آلية كونغ شنتشونغ دان في المسارات المتعلقة بالتوحد: دراسة تعتمد على علم الأدوية الشبكي، والربط الجزيئي، والتحقق التجريبي

ملخص

تدمج هذه الدراسة علم الأدوية الشبكي، والالتحام الجزيئي، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية (MD) لتوضيح المكونات النشطة الأساسية والأهداف العلاجية لمرض كونغشنغ تشنجونغ دان (KSZZD) في اضطراب طيف التوحد (ASD)، وتحدد بقايا الارتباط الرئيسية عبر مسح الألانين، وتؤمن من صحة التأثيرات في نموذج فئران اضطراب طيف التوحد المستحث بحمض الفالبرويك.

الملخص

اضطراب طيف التوحد (ASD) هو اضطراب عصبي نمائي معقد، ويرتبط مسببه ارتباطا وثيقا بالالتهاب العصبي المزمن. كصيغة كلاسيكية للطب الصيني التقليدي (TCM)، يستخدم كونغ شنتشونغ دان (KSZZD) لاضطرابات النمو العصبي والذاكرة بسبب تأثيراته الوقائية العصبية المبلغ عنها، لكن آليته الجزيئية المحددة في اضطراب طيف التوحد لا تزال غير واضحة. تدمج هذه الدراسة علم الأدوية الشبكي، وتحليل الالتحام الجزيئي، ومحاكاة MD لتوضيح المكونات الفعالة الأساسية والأهداف العلاجية المرشحة ل KSZZD لاضطراب طيف التوحد على المستويين النظامي والذري بشكل منهجي. بعد ذلك، يتم تحديد بقايا الارتباط الرئيسية من خلال المسح المرن بالألانين، ويتم تقييم التأثيرات البيولوجية باستخدام نموذج فئران اضطراب طيف التوحد المستحث بحمض الفالبرويك (VPA). كشف تحليل الأدوية الشبكي أن الكيرسيتين، وهو مكون رئيسي في KSZZD، قد يعمل جزئيا من خلال تنظيم مسار الإشارات الالتهابية البوساطة بواسطة TNF α. أظهرت نتائج الالتحام الجزيئي أن طاقات ارتباط المكونات الأساسية ل KSZZD بأهدافها كانت جميعها أقل من -5.0 كيلو كالوري/مول، ومن بينها أظهر الكيرسيتين أقوى ارتباط ب TNF (-8.52 كيلو كالوري/مول). اقترحت محاكاة MD أن الكيرسيتين يمكنه الحفاظ على ارتباط مستقر بالجيب النشط ل TNF-α، وحدد مسح الألانين أيضا GLU104 وGLN102 كبقايا رئيسية للأحماض الأمينية للحفاظ على الاستقرار الهيكلي للمركب. أظهرت التجارب في الجسم الحي أن تدخل الكيرسيتين حسن بشكل كبير السلوكيات الحركية والاستكشافية لدى فئران اضطراب طيف التوحد الناتج عن VPA، وخفض بشكل فعال مستويات تعبير TNF-α في المصل وأنسجة الدماغ. تشير هذه النتائج إلى أن الكيرسيتين قد يساهم في التأثيرات المتوقعة ل KSZZD، على الأقل جزئيا، من خلال تثبيط مسار إشارة TNF-α.

المقدمة

اضطراب طيف التوحد (ASD) هو اضطراب عصبي نمائي معقد يتميز بضعف التواصل الاجتماعي، واهتمامات محدودة، وسلوكيات نمطية متكررة.¹. الآلية المرضية لاضطراب طيف التوحد معقدة للغاية، وتشمل تفاعل التغيرات الجينية، والتنظيم فوق الجني، والعوامل البيئية، مما يؤدي في النهاية إلى ضعف اللدونة المشبكية وعدم انتظام الاتصال العصبي ^2,3. يلعب الالتهاب المزمن في الجهاز العصبي المركزي دورا مركزيا في التسبب في مرض اضطراب طيف التوحد، وقد برزت التدخلات التي تستهدف الالتهاب العصبي كاستراتيجيات علاجية واعدة.

كونغشنغ تشنجونغ دان (KSZZD)، وهي تركيبة كلاسيكية للطب الصيني التقليدي، سجلت لأول مرة في وصفات طبية أساسية تساوي ألف ذهب للطوارئ. يتكون من أربعة أعشاب طبية: درع السلحفاة، أوس دراكونيس، بوليجالاي راديكس، وجذر أكوري تاتارينووي. يستخدم KSZZD تقليديا لتقوية القلب والكلى، وتهدئة العقل، وتثبيت الروح. سريريا، يستخدم عادة لعلاج تأخر النمو الذهني وضعف الذاكرة⁴. أشارت الدراسات الدوائية الحديثة إلى أن KSZZD ومكوناته النشطة تمارس تأثيرات واقية عصبية، ومضادة للالتهابات، ومضادات أكسدة، وقد تحسن من السلوكيات التعليمية والذاكرة والقلق في نماذج اضطرابات النمو^{العصبي 5}. كشف تحليلنا الكيميائي النباتي أن الكيرسيتين وغيره من الفلافونويدات هما المكونات الفعالة الرئيسية لهذه الصيغة، والتي يمكنها اختراق الحاجز الدموي الدماغي وإظهار نشاط مضاد للالتهابات بشكل كبير.⁶. ومع ذلك، لا تزال الآلية التي تتوسط بها هذه المكونات الفعالة في التأثيرات العلاجية ل KSZZD في اضطراب طيف التوحد غير مفهومة جيدا.

مع التطور السريع لعلم الأحياء الحاسوبي، قدمت تقنيات مثل علم الأدوية الشبكي، والالتحام الجزيئي، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية، وحساب الكيمياء الكمومية أدوات قوية لتوضيح التفاعلات بين المكونات النشطة للطب الصيني التقليدي وأهداف الأمراض على المستوى الذري 7,8,9,10,11 . من خلال دمج مصادر البيانات غير المتجانسة، تمكن علم الأدوية الشبكي من بناء شبكة معقدة وتفاعلية من منظور علم الأحياء النظامي، مما يحدد أوليا العقد البيولوجية الرئيسية لتدخل الطب الصيني التقليدي في الأمراض.

وبناء على ذلك، يمكن استخدام الالتحام الجزيئي لمحاكاة المطابقة الهندسية وتوافق الطاقة بين المكونات والبروتينات المستهدفة، والتنبؤ بأنماط ارتباطها وأنشطتها المحتملة. بعد ذلك، تجرى محاكاة للديناميكا الجزيئية (MD) لدراسة التقلبات الهيكلية واستقرار الارتباط للمجمع تحت الظروف المائية والفسيولوجية. بالاقتران مع مسح الألانين، يتم تطبيق محاكاة الطفرات الموجهة للموقع لتحديد مواقع بقايا النقاط الساخنة الأساسية المسؤولة عن الحفاظ على الألفة الارتباطية بدقة، ولتوضيح وزن مساهمة الفارماكوفور على مستوى الأحماض الأمينية. وأخيرا، يمكن للتحقق بناء على تجارب دوائية مصممة جيدا أن يكشف بفعالية عن الآلية الجزيئية التي تقوم عليها التأثيرات العلاجية لمركبات الطب الصيني التقليدي على أمراض محددة.

وبناء عليه، تهدف هذه الدراسة أولا إلى فحص المكونات والأهداف الأساسية ل KSZZD في علاج اضطراب طيف التوحد عبر علم الأدوية الشبكي. لاحقا، وبالاقتران مع الالتحام الجزيئي، ومحاكاة الديناميكا الجزيئية، والمسح المرن بالألانين، سيتم تحديد "بقايا النقاط الساخنة" التي تحافظ على الاستقرار المعقد، وسيتم تقييم نمط التفاعل الديناميكي بين الكيرسيتين وTNF-α. وأخيرا، سيتم التحقق من النتائج الحسابية تجريبيا في نموذج فئران اضطراب طيف التوحد المستحث بواسطة VPA باستخدام تقييمات لسلوك الحيوانات، وعلم الأنسجة الدماغية، ومستويات تعبير عوامل الالتهاب. تهدف هذه الدراسة إلى استكشاف الآليات المحتملة التي قد تؤثر من خلالها مكونات KSZZD على المسارات الالتهابية المرتبطة بالتوحد من منظور متعدد المقاييس، مما يوفر أساسا لمزيد من التحقيق في تدخلات الطب الصيني التقليدي في اضطرابات النمو العصبي.

البروتوكول

تحليل علم الأدوية الشبكي

تم استخدام كلمة "التوحد" ككلمة مفتاحية للبحث في قاعدة بيانات GeneCards (https://www.genecards.org/) عن أهداف متعلقة بالتوحد^{12، 13، 14}. تم دمج الأهداف المسترجعة من قواعد البيانات بعد إزالة الإدخالات المكررة. تم تعزيز الأهداف المعروفة للمكونات النشطة التي لم تلتقط في تنبؤات قواعد البيانات بناء على تقارير الأدبيات¹⁵. تم توحيد أهداف الأمراض والأهداف المحتملة لمكونات الأدوية بشكل موحد إلى رموز الجينات باستخدام قاعدة بيانات بروتين UniProt (https://www.uniprot.org/)، وتم رسم هاتين المجموعتين للأهداف لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة ل KSZZD للتوحد¹⁶.

استنادا إلى قاعدة بيانات وتحليل أنظمة الأدوية التقليدية للطب الصيني (TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)، تم فحص المركبات النشطة الحيوية المحتملة في KSZZD وأهدافها المقابلة وفقا لمعايير التوافر الحيوي الفموي (OB ≥ 0.30) ومؤشر الشبه الدوائي (DL ≥ 0.18)¹⁷. تم استرجاع معرفات SMILES للمركبات من قاعدة بيانات PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)، وتم استخدام التنبؤ بالأهداف السويسرية (http://swisstargetprediction.ch/) لاستكشاف الأهداف المحتملة غير المدرجة في منصة^{TCMSP 18}. لاحقا، تم استخدام قاعدة بيانات HERB (http://herb.ac.cn) للفحص التكميلي وفقا لقاعدة ليبينسكي الخمسة، مع المعايير التالية: الوزن الجزيئي (ميغاوات ≤ 500 دالتون)، معامل تقسيم الأوكتانول-الماء (AlogP ≤ 5)، عدد مانحي الروابط الهيدروجينية (Hdon ≤ 5)، عدد مستقبلات الروابط الهيدروجينية (Hacc ≤ 10)، وعدد الروابط القابلة للدوران (RBN ≤ 10). ثم تم إجراء الفحص المستهدف باستخدام قاعدة بيانات باتمان-الطب الصيني التقليدي (http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/) بالمعايير التالية: الحد الأدنى للدرجة (≥0.84)، درجة قابلية التخدير (≥0.10)، وقيمة P (≤0.05). وأخيرا، تم استخدام قاعدة بيانات UniProt (https://www.uniprot.org) لتحويل أسماء الأهداف المختارة إلى رموز جينية قياسية.

تم تحديد الأهداف المتداخلة بين أهداف الأدوية وأهداف التوحد باستخدام أداة رسم مخطط فين عبر الإنترنت (http://bioinformatics.psb.ugent.be). تم استيراد هذه الأهداف المتداخلة إلى قاعدة بيانات STRING (https://string-db.org/) لبناء شبكة تفاعل البروتين والبروتين (PPI)¹⁹. تم تعيين النوع على إنسان العاقل، وتم تصفية تفاعلات البروتين والبروتين ذات درجات الثقة أقل من 0.40. تم استيراد الشبكة الناتجة إلى برنامج Cytoscape 3.10.0 للتحليل البصري¹⁶، حيث تم تمثيل الأدوية والمركبات والأهداف بألماس أحمر، ودوائر زرقاء، ومثلثات خضراء على التوالي، وعكست أوزان الحواف مركزية الدرجات للعقد. ثم تم استخدام إضافة CytoNCA لحساب قيم مركزية الدرجات، وترتيب المركبات الأساسية، وتحديد المركبات الأساسية الرئيسية. تم إجراء تحليل إثراء المعلوماتية الحيوية للجينات المستهدفة باستخدام منصة Metascape^{رقم 20}، بما في ذلك تحليل GO (العملية البيولوجية، BP؛ الوظيفة الجزيئية، MF؛ مكون الخلوي، CC) وتحليل مسار KEGG.

الالتحام الجزيئي

تم معالجة بروتينات المستقبلات المرتبطة بالتوحد المذكورة أعلاه مسبقا قبل الالتحام من خلال إصلاح البقايا المفقودة، وتحسين حالة البروتون، وإزالة جزيئات الماء البلوري للحفاظ على سلامة المستقبل الهيكلي. ثم تم استخدام طريقة الالتحام شبه المرنة في وحدة CDOCKER²¹ . تم تعريف البقايا ضمن 10 أنغروميوم من الليغاند البلوري المساعد على أنها الجيب النشط، وتم محاكاة ارتباط مستقبلات الليغاند داخل هذه المنطقة.

تم تقييم نتائج الالتحام باستخدام طاقة تفاعل CDOCKER كمؤشر رئيسي، مع انخفاض قيم الطاقة إلى ارتباط متوقع أكثر استقرارا بين الليجاند والمستقبل. تم تقييم موثوقية وضع الالتحام من خلال مقارنة تكوين الارتباط المكاني للمكون الأساسي مع الرابط البلوري المساعد في الجيب النشط. تم اختيار المركب ذو الطاقة المثلى للارتباط وأقوى تفاعل كشكل أولي لمحاكاة الديناميكا الجزيئية اللاحقة.

محاكاة الديناميكا الجزيئية

استنادا إلى نتائج الالتحام الجزيئي، تم إجراء محاكاة للديناميكا الجزيئية لاستكشاف آلية الارتباط بين مركب الكيرسيتين وTNF-α. يحاكي هذا النهج الحركة الجزيئية والتفاعلات على المستوى الذري ويحلل التغيرات الديناميكية في البروتينات والروابط والبيئة المحيطة، مما يوفر معلومات عن التغيرات الجزيئية، واستقرار الربط، وديناميكيات البروتين-الرابط. تم حل مركب المستقبل-الليغاند باستخدام نموذج الماء TIP3P، مع مسافة عازلة لا تقل عن 12 آنغو å بين المجمع وحدود النظام لضمان الحلول الكاملة وتقليل تأثيرات الحدود. تم ضبط تركيز الأيونيات على 0.154 M، وأضيفت أيونات Na⁺ و Cl⁻ لتحييد شحنة النظام. لتحسين دقة المحاكاة، تم اعتماد حقل قوة بروتين Amber14SB^{رقم 22} ، الذي يصف بفعالية التفاعلات بين الجزيئات غير المرتبطة وأنماط الارتباط، وهو مناسب بشكل خاص لدراسات معقدة البروتين-الرابطة²³.

لتقليل الطاقة الأولي، تم تشغيل طريقة النزول الأكثر انحدادا على 5000 خطوة لإزالة التلامسات غير المعقولة والتشكيلات عالية الطاقة، باستخدام عتبة تقارب 10 كيلوجول/مول/نانومتر لضمان استرخاء معلمات مجال القوة. ثم تم تشغيل طريقة التدرج المزدوج على 2000 خطوة لتحسين الحالة الديناميكية الحرارية وضمان استقرار النظام²⁴.

خلال التوازن، تم إجراء محاكاة مجموعة NVT لأول مرة بسرعة 100 حصان ثانوي مع خطوة زمنية بسرعة 2 إطار ثانية. تم تسخين النظام تدريجيا إلى 300 كلفن لتقليل تأثير البنية الأولية والوصول إلى التوازن الحراري. ثم تم تحويل المجموعة إلى NPT، وتم إجراء توازن إضافي بقوة 100 حصان ثانوي عند ضغط ثابت قدره 1 بار لتثبيت الكثافة والضغط. تم استخدام هذه المرحلة لجعل النظام في حالة ديناميكية حرارية مستقرة قبل محاكاة الإنتاج²⁵. تم إجراء المحاكاة الرسمية للديناميكا الجزيئية لمدة 20 نانوثانية، مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 300 كلفن، والضغط عند 1 بار، وخطوة زمنية قدرها 2 fs. تم حفظ المسار كل 10 حصان. لضمان استقرار ودقة المحاكاة، تم مراقبة المعايير الفيزيائية بانتظام بما في ذلك درجة الحرارة والضغط والحجم، للتأكد من بقائها ضمن النطاقات المتوقعة.

المسح المرن بالألانين

استنادا إلى الشكل المستقر الذي تم الحصول عليه من محاكاة الديناميكا الجزيئية، تم إجراء مسح الألانين على جميع بقايا الأحماض الأمينية ضمن دائرة نصف قطرها 3 أنغستروما من واجهة ارتباط الليجاند. في هذه الإجراءات، يتم استبدال بقايا الهدف بشكل منهجي بالألانين، مما يؤدي إلى قطع السلسلة الجانبية مع الحفاظ على تكوين السلسلة الرئيسية وإزالة التفاعلات المحددة التي تتوسط السلسلة الجانبية. تم قياس وزن مساهمة كل بقايا في ألفة الارتباط من خلال حساب التغير في طاقة الارتباط الحرة بين المجمعات البرية والمتحولة. على عكس النماذج الثابتة التقليدية، قدمت هذه الدراسة آلية استرخاء مرنة بسلسلة جانبية، تسمح للبيئة حول موقع الطفرة بالخضوع للاسترخاء الهيكلي ومحاكاة الاستجابة الديناميكية لواجهة الارتباط بشكل أكثر واقعية. هدف هذا التحليل إلى تحديد بقايا النقاط الساخنة المرشحة التي تحافظ على الاستقرار المعقد، مما يوفر بصمة طاقية لتحسين مركبات الرصاص المستهدفة البروتينات المرتبطة بالتوحد.

تجارب حيوانية

الحيوانات التجريبية

تم اختيار فئران سبراج-داولي (SD) السليمة من درجة SPF (ثلاثة ذكور وثلاث إناث، تبلغ أعمارهم 3 أشهر)، ولدت وتربت في ظروف متطابقة. تم التحكم في درجة حرارة الغرفة عند 18–22 درجة مئوية، وحافظت الرطوبة النسبية على 60٪–70٪، ودورة الضوء كانت 12 ساعة: 12 ساعة (الفاتح: داكن). تمت الموافقة على جميع العمليات التجريبية على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوانات التجريبية في مستشفى الشعب الأول في زوني (رقم الموافقة: لونشين (2025)-2-362).

تزاوج الحيوانات، تحديد الحمل، والتجميع

تم إطعام جميع الفئران بشكل تكيفي في بيئة حماية شمس لمدة أسبوع واحد بعد الشراء. كانت أنثى فأر وذكر آخر يحتجزان معا في الساعة 18:00 مساء كل يوم. تم إجراء فحص السدادة المهبلية في الساعة 8:00 صباحا في اليوم التالي (بعد 12 ساعة من الحبس). كان وجود سدادة مهبلية يعتبر تزاوجا ناجحا، وتم تعيين نفس اليوم كيوم حمل 0.5 (GD0.5). كانت الفئران الحوامل توضع بشكل فردي في أقفاص منفصلة. تم قياس وتسجيل وزن أجسام الفئران الحوامل يوميا. زاد وزن جسم الفئران الحوامل باستمرار، مع متوسط زيادة يومية يتراوح بين 2–5 جرام، وكان الوزن الكلي قد يزداد بحوالي 30٪ قبل الولادة. بعد حوالي 10 أيام من الحمل، كان هناك انتفاخ غير متماثل على شكل كمثرى في البطن ظاهر، وكان يمكن الشعور بكتل الأجنة الصلبة باللمس، وهو ما كان مميزا عن محيط البطن الموحد واللين الناتج عن السمنة.

إنشاء النماذج وإعداد مجموعة الضبط:

بالنسبة للمجموعة النموذجية، تم اختيار فأرتين حامل عشوائيا وحقنهما داخل الصفاق بمحلول VPA (600 ملغ/كغ) مرة واحدة في يوم الحمل 12.5 (GD12.5). تم إعطاء VPA عن طريق حقنة واحدة داخل الصفاق بجرعة 600 ملغ/كغ في يوم الحمل 12.5. تم اختيار هذا النظام بناء على العمل الأساسي الذي أجراه شنايدر وبريزوفسكي²⁶، اللذان أثبتا أن التعرض ل VPA في هذه النقطة الزمنية المحددة للحمل يعكس كل من السمات العصبية والسلوكية لاضطراب طيف التوحد البشري. أصبح هذا البروتوكول منذ ذلك الحين النموذج القياسي وتم التحقق منه باستمرار في الدراسات الصيدلانية الحديثة باستخدام نفس المعايير²⁷. بالنسبة لمجموعة الضابط الفارغة، تم اختيار فأر حامل واحد وحقنه داخل الصفاق بحجم متساوي 0.9٪ من محلول ملحي طبيعي في نفس النقطة الزمنية. ولدت الفئران الحوامل بشكل طبيعي، وتم تسجيل يوم ميلاد النسل كيوم ما بعد الولادة 0 (PND0). تم فطام جميع الفئران النسبية وإيواؤها بشكل منفصل حسب الجنس في يوم PND21.

تجميع النسل والتدخل

في PND28، تم اختيار 12 جروا ذكرا عشوائيا من نسل الفئران الحوامل المعرضة ل VPA (6 في مجموعة النموذج و6 في مجموعة تدخل الكيرسيتين)، وتم اختيار 6 جراء ذكور عشوائيا من نسل فئران حوامل معرضة للمحلول الملحي طبيعية (6 في المجموعة الفارغة). تم التأكد من عدم وجود فرق كبير في وزن الجسم بين الجراء في كل مجموعة. تم تعيين الأبناء المولودين لفئران حوامل عولجت بمحلول ملحي طبيعي إلى المجموعة الفارغة، وأولئك المولودون لفئران حوامل عولجت ب VPA إلى المجموعة النموذجية، وأولئك المولودون لفئران حوامل عولجت ب VPA إلى مجموعة التدخل بالكيرسيتين.

تم إجراء التدخل المستمر لمدة 4 أسابيع بدءا من PND28. بالنسبة لمجموعة تدخل الكيرسيتين، تم إعطاء تعليق الكيرسيتين عن طريق المعدة في وقت محدد يوميا بجرعة 100 ملغ/كغ/يوم. تم اختيار هذه الجرعة بناء على الأدلة المتكاملة التالية: (1) دراسة سابقة لتحديد الجرعات حددت 100 ملغ/كجم كأفضل جرعة لتخفيف السلوكيات الشبيهة بالقلق وتقليل السيتوكينات المؤيدة للالتهاب في نموذج فئران التهاب عصبي ناتج عن LPS²⁸؛ (2) أثبت أن الكيرسيتين بجرعة 50 ملغ/كغ يمنع عجز التفاعل الاجتماعي وتلف الدماغ التأكسدي في نموذج²⁹ من فئران التوحد الناتج عن VPA قبل الولادة؛ و(3) تم مؤخرا إثبات أن الكيرسيتين الفموي يقلل من مستويات TNF-α في الدماغ ويحسن السلوكيات الشبيهة بالتوحد في نموذج³⁰ من فئران التوحد الناتجة عن حمض البروبيونيك. تدعم هذه المراجعات المستقلة مجتمعة اختيار 100 ملغ/كجم لضمان مشاركة قوية للمسار الالتهابي الذي بوساط TNF α في نموذج اضطراب طيف التوحد الحالي الناتج عن VPA بعد الولادة. بالنسبة للمجموعتين الفارقة والنموذجية، تم إعطاء محلول ملحي طبيعي CMC-Na بنسبة 0.5٪ يوميا عن طريق المعدة بحجم متساو. كان لدى جميع الحيوانات إمكانية الوصول المجاني للطعام والماء خلال فترة التدخل، وتم قياس أوزان أجسامها كل أسبوع لتعديل حجم الإعطاء حسب أوزانها.

اختبار الملعب المفتوح

بعد 4 أسابيع من التدخل (حوالي PND56)، أجري اختبار المجال المفتوح لتقييم النشاط التلقائي ومستويات القلق. اختبار المجال المفتوح (OFT) هو تجربة سلوكية كلاسيكية لتقييم السلوك المرتبط بالقلق لدى الحيوانات التجريبية. كانت المؤشرات المقاسة هي القدرة العفوية على الحركة للفئران في البيئة المفتوحة والوقت الذي يقضيه في مركز الحقل المفتوح. كان جهاز OFT للفئران يبلغ ارتفاعه 30 سم، وطوله 50 سم، وعرضه 50 سم في الأسفل، مع جدران داخلية بيضاء، وكان مقسما صناعيا إلى 16 شبكة صغيرة، منها 4 شبكات في المنطقة الداخلية و12 شبكة في المنطقة الخارجية. تم إبقاء موقع التجربة هادئا لتجنب تحفيز الصوت الذي قد يؤثر على دقة نتائج التجارب. تم وضع كل فأر في وسط قاع الصندوق، وتم تسجيل الفيديو وتوقيت الجرعة في نفس الوقت. غطى مجال رؤية الكاميرا كامل الحقل المفتوح وسجل حركة الجرذان العفوية وعدد المرات التي تعبر بين الشبكات. استمر كل اختبار لمدة 5 دقائق، وبعدها توقف تسجيل الفيديو. تم مسح الجدار الداخلي وأسفل الصندوق المفتوح بنسبة 75٪ كحول لمنع البراز ورائحة الجسم التي يتركها حيوان واحد من التأثير على نتائج اختبار الحيوان التالي. تم تكرار العملية بعد استبدال الفئران حتى أكملت جميع الفئران الاختبار.

طريقة الكشف المرضي

بعد التثبيت على 4٪ بارافورمالديهايد، خضع نسيج الدماغ لتجفيف تدرج باستخدام جهاز تجفيف آلي بالكامل: 75٪ إيثانول لمدة ساعتين، 85٪ إيثانول لمدة ساعة، 95٪ إيثانول لمدة ساعة، وإيثانول مطلق I-IV لمدة 20 دقيقة لكل منهما. ثم تم تنظيف الأنسجة بمادة تنظيف I لمدة 25 دقيقة ومادة تنظيف II لمدة 30 دقيقة، تلاها إضافة البارافين. تم إزالة الشمع من الأقسام بسماكة 5 ميكرومتر باستخدام محلول إزالة الشمع I و II لمدة 30 دقيقة لكل منهما وإعادة ترطيبها بالإيثانول التدرجي. تم صبغ الأقسام بالهيماتوكسيلين لمدة 5–10 دقائق، ثم تم تمييزها بكحول حمض الهيدروكلوريك لمدة 3 ثوان، ثم صبغت بالماء القلوي لتتحول إلى اللون الأزرق. ثم تم تلوينها بالإيوزين القابل للذوبان في الكحول لمدة 3 دقائق، ثم جففها بالإيثانول التدرجي، ثم تنظف، ثم غطت بوسط تثبيت محايد، وتمت مراقبتها تحت المجهر.

الكشف عن مستويات TNF-α في المصل وأنسجة الدماغ

بعد آخر إعطاء، تم جمع دم الأبهر البطني من الفئران وتم تمركزه في الطرد المركزي عند 3,000 r/min عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة، وتم جمع المادة الفائقة في المصل. وفي الوقت نفسه، تم تشريح أنسجة الحصين والقشرة القشرى، وأضيفت الأنسجة المبردة مسبقا بنسبة 1:9 للتجانس الميكانيكي. ثم تم تطرد الخليط المركزي عند 12,000 r/min عند 4 °C لمدة 20 دقيقة لجمع السوبرناتانت. تم استخدام طريقة BCA لقياس كمية بروتينات الأنسجة. وفقا لتعليمات مجموعة ELISA، تمت إضافة العينات المراد اختبارها والأجسام المضادة البيوتينيلة إلى الصفيحة الصغيرة بالتسلسل. بعد الحضانة والغسيل، أضيف مركب أفيدين-بيروكسيداز وحضانته. بعد غسل آخر، أضيف محلول الركيزة لتطوير اللون، وتم إنهاء التفاعل بمحلول التوقف، وتم قياس الامتصاص عند 450 نانومتر باستخدام قارئ الميكرولوبلايت. تم حساب تركيزات TNF-α في المصل (pg/mL) وأنسجة الدماغ (pg/mg prot) باستخدام المنحنى القياسي.

التحليل الإحصائي

تم استخدام دالة RANDBETWEEN في Microsoft Excel لعشوائية الفئران وتوليد أرقام عشوائية لتخصيص الفئران. تم التعبير عن جميع البيانات التجريبية في هذه الدراسة كمتوسط ± انحراف معياري (SD). قبل التحليل الإحصائي، تم إجراء اختبار الطبيعية (اختبار شابيرو-ويلك) واختبار تجانس التباين (اختبار ليفين) أولا على بيانات كل مجموعة. للبيانات التي تتوافق مع التوزيع الطبيعي وتجانس التباين، تم استخدام تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANO أحادي الاتجاه). إذا كان الفرق ذا دلالة إحصائية، فقد تم استخدام طريقة LSD أيضا في عدة مقارنات. تم اعتبار قيمة *p < 0.05، و**p < 0.01، و***p < 0.001 ذات دلالة إحصائية.

النتائج

تحليل نتائج دراسة علم الأدوية الشبكي على KSZZD في علاج التوحد

تم استرجاع ما مجموعه 15,770 هدفا متعلقا بالتوحد من قاعدة بيانات GeneCards. تم اختيار أهداف ذات درجة صلة ≥ 4.21 كأهداف محتملة للتوحد، مما أدى إلى 1014 هدفا مرضيا. تم تقاطع 827 هدفا ل KSZZD مع 1,014 هدفا للتوحد، وتم الحصول على 125 هدفا مشتركا. تم إجراء التصور باستخدام منصة SRplot^{رقم 31} (https://www.bioinformatics.com.cn/)، ورسم مخطط فين، وهو موضح في

المناقشة

سؤال حاسم هو لماذا تم اختيار الكيرسيتين، بدلا من المكونات الأساسية الأخرى، للتحقق التجريبي وهل يمكنه تمثيل التأثيرات الشمولية ل KSZZD. استند هذا الاختيار إلى خطوط الأدلة المتقاربة التالية: (1) في نموذج الفئران المبكر الذي ناتج عن VPA، منع الكيرسيتين بشكل ملحوظ عجز التفاعل الاجتماعي وتلف الدماغ التأكسدي²⁹؛ (2) في نموذج التوحد الناجم عن حمض البروبيونيك، خفض الكيرسيتين الفموي مستويات TNF-α في الدماغ وحسن السلوكيات الشبيهة بالتوحد³⁰؛ و(3) في نم...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.5% CMC-Na normal saline solution	غير محدد في المخطوطة	غير محدد	مركب مستخدَم لمجموعات الفراغ/النموذج وتعليق الكويرسيتين.
0.9% محلول ملحي عادي	غير محدد في المخطوطة	غير محدد	مركب للحقن للأمهات في مجموعة التحكم الفارغة.
4% بارافورمالديهايد في PBS	Thermo Scientific Chemicals	J61899.AK	مستخدَم لتثبيت أنسجة المخ.
75% كحول	غير محدد في المخطوطة	غير محدد	مستخدَم لتنظيف جهاز الميدان المفتوح بين الحيوانات.
كحول مطلق	غير محدد في المخطوطة	غير محدد	مستخدَم لإزالة الماء من الأنسجة قبل التضمين.
ماء قلوي	غير محدد في المخطوطة	غير محدد	مستخدَم لتحسين اللون الأزرق للأقسام المصبوغة بالهيماتوكسيلين.
حقل القوة للبروتين Amber14SB	غير محدد في المخطوطة	غير قابل للتطبيق	حقل القوة للبروتين المستخدم في محاكاة الديناميات الجزيئية.
قاعدة بيانات BATMAN-TCM	غير محدد في المخطوطة	غير قابل للتطبيق	قاعدة بيانات للكشف عن الأهداف عبر الإنترنت: http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/
مجموعة BCA لتحليل البروتين	Thermo Scientific	23225	مستخدَم لتقدير كمية البروتين في مستحلبات الأنسجة.
مادة تلون	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7301	مستخدَم بعد صباغة الهيماتوكسيلين لتحسين اللون الأزرق للأنوية.
وحدة CDOCKER	غير محدد في المخطوطة	غير قابل للتطبيق	وحدة ربط مرنة شبه مرنة مستخدَمة في الربط الجزيئي.
مادة إزالة الشفافية / إزالة الشمع	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	Clear-Rite 3, 6901	يمكن استخدامها لإزالة الشفافية وإزالة البارافين في سير العمل الهيستولوجي.
مكون إضافي CytoNCA	غير محدد في المخطوطة	غير قابل للتطبيق	مكون إضافي لبرنامج Cytoscape مستخدَم لتحليل مركزية الدرجة.
برنامج Cytoscape	غير محدد في المخطوطة	الإصدار 3.10.0	مستخدَم لتصور الشبكة وتحليل تفاعل البروتين-البروتين.
برنامج Discovery Studio	غير محدد في المخطوطة	الإصدارات 2019 و2021	مستخدَم لمعالجة المستقبلات، والربط، ومسح الألانين.
أداة الرسم البياني Venn عبر الإنترنت	غير محدد في المخطوطة	غير قابل للتطبيق	أداة عبر الإنترنت لرسوم Venn البيانية: http://bioinformatics.psb.ugent.be
إيوسين-Y (كحولي)	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7111	مستخدَم لتلوين الهيولى المقابل في صبغة H&E.
آلة إزالة الماء الآلية بالكامل	غير محدد في المخطوطة	غير محدد	مستخدَم لإزالة الماء بشكل تدريجي لأنسجة المخ المثبتة.
قاعدة بيانات GeneCards	غير محدد في المخطوطة	غير قابل للتطبيق	قاعدة بيانات عبر الإنترنت مستخدَمة لاسترداد الأهداف المرتبطة بالتوحد: https://www.genecards.org/
برنامج GraphPad Prism	غير محدد في المخطوطة	الإصدار 9.5	مستخدَم للتحليل الإحصائي ورسم المخططات البيانية.
محلول صباغة الهيماتوكسيلين	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	7211	مستخدَم لتلوين الأنوية في صبغة H&E.
قاعدة بيانات HERB	غير محدد في المخطوطة	غير قابل للتطبيق	قاعدة بيانات عبر الإنترنت مستخدَمة للكشف عن المركبات التكميلية: http://herb.ac.cn
كحول حمض الهيدروكلوريك	غير محدد في المخطوطة	غير محدد	مستخدَم للتمييز خلال صبغة H&E.
منصة Metascape	غير محدد في المخطوطة	غير قابل للتطبيق	منصة عبر الإنترنت مستخدَمة لتحليل التخصيب GO وKEGG.
قارئ الألواح المجهرية	Thermo Scientific	Multiskan FC, 51119000	مستخدَم لقراءة الامتصاص عند 450 نانومتر.
مجهر	غير محدد في المخطوطة	غير محدد	مستخدَم لملاحظة الأقسام المصبغة بـH&E في المخ.
برنامج Microsoft Excel	Microsoft	غير محدد	مستخدَم لتخصيص الفئران باستخدام دالة RANDBETWEEN.
وسط التركيب	Thermo Scientific Richard-Allan Scientific	4111	مستخدَم لتغطية الشرائح وتثبيتها بشكل دائم بعد الصباغة.
جهاز اختبار المجال المفتوح	غير محدد في المخطوطة	غير محدد	صندوق بأبعاد 50 سم × 50 سم × 30 سم مستخدَم لاختبار السلوك.
البارافينات	غير محدد في المخطوطة	غير محدد	مستخدَم لتحضير البارافينات لأنسجة المخ.
محلول ملحي مخفف بالفوسفات (PBS)، pH 7.4	Gibco	10010023	مستخدَم كمحلول عازل مبرد لخلط الأنسجة.
بصمة تفاعل PLIP	غير محدد في المخطوطة	غير قابل للتطبيق	مستخدَم لتحليل بصمة تفاعل البروتين-الربيطة.
قاعدة بيانات PubChem	غير محدد في المخطوطة	غير قابل للتطبيق	قاعدة بيانات عبر الإنترنت مستخدَمة لاسترداد معرّفات SMILES: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
الكويرسيتين	غير محدد في المخطوطة	غير محدد	مستخدَم عن طريق السونار بمعدل 100 ملغ/كغ/يوم.
مجموعة تحليل TNF-α للفئران	Invitrogen	ERA56RB	مناسب لكشف TNF-α في المصل ومستحلبات الأنسجة.
الطرد المركزي المبرَّد	Thermo Scientific	Sorvall ST 16R, 75004383	مستخدَم لفصل المصل ومستحلبات الأنسجة.
برنامج Schrödinger Suite	Schrödinger, LLC	الإصدار 2024	مستخدَم لبناء نظام محاكاة الديناميات الجزيئية.
فئران من درجة SPF من نوع Sprague-Dawley	غير محدد في المخطوطة	غير محدد	3 ذكور و3 إناث مستخدَمات لتأسيس نموذج حيواني.
برنامج SPSS	غير محدد في المخطوطة	الإصدار 25.0	مستخدَم للتحليل الإحصائي.
منصة SRplot	غير محدد في المخطوطة	غير قابل للتطبيق	منصة عبر الإنترنت مستخدَمة للتصور: https://www.bioinformatics.com.cn/
قاعدة بيانات STRING	غير محدد في المخطوطة	الإصدار 12.0	مستخدَم لبناء شبكة تفاعل البروتين-الب