مقالة منهجية

تصنيع جهاز "عضو على شريحة" لمعقد العاج واللب مكدس عمودياً باستخدام قرص عاج بشري

DOI:

10.3791/71713

⸱

أغسطس 14, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لوصف عملية تصنيع وتجميع جهاز "عضو على شريحة" لمركب العاج واللب مكدس رأسيًا، يتضمن قرص عاج بشري وقنوات دقيقة مصنعة بالطباعة الحجرية الضوئية، يليه استزراع وزراعة الخلايا الجذعية لللب السني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفرض النماذج قبل السريرية التقليدية المستخدمة في أبحاث طب الأسنان، بما في ذلك النماذج الحيوانية والمزارع الخلوية الساكنة، قيوداً مهمة في إعادة إنتاج الظروف الفسيولوجية للواجهة بين العاج واللب والتنبؤ بالاستجابات البيولوجية البشرية للمواد الحيوية السنية. وتوفر تقنية "عضو على شريحة" (OoC) نهجاً بديلاً من خلال تمكين إعادة إنشاء بيئات دقيقة خاصة بالأنسجة ضمن أنظمة مائعية مجهرية متحكم بها. تصف هذه المخطوطة بروتوكولاً خطوة بخطوة لتصنيع وتجميع جهاز "عضو على شريحة" لمعقد العاج واللب، يدمج قرصاً من العاج البشري ضمن منصة مائعية مجهرية مكونة من ثلاث طبقات من مادة البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS). يتضمن البروتوكول تحضير قرص العاج، وتصنيع قوالب ذات هياكل مجهرية باستخدام الطباعة الضوئية، وصب ومعالجة PDMS، والربط بين الطبقات بمساعدة البلازما، وتجميع الجهاز، واختبار التسريب، واستزراع الخلايا الجذعية للب لب الأسنان تحت ظروف المزرعة الساكنة. كما تتم مناقشة معايير التصنيع الحرجة التي تؤثر على أداء الجهاز، بما في ذلك التحكم في سمك طبقة PDMS، ومعالجة السطح بالبلازما، ودمج قرص العاج داخل الجهاز لتقليل التسريب. تم تقييم التصاق الخلايا وحيويتها داخل الجهاز باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح وصبغ الخلايا الحية/الميتة بالفلورة البؤرية. وتظهر النتائج التمثيلية نجاح دمج قرص العاج ضمن التجميع المائعي المجهري، والحفاظ على ظروف خالية من التسريب، والتصاق الخلايا الجذعية الحية للب الأسنان بسطح العاج. يوفر هذا البروتوكول نهجاً قابلاً للتكرار لتصنيع منصة "عضو على شريحة" لمعقد العاج واللب، والتي قد تدعم الدراسات المستقبلية التي تبحث في الاستجابات الخلوية للمواد الحيوية السنية والمحفزات البيئية الدقيقة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لطالما كانت التجارب على الحيوانات أداة فعالة في تعزيز فهم العمليات المرضية والفسيولوجية، ولعبت دوراً محورياً في المراحل المبكرة من تطوير الأدوية1. وعلى مدار القرن العشرين، ارتفع متوسط العمر المتوقع للبشر بشكل ملحوظ، ورغم أنه ليس من الممكن تحديد المدى الذي يعود فيه هذا التحسن حصراً إلى الأبحاث الحيوانية بدقة، إلا أنه من المعترف به على نطاق واسع أن العديد من العلاجات الطبية المعاصرة قد تم تطويرها أو التحقق من فعاليتها باستخدام النماذج الحيوانية2. وتشمل الأمثلة البارزة تطوير لقاحات ضد شلل الأطفال، والحصبة، والتهاب الكبد B، وتقييم سلامة وفعالية البنسلين، وإنتاج الأنسولين. وفي مجال أبحاث طب الأسنان والمواد الحيوية، كانت هذه النماذج حاسمة في استكشاف عملية تسوس الأسنان، وبيولوجيا وتجدد معقد العاج واللب، والفسيولوجيا المرضية لأنسجة دواعم الأسنان3,4.

على الرغم من الاستخدام الواسع لهذه المنهجيات، لا يزال مسار تطوير الأدوية الحالي يُظهر معدلات فشل مرتفعة، حيث تفشل العديد من الأدوية المرشحة خلال التجارب السريرية على الرغم من إثبات فعاليتها وسلامتها في الإعدادات المختبرية قبل السريرية والنماذج الحيوانية5. وقد رُبط هذا التباين بالاختلافات بين الأنواع التي قد تحد من القدرة التنبؤية الانتقالية للنماذج الحيوانية بسبب الاختلافات التشريحية والجينية والفسيولوجية بين الأنواع6. بالإضافة إلى ذلك، لا يزال تطوير مناهج علاجية جديدة يستغرق وقتاً طويلاً ومكلفاً7. علاوة على ذلك، تعتمد النماذج التقليدية في المختبر (in vitro) بشكل أساسي على مزارع أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (2D) مبسطة على ركائز بلاستيكية غير فسيولوجية، مما يؤدي إلى الفشل في محاكاة الإشارات البيوكيميائية والفيزيائية، والتفاعلات بين الخلايا، وإشارات المصفوفة خارج الخلوية (ECM) الموجودة في تجويف الفم البشري8,9. وعلى الرغم من أن النماذج ثنائية الأبعاد توفر مزايا تجريبية معينة، إلا أنها عاجزة بطبيعتها عن محاكاة التفاعلات المعقدة التي تحدث بين مكونات متعددة في آن واحد، مثل الأغشية الحيوية، والمواد الحيوية، والعاج، وخلايا اللب10. وبناءً على ذلك، هناك اهتمام متزايد بتطوير منصات تجريبية بديلة قادرة على إعادة إنتاج الاستجابات البيولوجية البشرية بدقة أكبر. وفي عام 2022، ألغى قانون تحديث إدارة الغذاء والدواء (FDA Modernization Act 2.0) المتطلب الإلزامي للاختبارات الحيوانية في عملية الموافقة على الأدوية، واعترف بإمكانية استخدام المنصات البديلة، بما في ذلك تقنيات العضو على شريحة (OoC)، في الأبحاث قبل السريرية11.

يعتبر "العضو على شريحة" (OoC) جهازاً للموائع الدقيقة صُمم لمحاكاة بنية ووظيفة والبيئة المجهرية لعضو معين أو مكون نسيجي12. تُستزرع في هذه الأجهزة خلايا وأنسجة حية داخل قنوات دقيقة مهندسة تعيد إنتاج الجوانب الرئيسية للبيئة المجهرية الفسيولوجية التي تتعرض لها الخلايا طبيعياً. وعلاوة على المحاكاة البنيوية، تتيح القنوات الدقيقة تحكماً زمانياً ومكانياً في البيئة الخلوية وتدعم الحفاظ على الوظائف الخاصة بالأنسجة، مما يوفر ظروفاً تجريبية قد تشبه الفسيولوجيا الحية (in vivo) بشكل أوثق من أنظمة الزرع التقليدية12. ومن الأهمية بمكان أن القنوات الدقيقة في أجهزة OoC تسهل التدفق المتحكم فيه لوسط الزرع، مما يولد إجهاد قص على الخلايا المستقرة13. تؤثر هذه المحفزات الميكانيكية على الاستجابات الخلوية بما في ذلك الالتصاق، والتكاثر، والهجرة، والتعبير الجيني، والتفاعلات بين الخلايا14,15. بالإضافة إلى ذلك، يساهم التدفق المستمر للوسط في الحفاظ على البيئة المجهرية من خلال إمداد العناصر الغذائية وإزالة نواتج الفضلات الأيضية16. وعلاوة على ذلك، وبالمقارنة مع المزارع التقليدية ثنائية الأبعاد (2D)، أفادت بعض منصات OoC بدعم تحكم محسّن في قراءات الإجهاد التأكسدي، بما في ذلك أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا وحيوية الخلايا، في نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) على الشريحة17. وبناءً على ذلك، ظهرت أنظمة OoC كمنصات واعدة لدراسة فسيولوجيا الأنسجة، وتفاعلات المواد الحيوية، وعمليات المرض تحت ظروف تجريبية محكومة18. وفي أبحاث طب الأسنان، طُبقت تقنية OoC تدريجياً لنمذجة واجهات الأنسجة الفموية التي تزداد تعقيداً19. وقد حاكت منصات "السن على شريحة" المبكرة الواجهة بين المادة الحيوية والعاج واللب20، بينما دمجت الإصدارات الأكثر تقدماً منذ ذلك الحين الأوعية الدموية والتعصيب الثلاثي التوائم لمحاكاة التعقيد البنيوي والوظيفي لمعقد اللب والعاج بشكل أكثر دقة21. وبعيداً عن اللب، مكنت النماذج ثلاثية الأبعاد لقنوات الجذور غير المكتملة من تقييم محاليل الإرواء اللبية والتبريعم الوعائي في الخلايا الجذعية المستمدة من الحليمة الذروية22,23. وعلى مستوى دواعم السن، استُخدمت منصات "اللثة على شريحة" لاستقصاء التفاعلات بين المضيف والميكروبات ولتقييم القدرة التعديلية المناعية للمعززات الحيوية (probiotics) كعوامل علاجية24، بينما أظهرت أجهزة "الرباط periodontal على شريحة" كيف يقوم تدفق السوائل الخلالية بتعديل تكوين الشبكة الوعائية والتمايز العظمي لكريات الخلايا الجذعية للرباط periodontal25,26. واستكمالاً لهذه النماذج، ساهمت أنظمة "المخاطية الفموية على شريحة" و"غرسات الأسنان على شريحة" المتخصصة في توسيع نطاق أبحاث الموائع الدقيقة في طب الأسنان من خلال توصيف التفاعلات بين المضيف والمادة والسمية الخلوية للمونومرات السنية تحت ظروف ذات صلة فسيولوجياً27,28.

بينما يتم تطبيق أنظمة العضو على شريحة (OoC) بشكل متزايد في أبحاث الأسنان والفم والوجه والفكين، تظل الجهود المستمرة نحو توحيد معايير سير عمل التصنيع وقابليته للتكرار أمراً بالغ الأهمية. وقد ورد في الأدبيات عدة نماذج لـ "السن على شريحة"20,29,30,31، والتي استعرضت تكوينات مختلفة للأجهزة وتطبيقات تجريبية متنوعة. ومع ذلك، فإن التباينات في بنية الجهاز، وطرق التصنيع، ودمج العاج، والتقرير عن المعاملات التجريبية قد تحد من القابلية للتكرار والمقارنة المباشرة بين الدراسات. وبوجه خاص، قد تؤثر الاختلافات في هندسة القنوات الدقيقة، واستراتيجيات دمج العاج، ونهج التصنيع على البيئة الدقيقة البيولوجية والميكانيكية داخل الجهاز. تتضمن بعض النماذج المبلغ عنها العاج لإعادة إنتاج جوانب من الواجهة بين العاج واللب20,29,30، بينما تستخدم نماذج أخرى تكوينات بديلة31. بالإضافة إلى ذلك، فإن طرق التصنيع مثل الطباعة الحجرية الضوئية، والقطع بالليزر، والتقطيع الدقيق، والطباعة ثلاثية الأبعاد، يقدم كل منها مزايا وقيوداً محددة بناءً على تصميم الجهاز والتطبيق المنشود. علاوة على ذلك، يعد التوجه المعماري للجهاز محدداً حاسماً للفائدة البيولوجية، وتحديداً ما إذا كانت القنوات وشريحة العاج مرتبة في تكوين أفقي أو رأسي19,32. في التكوينات المكدسة أفقياً، تسهل المقصورات المرتبة جنباً إلى جنب عملية التقسيم الجانبي والتصوير المباشر للخلايا في الوقت الفعلي، مما يجعلها مناسبة بشكل خاص لنمذجة الأنسجة ذات التنظيم المكاني الجانبي بطبيعتها، مثل المعقد اللثوي24,32. ومع ذلك، فإن هذا التصميم محدود بطبيعته في قدرته على إعادة إنشاء الواجهات البيولوجية المتعامدة، مثل معقد المادة الحيوية والعاج واللب، حيث أن الترتيب الجانبي للمقصورات لا يحاكي بدقة التوجه الحيوي لحاجز العاج بين التجويف واللب20,32. وتتجاوز التكوينات المكدسة رأسياً هذه القيود من خلال وضع مقصورتين فوق بعضهما البعض على طول المحور y، يفصل بينهما شريحة عاج طبيعية، مما يسمح بالقياس الكمي المتزامن للنقل الجزيئي عبر العاج السليم والمراقبة الفورية لاستجابات خلايا اللب التي يتم قياسها في وسط المخرج30. ومع ذلك، فإن أحد القيود المعروفة لهذا التوجه يتعلق بالتصوير المقطعي لواجهة العاج والخلايا، حيث يظل الحصول على صور مقطعية لواجهة العاج والخلايا ضمن نفس المستوى البؤري أكثر تحدياً من الناحية التقنية مقارنة بالتكوينات المكدسة أفقياً، حيث تكون الخلايا والمصفوفات خارج الخلوية مرتبة جانبياً. ورغم الإبلاغ عن نماذج متعددة لمعقد العاج واللب على شريحة في الأدبيات، إلا أن غالبيتها تتبنى تكويناً مكدساً أفقياً يتم فيه ترتيب المقصورات جنباً إلى جنب في نفس المستوى10,20,21,29، بينما دمج عدد قليل نسبياً شريحة عاج طبيعية ضمن تكوين مكدس رأسياً30. وبالرغم من ذلك، لا تزال الاختلافات في نهج التصنيع ومعاملات التقرير عبر هذه النماذج تحد من القابلية للتكرار والمقارنات بين الدراسات33. تهدف المخطوطة الحالية إلى تحسين القابلية للتكرار المنهجي من خلال توفير بروتوكول تصنيع مفصل لجهاز "سن على شريحة" مكدس رأسياً، مما يسهل الاعتماد الأوسع لهذه المنصة داخل مجتمع أبحاث الأسنان.

تصف هذه المخطوطة بروتوكولاً تفصيلياً للتصنيع والتجميع لجهاز "عضو على شريحة" (OoC) يمثل معقد العاج واللب بشكل مكدس رأسياً، حيث يدمج قرص عاج بشرياً ضمن منصة موائع دقيقة مكونة من ثلاث طبقات من مادة البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) مصنعة باستخدام قالب تم إنتاجه عبر الطباعة الحجرية الضوئية. كما يصف البروتوكول عملية استزراع الخلايا الجذعية لب السن وزراعتها داخل الجهاز تحت ظروف ساكنة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أُجريت هذه الدراسة وفقاً لإعلان هلسنكي، وحصلت على موافقة لجنة الأخلاقيات في Universidad de La Frontera للدراسات التي تتضمن عينات بشرية.

1. الحصول على قرص العاج

ملاحظة: قم بإعداد تصميم الجهاز قبل البدء في البروتوكول (الشكل 1A–1C).

  1. جمع الأسنان وتخزينها
    1. جمع الأضراس أو الضواحك البشرية السليمة بعد الحصول على موافقة مستنيرة من المريض.
    2. حفظ جميع العينات في محلول كلورامين بتركيز 0.5% عند درجة حرارة 4°C لمنع جفاف العاج وتمسخ البروتين.
    3. استبدال محلول الكلورامين مرة واحدة أسبوعياً أثناء التخزين.
  2. تحضير أقراص العاج
    1. قطع كل سن أفقياً عند الثلث الأوسط من التاج باستخدام قبضة يدوية عالية السرعة تعمل بسرعة 350,000 rpm ومجهزة بسن ماسي أسطواني (قطره 1 mm؛ وحجم حبيبات 100–150 µm).
    2. إجراء القطع تحت ري مستمر بالماء بمعدل 50 mL/min تقريباً.
    3. تحديد موقع القطع عند الثلث الأوسط من التاج لتجنب حجرة اللب والمينا الموجودة عند الأخاديد والشقوق الإطباقية، وبذلك يتم الحصول على قرص يتكون بشكل أساسي من نسيج العاج.
      تنبيه: يجب إجراء قطع السن تحت ري مستمر وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات والقناع ونظارات الواقية.
  3. تشطيب أقراص العاج
    1. صقل قرص العاج باستخدام أقراص تشطيب ذات أحجام حبيبات تتناقص تدريجياً.
    2. الاستمرار في الصقل حتى الوصول إلى سمك نهائي للعاج يبلغ 0.8 mm تقريباً (±± 0.3 mm) وأبعاد جانبية تبلغ 5 mm × 5 mm تقريباً (±± 0.3 mm) (الشكل 1D).
  4. تخزين أقراص العاج
    1. تخزين أقراص العاج المحضرة في محلول كلورامين بتركيز 0.5% عند درجة حرارة 4°C حتى تجميع جهاز OoC.

figure-protocol-1
الشكل 1: سير عمل تصميم وتصنيع جهاز مجمع العاج واللب على شريحة (OoC). (A) التصميم ثلاثي الأبعاد للجهاز يوضح بنية الطبقات الثلاث. (B) عرض علوي لتصميم الجهاز مع الأبعاد الرئيسية. (C) عرض جانبي لتكوين الجهاز المكون من ثلاث طبقات. (D) قرص عاجي نموذجي تم تحضيره بسمك تقريبي يبلغ 0.8 mm وأبعاد جانبية تبلغ حوالي 5 mm × 5 mm. (E) قالب رئيسي من السيليكون تم تصنيعه بواسطة الطباعة الحجرية الضوئية واستُخدم لصب طبقات البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) العلوية والسفلية. (F) إزالة طبقة PDMS المعالجة من قالب السيليكون بعد البلمرة الحرارية. (G) معالجة سطح PDMS بالبلازما قبل ربط الطبقات. (H) جهاز مجمع العاج واللب OoC النهائي المكون من ثلاث طبقات، تم تجميعه عن طريق الربط بالبلازما ودمج واجهة العاج. (I) الجهاز المجمع متصلاً بأنابيب لاختبار التسريب والتحضير لتجارب الموائع الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. تصنيع جهاز محاكاة العضو على شريحة (OoC) لمعقد العاج واللب السني

  1. تجهيز مساحة العمل والمواد
    1. تجهيز المواد والمعدات
      1. قم بتجهيز جميع المواد والمعدات المدرجة في جدول المواد قبل البدء في تصنيع الجهاز.
      2. جهز خرامات الخزعة قبل تجميع الجهاز.
      3. نفذ جميع إجراءات التصنيع في بيئة نظيفة وخالية من الغبار.
      4. ارتدِ القفازات، ونظارات واقية، ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة طوال فترة تصنيع الجهاز وتجميعه.
        ملاحظة: جهز القالب المُنتج بالطباعة الحجرية الضوئية قبل البدء في البروتوكول (الشكل 1E).
  2. تصنيع القالب ذي البنية المجهرية
    1. تجهيز رقاقة السيليكون
      1. صنّع القالب على رقاقة سيليكون مصقولة من جانب واحد بمقاس 4 بوصات (من النوع N، مطعمة بالزرنيخ As-doped، بطريقة نمو CZ، بتوجيه <100>، وسُمك 500 ±± 25 µm، مع TTV ≤ 10 µm، وBOW ≤ 35 µm، ومقاومة كهربائية 0.001–0.005 Ω·cm).
      2. نظف الرقاقة بالتتابع في الأسيتون، ثم الإيزوبروبانول، ثم الماء فائق النقاء لمدة 10 دقائق لكل منها تحت تأثير الموجات فوق الصوتية.
      3. جفف الرقاقة باستخدام الهواء المضغوط.
      4. سخن الرقاقة عند 200°C لمدة 10 دقائق على لوح تسخين لإزالة الرطوبة المتبقية.
      5. اترك الرقاقة تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT; 20°C–25°C).
    2. تنشيط السطح وطلاء المقاوم الضوئي
      1. نشط سطح رقاقة السيليكون باستخدام منظف بلازما فراغي يعمل ببلازما الهواء عند المستوى 7 لمدة 120 ثانية.
      2. ضع المقاوم الضوئي السلبي القائم على الإيبوكسي GM 1060 عن طريق الطلاء الدوراني بسرعة 300 rpm لمدة 10 ثوانٍ.
      3. استمر في الطلاء الدوراني بسرعة 565 rpm لمدة 100 ثانية وبسرعة 965 rpm لمدة ثانية واحدة باستخدام تسارع قدره 200 rpm/s.
      4. اترك الرقاقة المطلية لترتاح لمدة 10 دقائق.
      5. أجرِ عملية خبز أولي عند 65°C لمدة 10 دقائق.
      6. استمر في الخبز الأولي عند 95°C لمدة ساعة واحدة.
      7. اترك الرقاقة تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
    3. التعريض والتحميض
      1. عرض المقاوم الضوئي باستخدام نظام الطباعة الحجرية بالليزر المباشر بجرعة قدرها 1,950 mJ/cm2.
      2. أجرِ عملية خبز بعدي عند 65°C لمدة 10 دقائق.
      3. استمر في الخبز البعدي عند 95°C لمدة 30 دقيقة.
      4. اترك الرقاقة تبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT).
      5. اترك الرقاقة لترتاح لمدة 10 دقائق.
      6. حمض النمط في PGMEA لمدة 4 دقائق.
      7. مدد فترة التحميض على فترات زمنية مدتها 30 ثانية إذا ظل هناك مقاوم ضوئي متبقٍ.
      8. أوقف التحميض بالشطف بالإيزوبروبانول.
      9. جفف الرقاقة باستخدام الهواء المضغوط.
    4. الخبز الصلب
      1. أجرِ عملية خبز صلب عند 135°C لمدة ساعتين.
      2. احصل على قالب رئيسي ذي بنية مجهرية يحتوي على قنوات مجهرية بعرض 1 mm وارتفاع 50 µm.
  3. تجهيز وإزالة الغازات من خليط PDMS
    1. تجهيز خليط PDMS
      1. امزج قاعدة PDMS وعامل المعالجة بنسبة وزنية 10:1.
      2. حرك الخليط يدويًا باستخدام قضيب زجاجي في بيكر بلاستيكي لمدة 5 دقائق تقريبًا.
      3. حافظ على حركات دائرية بطيئة ومستمرة أثناء المزج.
        ملاحظة: تجنب إدخال فقاعات الهواء أثناء المزج.
    2. إزالة الغازات
      1. ضع خليط PDMS في مجفف فراغي متصل بمضخة فراغ.
      2. أزل الغازات من الخليط عند ضغط 700 mmHg تقريبًا لمدة 5 دقائق.
      3. حرر الفراغ لفترة وجيزة للسماح للفقاعات السطحية بالانفجار.
      4. أعد تطبيق الفراغ.
      5. كرر الدورة حتى لا تبقى أي فقاعات مرئية.
        ملاحظة: يستغرق إجمالي وقت إزالة الغازات عادةً حوالي 30 دقيقة.
  4. صب PDMS على القالب
    1. تجهيز القالب
      1. ضع القالب على سطح مستوٍ.
      2. نظف القالب باستخدام الهواء المضغوط.
      3. تجنب الملامسة المباشرة للسطح المنقوش.
      4. تحقق من خلو القالب من الغبار والملوثات.
    2. توزيع PDMS
      1. وزع حوالي 8 g من PDMS حول قرص العاج لتصنيع طبقة تضمين العاج.
      2. اضبط ارتفاع PDMS ليتناسب مع سُمك قرص العاج (0.8 ±± 0.3 mm).
      3. امنع PDMS من تغطية سطح العاج.
      4. وزع حوالي 0.26 g من PDMS لكل وحدة قالب لتصنيع كل طبقة من القنوات المجهرية.
      5. انقر برفق على القالب أو طبق اهتزازًا لتسهيل ملء البنى المجهرية.
      6. اترك PDMS يستقر في أصغر التفاصيل.
      7. غطِ القالب باستخدام غطاء أو غطاء مسطح دون ملامسة سطح PDMS.
        ملاحظة: يبلغ سُمك طبقة تضمين العاج حوالي 0.8 mm، ويبلغ سُمك كل طبقة قناة مجهرية حوالي 0.4 mm، مما يعطي سُمكًا إجماليًا للجهاز يبلغ حوالي 1.6 mm.
        ملاحظة: اضبط سُمك الطبقة وفقًا لمسافة العمل للعدسة البؤرية المجهرية البؤرية (confocal objective) عند التخطيط للتصوير المجهري البؤري.
  5. المعالجة
    1. ضع القوالب في فرن عند 50°C.
    2. عالج PDMS لمدة 4 ساعات.
  6. إزالة طبقات PDMS
    1. إزالة PDMS المعالج
      1. قشر طبقات PDMS المعالجة بعناية من القالب (الشكل 1F).
      2. تعامل مع طبقات PDMS بعناية لتجنب إتلاف البنى المجهرية.
  7. ربط طبقات PDMS وتصنيع منافذ الدخول والخروج
    1. تصنيع منافذ الدخول والخروج
      1. اصنع ثقوبًا في مواقع الدخول والخروج المحددة باستخدام خرامة خزعة بمقاس 1 mm.
      2. اجعل جانب القناة المجهرية متجهًا للأعلى أثناء الثقب.
        ملاحظة: ضع طبقة PDMS على حصيرة تقطيع لتجنب التلف الهيكلي.
      3. اصنع ثقبين في الطبقة العلوية بما يتوافق مع القناة المجهرية العلوية.
    2. تنظيف طبقات PDMS
      1. نظف طبقات PDMS باستخدام كحول الإيزوبروبيل أو الإيثانول.
      2. أزل جزيئات الغبار المتبقية باستخدام شريط لاصق معقم.
      3. تحقق من خلو جميع أسطح الربط من الملوثات قبل التجميع.
    3. تنشيط أسطح PDMS بالبلازما
      1. ضع طبقتي PDMS العلوية والوسطى للمعالجة بالبلازما (الشكل 1G).
      2. نشط الأسطح باستخدام معالج بلازما كورونا محمول يعمل عند 25 W تقريبًا مع استخدام الهواء المحيط كغاز تشغيل.
      3. حافظ على مسافة عمل تبلغ حوالي 1 mm بين مصدر البلازما وسطح PDMS.
        تحذير: أجرِ المعالجة بالبلازما تحت تهوية مناسبة وتجنب التعرض المباشر للأوزون الناتج عن البلازما.
      4. نشط جهاز المعالجة بالبلازما واتركه يستقر لمدة 5 ثوانٍ.
      5. تحقق من تولد شعاع بلازما موحد قبل المعالجة.
      6. عالج طبقة PDMS العلوية لمدة 10 ثوانٍ باستخدام حركة مستمرة ذهابًا وإيابًا بسرعة 5 mm/s تقريبًا.
      7. عالج طبقة PDMS الوسطى لمدة 10 ثوانٍ باستخدام نفس الحركة والمسافة.
      8. طبق معالجة إضافية بالبلازما لمدة ثانية واحدة على الطبقة العلوية مباشرة قبل الربط.
    4. ربط الطبقتين العلوية والوسطى
      1. قم بمحاذاة القناة المجهرية العلوية مع قرص العاج فورًا بعد المعالجة بالبلازما.
      2. اربط الطبقتين العلوية والوسطى معًا.
      3. ضع التجمع المربوط في فرن عند 75°C لمدة 5 دقائق.
      4. عزز الربط أثناء فترة التحضين.
        ملاحظة: يكون قرص العاج والقناة المجهرية مرئيين بالعين المجردة ويمكن محاذاتهما دون الحاجة لأدوات محاذاة إضافية.
    5. تصنيع منافذ القناة المجهرية السفلية
      1. اصنع ثقبين يتوافقان مع القناة المجهرية السفلية من خلال الطبقتين العلوية والوسطى المربوطتين.
      2. أجرِ الثقب عبر الطبقتين في وقت واحد لضمان المحاذاة.
        ملاحظة: ينتج عن هذا الإجراء أربعة ثقوب في الطبقة العلوية وثقبين في الطبقة الوسطى.
      3. ضع التجمع المربوط على حصيرة تقطيع متينة قبل الثقب.
      4. طبق ضغطًا ثابتًا للأسفل في حركة واحدة.
        ملاحظة: تجنب القوى الدورانية أو الجانبية لتقليل خطر انفصال الطبقات.
      5. أزل الحطام من مواقع الثقوب باستخدام شاش معقم خالٍ من الوبر ومبلل بكحول الإيزوبروبيل.
      6. افحص الثقوب والمناطق المربوطة المحيطة بها تحت إضاءة كافية.
      7. تحقق من عدم وجود انفصال في الطبقات، أو تمزقات، أو ثقوب غير مكتملة قبل المتابعة.
    6. ربط الطبقة السفلية
      1. عالج الطبقة السفلية بالبلازما كما هو موضح في الخطوة 2.7.4.
      2. قم بمحاذاة منافذ الدخول والخروج للقناة المجهرية السفلية مع الثقوب الموجودة في الطبقتين العلوية والوسطى.
      3. اربط الطبقة السفلية لإكمال تجميع الجهاز.
        ملاحظة: حدد مواقع الدخول والخروج على السطح الخارجي للطبقة السفلية قبل الربط لتسهيل المحاذاة.
        ملاحظة: قد توفر غرف البلازما ربطًا أقوى من أقلام البلازما، كما ورد في الدراسات36.
        ملاحظة: يتكون الجهاز المكتمل من منصة مائعية مجهرية مكونة من ثلاث طبقات تشتمل على واجهة عاجية (الشكل 1H). يمثل سطح العاج السفلي جانب اللب في النموذج، بينما يمثل سطح العاج العلوي الجانب التاجي للتعرض للمواد الحيوية السنية أو المستحضرات البكتيرية.
  8. اختبار التسرب في الجهاز المائعي المجهري
    1. فحص الجهاز المجمّع
      1. افحص الجهاز المجمّع للتأكد من عدم وجود عدم محاذاة.
      2. افحص التجميع للتأكد من عدم وجود ربط غير مكتمل أو تسرب مرئي.
    2. اختبار التسرب
      1. صل إبر Luer-lock بمقاس 19G بمنافذ الدخول (الشكل 1E).
      2. صل الإبر بأنابيب مضخة الموائع المجهرية.
      3. اضغط محاور الإبر برفق في المنافذ المثقوبة للحصول على إحكام يمنع نفاذ الهواء.
      4. احقن PBS معقمًا أو وسط استزراع بمعدل تدفق 10 µL/min.
      5. حافظ على تدفق السائل لمدة 5 دقائق على الأقل.
      6. افحص جميع واجهات الربط، وحواف القنوات، وحدود قرص العاج أثناء التدفق.
      7. راقب الجهاز تحت إضاءة كافية أثناء وبعد الحقن.
      8. تأكد من عدم وجود تراكم للسوائل، أو بلل، أو تكون قطرات.
      9. صنف الجهاز على أنه خالٍ من التسرب إذا لم يتم اكتشاف أي تسرب.
      10. تخلص من الأجهزة التي تظهر تسربًا.
        ملاحظة: أجرِ اختبار التسرب على كل جهاز مُصنّع قبل استزراع الخلايا أو الاستخدام التجريبي.
  9. تعقيم وتخزين الجهاز المائعي المجهري
    1. التعقيم
      1. عرّض السطح العلوي للجهاز المجمّع للأشعة فوق البنفسجية (254 nm) لمدة 30 دقيقة داخل كابينة تدفق صفائحي.
      2. عرّض السطح السفلي للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة إضافية.
      3. اغسل القنوات المجهرية بالإيثانول بتركيز 70% لمدة 20 دقيقة.
      4. اغسل القنوات المجهرية ثلاث مرات بـ PBS معقم لإزالة بقايا الإيثانول.
    2. التخزين
      1. استخدم الجهاز المعقم فورًا لتجارب استزراع الخلايا.
      2. بدلاً من ذلك، خزن الجهاز مغمورًا في PBS معقم عند 4°C داخل حاوية معقمة حتى وقت الاستخدام.
        ​تحذير: لا تستخدم الكلورامين أو محاليل التطهير الأخرى بعد تجميع الجهاز لأن PDMS قد يمتص هذه المركبات مما يؤثر سلبًا على حيوية الخلايا.

3. تقييم التصاق وحيوية الخلايا الجذعية لب لب الأسنان

  1. التهيئة المسبقة لسطح العاج
    1. يُحقن EDTA بتركيز 10% في الجهاز.
    2. يُترك محلول EDTA ملامساً لسطح العاج لمدة 15 min.
    3. يُحقن 0.5 mL من EDTA كل 3 min للحفاظ على حركة السائل داخل القناة الدقيقة.
    4. يُغسل قرص العاج ثلاث مرات باستخدام ماء فائق النقاء.
    5. تستغرق كل عملية غسل 5 min.
      ملاحظة: تعمل معالجة EDTA على إزالة الطبقة اللطاخة وكشف بروتينات مصفوفة العاج.
      تنبيه: يجب التعامل مع محاليل EDTA باستخدام القفازات ونظارات واقية لتجنب تهيج الجلد والعينين.
  2. استزراع الخلايا الجذعية لب اللب السني
    1. توسيع الخلايا الجذعية لب اللب السني
      1. تُستزرع الخلايا الجذعية لب اللب السني في دورق T75 بكثافة 1 × 106 خلية لكل دورق.
      2. تُحضن الخلايا عند 37°C و 5% CO2 حتى تصل نسبة التلاقي إلى 80% تقريباً.
      3. تُفصل الخلايا باستخدام التربسين.
      4. يُعادل التربسين باستخدام وسط زراعي كامل.
      5. يُجرى طرد مركزي لمعلق الخلايا للحصول على كتلة خلوية.
      6. تُقيم حيوية الخلايا باستخدام صبغة trypan blue.
      7. تُستخدم معلقات الخلايا التي تظهر حيوية ≥90%.
    2. تحضير معلق الخلايا
      1. يُحضر معلق خلايا مُدفأ مسبقاً عند 37°C.
      2. يُضبط تركيز الخلايا على 100,000 خلية/mL في وسط زراعي كامل.
      3. يُحضر حجم نهائي للمعلق يتراوح بين 1–2 mL.
        ملاحظة: استُخدمت خلايا في الممر الخامس (passage 5) في هذه الدراسة.
    3. استزراع الخلايا
      1. يُحقن معلق الخلايا في منفذ الدخول للقناة الدقيقة السفلية.
      2. يُقلب الجهاز بعد استزراع الخلايا
        ملاحظة: يساعد قلب الجهاز على ترسيب الخلايا نحو سطح العاج ويعزز من التصاق الخلايا.
    4. التحضين
      1. يُوضع الجهاز المقلوب داخل طبق بتري.
      2. يُضاف 1 mL من الوسط الزراعي إلى طبق بتري لتقليل التبخر.
      3. يُحضن الجهاز عند 37°C و 5% CO2 لمدة 24 h.
      4. تُحفظ ظروف الزراعة الساكنة طوال فترة التحضين.
        ملاحظة: لم يتم إجراء التحقق من التدفق الديناميكي في هذه الدراسة.
        ملاحظة: يصف البروتوكول الحالي ظروف الزراعة الساكنة للتحقق الأولي من الجهاز وتقييم التصاق الخلايا.
    5. التحقق الأولي من الجهاز
      1. يُقيم التصاق الخلايا باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.
      2. يُستخرج قرص العاج عن طريق تفكيك الجهاز قبل التحليل.
  3. تحضير العينات للمجهر الإلكتروني الماسح
    1. استخراج العينات وغسلها
      1. يُفكك الجهاز بعد 24 h من التحضين.
      2. يُستخرج قرص العاج ويُنقل إلى طبق زراعة أو طبق بتري.
      3. يُوضع سطح العاج المستزرع بالخلايا بحيث يكون موجهاً للأعلى.
      4. يُغسل قرص العاج مرتين باستخدام 1 mL من PBS.
    2. التثبيت
      1. يُضاف 2 mL من glutaraldehyde بتركيز 2.5% في محلول Sorensen’s phosphate buffer بتركيز 0.1 M.
      2. تُحضن العينة لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة (RT).
        تنبيه: مادة glutaraldehyde سامة وقد تسبب تهيجاً للجلد والعينين والجهاز التنفسي. يجب إجراء عمليات التثبيت داخل خزانة استخلاص كيميائية مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    3. الغسل بعد التثبيت
      1. يُزال محلول glutaraldehyde.
      2. يُغسل قرص العاج ثلاث مرات بماء مقطر فائق النقاء في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. تحليل SEM
      1. تُحلل العينات باستخدام مجهر إلكتروني ماسح بيئي.
      2. يُشغل المجهر تحت ظروف فراغ منخفض (25 Pa).
      3. يُستخدم جهد تسريع قدره 10.0 kV ومسافة عمل قدرها 7.0 mm.
      4. تُلتقط الصور باستخدام وضع الكشف ثلاثي الأبعاد للإلكترونات المرتدة (BSE-3D).
      5. تُلتقط الصور بتكبير ×200 (الشكل 2A).
  4. تقييم حيوية الخلايا عبر المجهر البؤري
    1. تحضير العينات
      1. تُستزرع الخلايا وتُربى كما هو موضح في الخطوة 3.2.
      2. يُحضن الجهاز لمدة 24 h عند 37°C و 5% CO2.
      3. يُفكك الجهاز ويُكشف عن سطح العاج.
      4. يُنقل قرص العاج إلى طبق آبار يحتوي على HBSS+/+ مُدفأ مسبقاً ومُدعم بـ Ca2+ و Mg2+.
    2. غسل العينات
      1. يُغسل قرص العاج مرتين باستخدام HBSS+/+.
      2. يُزال المصل المتبقي والفينول الأحمر قبل التلوين.
        ملاحظة: قد يؤدي المصل المتبقي والفينول الأحمر إلى زيادة التألق الذاتي في الخلفية.
    3. تلوين الخلايا الحية
      1. يُحضر محلول عمل طازج من Calcein AM بتركيز 2 µM في HBSS+/+.
      2. تُضاف كمية كافية من محلول التلوين لتغطية سطح العاج بالكامل.
      3. تُحضن العينة لمدة 20 min عند 37°C في الظلام.
      4. يُزال محلول التلوين بعد التحضين.
    4. تلوين الخلايا الميتة
      1. يُضاف محلول عمل Propidium Iodide (بتركيز 1–2 µg/mL في HBSS+/+).
      2. تُحضن العينة لمدة 5–8 min عند 37°C في الظلام.
      3. يجب ألا تتجاوز مدة التحضين 10 min.
      4. تُغسل العينة مرتين باستخدام HBSS+/+.
      5. تُترك العينة مغمورة في المحلول المنظم حتى التصوير.
    5. الالتقاط بالمجهر البؤري
      1. تُلتقط الصور البؤرية خلال 30 min من التلوين.
      2. تُلتقط الصور بالتتابع في القناتين الخضراء والحمراء.
      3. يُستخدم λex 490 nm و λem 515 nm لتصوير الخلايا الحية.
      4. يُستخدم λex 535 nm و λem 617 nm لتصوير الخلايا الميتة.
        ​ملاحظة: يجب حماية محاليل التلوين الفلورية والعينات الملونة من التعرض للضوء أثناء إجراءات التحضين والتصوير (الشكل 2B).

figure-protocol-2
الشكل 2: تقييم تمثيلي لالتصاق وحيوية الخلايا الجذعية لب لب الأسنان داخل جهاز محاكاة العضو على شريحة (OoC) لمعقد العاج واللب. (A) صورة بالمجهر الإلكتروني الماسح تظهر الخلايا الجذعية لب لب الأسنان الملتصقة (النجمة البيضاء) على سطح العاج بعد 24 h من الزراعة الساكنة داخل جهاز OoC. بعد 24 h من الزراعة، غطت الخلايا الملتصقة 54.35 ± 0.92% من سطح العاج المعرض للقناة الدقيقة. لا تظهر أي خلايا في منطقة العاج المغطاة بـ PDMS (النجمة السوداء)، مما يشير إلى الإغلاق الفعال بين طبقات الجهاز. شريط المقياس = 200 µm. (B) صورة بالمجهر البؤري تظهر الخلايا الجذعية لب لب الأسنان الحية المصبوغة باللون الأخضر والملتصقة بسطح العاج (الأسهم البيضاء) بعد 24 h من الزراعة الساكنة. كما تُلاحظ الخلايا غير الحية المصبوغة باللون الأحمر (الأسهم الزرقاء). شريط المقياس = 50 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصنيع جهاز "السن على شريحة" بنجاح وفقاً لسير العمل الموضح في الشكل 1A–1I، والذي شمل تحضير قرص العاج (الشكل 1D)، وتصنيع القالب المشتق من الطباعة الضوئية (الشكل 1E)، وإزالة طبقات PDMS المصلدة (الشكل 1F)، والتنشيط بالبلازما قبل الربط (الشكل 1G)، وتجميع الجهاز النهائي (الشكل 1H)، وتوصيل الجهاز بمنظومة الموائع الدقيقة (الشكل 1I). وتكون الجهاز الناتج من تجميعة PDMS مكونة من ثلاث طبقات، حيث دُمِج قرص العاج بالكامل داخل الطبقة الوسطى، مع وجود قنوات مائعية دقيقة علوية وسفلية على جانبي سطح العاج (الشكل 1H).

تميزت النتيجة الإيجابية في هذه المرحلة بغياب فقاعات الهواء المرئية أو الانفصال الطبقي، وبمرور السوائل دون تسرب بعد حقن PBS أو وسط الزرع عبر منافذ الإدخال (الشكل 1I). وكان عدم محاذاة منافذ القناة الدقيقة، أو عدم اكتمال الربط البلازمي، أو حدوث تسرب عند الواجهة بين العاج وPDMS مؤشراً على فشل عملية التجميع، مما تطلب إعادة إجراء خطوات التصنيع.

تم تصنيع ما مجموعه 30 جهازاً، فشل ما يقرب من 20% منها أثناء التصنيع أو الاختبار. ارتبط الفشل في المقام الأول بتسرب السوائل خارج حدود القناة الدقيقة بسبب عدم اكتمال الربط بالبلازما، بينما نتجت نسبة أقل من حالات الفشل عن انفصال الطبقات في مناطق أخرى من الجهاز. ولم تُعزَ أي حالات فشل إلى تسرب عند الواجهة بين العاج وPDMS أو إلى عدم محاذاة فتحات الإدخال والإخراج للقناة الدقيقة.

بعد 24 h من الزراعة الساكنة، تم التأكد من نجاح استزراع الخلايا من خلال وجود خلايا جذعية لبنية سنية ملتصقة تظهر شكلًا ليفيًا على سطح العاج. وقد وفر المجهر الإلكتروني الماسح تقييمًا لكل من التزام الخلايا وسلامة الجهاز (الشكل 2A). وباستخدام البروتوكول الحالي، غطت الخلايا الملتصقة 54.35 ± 0.92% من سطح العاج المعرض للقناة الدقيقة بعد 24 h من الزراعة. وتمثلت النتيجة الإيجابية في وجود خلايا ملتصقة حصريًا ضمن منطقة القناة الدقيقة، بينما ظل سطح العاج المغطى بـ PDMS خاليًا من ارتباط الخلايا (الشكل 2A). وقد دعم هذا التوزيع المكاني نجاح عملية الختم بين طبقات الجهاز والتجميع السليم للجهاز. وعلى العكس من ذلك، فإن وجود خلايا خارج حدود القناة الدقيقة يشير إلى حدوث تسرب ويجب اعتباره نتيجة سلبية.

أتاح المجهر البؤري باستخدام صبغة الخلايا الحية والميتة إجراء تقييم غير مدمر لصلاحية الخلايا داخل الجهاز. وتميزت النتيجة الناجحة بسيادة الخلايا الحية التي أظهرت فلورة خضراء ومورفولوجيا ليفية، مع وجود خلايا غير حية ملونة باللون الأحمر في حالات نادرة فقط (الشكل 2B). وفي المقابل، فإن وجود نسبة عالية من الخلايا غير الحية من شأنه أن يشير إلى تهيئة غير مثالية للعاج، أو غسيل غير كافٍ، أو ظروف زراعة غير مناسبة.

خلال مرحلة تحسين البروتوكول، تم تقييم استراتيجية تصنيع أولية استُخدم فيها قالب ثابت يشتمل على تجويف محدد مسبقاً لتحديد موضع قرص العاج ضمن طبقة PDMS الوسطى (الشكل 3A). ورغم أن هذا النهج كان يهدف إلى توحيد وضع القرص وتقليل التسريب عند الواجهة الفاصلة بين القرص وPDMS، إلا أنه ثبت عدم كفاءته من الناحية العملية. ونظراً لأن المنطقة المقابلة لتجويف قرص العاج كان يجب قطعها يدوياً من طبقة PDMS المعالجة، لم يكن من الممكن تحقيق تكيف دقيق وموثوق بين حواف القرص وحواف PDMS المقطوعة، مما أدى إلى حدوث فجوات بينية تسببت في تسريب في حوالي 50% من الأجهزة المصنعة (الشكل 3A).

figure-results-1
الشكل 3: صور تمثيلية توضح نهج التصنيع غير الناجحة التي تم تحديدها أثناء تحسين جهاز محاكاة العضو (OoC) لمعقد العاج واللب. (A) قالب سيليكون يحتوي على تجاويف ثابتة مصممة لتحديد موضع أقراص العاج بشكل معياري (الأسهم البيضاء). نظرًا للتفاوت المتأصل في أبعاد أقراص العاج الناتج عن التحضير اليدوي للعينات، تعذر تحقيق تكيف موثوق مع هندسة القالب الثابتة، مما أدى إلى ظهور فجوات بينية وتسرب في حوالي 50% من الأجهزة المصنعة. (B) صورة بالمجهر الإلكتروني الماسح لسطح العاج بعد وضع مادة سدادة عند الواجهة بين القرص وPDMS. يظهر العاج المكشوف (النجمة السوداء) ورواسب المادة السدادة (النجمة البيضاء). أدى الانتشار غير المقصود للمادة السدادة على سطح العاج إلى إضعاف التصاق الخلايا وتقليل مساحة السطح المتاحة لاستعمار الخلايا. شريط المقياس = 100 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

ولمعالجة هذا القصور، تم تطبيق مادة سدّ عند الواجهة الفاصلة بين القرص وPDMS. ومع ذلك، أدى هذا النهج إلى ظهور عيب إضافي، حيث انتشرت مادة السد على سطح العاج ومنعت التصاق الخلايا في المناطق المغطاة، كما ظهر في المجهر الإلكتروني الماسح (الشكل 3B). وقد سلطت هذه النتائج غير المرضية الضوء على قصورين حاسمين في استراتيجية التصنيع الأولية: عدم التكيف الكافي بين تجويف PDMS المقطوع يدويًا وقرص العاج، وانخفاض التصاق الخلايا المرتبط بمادة السد.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الدراسة بروتوكولاً مفصلاً خطوة بخطوة لتصنيع جهاز "سن على شريحة" (tooth-on-a-chip) مكدس رأسياً يشتمل على عاج وأسنان وخلايا جذعية لبية سنية، وتوضح نماذج ممثلة لالتصاق الخلايا وحيويتها داخل الجهاز تحت ظروف زراعة ساكنة. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لتوفير سير عمل قابل للتكرار لتصنيع وتجميع منصة "عضو على شريحة" (OoC) لمعقد العاج واللب، تكون مناسبة للدراسات المختبرية (in vitro) للواجهة العاجية. ويكتسب إنشاء سير العمل هذا أهمية خاصة لأن مراجعتنا المنهجية الأخيرة سلطت الضوء على أن مجال النماذج المائعية الدقيقة لمعقد العاج واللب لا يزال في مرحلة ناشئة، وتتميز بتباين منهجي كبير في بنية الأجهزة والمواد المستخدمة، مما يضعف بشدة إمكانية تكرار وتوحيد نماذج "السن على شريحة" الحالية34. ومن خلال تقديم بروتوكول مفصل وقابل للتكرار، تعالج هذه الدراسة هذه القيود وتساهم في تطوير نماذج بيولوجية محددة بشكل أفضل. وفي السياق الأوسع لتطوير تقنية "العضو على شريحة" المطبقة على بيولوجيا الفم، كان لـ França et al.15 السبق في هذا المجال من خلال نموذج مائعي دقيق "لسن على شريحة" يشتمل على أقراص عاجية وخلايا شبيهة بالأرومات السنية، مما أثبت إمكانية إعادة إنشاء الواجهة بين العاج واللب في بيئة مائعية دقيقة وديناميكية، وتقييم الاستجابة السامة للخلايا تجاه مواد طب الأسنان. ومنذ هذه المساهمة الرائدة، تم تسجيل عدد متزايد من منصات "العضو على شريحة" الفموية في الأدبيات العلمية34، والتي تناولت جوانب متنوعة من بيولوجيا أنسجة الأسنان، وتفاعلات المواد الحيوية، وعلم الأحياء الدقيقة الفموي، مما رسخ هذا النهج كمجال بحثي نشط ومتوسع بسرعة. ويساهم البروتوكول الحالي في هذا المشهد من خلال توفير سير عمل مفصل وقابل للتكرار لتصنيع منصة "سن على شريحة" مكدسة رأسياً، تكون متاحة للمجموعات البحثية التي تمتلك إمكانيات مائعية دقيقة قياسية.

تعد العديد من الخطوات في البروتوكول حاسمة لنجاح تصنيع الجهاز وأدائه. وبوجه خاص، يتطلب صب PDMS فوق القالب تحكماً دقيقاً للحصول على سمك طبقة موحد وتكوين قنوات دقيقة سليمة. يجب اختيار سمك طبقات PDMS وفقاً للتطبيق اللاحق المستهدف؛ فعلى سبيل المثال، يتطلب المجهر البؤري (confocal microscopy) طبقات PDMS رقيقة بما يكفي للسماح بالتصور البصري للخلايا الملتصقة بسطح العاج. ومع ذلك، قد تكون الطبقات الأكثر رقة أصعب في التعامل معها أثناء إجراءات التصنيع والتجميع. وبناءً على ذلك، يمثل تحسين سمك PDMS توازناً هاماً بين إمكانية التصوير والتعامل العملي أثناء تصنيع الجهاز. علاوة على ذلك، في الدراسة الحالية، لم يكن التصوير بالمجهر البؤري للأجهزة السليمة ممكناً لأن طبقة PDMS التي تعلو الخلايا كان سمكها 0.4 mm، وهو ما يتجاوز عمق الاختراق للمجهر البؤري المتاح (0.2 mm). ونتيجة لذلك، تم إجراء التصوير البؤري بعد تفكيك الجهاز والتعريض المباشر لسطح العاج. بالإضافة إلى ذلك، لم يكن المجهر الفلوري قابلاً للتطبيق في هذا الجهاز لأن العتامة المتأصلة في العاج منعت التصور البصري المباشر للخلايا الملتصقة بسطحه.

يعد هذا القيد ذا صلة خاصة بتكوينات العضو على شريحة (OoC) المكدسة عمودياً، حيث يتم وضع القناة الدقيقة التي تحتوي على الخلايا أسفل قرص العاج، مما يؤدي إلى إعاقة الوصول البصري بسبب كل من طبقة PDMS العلوية وعتمة العاج نفسه. ولا يظهر هذا القيد في تصميمات الشرائح المكدسة أفقياً، حيث تمتد القنوات الدقيقة جانبياً بجوار العاج بدلاً من أن تكون أسفله، مما يسمح بالوصول البصري المباشر إلى السطح المزروع بالخلايا دون تداخل من عتمة العاج أو سمك PDMS. لذا، يجب أن يأخذ الاختيار بين تكوينات التكديس العمودي والأفقي في الاعتبار ليس فقط المتطلبات السائلة والبيولوجية، بل أيضاً أنماط التصوير المتاحة في المختبر. وفي نظام OoC، يلعب تصميم الجهاز دوراً هاماً، ويجب الحفاظ على البيئة الدقيقة لتكون أقرب ما يمكن إلى الظروف الحيوية (in vivo). ومثل معظم الأنسجة، يتعرض السن لمحفزات ميكانيكية ويظهر سلوكاً متباين الخواص (anisotropic) 35، مما يعني أن خصائصه تختلف اعتماداً على اتجاه المحفز المطبق. علاوة على ذلك، توجد اختلافات نسيجية بين الجزء التاجي من معقد العاج واللب، حيث يترتب العاج والخلايا المكونة للعاج عمودياً، والجزء الجانبي، حيث تقع الخلايا المكونة للعاج بجوار العاج، مع وجود اختلافات ملحوظة في عدد الخلايا وتنظيمها واتجاه الأنابيب العاجية. وبالتالي، فإن تصميم الشريحة المكدسة عمودياً يوفر تمثيلاً تشريحياً أكثر دقة للآفات النخرية ومواد الترميم التي تؤثر على الجانب التاجي من معقد العاج واللب.

تُعد المعالجة الدقيقة لسطح البلازما ضرورية لتجميع الأجهزة بنجاح وتظل واحدة من التحديات الرئيسية في إنتاج الرقائق36. في هذه الدراسة، حدث انفصال في الطبقات في 20% من الأجهزة المصنعة. وهذه النتيجة ليست مفاجئة لأن ربط PDMS–PDMS الذي تم تحقيقه باستخدام قلم بلازما محمول، كما هو مستخدم في الدراسة الحالية، يولد تركيزاً أقل من أنواع الأكسجين التفاعلية مقارنة بأنظمة غرف البلازما القائمة على الفراغ، والتي تسمح بتراكيز أكسجين أعلى من المستويات الجوية، وبالتالي تنتج عدداً أكبر من المجموعات السطحية التساهمية المتاحة للربط36. ونتيجة لذلك، فإن قوة الربط التي يتم تحقيقها باستخدام قلم البلازما تكون بطبيعتها أقل وأقل قابلية للتكرار من تلك التي يتم الحصول عليها باستخدام غرفة بلازما مخصصة، وهو ما ساهم على الأرجح في معدل انفصال الطبقات الملحوظ. كما تطلبت عملية تحسين استراتيجية دمج العاج عدة تكرارات للتصنيع لتحقيق تلامس وثيق بين قرص العاج وطبقة PDMS الوسطى مع تقليل التسريب إلى أدنى حد. تضمن النهج الأولي تصنيع تجويف محدد مسبقاً داخل الطبقة الوسطى لوضع العاج؛ ومع ذلك، فإن التقطيع اليدوي للتجويف حال دون التكيف المتسق بين قرص العاج وحواف PDMS، مما أدى إلى حدوث تسريب أثناء حقن وسط المزرعة وأسفر عن معدل نجاح إجمالي للتصنيع يبلغ حوالي 50%.

تم تقييم مادة لاصقة لأطقم الأسنان لاحقاً لتحسين الإحكام عند الواجهة بين العاج وPDMS، إلا أن المجهر الإلكتروني الماسح أظهر تداخلاً مع التصاق الخلايا وانخفاضاً في رؤية الخلايا على سطح العاج. وبناءً على ذلك، تم تحسين البروتوكول النهائي عن طريق وضع قرص العاج مباشرة داخل القالب قبل صب PDMS بعناية حول العينة، مما أدى إلى تحسين دمج قرص العاج داخل الجهاز وتقليل الحاجة إلى مواد إحكام إضافية. وقد قضى هذا النهج بفعالية على التسريب عند الواجهة بين العاج وPDMS من خلال ضمان تلامس وثيق ومتطابق بين حواف قرص العاج وPDMS المحيط به، دون الاعتماد على عوامل إحكام ثانوية قد تتدخل في التصاق الخلايا بسطح العاج. كما يجب مراعاة العديد من القيود في الطريقة الحالية؛ حيث يظل تصنيع الأجهزة الموائع دقيقة معتمداً جزئياً على إجراءات المناولة اليدوية، مما قد يؤدي إلى تباين بين الأجهزة والمشغلين. وعلى الرغم من أن الطباعة الحجرية الضوئية توفر دقة عالية وقابلية للتكرار في تصنيع هندسة القنوات الدقيقة، إلا أن هذه العملية قد تتطلب معدات متخصصة وخبرة تقنية. وقد تسهل مناهج التصنيع البديلة، بما في ذلك تقنيات الطباعة ثلاثية الأبعاد، عملية بناء النماذج الأولية للأجهزة وإمكانية الوصول إليها في بعض المختبرات؛ ومع ذلك، فإن عوامل مثل دقة الطباعة، والمونومرات المتبقية، والتوافق الحيوي للمواد تتطلب تحسيناً دقيقاً37.

يوفر الإمداد المستمر من الوسط بيئة مستقرة للخلايا ويحميها من تراكم الفضلات أو اختلال توازن الكالسيوم/الفوسفات16. وقد أظهرت دراسات عدة أن إجهاد القص الناتج عن التدفق المستمر يمكن أن يحاكي عمليات نقل الإشارات الميكانيكية المشابهة لتلك التي تحدث في الجسم الحي، والتي تعد محددات رئيسية لسلوك الخلايا38,39، مما يساهم في تمايز الخلايا ونضجها ويحدث تغييرات ملحوظة في مورفولوجيا الخلايا وتعبيرها الجيني ووظيفتها39. تصف الدراسة الحالية تصنيع الجهاز والتحقق الأولي من كفاءته، مع إثبات التصاق الخلايا وحيويتها بعد 24 h في ظروف الزرع الساكن؛ ولذلك، لم يتم تقييم تأثيرات التدفق الديناميكي. ويمثل تطبيق ظروف التدفق الديناميكي مساراً هاماً للأبحاث المستقبلية وسيتم تناوله في استقصاءات لاحقة. يوفر البروتوكول الحالي سير عمل قابلاً للتكرار لتصنيع جهاز "عضو على شريحة" (OoC) لمركب العاج واللب مكدس عمودياً يدمج العاج ضمن منصة مائعية دقيقة من الـ PDMS مكونة من ثلاث طبقات. وتشمل التطبيقات المحتملة لهذا النموذج استقصاء التفاعلات بين العاج والمواد الحيوية، والاستجابات الخلوية لمواد طب الأسنان، والتقييم المختبري للواجهة بين العاج واللب تحت ظروف تجريبية مضبوطة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي مصالح مالية متضاربة، وأنه لا توجد لديهم أي تضاربات في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال المشروع DIM24-0004 والمشروع PP24-0031، مديرية الأبحاث، جامعة لا فرونتيرا (Universidad de La Frontera)؛ ومنحة FONDECYT Regular رقم 1260116؛ ومنحة FONDECYT de Iniciación رقم 11230701، الوكالة الوطنية للبحث والتطوير (ANID)، تشيلي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>المواد البيولوجية والكيميائية
الأسيتونExpertQسولف 8تنظيف رقاقة السيليكون
وسط زراعة Alpha MEMCytivaSH30265.02وسط زراعة الخلايا الجذعية لللب السني
كلورامين (0.5%)Merck7080-50-4محلول تخزين أقراص العاج
الخلايا الجذعية لب لب الأسنانغير قابل للتطبيقغير قابل للتطبيقزراعة الخلايا الأولية. راجع الخطوتين 3.2.1 و3.2.2
إيديتات (10%)وينكلرN2222158Eإزالة طبقة اللطخة
مقاوم ضوئي سلبي قائم على الإيبوكسيGersteltecGM1060تصنيع قوالب الطباعة الحجرية الضوئية
غلوتارالدهيد (2.5%) في محلول سورينسن (0.1 مولار)’محلول فوسفات منظمSigma-Aldrich210908-06تثبيت العينات للمجهر الإلكتروني الماسح (SEM)
أسنان بشرية سليمة (أضراس أو ضواحك)غير قابل للتطبيقغير قابل للتطبيقعينة بشرية
إيزوبروبانولإكسبرت كيو (ExpertQ)SOLV 16تنظيف الرقاقة، وإيقاف التحميض، وتنظيف مادة PDMS
طقم قياس الحيوية LIVE/DEADSigma-Aldrich451صبغ الحيوية الفلوري. 
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)Corning46-013-CMالغسيل واختبار التسرب
قاعدة وعامل معالجة الـ PDMS (بوليديميثيل سيلوكسان)داوSylgard 184تصنيع الجهاز
PGMEASigma Aldrich484431تحميض المقاوم الضوئي
صبغة تريبان الزرقاءSigma Aldrich T8154-100 ملتقييم حيوية الخلايا
تريبسينCorning25-053-CIفصل الخلايا
مياه فائقة النقاءCytivaSH30529.01محلول الغسيل
<قوي>المستهلكات والأدوات المختبرية
إبر محاقن بقياس 19GVmaticVCB19050توصيل الجهاز بمضخة دقيقة أو محقنة
مخرم الخزعة (القطر: 1 مم)هاريس يونيكور (Harris Unicore)WHAWB100073تصنيع منافذ المدخل والمخرج
بساط تقطيعNicecoolغير قابل للتطبيقحماية السطح أثناء التثقيب
أقراص الإنهاء السنية (مثل Sof-Lex)3MSof-Lexتلميع العاج
وصلات تحويل من لور (Luer) الأنثوية إلى وصلات مسننةRunze FluidicsRH-M016توصيل الأنابيب
عصا خلط زجاجية أو بلاستيكيةديورانغير قابل للتطبيقخلط الـ PDMS
محاقن تحت الجلدتوت البريpc-12246استزراع الخلايا واختبار التسرب
شاش معقم خالٍ من الوبرليندرسونغير قابل للتطبيقإزالة بقايا الثقب
وصلات لور الذكريةRunze FluidicsRH-G016توصيل الأنابيب
وعاء خلطديورانغير قابل للتطبيقتحضير الـ PDMS
طبق بتري (140 مم) × ٢٠ مم)Deltalab2000219زراعة الخلايا/التحضين
قاعدة من بولي تيترا فلورو إيثيلينCCTValغير قابل للتطبيقتصنيع طبقة العاج البينية
رقاقة السيليكونجياوزو كوميرشال فاين وين (Jiaozuo Commercial FineWin)غير قابل للتطبيقتصنيع القوالب
أنبوب سيليكونRunze Fluidics96421التوصيل المائعي
دورق T75Corning 353136توسيع الخلايا الجذعية لب لب الأسنان
صفيحة الآبارSPL Life Sciences30006تحضير صبغ وتصوير المجهر البؤري (Confocal)
<قوي>الأجهزة والأدوات
مجفف الهواءميتالبلان (METALPLAN)TITAN-040تجفيف الهواء المضغوط
مصدر للهواء المضغوطشولتزCSD-18.1تنظيف العفن والأسطح
المجهر البؤري (Confocal microscope)Olympusغير قابل للتطبيقالطراز: FV1000
نظام الليثوغرافيا المباشرة بالليزرهايدلبرغuPG 101تعريض المقاوم الضوئي
المجهر الإلكتروني الماسح البيئيHitachiغير قابل للتطبيقالطراز: Quanta 400 
قبضة يدوية عالية السرعةناكانيشيغير قابل للتطبيقالطراز: Pana-max2
لوح تسخينلاب تيك (LabTech)EH20A Plusتجفيف الرقاقة حرارياً وتجفيف المقاوم الضوئي حرارياً
خزانة التدفق الصفائحيBioBaseBBS8V1708313Dتعقيم الأجهزة
مضخة مائعية دقيقةعصر جديدغير قابل للتطبيقالطراز: 1002X-ES. اختبار التسرب عند 10 µلتر/دقيقة
قالب ذو بنية مجهرية (مُصنع عبر الطباعة الحجرية الضوئية)CCTValغير قابل للتطبيقراجع الخطوة 2.2 لمعرفة مواصفات تصنيع القالب
فرن أو حاضنةMemmertUN110معالجة PDMS عند 50 درجة مئوية°توطيد الروابط وC عند 75°سي
غرفة تنظيف بالبلازما تحت الفراغبلازما فاريGD-5تنشيط الرقاقة بالبلازما
بلازما كورونا محمولة باليد أورورا برو ساينتيفيك (Aurora Pro Scientific)APS-CD-20ACتنشيط البلازما لـ PDMS
جهاز الموجات فوق الصوتية (Ultrasonicator)إلما سونيك (Elma Sonic)S 10 (H)تنظيف الرقاقة
غرفة تفريغ أو مجفف (250 مم)وينجلاسغير قابل للتطبيقإزالة الغازات من الـ PDMS
مضخة تفريغهزاز300إزالة الفقاعات من الـ PDMS

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDMS
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة