. تبدأ نسبة الفلورة في الانخفاض بشكل حاد بعد حوالي دقيقة واحدة من التفعيل وتستمر في الانخفاض السريع لمدة دقيقة تقريبا، ثم تتباطأ خلال ~18 دقيقة التالية. يشير هذا السلوك إلى أن غالبية جزيئات أوكسيداز bo₃ موجهة بحيث يحدث ضخ البروتونات نحو داخل GUVs. أظهرت الفروع الخالية من البروتين التي تعرضت لظروف متطابقة انخفاضا أصغر في نسبة التألق، مما عمل كعامل تحكم سلبي وأكد أن الانخفاض الأكبر الذي لوحظ في بروتينات_bo-GUVs ينشأ تحديدا من نشاط ضخ بروتونات أوكسيداز bo₃ وليس من التأثيرات غير المحددة ل DTT و_Q1 على نسبة التألق في البرانين.

figure-results-1
الشكل 1. تمثيل تخطيطي لتحضير الحويصلة أحادية الطبقات الكبيرة (LUV)، وإعادة تشكيل بروتين الغشاء من السيتوكروم بو₃ أكسيداز إلى LUVs، وتكوين حويصلات عملاقة أحادية السطح ذات وظائف أكسيداز_BO3(GUVs) عبر نهج الاندماج-التشكيل الكهربائي. يتم تحضير LUVs عن طريق إعادة ترطيب الأغشية الرقيقة، ودورات التجميد والذوبان، والبثق عبر غشاء بحجم مسام بحجم 100 نانومتر. يتم إعادة تشكيل السيتوكروم بو₃ أوكسيداز بوجود المنظف، الذي يزال لاحقا باستخدام بيو-بيدز. تتكون ب_bo-GUVs عن طريق ترسيب _bo-LUVs على شرائح زجاجية مطلية بأكسيد القصدير الإنديوم (ITO)، تليها جفاف جزئي وإعادة ترطيب في وجود تيار كهربائي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2. تكوين طبقة حويصلية كبيرة وحيدة السطح (LUV) ملتحمة عن طريق الجفاف. تم ترسيب سبع قطرات بحجم 2 ميكرولتر من بروتيو-LUVs وLUVs مختلطة على شرائح زجاجية مغطاة بأكسيد القصدير الإنديوم (ITO): (أ) مباشرة بعد الترسيب و(ب) بعد الجفاف الجزئي. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3. وسم فلوري لسيتوكروم بو₃ أوكسيداز. (أ) كروماتوجرام (ملف إزراز) لبوكرو₃ أوكسيداز-ATTO 643 تم تنقيه على عمود سوبرديكس 200 10/300 جيلومتر. تم جمع الكسور المميزة بالرمادي وتركيزها لاحقا. (ب) أطياف الامتصاص لأوكسيداز بو₃ المركز ATTO 643، ويظهر ذروتا عند 280 نانومتر (بروتين)، 400 نانومتر (نطاق سوريت من عوامل الهيم في أوكسيداز بو₃ )، و643 نانومتر (صبغة). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4. توزيعات حجم الحويصلات أحادية السطح الكبيرة (LUVs) قبل وبعد إعادة تكوين البروتين: (أ) بوليمر بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان)-بولي (أكسيد الإيثيلين) (PDMS-g-PEO) و(ب) الحويصلات الهجينة PDMS-g-PEO/فوسفاتيديل كولين الصويا (PC). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5. استهلاك الأكسجين بواسطة أوكسيداز bo₃ المعاد تشكيله في الحويصلات أحادية السطح الكبيرة (LUVs). (أ) أثر تمثيلي لتركيز الأكسجين مع مرور الوقت بعد تنشيط سيتوكروم بو₃ أكسيداز المعاد تشكيله بإضافة ديثيوثرايتول (DTT) ويوبيكينون-1 (Q₁). الأثر الأخضر يتوافق مع LUVs المعاد تشكيلها بواسطة البروتين، والأثر الرمادي يعادل الضابط السلبي (LUVs الخالية من البروتين). (ب) معدلات استهلاك الأكسجين (OCR) لأوكسيداز بو₃ المعاد تشكيله في بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان)-بولي الطعم (أكسيد الإيثيلين) (PDMS-g-PEO) وPDMS-g-PEO/فوسفاتيديل كولين الصويا (PC). تمثل الأشرطة متوسط ± الانحراف المعياري (SD) لثلاثة قياسات مستقلة (n = 3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6. إدخال أوكسيداز بو₃ الموسوم بالفلورية في حويصلات أحادية الطبقات العملاقة (GUVs). صور مجهرية تمثيلية ل (A) بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان)-بولي الرقعة (أكسيد الإيثيلين) (PDMS-g-PEO) و(B) PDMS-g-PEO/فوسفاتيديل كولين الصويا (PC) GUVs (أغشية موسومة بفوسفاتيديل إيثانولامين-رودامين (PE-Rho)، باللون الأحمر) تحتوي على السيتوكروم المعاد تشكيله bo₃ أوكسيداز-ATTO 643 (الأرجواني). قياس كثافة الفلورة bo₃ أوكسيداز-ATTO 643 كدالة لحجم GUV (N = 100) لظروف إعادة التكوين المختلفة: (C) إضافة 0.2٪ كولات الصوديوم (SC) إلى الحويصلات البوليمرية الكبيرة أحادية السطح (LUVs) المكونة مسبقا و0.015٪ SC إلى LUVs الهجينة المكونة مسبقا؛ (D) تكونت LUVs بوليمرية في وجود LUVs بنسبة 0.1٪ SC وLUVs هجينة معالجة ب 0.1٪ SC بعد التكوين. تمثل القيم شدة الفلورة لوحدات GUV الفردية (N = 100 لكل حالة). يتم الإبلاغ عن قيم متوسط ± الانحراف المعياري (SD) في النص. المقارنات وصفية؛ لم يتم إجراء أي اختبارات إحصائية رسمية. A.U. (وحدات عشوائية). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7
الشكل 7. ضخ البروتون بواسطة أوكسيداز بو₃ معاد تكوينه في حويصلات أحادية السطح العملاقة (GUVs). (أ) تصوير فلوري تمثيلي لميكروگراف بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان)-الطعم البولي (أكسيد الإيثيلين) (PDMS-g-PEO)/فوسفاتيديل كولين الصويا (PC)، مع أغشية موسومة ب 0.05 mol٪ فوسفاتيديل إيثانولامين-رودامين (PE-Rho، أحمر)، تحتوي على سيتوكروم معاد تشكيله ب Bo₃ أوكسيداز وصبغة بيرانين حساس لدرجة الحموضة مغلف (الإثارة عند 405 و448 نانومتر؛ قنوات زرقاء وخضراء)، ترسيب في شريحة زجاجية مغرفة. (ب) تغير نسبة فلورة البرانين داخل الحويصة عند التنشيط باستخدام ديثيوثرايتول (DTT) ويوبيكينون-1 (Q₁) في PDMS-g-PEO/فول الصويا التي تحتوي على أوكسيداز _bo3 المعاد تشكيله. الأثر الأخضر يتوافق مع GUVs المعاد تكوينها بواسطة البروتين، والأثر الرمادي يعادل الضابط السلبي (GUVs الخالية من البروتين). يمثل الأثر متوسط ± الانحراف المعياري (SD) (n = 3 حويصلات). شريط المقياس = 20 ميكرومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

	المكون	المخزون	المبلغ	التركيب النهائي للغشاء
البوليمرسومات	PDMS-g-PEO في الكلوروفورم:الميثانول (2:1، v/v)	10 ملغ/مل	499.9 ميكرولتر	99.95 مول٪
البوليمرسومات	PE-رودامين في الكلوروفورم	1 ملغ/مل	1.1 ميكرولتر	0.05 مول٪
الحويصلات الهجينة	PDMS-g-PEO في الكلوروفورم:الميثانول (2:1، v/v)	10 ملغ/مل	450.1 ميكرولتر	70 مول٪
	فول الصويا PC (95٪) في الكلوروفورم	10 ملغ/مل	49.8 ميكرولتر	29.95 مول٪
	PE-رودامين في الكلوروفورم	1 ملغ/مل	1.4 ميكرولتر	0.05 مول٪

الجدول 1: المحاليل والأحجامات المستخدمة في تحضير الأغشية الرقيقة لتكوين الحويصلات أحادية السطح الكبيرة (LUV). تعطى تركيزات المخزون بالملليغرام/مل. يتم حساب الأحجام لتركيز إجمالي الفيلم 5 ملغ/مل من الأمفيفيل. يتم التعبير عن التركيب النهائي للغشاء بوحدة mol٪. PDMS-g-PEO: بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان)-زراعة (أكسيد الإيثيلين)؛ PE-رودامين: فوسفاتيديل إيثانولامين-رودامين؛ صويا PC: صويا فوسفاتيديل كولين; V/V: الصوت/الصوت.

	شرط إعادة التشكيل	القطر (نانومتر)	PDI
البوليمرسومات	ما قبل إعادة التشكيل	84.34 ± 0.22	0.084
البوليمرسومات	ما بعد إعادة التشكيل	100.73 ± 0.81	0.109
الهجائن	ما قبل إعادة التشكيل	89.21 ± 0.77	0.129
الهجائن	ما بعد إعادة التشكيل	85.01 ± 0.42	0.17

الجدول 2: متوسط حجم الحويصلات ومؤشر التشتت المتعدد (PDI) للبوليمرسومات (بولي (ثنائي ميثيل سيلوكسان)-الطعم - بولي (أكسيد الإيثيلين)، PDMS-g-PEO) والحويصلات الهجينة (PDMS-g-PEO/فوسفاتيديل كولين الصويا (PC)) قبل وبعد إعادة التكوين. تمثل البيانات متوسط ثلاثة قياسات مستقلة.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتميز البوليمرسوم والحويصلات الهجينة بين البوليمر/الدهون بثبات كيميائي وميكانيكي معزز مقارنة بالحويصلات الدهنية التقليدية، مما يجعلها جذابة للغاية لتطبيقات تتراوح بين توصيل الأدوية والاستشعار الحيوي إلى المفاعلات النانوية والدقيقة والخلايا الصناعية. ومع ذلك، فإن بنية الغشاء المميزة وخصائصها الحيوية غالبا ما تمنع النقل المباشر للبروتوكولات المحسنة للحويصلات الدهنية إلى الأنظمة القائمة على البوليمرات 15,20,30. يعالج البروتوكول المعروض هنا هذه الاختلافات ويوفر سير عمل محسن لإعادة تكوين بروتينات الغشاء إلى بوليمرات قائمة على PDMS-g-PEO وLUVs هجينة، تليها التوسع إلى GUVs عبر الاندماج والتشكيل الكهربائي.

خطوة حاسمة في البروتوكول هي إعداد LUVs ذات توزيع حجم ضيق وقابل للتكرار. كما هو الحال مع أفلام الدهون، تتجمع أفلام PDMS-g-PEO ذاتيا إلى حويصلات عند إعادة الترطيب باستخدام محلول مائي. على عكس أنظمة الدهون التي غالبا ما تنتج مزيجا من الحويصلات أحادية ومتعددة الصفائح، يشكل PDMS-g-PEO بشكل مفضل هياكل أحادية السطح¹، مما يلغي الحاجة إلى دورات التجميد-الذوبان التي تستخدم عادة لتقليل تعدد الصفائح في تحضيرات الدهون. يتم إجراء البثق لتوحيد توزيع حجم الحويصلات. نظرا لزيادة نعومة أغشية PDMS-g-PEO مقارنة بطبقات الدهون^{الثنائية 1}، فإن ضغوط البثق الأقل كافية. بينما تكون 11 تمريرة بثق موصى بها المصنع كافية عموما، فإن زيادة عدد التمريرات عادة ما تؤدي إلى توزيع أضيق وزيادة قابلية التكرار. ومع ذلك، يمكن أن يؤدي البثق المفرط إلى إنتاج حويصلات أصغر قليلا من حجم المسام الاسمي للغشاء. قد يقلل البثق المتكرر أيضا من عائد الحويصلات بسبب فقدان المواد؛ لقد حددنا سابقا أن حوالي 31٪ من مادة PDMS-g-PEO و25٪ من مادة حويصلات PDMS-g-PEO/فول الصويا في PCقد فقدت بعد مرور 21 مرة عبر غشاء 100 نانومتر^. لذلك، يجب تحسين عدد مرات البثق لتحقيق توازن بين تجانس الحجم وسلامة الحويصلات والانضمام.

إعادة التشكيل التي تعبر عن طريق المغسلة تمثل عاملا حاسما آخر في النجاح. يعتمد النوع الأمثل وتركيز المنظف على كل من البروتين الغشائي المحدد وتركيبة الغشاء ^3,20. في حالة الأغشية البوليمرية النقية، عندما تكون ظروف التشبع مثالية، فإن دمج المنظف أثناء إعادة ترطيب الفيلم يعطي كفاءة إدخال أعلى من الحويصلات المكونة مسبقا. الأغشية البوليمرية الأكثر صلابة، مثل تلك المصنوعة من PBD-b-PEO، تتطلب تركيزات منظفات أعلى بكثير لإذابة الغشاء³⁰، مما يؤكد الحاجة إلى تحسين خاص بالبوليمر. يجب التحقق من نجاح الإدخال ليس فقط من خلال قياسات النشاط — مقارنة بمسييلات المغسلة أو الحويصلات الدهنية — بل أيضا من خلال التحليل الهيكلي مثل التجميد الداخلي (cryo-TEM)، لتقييم عمق الإدخال وتكيف الغشاء مع عدم التوافق الكاره^{للماء 1}. اتجاه البروتين مهم بنفس القدر، خاصة لمضخات البروتونات، حيث يتطلب تدرج البروتونات الوظيفي أن تكون معظم المضخات موجهة بشكل متساو. من الناحية المثالية، يجب أن تنقل المضخات البروتونات إلى الداخل لتمكين الاقتران مع عمليات تستهلك التدرج، مثل توليف ATP ^3,15. يمكن تقييم الاتجاه باستخدام علامات البروتين، على سبيل المثال، عن طريق تبريد الأصباغ المعرضة للخارج الحويصلي بشكل انتقائي أو عن طريق إزاحة الملصقات الفلورية المرتبطة بعلامات^{His-Tags 20}. تم تقديم هذه الأساليب كتوصيات عامة لتحسين البروتوكولات ولم يتم تنفيذها في هذه الدراسة.

يتطلب التوسع من بروتيو-LUVs إلى بروتيو-GUVs باستخدام الاندماج والتشكيل الكهربائي تحكما دقيقا في معايير الترسيب والجفاف. يؤثر تركيز LUVs وحجم القطرات بشكل حاسم على العائد النهائي للGUV ونقائه. تركيزات LUV المرتفعة جدا (≥10 ملغ/مل) يمكن أن تؤدي إلى بقاء LUVs غير المندمجة في العينة النهائية، بينما تؤدي التركيزات المنخفضة جدا (<5 ملغ/مل) إلى تقليل إنتاج GUV بسبب نقص المادة الترسيبية. يجب أن يكون الجفاف جزئيا وليس كاملا—ويدل ذلك على ظهور حلقة بيضاء عند محيط القطرة بدلا من قطرة بيضاء بالكامل—لأن الجفاف المفرط يمكن أن يؤثر أو يلغي نشاط البروتين الغشائي، خاصة في مضخات البروتونات. لذلك، فإن الرطوبة ودرجة الحرارة المسيطر عليها ضرورية لزعزعة استقرار الأغشية بما يكفي للاندماج مع الحفاظ على وظيفة البروتين.

يمكن أن تقلل الأحمال البروتينية العالية من حجم GUV، لكن يمكن التخفيف من هذا التأثير عن طريق تخفيف LUVs الوظيفية بالبروتين باستخدام LUVs خالية من البروتين. وبهذه الطريقة، يمكن تعديل كثافة البروتين داخل أغشية GUV بدقة قبل الترسب. على سبيل المثال، خلط ب_bo 3-LUVs عالي التحميل مع LUVs فارغة (حتى 1:10، v/v) ينتج GUVs بأقطار 5–30 ميكرومتر ومحتوى بروتين قابل للضبط مع الحفاظ على توزيع أغشائي منتظم²⁷. على الرغم من أن هذه الاستراتيجية تؤدي إلى تجمعات حويصلات غير متجانسة من حيث كثافة البروتينات، إلا أن إجراءات المعايرة تسمح بتقييم كمي لمستويات الدمج^23,31. ومن المهم أن طريقة الخلط تتيح تحميل بروتين أعلى بشكل عام دون تقليل مفرط في حجم GUV²⁷.

يمكن إجراء التحليل الوظيفي للبروتينات المعاد تشكيلها عن طريق تغليف أصباغ حساسة لدرجة الحموضة مثل البيرانين في مخزن التشكيل الكهربائي لمراقبة تغيرات الرقم الهيدروجيني داخل الحويص. للحصول على تصوير حي موثوق، يجب ترسيب الحويصلات أو تثبيتها لمنع الحركة، مما قد يؤدي إلى طمس إشارات الفلورة وعرقلة القياس الدقيق لديناميكيات الحموضة داخل الحويصل. التثبيت عبر اقتران البيوتين-ستربتافيدين باستخدام الدهون البيوتينيلة والأسطح المغطاة بالستربتافيدين^يوفر ارتباطا مستقرا لكنه قد يغير تركيب الغشاء أو توتره. يوفر شبه التثبيت في المصائد الميكروفلويدية بديلا يتجنب مكونات الغشاء الإضافية ويقلل من الاضطراب ^1,33. على الرغم من أن قياسات الفلورة الجماعية ممكنة بعد إزالة الصبغة الخارجية عن طريق الترسيب المتكرر وتبادل العازلة، إلا أن الصبغة المرتبطة بالغشاء المتبقية قد تتداخل مع القراءة؛ لذلك، يفضل عادة المجهر الكونفوكلي للميكروفون الفريد البارد البارد.

مقارنة بالأساليب البديلة التي تحاول إدخال البروتين مباشرة في GUVs المشكلة، تسمح استراتيجية الاندماج والتشكيل الكهربائي بتحسين مستقل لظروف إعادة التكوين على مستوى LUV قبل التوسع إلى GUVs. هذا السير العملي المعياري يحسن قابلية التكرار والعائد الوظيفي، خاصة للغشية البوليمرية والهجينة التي تكون أقل قابلية للبروتوكولات التقليدية القائمة على الدهون. تتوافق الطريقة مع مجموعة واسعة من بروتينات الغشاء¹، بما في ذلك أنظمة متعددة البروتينات¹⁵، وتمكن من وظيفة الغشاء وتغليف المكونات الإضافية بشكل مشترك. وبالتالي، يوفر منصة متعددة الاستخدامات لبناء خلايا صناعية متينة، ومفاعلات دقيقة، وأنظمة نموذجية للتحقيق في تفاعلات البوليمر والبروتين تحت ظروف مضبوطة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء هذا البحث ضمن مبادرة "مهمة إلى الحياة" لمدرسة ماكس بلانك، بدعم من مؤسسة ديتر شفارتز بالتعاون مع جمعية ماكس بلانك. نحن ممتنون لكلوديا بيدنارز على عزل وتنقية السيتوكروم بو₃ أوكسيداز، ولآن كريستين وينريش لمساعدتها في تحضير الحويصلات والمجهر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
نظام كروماتوجرافيا pure™ AKTA	Cytiva	29018224
18:1 Liss Rhod PE	Avanti Research	810150
زجاج تغطية مقسوم إلى 8 خلايا	Cellvis	C8-1.5H-N
مرشحات الطرد المركزي Amicon Ultra 0.5 مل	Sigma Aldrich	UFC5030
ATTO 643 NHS ester	ATTO-TEC	AD 643-31
Bio-Beads SM-2	Bio-Rad	1523920
Cholic acid-Na-salt (sodium cholate)	Serva	361-09-1
Coenzyme Q1	TargetMol	TGM-T19594
المجهر المجسم STELLARIS 5	Leica Microsystems	603810
DTT (Dithiothreitol)	Merck	10197777001
Fine Tip Ultra Micro Pastette	Pastette	LW4243
HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt)	Sigma Aldrich	6358-69-6
شرائح زجاجية مكسوة بـ ITO (25×75×1.1 ملم، ≤20 أوم/متر مربع)	pgo	CEC020S
برنامج LAS X	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Mini centrifuge MCF-2360	LMS	24572
Mini-extruder	Avanti Research	610000
نظام Oxytherm+P	Hansatech Instruments	/
منظف البلازما (سطح العمل)	Harrick Plasma	PDC-32G-2
غشاء البولي كربونات 0.1 ميكرومتر	Avanti Research	610005
عازل سيليكون لختم الضغط (مستدير، قطر 20 ملم، عمق 1 ملم)	Grace Bio-Labs	41161502
فواصل سيليكون (مستدير، قطر خارجي 24.2 ملم، قطر داخلي 14.3 ملم، عمق 1.8 ملم)			مصنوع في المختبر، مقطوع من صفيحة سيليكون
Soy PC (95%)	Avanti Research	441601
Specord 50 PLUS spectrophotometer	Analytik Jena	823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL column (طول العمود × القطر الداخلي 30 سم × 10 ملم)	Cytiva	28-9909-44
مذبذب أنبوب الاختبار (2800 دورة في الدقيقة)	IKA Lab Dancer	3365000
Thermomixer comfort 5355	Eppendorf	5355000.011
Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO؛ MW 3000)	Dow Corning	000000000004109892
ZetaSizer Nano ZS	Malvern Panalytical	ZEN3600

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

234 234 PDMS g PEO LUVs GUVs

تحضير الحويصلات الهجينة الكبيرة والعملاقة أحادية السطح ذات الغلاف الوظيفي من بروتين الغشاء والنظام الوظيفي بين بوليمر وبوليمر ودهون

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة