يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصنيع جهاز "عضو على شريحة" لمعقد العاج واللب مكدس عمودياً باستخدام قرص عاج بشري

110 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/71713

⸱

أغسطس 14, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

في هذه المقالة

ملخص

لوصف عملية تصنيع وتجميع جهاز "عضو على شريحة" لمركب العاج واللب مكدس رأسيًا، يتضمن قرص عاج بشري وقنوات دقيقة مصنعة بالطباعة الحجرية الضوئية، يليه استزراع وزراعة الخلايا الجذعية لللب السني.

الملخص

تفرض النماذج قبل السريرية التقليدية المستخدمة في أبحاث طب الأسنان، بما في ذلك النماذج الحيوانية والمزارع الخلوية الساكنة، قيوداً مهمة في إعادة إنتاج الظروف الفسيولوجية للواجهة بين العاج واللب والتنبؤ بالاستجابات البيولوجية البشرية للمواد الحيوية السنية. وتوفر تقنية "عضو على شريحة" (OoC) نهجاً بديلاً من خلال تمكين إعادة إنشاء بيئات دقيقة خاصة بالأنسجة ضمن أنظمة مائعية مجهرية متحكم بها. تصف هذه المخطوطة بروتوكولاً خطوة بخطوة لتصنيع وتجميع جهاز "عضو على شريحة" لمعقد العاج واللب، يدمج قرصاً من العاج البشري ضمن منصة مائعية مجهرية مكونة من ثلاث طبقات من مادة البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS). يتضمن البروتوكول تحضير قرص العاج، وتصنيع قوالب ذات هياكل مجهرية باستخدام الطباعة الضوئية، وصب ومعالجة PDMS، والربط بين الطبقات بمساعدة البلازما، وتجميع الجهاز، واختبار التسريب، واستزراع الخلايا الجذعية للب لب الأسنان تحت ظروف المزرعة الساكنة. كما تتم مناقشة معايير التصنيع الحرجة التي تؤثر على أداء الجهاز، بما في ذلك التحكم في سمك طبقة PDMS، ومعالجة السطح بالبلازما، ودمج قرص العاج داخل الجهاز لتقليل التسريب. تم تقييم التصاق الخلايا وحيويتها داخل الجهاز باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح وصبغ الخلايا الحية/الميتة بالفلورة البؤرية. وتظهر النتائج التمثيلية نجاح دمج قرص العاج ضمن التجميع المائعي المجهري، والحفاظ على ظروف خالية من التسريب، والتصاق الخلايا الجذعية الحية للب الأسنان بسطح العاج. يوفر هذا البروتوكول نهجاً قابلاً للتكرار لتصنيع منصة "عضو على شريحة" لمعقد العاج واللب، والتي قد تدعم الدراسات المستقبلية التي تبحث في الاستجابات الخلوية للمواد الحيوية السنية والمحفزات البيئية الدقيقة.

المقدمة

لطالما كانت التجارب على الحيوانات أداة فعالة في تعزيز فهم العمليات المرضية والفسيولوجية، ولعبت دوراً محورياً في المراحل المبكرة من تطوير الأدوية1. وعلى مدار القرن العشرين، ارتفع متوسط العمر المتوقع للبشر بشكل ملحوظ، ورغم أنه ليس من الممكن تحديد المدى الذي يعود فيه هذا التحسن حصراً إلى الأبحاث الحيوانية بدقة، إلا أنه من المعترف به على نطاق واسع أن العديد من العلاجات الطبية المعاصرة قد تم تطويرها أو التحقق من فعاليتها باستخدام النماذج الحيوانية2. وتشمل الأمثلة البارزة تطوير لقاحات ضد شلل الأطفال، والحصبة، والتهاب الكبد B، وتقييم سلامة وفعالية البنسلين، وإنتاج الأنسولين. وفي مجال أبحاث طب الأسنان والمواد الحيوية، كانت هذه النماذج حاسمة في استكشاف عملية تسوس الأسنان، وبيولوجيا وتجدد معقد العاج واللب، والفسيولوجيا المرضية لأنسجة دواعم الأسنان3,4.

على الرغم من الاستخدام الواسع لهذه المنهجيات، لا يزال مسار تطوير الأدوية الحالي يُظهر معدلات فشل مرتفعة، حيث تفشل العديد من الأدوية المرشحة خلال التجارب السريرية على الرغم من إثبات فعاليتها وسلامتها في الإعدادات المختبرية قبل السريرية والنماذج الحيوانية5. وقد رُبط هذا التباين بالاختلافات بين الأنواع التي قد تحد من القدرة التنبؤية الانتقالية للنماذج الحيوانية بسبب الاختلافات التشريحية والجينية والفسيولوجية بين الأنواع6. بالإضافة إلى ذلك، لا يزال تطوير مناهج علاجية جديدة يستغرق وقتاً طويلاً ومكلفاً7. علاوة على ذلك، تعتمد النماذج التقليدية في المختبر (in vitro) بشكل أساسي على مزارع أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد (2D) مبسطة على ركائز بلاستيكية غير فسيولوجية، مما يؤدي إلى الفشل في محاكاة الإشارات البيوكيميائية والفيزيائية، والتفاعلات بين الخلايا، وإشارات المصفوفة خارج الخلوية (ECM) الموجودة في تجويف الفم البشري8,9. وعلى الرغم من أن النماذج ثنائية الأبعاد توفر مزايا تجريبية معينة، إلا أنها عاجزة بطبيعتها عن محاكاة التفاعلات المعقدة التي تحدث بين مكونات متعددة في آن واحد، مثل الأغشية الحيوية، والمواد الحيوية، والعاج، وخلايا اللب10. وبناءً على ذلك، هناك اهتمام متزايد بتطوير منصات تجريبية بديلة قادرة على إعادة إنتاج الاستجابات البيولوجية البشرية بدقة أكبر. وفي عام 2022، ألغى قانون تحديث إدارة الغذاء والدواء (FDA Modernization Act 2.0) المتطلب الإلزامي للاختبارات الحيوانية في عملية الموافقة على الأدوية، واعترف بإمكانية استخدام المنصات البديلة، بما في ذلك تقنيات العضو على شريحة (OoC)، في الأبحاث قبل السريرية11.

يعتبر "العضو على شريحة" (OoC) جهازاً للموائع الدقيقة صُمم لمحاكاة بنية ووظيفة والبيئة المجهرية لعضو معين أو مكون نسيجي12. تُستزرع في هذه الأجهزة خلايا وأنسجة حية داخل قنوات دقيقة مهندسة تعيد إنتاج الجوانب الرئيسية للبيئة المجهرية الفسيولوجية التي تتعرض لها الخلايا طبيعياً. وعلاوة على المحاكاة البنيوية، تتيح القنوات الدقيقة تحكماً زمانياً ومكانياً في البيئة الخلوية وتدعم الحفاظ على الوظائف الخاصة بالأنسجة، مما يوفر ظروفاً تجريبية قد تشبه الفسيولوجيا الحية (in vivo) بشكل أوثق من أنظمة الزرع التقليدية12. ومن الأهمية بمكان أن القنوات الدقيقة في أجهزة OoC تسهل التدفق المتحكم فيه لوسط الزرع، مما يولد إجهاد قص على الخلايا المستقرة13. تؤثر هذه المحفزات الميكانيكية على الاستجابات الخلوية بما في ذلك الالتصاق، والتكاثر، والهجرة، والتعبير الجيني، والتفاعلات بين الخلايا14,15. بالإضافة إلى ذلك، يساهم التدفق المستمر للوسط في الحفاظ على البيئة المجهرية من خلال إمداد العناصر الغذائية وإزالة نواتج الفضلات الأيضية16. وعلاوة على ذلك، وبالمقارنة مع المزارع التقليدية ثنائية الأبعاد (2D)، أفادت بعض منصات OoC بدعم تحكم محسّن في قراءات الإجهاد التأكسدي، بما في ذلك أنواع الأكسجين التفاعلية داخل الخلايا وحيوية الخلايا، في نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) على الشريحة17. وبناءً على ذلك، ظهرت أنظمة OoC كمنصات واعدة لدراسة فسيولوجيا الأنسجة، وتفاعلات المواد الحيوية، وعمليات المرض تحت ظروف تجريبية محكومة18. وفي أبحاث طب الأسنان، طُبقت تقنية OoC تدريجياً لنمذجة واجهات الأنسجة الفموية التي تزداد تعقيداً19. وقد حاكت منصات "السن على شريحة" المبكرة الواجهة بين المادة الحيوية والعاج واللب20، بينما دمجت الإصدارات الأكثر تقدماً منذ ذلك الحين الأوعية الدموية والتعصيب الثلاثي التوائم لمحاكاة التعقيد البنيوي والوظيفي لمعقد اللب والعاج بشكل أكثر دقة21. وبعيداً عن اللب، مكنت النماذج ثلاثية الأبعاد لقنوات الجذور غير المكتملة من تقييم محاليل الإرواء اللبية والتبريعم الوعائي في الخلايا الجذعية المستمدة من الحليمة الذروية22,23. وعلى مستوى دواعم السن، استُخدمت منصات "اللثة على شريحة" لاستقصاء التفاعلات بين المضيف والميكروبات ولتقييم القدرة التعديلية المناعية للمعززات الحيوية (probiotics) كعوامل علاجية24، بينما أظهرت أجهزة "الرباط periodontal على شريحة" كيف يقوم تدفق السوائل الخلالية بتعديل تكوين الشبكة الوعائية والتمايز العظمي لكريات الخلايا الجذعية للرباط periodontal25,26. واستكمالاً لهذه النماذج، ساهمت أنظمة "المخاطية الفموية على شريحة" و"غرسات الأسنان على شريحة" المتخصصة في توسيع نطاق أبحاث الموائع الدقيقة في طب الأسنان من خلال توصيف التفاعلات بين المضيف والمادة والسمية الخلوية للمونومرات السنية تحت ظروف ذات صلة فسيولوجياً27,28.

بينما يتم تطبيق أنظمة العضو على شريحة (OoC) بشكل متزايد في أبحاث الأسنان والفم والوجه والفكين، تظل الجهود المستمرة نحو توحيد معايير سير عمل التصنيع وقابليته للتكرار أمراً بالغ الأهمية. وقد ورد في الأدبيات عدة نماذج لـ "السن على شريحة"20,29,30,31، والتي استعرضت تكوينات مختلفة للأجهزة وتطبيقات تجريبية متنوعة. ومع ذلك، فإن التباينات في بنية الجهاز، وطرق التصنيع، ودمج العاج، والتقرير عن المعاملات التجريبية قد تحد من القابلية للتكرار والمقارنة المباشرة بين الدراسات. وبوجه خاص، قد تؤثر الاختلافات في هندسة القنوات الدقيقة، واستراتيجيات دمج العاج، ونهج التصنيع على البيئة الدقيقة البيولوجية والميكانيكية داخل الجهاز. تتضمن بعض النماذج المبلغ عنها العاج لإعادة إنتاج جوانب من الواجهة بين العاج واللب20,29,30، بينما تستخدم نماذج أخرى تكوينات بديلة31. بالإضافة إلى ذلك، فإن طرق التصنيع مثل الطباعة الحجرية الضوئية، والقطع بالليزر، والتقطيع الدقيق، والطباعة ثلاثية الأبعاد، يقدم كل منها مزايا وقيوداً محددة بناءً على تصميم الجهاز والتطبيق المنشود. علاوة على ذلك، يعد التوجه المعماري للجهاز محدداً حاسماً للفائدة البيولوجية، وتحديداً ما إذا كانت القنوات وشريحة العاج مرتبة في تكوين أفقي أو رأسي19,32. في التكوينات المكدسة أفقياً، تسهل المقصورات المرتبة جنباً إلى جنب عملية التقسيم الجانبي والتصوير المباشر للخلايا في الوقت الفعلي، مما يجعلها مناسبة بشكل خاص لنمذجة الأنسجة ذات التنظيم المكاني الجانبي بطبيعتها، مثل المعقد اللثوي24,32. ومع ذلك، فإن هذا التصميم محدود بطبيعته في قدرته على إعادة إنشاء الواجهات البيولوجية المتعامدة، مثل معقد المادة الحيوية والعاج واللب، حيث أن الترتيب الجانبي للمقصورات لا يحاكي بدقة التوجه الحيوي لحاجز العاج بين التجويف واللب20,32. وتتجاوز التكوينات المكدسة رأسياً هذه القيود من خلال وضع مقصورتين فوق بعضهما البعض على طول المحور y، يفصل بينهما شريحة عاج طبيعية، مما يسمح بالقياس الكمي المتزامن للنقل الجزيئي عبر العاج السليم والمراقبة الفورية لاستجابات خلايا اللب التي يتم قياسها في وسط المخرج30. ومع ذلك، فإن أحد القيود المعروفة لهذا التوجه يتعلق بالتصوير المقطعي لواجهة العاج والخلايا، حيث يظل الحصول على صور مقطعية لواجهة العاج والخلايا ضمن نفس المستوى البؤري أكثر تحدياً من الناحية التقنية مقارنة بالتكوينات المكدسة أفقياً، حيث تكون الخلايا والمصفوفات خارج الخلوية مرتبة جانبياً. ورغم الإبلاغ عن نماذج متعددة لمعقد العاج واللب على شريحة في الأدبيات، إلا أن غالبيتها تتبنى تكويناً مكدساً أفقياً يتم فيه ترتيب المقصورات جنباً إلى جنب في نفس المستوى10,20,21,29، بينما دمج عدد قليل نسبياً شريحة عاج طبيعية ضمن تكوين مكدس رأسياً30. وبالرغم من ذلك، لا تزال الاختلافات في نهج التصنيع ومعاملات التقرير عبر هذه النماذج تحد من القابلية للتكرار والمقارنات بين الدراسات33. تهدف المخطوطة الحالية إلى تحسين القابلية للتكرار المنهجي من خلال توفير بروتوكول تصنيع مفصل لجهاز "سن على شريحة" مكدس رأسياً، مما يسهل الاعتماد الأوسع لهذه المنصة داخل مجتمع أبحاث الأسنان.

تصف هذه المخطوطة بروتوكولاً تفصيلياً للتصنيع والتجميع لجهاز "عضو على شريحة" (OoC) يمثل معقد العاج واللب بشكل مكدس رأسياً، حيث يدمج قرص عاج بشرياً ضمن منصة موائع دقيقة مكونة من ثلاث طبقات من مادة البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) مصنعة باستخدام قالب تم إنتاجه عبر الطباعة الحجرية الضوئية. كما يصف البروتوكول عملية استزراع الخلايا الجذعية لب السن وزراعتها داخل الجهاز تحت ظروف ساكنة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

أُجريت الدراسة وفقاً لإعلان هلسنكي وبموافقة لجنة الأخلاقيات في Universidad de La Frontera للدراسات التي تتضمن عينات بشرية.

1. الحصول على قرص العاج

ملاحظة: قم بإعداد تصميم الجهاز قبل البدء في البروتوكول (الشكل 1A–1C).

  1. جمع وتخزين الأسنان
    1. جمع الأضراس أو الضواحك البشرية السليمة بعد الحصول على موافقة مستنيرة من المريض.
    2. حفظ جميع العينات في محلول كلورامين بتركيز 0.5% عند درجة حرارة 4°C لمنع جفاف العاج وتبيذ البروتين.
    3. استبدال محلول الكلورامين مرة واحدة أسبوعياً أثناء التخزين.
  2. تحضير أقراص العاج
    1. قطع كل سن أفقياً عند الثلث الأوسط من التاج باستخدام قبضة يدوية عالية السرعة تعمل بسرعة 350,0 rpm ومجهزة بسن ماسي أسطواني (قطره 1 mm؛ وحجم حبيبات 10–150 µm).
    2. إجراء عملية القطع تحت ري مستمر بالماء بمعدل تقريبي قدره 50 mL/min.
    3. تحديد موضع القطع عند الثلث الأوسط من التاج لتجنب حجرة اللب والميناء الموجود عند الأخاديد والشقوق الإطباقية، وبذلك يتم الحصول على قرص يتكون غالباً من نسيج العاج.
      تنبيه: يجب إجراء قطع السن تحت ري مستمر وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات، والكمامة، والنظارات الواقية.
  3. تشطيب أقراص العاج
    1. صقل قرص العاج باستخدام أقراص تشطيب ذات أحجام حبيبات تناقصية بالتتابع.
    2. الاستمرار في الصقل حتى الوصول إلى سمك نهائي للعاج يبلغ حوالي 0.8 mm (± 0.3 mm) وأبعاد جانبية تبلغ حوالي 5 mm × 5 mm (± 0.3 mm) (الشكل 1D).
  4. تخزين أقراص العاج
    1. تخزين أقراص العاج المُحضرة في محلول كلورامين بتركيز 0.5% عند درجة حرارة 4°C حتى تجميع جهاز OoC.

مخطط تجميع جهاز الموائع الدقيقة؛ مراحل التصنيع باستخدام الملاقط، وأداة الثقب، وتوجيه السوائل.
الشكل 1: سير عمل تصميم وتصنيع جهاز "عضو على شريحة" (OoC) للمعقد العاجي اللبي. (Aتصميم ثلاثي الأبعاد للجهاز يوضح البنية ذات الثلاث طبقات.B( منظر علوي لتصميم الجهاز مع الأبعاد الرئيسية. (كربون(منظر جانبي لتكوين الجهاز المكون من ثلاث طبقات.)د) قرص عاجي ممثل تم تحضيره بسمك تقريبي يبلغ 0.8 ملم وأبعاد جانبية تبلغ حوالي 5 ملم × 5 ملم. (هـ(قالب رئيسي من السيليكون تم تصنيعه بواسطة الطباعة الحجرية الضوئية واستُخدم لصب طبقات البوليديميثيل سيلوكسان (PDMS) العلوية والسفلية.)فإزالة طبقة PDMS المعالجة من القالب السيليكوني بعد البلمرة الحرارية.ج) معالجة سطح PDMS بالبلازما قبل ربط الطبقات. (هـ(جهاز محاكاة عضو على شريحة (OoC) النهائي لمعقد العاج واللب المكون من ثلاث طبقات، تم تجميعه بواسطة الربط بالبلازما ودمج الواجهة العاجية).Iالجهاز المُجمع متصلاً بالأنابيب لاختبار التسريب والتحضير لتجارب الموائع الدقيقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

2. تصنيع جهاز محاكاة العضو على شريحة (OoC) لمجمع العاج واللب السني

  1. تحضير مساحة العمل والمواد
    1. تحضير المواد والمعدات
      1. تحضير جميع المواد والمعدات المدرجة في جدول المواد قبل البدء في تصنيع الجهاز.
      2. تحضير أدوات ثقب الخزعات قبل تجميع الجهاز.
      3. تنفيذ جميع إجراءات التصنيع في بيئة نظيفة وخالية من الغبار.
      4. ارتداء القفازات، ونظارات الوقاية، ومعدات الوقاية الشخصية المناسبة طوال عملية تصنيع وتجميع الجهاز.
        ملاحظة: يتم تحضير القالب المصنع بواسطة الطباعة الضوئية قبل البدء في البروتوكول (الشكل 1E).
  2. تصنيع القالب ذو البنية المجهرية
    1. تحضير رقاقة السيليكون
      1. تصنيع القالب على رقاقة سيليكون مقاس 4 بوصات، مصقولة من جانب واحد (N-type, As-doped, CZ growth method, <10> orientation, 50 ±± 25 µm thickness, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, resistivity 0.01–0.05 Ω·cm).
      2. تنظيف الرقاقة بالتتابع في الأسيتون، والإيزوبروبانول، والمياه فائقة النقاء لمدة 10 دقائق لكل منها باستخدام التنظيف بالموجات فوق الصوتية.
      3. تجفيف الرقاقة بالهواء المضغوط.
      4. تسخين الرقاقة عند 200°C لمدة 10 دقائق على لوح تسخين لإزالة الرطوبة المتبقية.
      5. ترك الرقاقة لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة (RT; 20°C–25°C).
    2. تنشيط السطح وطلاء المقاوم الضوئي
      1. تنشيط سطح رقاقة السيليكون باستخدام منظف بلازما تفريغي يعمل ببلازما الهواء عند المستوى 7 لمدة 120 ثانية.
      2. تطبيق المقاوم الضوئي السلبي القائم على الإيبوكسي GM 1060 عن طريق الطلاء الدوراني بسرعة 30 دورة/دقيقة لمدة 10 ثوانٍ.
      3. مواصلة الطلاء الدوراني بسرعة 565 دورة/دقيقة لمدة 10 ثانية و965 دورة/دقيقة لمدة ثانية واحدة باستخدام تسارع قدره 20 دورة/دقيقة/ثانية.
      4. ترك الرقاقة المطلية لترتاح لمدة 10 دقائق.
      5. إجراء تسخين أولي عند 65°C لمدة 10 دقائق.
      6. مواصلة التسخين الأولي عند 95°C لمدة ساعة واحدة.
      7. ترك الرقاقة لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
    3. التعريض والتظهير
      1. تعريض المقاوم الضوئي باستخدام نظام الليثوغرافيا الليزرية المباشرة بجرعة قدرها 1,950 mJ/cm2.
      2. إجراء تسخين لاحق عند 65°C لمدة 10 دقائق.
      3. مواصلة التسخين اللاحق عند 95°C لمدة 30 دقيقة.
      4. ترك الرقاقة لتبرد حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة.
      5. ترك الرقاقة لترتاح لمدة 10 دقائق.
      6. تظهير النمط في PGMEA لمدة 4 دقائق.
      7. تمديد عملية التظهير على فترات مدتها 30 ثانية إذا ظل هناك مقاوم ضوئي متبقٍ.
      8. إيقاف التظهير بالشطف باستخدام الإيزوبروبانول.
      9. تجفيف الرقاقة باستخدام الهواء المضغوط.
    4. التسخين الصلب
      1. إجراء تسخين صلب عند 135°C لمدة ساعتين.
      2. الحصول على قالب رئيسي ذو بنية مجهرية يحتوي على قنوات مجهرية بعرض 1 mm وارتفاع 50 µm.
  3. تحضير وإزالة الغازات من خليط PDMS
    1. تحضير خليط PDMS
      1. خلط قاعدة PDMS وعامل المعالجة بنسبة وزنية 10:1.
      2. تقليب الخليط يدويًا باستخدام قضيب زجاجي في بيكر بلاستيكي لمدة 5 دقائق تقريبًا.
      3. الحفاظ على حركات دائرية بطيئة ومستمرة أثناء الخلط.
        ملاحظة: تجنب إدخال فقاعات الهواء أثناء الخلط.
    2. إزالة الغازات
      1. وضع خليط PDMS في مجف تفريغي متصل بمضخة تفريغ.
      2. إزالة الغازات من الخليط عند ضغط 70 mmHg تقريبًا لمدة 5 دقائق.
      3. تفريغ الضغط لفترة وجيزة للسماح للفقاعات السطحية بالانفجار.
      4. إعادة تطبيق التفريغ.
      5. تكرار الدورة حتى لا تبقى فقاعات مرئية.
        ملاحظة: يستغرق إجمالي وقت إزالة الغازات عادةً 30 دقيقة تقريبًا.
  4. صب PDMS على القالب
    1. تحضير القالب
      1. وضع القالب على سطح مستوٍ.
      2. تنظيف القالب باستخدام الهواء المضغوط.
      3. تجنب الملامسة المباشرة للسطح المنقوش.
      4. التحقق من خلو القالب من الغبار والملوثات.
    2. توزيع PDMS
      1. توزيع 8 g تقريبًا من PDMS حول قرص العاج لتصنيع طبقة غمر العاج.
      2. ضبط ارتفاع PDMS ليتناسب مع سمك قرص العاج (0.8 ±± 0.3 mm).
      3. منع PDMS من تغطية سطح العاج.
      4. توزيع 0.26 g تقريبًا من PDMS لكل وحدة قالب لتصنيع كل طبقة قناة مجهرية.
      5. النقر برفق على القالب أو تطبيق اهتزاز لتسهيل ملء البنى المجهرية.
      6. ترك PDMS يستقر في أصغر التفاصيل.
      7. تغطية القالب باستخدام غطاء أو غطاء مستوٍ دون ملامسة سطح PDMS.
        ملاحظة: يبلغ سمك طبقة غمر العاج 0.8 mm تقريبًا، وسمك كل طبقة قناة مجهرية 0.4 mm تقريبًا، مما يعطي سمكًا إجماليًا للجهاز يبلغ 1.6 mm تقريبًا.
        ملاحظة: يتم ضبط سمك الطبقة وفقًا لمسافة العمل لعدسة confocal عندما يكون التصوير بـ confocal مخططًا له.
  5. المعالجة
    1. وضع القوالب في فرن عند 50°C.
    2. معالجة PDMS لمدة 4 ساعات.
  6. إزالة طبقات PDMS
    1. إزالة PDMS المعالج
      1. تقشير طبقات PDMS المعالجة بعناية من القالب (الشكل 1F).
      2. التعامل مع طبقات PDMS بعناية لتجنب إتلاف البنى المجهرية.
  7. ربط طبقات PDMS وتصنيع منافذ المداخل والمخارج
    1. تصنيع منافذ المداخل والمخارج
      1. عمل ثقوب في مواقع المداخل والمخارج المحددة باستخدام أداة ثقب خزعات مقاس 1 mm.
      2. توجيه جانب القناة المجهرية للأعلى أثناء الثقب.
        ملاحظة: ضع طبقة PDMS على حصيرة تقطيع لتجنب التلف الهيكلي.
      3. عمل ثقبين في الطبقة العلوية بما يتوافق مع القناة المجهرية العلوية.
    2. تنظيف طبقات PDMS
      1. تنظيف طبقات PDMS باستخدام كحول الإيزوبروبيل أو الإيثانول.
      2. إزالة جزيئات الغبار المتبقية باستخدام شريط لاصق معقم.
      3. التحقق من خلو جميع أسطح الربط من الملوثات قبل التجميع.
    3. تنشيط بلازما أسطح PDMS
      1. وضع طبقات PDMS العلوية والوسطى للمعالجة بالبلازما (الشكل 1G).
      2. تنشيط الأسطح باستخدام معالج بلازما كورونا يدوي يعمل عند 25 W تقريبًا مع استخدام الهواء المحيط كغاز عمل.
      3. الحفاظ على مسافة عمل تبلغ 1 mm تقريبًا بين مصدر البلازما وسطح PDMS.
        تنبيه: تنفيذ المعالجة بالبلازما تحت تهوية مناسبة وتجنب التعرض المباشر للأوزون الناتج عن البلازما.
      4. تشغيل جهاز المعالجة بالبلازما والانتظار حتى يستقر لمدة 5 ثوانٍ.
      5. التحقق من توليد شعاع بلازما منتظم قبل المعالجة.
      6. معالجة طبقة PDMS العلوية لمدة 10 ثوانٍ باستخدام حركة مستمرة ذهابًا وإيابًا بسرعة 5 mm/s تقريبًا.
      7. معالجة طبقة PDMS الوسطى لمدة 10 ثوانٍ باستخدام نفس الحركة والمسافة.
      8. تطبيق معالجة بلازما إضافية لمدة ثانية واحدة على الطبقة العلوية مباشرة قبل الربط.
    4. ربط الطبقتين العلوية والوسطى
      1. محاذاة القناة المجهرية العلوية مع قرص العاج مباشرة بعد المعالجة بالبلازما.
      2. ربط الطبقتين العلوية والوسطى معًا.
      3. وضع المجموعة المربوطة في فرن عند 75°C لمدة 5 دقائق.
      4. تعزيز الربط أثناء فترة التحضين.
        ملاحظة: يمكن رؤية قرص العاج والقناة المجهرية بالعين المجردة ويمكن محاذاتهما دون أدوات محاذاة إضافية.
    5. تصنيع منافذ القناة المجهرية السفلية
      1. ثقب ثقبين يتوافقان مع القناة المجهرية السفلية عبر الطبقتين العلوية والوسطى المربوطتين.
      2. تنفيذ الثقب عبر الطبقتين في وقت واحد لضمان المحاذاة.
        ملاحظة: ينتج عن هذا الإجراء أربعة ثقوب في الطبقة العلوية وثقبين في الطبقة الوسطى.
      3. وضع المجموعة المربوطة على حصيرة تقطيع متينة قبل الثقب.
      4. تطبيق ضغط ثابت للأسفل في حركة واحدة.
        ملاحظة: تجنب القوى الدورانية أو الجانبية لتقليل مخاطر الانفصال الطبقي.
      5. إزالة البقايا من مواقع الثقب باستخدام شاش معقم خالي من الوبر مبلل بكحول الإيزوبروبيل.
      6. فحص الثقوب والمناطق المربوطة المحيطة بها تحت إضاءة كافية.
      7. التحقق من عدم وجود انفصال طبقي أو تمزقات أو ثقوب غير مكتملة قبل المتابعة.
    6. ربط الطبقة السفلية
      1. معالجة الطبقة السفلية بالبلازما كما هو موضح في الخطوة 2.7.4.
      2. محاذاة منافذ الدخول والخروج للقناة المجهرية السفلية مع الثقوب في الطبقتين العلوية والوسطى.
      3. ربط الطبقة السفلية لإكمال تجميع الجهاز.
        ملاحظة: يتم تحديد مواقع المداخل والمخارج على السطح الخارجي للطبقة السفلية قبل الربط لتسهيل المحاذاة.
        ملاحظة: قد توفر غرف البلازما ربطًا أقوى من أقلام البلازما، كما ورد في الدراسات36.
        ملاحظة: يتكون الجهاز المكتمل من منصة مائعة مجهرية ثلاثية الطبقات تدمج واجهة عاجية (الشكل 1H). يمثل سطح العاج السفلي جانب اللب في النموذج، بينما يمثل سطح العاج العلوي الجانب التاجي للتعرض للمواد الحيوية السنية أو المستحضرات البكتيرية.
  8. اختبار تسريب الجهاز المائعي المجهري
    1. فحص الجهاز المجمّع
      1. فحص الجهاز المجمّع بحثًا عن أي عدم محاذاة.
      2. فحص التجميع للتأكد من عدم وجود ربط غير مكتمل أو تسريب مرئي.
    2. اختبار التسريب
      1. توصيل إبر Luer-lock مقاس 19G بمنافذ الدخول (الشكل 1E).
      2. توصيل الإبر بأنابيب مضخة الموائع المجهرية.
      3. ضغط محاور الإبر برفق في المنافذ المثقوبة لتحقيق إغلاق محكم للهواء.
      4. حقن PBS معقم أو وسط زراعة بمعدل تدفق 10 µL/min.
      5. الحفاظ على تدفق السائل لمدة 5 دقائق على الأقل.
      6. فحص جميع واجهات الربط، وحواف القنوات، وحدود قرص العاج أثناء التدفق.
      7. مراقبة الجهاز تحت إضاءة كافية أثناء وبعد الحقن.
      8. التأكد من عدم وجود تراكم للسوائل أو بلل أو تشكل قطرات.
      9. تصنيف الجهاز على أنه خالٍ من التسريب إذا لم يتم اكتشاف أي تسريب.
      10. استبعاد الأجهزة التي تظهر تسريبًا.
        ملاحظة: يتم إجراء اختبار التسريب على كل جهاز مصنع قبل استزراع الخلايا أو الاستخدام التجريبي.
  9. تعقيم وتخزين الجهاز المائعي المجهري
    1. التعقيم
      1. تعريض السطح العلوي للجهاز المجمّع للأشعة فوق البنفسجية (254 nm) لمدة 30 دقيقة داخل خزانة تدفق صفائحي.
      2. تعريض السطح السفلي للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة إضافية.
      3. شطف القنوات المجهرية بإيثانول 70% لمدة 20 دقيقة.
      4. غسل القنوات المجهرية ثلاث مرات باستخدام PBS معقم لإزالة الإيثانول المتبقي.
    2. التخزين
      1. استخدام الجهاز المعقم فورًا لتجارب زراعة الخلايا.
      2. بدلاً من ذلك، يتم تخزين الجهاز مغمورًا في PBS معقم عند 4°C داخل حاوية معقمة حتى وقت الاستخدام.
        ​تنبيه: لا تستخدم الكلورامين أو أي محاليل مطهرة أخرى بعد تجميع الجهاز لأن PDMS قد يمتص هذه المركبات مما يؤثر سلبًا على حيوية الخلايا.

3. تقييم التصاق وحيوية الخلايا الجذعية للُّب السني

  1. التهيئة المسبقة لسطح العاج
    1. احقن EDTA بتركيز 10% في الجهاز.
    2. حافظ على التلامس بين محلول EDTA وسطح العاج لمدة 15 min.
    3. احقن 0.5 mL من EDTA كل 3 min للحفاظ على حركة السوائل داخل القناة الدقيقة.
    4. اغسل قرص العاج ثلاث مرات باستخدام ماء فائق النقاء.
    5. حافظ على كل غسلة لمدة 5 min.
      ملاحظة: تعمل معالجة EDTA على إزالة الطبقة الملطخة وكشف بروتينات مصفوفة العاج.
      تنبيه: تعامل مع محاليل EDTA باستخدام قفازات ونظارات واقية لتجنب تهيج الجلد والعين.
  2. استزراع الخلايا الجذعية لبلب اللب السني
    1. توسيع الخلايا الجذعية لبلب اللب السني
      1. استزرع الخلايا الجذعية لبلب اللب السني في قارورة T75 بكثافة 1 × 106 خلية لكل قارورة.
      2. حضّن الخلايا عند 37°C و 5% CO2 حتى يتم الوصول إلى حالة تلاقي تقارب 80%.
      3. افصل الخلايا باستخدام التربسين (trypsin).
      4. عادل التربسين باستخدام وسط زراعي كامل.
      5. قم بطرد مركزي لمعلق الخلايا للحصول على كتلة خلوية (cell pellet).
      6. قيّم حيوية الخلايا باستخدام صبغة تريبان بلو (trypan blue).
      7. استخدم معلقات الخلايا التي تظهر حيوية ≥90%.
    2. تحضير معلق الخلايا
      1. حضر معلق خلايا تم تدفئته مسبقاً عند 37°C.
      2. اضبط تركيز الخلايا ليكون 10,0 خلية/mL في وسط زراعي كامل.
      3. حضر حجماً نهائياً للمعلق يتراوح بين 1–2 mL.
        ملاحظة: استخدمت الخلايا في الممر الخامس (passage 5) في هذه الدراسة.
    3. استزراع الخلايا
      1. احقن معلق الخلايا في منفذ الإدخال للقناة الدقيقة السفلية.
      2. اقلب الجهاز بعد استزراع الخلايا
        ملاحظة: يعز قلب الجهاز ترسيب الخلايا باتجاه سطح العاج ويعز التصاق الخلايا.
    4. التحضين
      1. ضع الجهاز المقلوب داخل طبق بتري (Petri dish).
      2. أضف 1 mL من الوسط الزراعي إلى طبق بتري لتقليل التبخر.
      3. حضّن الجهاز عند 37°C و 5% CO2 لمدة 24 h.
      4. حافظ على ظروف الزراعة الساكنة طوال فترة التحضين.
        ملاحظة: لم يتم إجراء التحقق من التدفق الديناميكي في هذه الدراسة.
        ملاحظة: يصف البروتوكول الحالي ظروف الزراعة الساكنة للتحقق الأولي من الجهاز وتقييم التصاق الخلايا.
    5. التحقق الأولي من الجهاز
      1. قيّم التصاق الخلايا باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح.
      2. استرجع قرص العاج عن طريق تفكيك الجهاز قبل التحليل.
  3. تحضير العينات للمجهر الإلكتروني الماسح
    1. استرجاع العينات وغسلها
      1. فكك الجهاز بعد 24 h من التحضين.
      2. استرجع قرص العاج وانقله إلى طبق زراعة أو طبق بتري.
      3. ضع سطح العاج المستزرع بالخلايا بحيث يكون موجهاً للأعلى.
      4. اغسل قرص العاج مرتين باستخدام 1 mL من PBS.
    2. التثبيت
      1. أضف 2 mL من جلوتارالدهيد (glutaraldehyde) بتركيز 2.5% في محلول سورسين الملحى الفوسفاتي (Sorensen’s phosphate buffer) بتركيز 0.1 M.
      2. حضّن العينة لمدة 30 min في درجة حرارة الغرفة (RT).
        تنبيه: مادة الجلوتارالدهيد سامة وقد تسبب تهيجاً للجلد والعين والجهاز التنفسي. قم بإجراء عمليات التثبيت داخل خزانة أبخرة كيميائية مع ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة.
    3. الغسل بعد التثبيت
      1. أزل محلول الجلوتارالدهيد.
      2. اغسل قرص العاج ثلاث مرات بماء مقطر فائق النقاء في درجة حرارة الغرفة (RT).
    4. تحليل SEM
      1. حلل العينات باستخدام مجهر إلكتروني ماسح بيئي.
      2. شغل المجهر تحت ظروف فراغ منخفض (25 Pa).
      3. استخدم جهداً تسريعيّاً قدره 10.0 kV ومسافة عمل قدرها 7.0 mm.
      4. التقط الصور باستخدام وضع كشف الإلكترونات المرتدة ثلاثي الأبعاد (BSE-3D).
      5. التقط الصور بتكبير ×20 (الشكل 2A).
  4. تقييم حيوية الخلايا عبر المجهر البؤري
    1. تحضير العينة
      1. استزرع الخلايا وحضّنها كما هو موضح في الخطوة 3.2.
      2. حضّن الجهاز لمدة 24 h عند 37°C و 5% CO2.
      3. فكك الجهاز واكشف سطح العاج.
      4. انقل قرص العاج إلى لوحة آبار تحتوي على HBSS+/+ مدفأ مسبقاً ومدعم بـ Ca2+ و Mg2+.
    2. غسل العينة
      1. اغسل قرص العاج مرتين باستخدام HBSS+/+.
      2. أزل السيروم المتبقي والأحمر الفينولي قبل التلوين.
        ملاحظة: قد يؤدي السيروم المتبقي والأحمر الفينولي إلى زيادة الفلورة الذاتية للخلفية.
    3. تلوين الخلايا الحية
      1. حضر محلول عمل طازج من Calcein AM بتركيز 2 µM في HBSS+/+.
      2. أضف كمية كافية من محلول التلوين لتغطية سطح العاج بالكامل.
      3. حضّن العينة لمدة 20 min عند 37°C في الظلام.
      4. أزل محلول التلوين بعد التحضين.
    4. تلوين الخلايا الميتة
      1. أضف محلول عمل يوديد البروبيديوم (Propidium Iodide) بتركيز (1–2 µg/mL في HBSS+/+).
      2. حضّن العينة لمدة 5–8 min عند 37°C في الظلام.
      3. لا تتجاوز 10 min من التحضين.
      4. اغسل العينة مرتين باستخدام HBSS+/+.
      5. حافظ على غمر العينة في المحلول المنظم حتى التصوير.
    5. التقاط بالمجهر البؤري
      1. التقط الصور البؤرية خلال 30 min من التلوين.
      2. التقط الصور بالتتابع في القناتين الخضراء والحمراء.
      3. استخدم λex 490 nm و λem 515 nm لتصوير الخلايا الحية.
      4. استخدم λex 535 nm و λem 617 nm لتصوير الخلايا الميتة.
        ​ملاحظة: احمِ محاليل التلوين الفلورية والعينات الملونة من التعرض للضوء أثناء إجراءات التحضين والتصوير (الشكل 2B).

مقارنة بين المجهر الإلكتروني والمجهر الفلوري، تحليل البنية الخلوية.
الشكل 2: تقييم نموذجي لالتصاق الخلايا الجذعية للّب السني وحيويتها داخل جهاز محاكاة العضو على شريحة (OoC) للمركب السني اللبي. (Aصورة بالمجهر الإلكتروني الماسح تُظهر خلايا جذعية لبنية سنية ملتصقة (النجمة البيضاء) على سطح العاج بعد 24 ساعة من الزرع الساكن داخل جهاز العضو على شريحة (OoC). بعد 24 ساعة من الزرع، غطت الخلايا الملتصقة 54.35 ± 0.92% من سطح العاج المعرض للقناة الدقيقة. لا تُلاحظ أي خلايا في منطقة العاج المغطاة بـ PDMS (النجمة السوداء)، مما يشير إلى إحكام الغلق بفعالية بين طبقات الجهاز. شريط المقياس = 200 µm. (Bصورة بالمجهر البؤري تظهر خلايا جذعية حية من لب الأسنان مصبوغة باللون الأخضر وملتصقة بسطح العاج (الأسهم البيضاء) بعد 24 ساعة من الزرع الساكن. كما تظهر خلايا غير حية مصبوغة باللون الأحمر (الأسهم الزرقاء). شريط المقياس = 50 µm. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

اتبعت عملية تصنيع ناجحة لجهاز السن-على-رقاقة التدفق العملي الموضح في الشكل 1A–1I، بما في ذلك تحضير قرص العاج (الشكل 1D)، وتصنيع القالب المستمد من التصوير الضوئي (الشكل 1E)، وإزالة طبقات البولي دايميثيل سيلوكسان (PDMS) المتصلبة (الشكل 1F)، والتنشيط بالبلازما قبل الربط (الشكل 1G)، وتجميع الجهاز النهائي (الشكل 1H)، وربط الجهاز بمن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تصف هذه الدراسة بروتوكولاً مفصلاً خطوة بخطوة لتصنيع جهاز "سن على شريحة" (tooth-on-a-chip) مكدس رأسياً يشتمل على عاج وأسنان وخلايا جذعية لبية سنية، وتوضح نماذج ممثلة لالتصاق الخلايا وحيويتها داخل الجهاز تحت ظروف زراعة ساكنة. وقد تم تطوير هذا البروتوكول لتوفير سير عمل قابل للتكرار لتصنيع وتجميع منصة "عضو على شريحة" (OoC) لمعقد العاج واللب، تكون مناسبة للدراسات المختبرية (in vitro) للواجهة العاجية. ويكتسب إنشاء سير العمل هذا أهمية خاصة لأن مراجعتنا المنهجية الأخيرة سلطت الضوء على أن مجال النماذج المائعية الدقيقة لمعقد العاج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يصرح المؤلفون بعدم وجود أي مصالح مالية متضاربة، وأنه لا توجد لديهم أي تضاربات في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من خلال المشروع DIM24-0004 والمشروع PP24-0031، مديرية الأبحاث، جامعة لا فرونتيرا (Universidad de La Frontera)؛ ومنحة FONDECYT Regular رقم 1260116؛ ومنحة FONDECYT de Iniciación رقم 11230701، الوكالة الوطنية للبحث والتطوير (ANID)، تشيلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>المواد البيولوجية والكيميائية
الأسيتونExpertQسولف 8تنظيف رقاقة السيليكون
وسط زراعة Alpha MEMCytivaSH30265.02وسط زراعة الخلايا الجذعية لللب السني
كلورامين (0.5%)Merck7080-50-4محلول تخزين أقراص العاج
الخلايا الجذعية لب لب الأسنانغير قابل للتطبيقغير قابل للتطبيقزراعة الخلايا الأولية. راجع الخطوتين 3.2.1 و3.2.2
إيديتات (10%)وينكلرN2222158Eإزالة طبقة اللطخة
مقاوم ضوئي سلبي قائم على الإيبوكسيGersteltecGM1060تصنيع قوالب الطباعة الحجرية الضوئية
غلوتارالدهيد (2.5%) في محلول سورينسن (0.1 مولار)’محلول فوسفات منظمSigma-Aldrich210908-06تثبيت العينات للمجهر الإلكتروني الماسح (SEM)
أسنان بشرية سليمة (أضراس أو ضواحك)غير قابل للتطبيقغير قابل للتطبيقعينة بشرية
إيزوبروبانولإكسبرت كيو (ExpertQ)SOLV 16تنظيف الرقاقة، وإيقاف التحميض، وتنظيف مادة PDMS
طقم قياس الحيوية LIVE/DEADSigma-Aldrich451صبغ الحيوية الفلوري. 
محلول ملحي منظم بالفوسفات (PBS)Corning46-013-CMالغسيل واختبار التسرب
قاعدة وعامل معالجة الـ PDMS (بوليديميثيل سيلوكسان)داوSylgard 184تصنيع الجهاز
PGMEASigma Aldrich484431تحميض المقاوم الضوئي
صبغة تريبان الزرقاءSigma Aldrich T8154-100 ملتقييم حيوية الخلايا
تريبسينCorning25-053-CIفصل الخلايا
مياه فائقة النقاءCytivaSH30529.01محلول الغسيل
<قوي>المستهلكات والأدوات المختبرية
إبر محاقن بقياس 19GVmaticVCB19050توصيل الجهاز بمضخة دقيقة أو محقنة
مخرم الخزعة (القطر: 1 مم)هاريس يونيكور (Harris Unicore)WHAWB100073تصنيع منافذ المدخل والمخرج
بساط تقطيعNicecoolغير قابل للتطبيقحماية السطح أثناء التثقيب
أقراص الإنهاء السنية (مثل Sof-Lex)3MSof-Lexتلميع العاج
وصلات تحويل من لور (Luer) الأنثوية إلى وصلات مسننةRunze FluidicsRH-M016توصيل الأنابيب
عصا خلط زجاجية أو بلاستيكيةديورانغير قابل للتطبيقخلط الـ PDMS
محاقن تحت الجلدتوت البريpc-12246استزراع الخلايا واختبار التسرب
شاش معقم خالٍ من الوبرليندرسونغير قابل للتطبيقإزالة بقايا الثقب
وصلات لور الذكريةRunze FluidicsRH-G016توصيل الأنابيب
وعاء خلطديورانغير قابل للتطبيقتحضير الـ PDMS
طبق بتري (140 مم) × ٢٠ مم)Deltalab2000219زراعة الخلايا/التحضين
قاعدة من بولي تيترا فلورو إيثيلينCCTValغير قابل للتطبيقتصنيع طبقة العاج البينية
رقاقة السيليكونجياوزو كوميرشال فاين وين (Jiaozuo Commercial FineWin)غير قابل للتطبيقتصنيع القوالب
أنبوب سيليكونRunze Fluidics96421التوصيل المائعي
دورق T75Corning 353136توسيع الخلايا الجذعية لب لب الأسنان
صفيحة الآبارSPL Life Sciences30006تحضير صبغ وتصوير المجهر البؤري (Confocal)
<قوي>الأجهزة والأدوات
مجفف الهواءميتالبلان (METALPLAN)TITAN-040تجفيف الهواء المضغوط
مصدر للهواء المضغوطشولتزCSD-18.1تنظيف العفن والأسطح
المجهر البؤري (Confocal microscope)Olympusغير قابل للتطبيقالطراز: FV1000
نظام الليثوغرافيا المباشرة بالليزرهايدلبرغuPG 101تعريض المقاوم الضوئي
المجهر الإلكتروني الماسح البيئيHitachiغير قابل للتطبيقالطراز: Quanta 400 
قبضة يدوية عالية السرعةناكانيشيغير قابل للتطبيقالطراز: Pana-max2
لوح تسخينلاب تيك (LabTech)EH20A Plusتجفيف الرقاقة حرارياً وتجفيف المقاوم الضوئي حرارياً
خزانة التدفق الصفائحيBioBaseBBS8V1708313Dتعقيم الأجهزة
مضخة مائعية دقيقةعصر جديدغير قابل للتطبيقالطراز: 1002X-ES. اختبار التسرب عند 10 µلتر/دقيقة
قالب ذو بنية مجهرية (مُصنع عبر الطباعة الحجرية الضوئية)CCTValغير قابل للتطبيقراجع الخطوة 2.2 لمعرفة مواصفات تصنيع القالب
فرن أو حاضنةMemmertUN110معالجة PDMS عند 50 درجة مئوية°توطيد الروابط وC عند 75°سي
غرفة تنظيف بالبلازما تحت الفراغبلازما فاريGD-5تنشيط الرقاقة بالبلازما
بلازما كورونا محمولة باليد أورورا برو ساينتيفيك (Aurora Pro Scientific)APS-CD-20ACتنشيط البلازما لـ PDMS
جهاز الموجات فوق الصوتية (Ultrasonicator)إلما سونيك (Elma Sonic)S 10 (H)تنظيف الرقاقة
غرفة تفريغ أو مجفف (250 مم)وينجلاسغير قابل للتطبيقإزالة الغازات من الـ PDMS
مضخة تفريغهزاز300إزالة الفقاعات من الـ PDMS

المراجع

  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

PDMS

تم نشر هذه المقالة

الفيديو قريباً

تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.