SMART (تقنية إعادة البناء الآلي من شويمو): منصة حسابية متكاملة لتبسيط سير عمل المجهر الإلكتروني البارد

Haibin Liu; Yangyu Wu; Wenpeng Zhang; Qining Liu; Huaican Xu; Zhenqian Guo; Fanhao Meng; Xinyu Men; Allen Chunlong Guo

doi:10.3791/71725

مقالة منهجية

SMART (تقنية إعادة البناء الآلي من شويمو): منصة حسابية متكاملة لتبسيط سير عمل المجهر الإلكتروني البارد

DOI:

10.3791/71725

⸱

يونيو 16, 2026

Haibin Liu¹ , Yangyu Wu² , Wenpeng Zhang¹ , Qining Liu¹ , Huaican Xu¹ , Zhenqian Guo² , Fanhao Meng² , Xinyu Men² , Allen Chunlong Guo¹

¹Shuimu BioSciences Ltd., ²Cryo-EM Center, Shuimu BioSciences Ltd.

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظهر هذا البروتوكول سير عمل المجهر الإلكتروني المجذر بالتبريد خطوة بخطوة باستخدام منصة برمجية متكاملة (SMART) تربط بين جمع البيانات، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، وبناء النماذج الذرية في واجهة واحدة قائمة على المتصفح. كمثال تمثيلي، يتم تحديد هيكل TRPML1 البشري بدقة 2.38 Å.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح المجهر الإلكتروني البارد (cryo-EM) أداة مركزية في علم الأحياء البنيوي، ومع ذلك تتطلب سير العمل الحالية عادة عدة حزم برمجية متخصصة لجمع البيانات، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، وبناء النماذج الذرية، مما يؤدي إلى تجزئة خطوط الأنابيب وتدخلات يدوية متكررة. هنا، نقدم SMART (تقنية إعادة البناء الآلي من شويمو)، وهي منصة برمجية متكاملة تجمع بين ثلاث وحدات—DataSmart لجمع البيانات الآلي، CryoSmart لمعالجة الصور وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، وModelSmart لبناء نماذج ذرية قائمة على التعلم العميق—ضمن واجهة موحدة يمكن الوصول إليها عبر المتصفح. يوفر هذا البروتوكول تعليمات خطوة بخطوة لتشغيل جميع الوحدات الثلاث. يشمل سير العمل التنقل الآلي للعينات وجمع البيانات، وتصحيح الحركة، وتقدير دالة نقل التباين (CTF)، واختيار الجسيمات، والتصنيف ثنائي الأبعاد (2D)، والتحسين ثلاثي الأبعاد، وتحسين الخرائط، وتوليد النماذج الذرية. كمثال تمثيلي، طبقنا سير العمل الكامل لتحديد بنية قناة TRPML1 البشرية، وهي قناة كاتيون ليزوسومية Ca²⁺ النفاذة، محققين دقة عالمية تبلغ 2.38 Å حسب معيار الذهب لارتباط صدفة فورييه (FSC) عند معيار 0.143. تم تطبيق جميع الوحدات الثلاث (DataSmart، CryoSmart، وModelSmart) بشكل تسلسلي على نفس مجموعة بيانات TRPML1 ضمن هذه الدراسة. تم تصميم البروتوكول ليكون متاحا للمستخدمين الذين لديهم مستويات مختلفة من تجربة التجميد الكهرومغناطيسي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجهر الإلكتروني البارد: التطور التكنولوجي والتأثير البيولوجي. يظل تحديد بنية البروتين ثلاثية الأبعاد تحديا مركزيا في علم الأحياء الجزيئي، حيث ترتبط الوظيفة البيولوجية ارتباطا وثيقا بالترتيب المكاني لبقايا الأحماض الأمينية. توضيح هذه التكوينات الهيكلية أمر ضروري لفك رموز الآليات الإنزيمية، وتفاعلات الليجاند، ومسارات الإشارات الخلوية بدقة ذرية. وقد أدى هذا الدافع إلى تطورات تحويلية في تقنية التجميد المغناطيسي المغناطيسي، التي برزت كتقنية معتمدة على نطاق واسع في علم الأحياء البنيوي ^1,2.

يعد تحليل الجسيمات المفردة بتقنية Cryo-EM نهجا قويا للحصول على رؤى بيولوجية عبر أنواع عينات متنوعة من خلال حل البنى عالية الدقة لمجمعات معزولة³. تشمل هذه الفيروسات، وبروتينات الغشاء، والتجمعات الحلزونية، وغيرها من المركبات الجزيئية الكبيرة الديناميكية وغير المتجانسة، تمتد عبر نطاق واسع من أحجام الجزيئات—من حوالي 50 كيلو دالتون إلى عشرات الميغادالتونات.

برزت تقنية Cryo-EM SPA كتقنية أساسية لحل البنى ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للجزيئات الكبيرة البيولوجية، والتي تشمل ثلاث مراحل حسابية مترابطة: جمع البيانات، إعادة البناء ثلاثي الأبعاد، وبناء النماذج الذرية (الشكل 1).

أثناء جمع البيانات، يتم تصوير العينات المزججة تحت ظروف جرعة منخفضة لتوليد أفلام مجهرية، تلتقط آلاف الإسقاطات الجسيمية في حالات شبه أصلية. تتم معالجة هذه المجموعات الخام لاحقا من خلال خوارزميات محاذاة وتصنيف تكرارية لإعادة بناء خرائط الكثافة الحجمية. وأخيرا، تبنى النماذج الذرية وتتحسن لتتناسب مع الكثافة، موضحة التفاعلات الجزيئية عند الدقة القريبة من الذرة.

يوضح التحليل أعلاه أن إنتاج التجميد الكهرومغناطيسي يمثل فقط نقطة البداية لخط الأنابيب الهيكلي. يتطلب تحويل هذه البيانات الخام إلى نماذج ذرية قابلة للتفسير سلسلة من أدوات البرمجيات الحاسوبية المتخصصة. لذا، تعمل البرمجيات كجسر حاسم يحول البيانات الخام إلى نماذج ذرية.

نظام برمجيات التجميد المجزأ: الأدوات الحالية والقيود الحالية. تعتمد سير العمل الحديثة في التجميد-EM على مجموعة من الأدوات البرمجية المتخصصة، كل منها يعالج مراحل منفصلة:

جمع البيانات. بينما تتوفر العديد من حزم برامج اكتساب بيانات التجميد الكهرومغناطيسي للجمهور—بما في ذلك Leginon ^4,5، SerialEM⁶، UCSFImage4⁷، TFS EPU ^8,9، Gatan Latitude، JEOL JADAS¹⁰، وAuto-EMation¹¹—إلا أن هذه الأدوات تخرج في الغالب بيانات الأفلام الخام مع قدرات معالجة محدودة بعد الاستحواذ. لا تزال خطوات سير العمل الحرجة، مثل إعداد المعلمات، وتخصيص القالب، تتطلب عمليات يدوية تتطلب جهدا كبيرا، وغالبا ما تتطلب عددا كبيرا من المعلمات لكل مجموعة بيانات. هذا الاعتماد على تدخل الخبراء يسبب تحديات في قابلية التكرار وعدم كفاءة سير العمل، خاصة في السيناريوهات ذات الإنتاجية العالية.

إعادة البناء ثلاثية الأبعاد. شهد تقنية التجميد الكهرومغناطيسي تقدما كبيرا في برامج إعادة البناء ثلاثية الأبعاد، مما أتاح الحل القريب من الذرة للجزيئات الكبيرة البيولوجية. من بين أكثر الأدوات استخداما RELION وcryoSPARC وEMAN2، وكل منها يقدم مزايا وحدود مميزة. يستخدم RELION نهجا بايزيا للتحسين التكراري، متفوقا في التعامل مع مجموعات البيانات غير المتجانسة وتحقيق إعادة بناء عالية الدقة¹². ومع ذلك، فإن شدته الحسابية ومنحنى التعلم الحاد غالبا ما يستدعيان تدخل خبير. cryoSPARC، الذي يعتمد على تسريع وحدة معالجة الرسومات والتعلم العميق، يقلل بشكل كبير من وقت المعالجة وهو سهل الاستخدام¹³. يوفر EMAN2 مجموعة شاملة لاختيار الجسيمات وإعادة البناء ثلاثية الأبعاد، لكنه يتطلب ضبطا يدويا واسعا ويفتقر إلى قدرات التغذية الراجعة في الوقت الحقيقي¹⁴. بينما تتفوق هذه الأدوات في جوانب محددة من إعادة البناء ثلاثي الأبعاد، إلا أنها تبقى محصورة في وظائف فردية، تفتقر إلى التكامل مع جمع البيانات في المراحل العليا أو النمذجة الذرية في المراحل النهائية. على سبيل المثال، تتطلب RELION وcryoSPARC نقل البيانات يدويا من برامج التحكم بالمجهر، مما يسبب عدم كفاءة وأخطاء محتملة. علاوة على ذلك، لا توفر أي من هذه الأدوات تقييما لحظيا للجودة أثناء جمع البيانات أو الانتقال السلس إلى بناء النماذج الذرية، مما يؤدي إلى سير عمل مجزأ يعيق معدل النقل وقابلية التكرار.

المرحلة الحسابية النهائية في تحديد الهيكل القائم على التجميد والكهرومغناطيسية هي بناء النماذج الذرية، حيث يتم تركيب الإحداثيات الجزيئية بشكل تكراري في خرائط الكثافة المعاد بناؤها لتوضيح التفاعلات على المستوى الذري.

بينما تستخدم طرق بناء النماذج التقليدية خوارزميات تقليل الطاقة القائمة على الفيزياء—تتضمن الجهود الكهروستاتيكية، وتفاعلات فان دير فالس، وقيود هندسة الروابط التساهمية—إلا أنها لا تزال تعتمد بشكل كبير على التدخل اليدوي لوضع النموذج الأولي، وتفسير الكثافة، والتحقق الكيميائي الفراغي 15,16,17,18 . هذا الاعتماد على التنظيم الخبير لا يحد فقط من معدل الإنتاجية، بل يدخل أيضا تحيزات ذاتية، خاصة في الأنظمة منخفضة الدقة (< 4 Å) حيث تكون خصائص الكثافة غامضة.

لتجاوز هذه القيود، ظهرت منهجيات قائمة على التعلم العميق (DL) كحلول تحويلية، تستفيد من الشبكات العصبية لأتمتة استخراج الميزات، وتهيئة النموذج، وتحسينها. تظهر هذه الأساليب أداء أفضل في التعامل مع خرائط الكثافة الصاخبة أو غير المكتملة مع تقليل كبير من التدخل اليدوي، كما يتضح من المعايير الحديثة التي أظهرت انخفاضا بنسبة 40–60٪ في الخطوات المعتمدة على المستخدم مقارنة بخطوط الأنابيب التقليدية¹⁹^، ²⁰^، ²¹^، ²².

ومع ذلك، تتطلب هذه الطرق دائما تصدير خرائط الكثافة من برامج إعادة البناء ثلاثية الأبعاد واستيرادها إلى أنظمة بناء النماذج. قبل الاستيراد، قد تكون هناك حاجة لخطوات معالجة مسبقة إضافية—غالبا ما تشمل أدوات طرف ثالث—لتحسين خرائط الكثافة. هذا السير المفكك يتطلب نقل بيانات متكرر وتحويلات تنسيقات، مما يخلق عدم كفاءة. علاوة على ذلك، إذا كانت نتائج بناء النماذج الأولية غير مرضية، يجب على الباحثين العودة إلى مرحلة إعادة البناء لإعادة الحساب، تليها جولة أخرى من بناء النموذج والتحقق من المعلومات. تعيق هذه الدورات التكرارية بشكل كبير معدل النقل والكفاءة التشغيلية لخطوط التحديد الهيكلية بالتجميد والكهرومغناطيسية.

1.3 SMART: حل متكامل للتجميد المغناطيسي من البداية إلى النهاية

على الرغم من التقدم الكبير في SPA بالتجميد والEM، إلا أن نقص الحلول الحاسوبية المتكاملة بالكامل لا يزال يعيق إمكاناته في علم الأحياء الهيكلي عالي الإنتاجية. حزم البرمجيات الحالية، رغم تفوقها في أتمتة مكونات سير العمل المعزولة—مثل جمع البيانات أو إعادة البناء ثلاثي الأبعاد—تفشل في سد الفجوات الحرجة بين جمع المجهرصور الخام، وتحسين خرائط الكثافة، وبناء النماذج الذرة. هذا التجزئة يتطلب نقل البيانات يدويا، وتحويل التنسيقات، وضبط المعلمات المتكرر، مما يؤدي إلى عدم كفاءة تتراكم مع توسع مجموعة البيانات.

لمعالجة هذه القيود، نقدم منصة سير عمل التجميد-EM المتكاملة، وهي منصة حسابية متكاملة توحد كامل خط أنابيب التجميد المدفوع بالتيار الاجتماعي في سير عمل متماسك قائم على الذكاء الاصطناعي. تدمج المنصة المتكاملة ثلاث وحدات أساسية: DataSmart (اكتساب البيانات الآلي)، CryoSmart (إعادة بناء ثلاثية الأبعاد الهجينة المدعومة بالشبكة العصبية)، وModelSmart (النمذجة الذرية القائمة على التعلم العميق).

الوحدات الحاسوبية الثلاث في المنصة متصلة عبر تدفق بيانات موحد، مما يتيح تدفق بيانات مبسط حيث يمكن للمخرجات من وحدة واحدة أن تساعد في تعديل المعلمات في خطوات المعالجة التالية. يهدف هذا التكامل إلى تقليل عدد الخطوات اليدوية ونقل البيانات المطلوبة في سير عمل التجميد التقليدي للتجميد والتنشيط المغناطيسي، مما قد يحسن سهولة الوصول والكفاءة لمختبرات علم الأحياء الهيكلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم شراء خط خلايا Expi293F المستخدم لتعبير البروتين لبروتين TRPML1 البشري من شركة هونان فنغهوي للتكنولوجيا الحيوية المحدودة (رقم الكتالوج: SC0236058). تم التحقق من هوية خط الخلية بشكل صحيح عبر التكرار القصير (STR) (الملف التكميلي 1).

البيان الأخلاقي
لم تشمل هذه الدراسة مشاركين بشريين أو حيوانات أو عينات تم الحصول عليها مباشرة من البشر أو الحيوانات. تم إنتاج بروتين TRPML1 البشري عن طريق التعبير المؤتلف، وتم نقاؤه في المختبر. خط خلايا Expi293F المستخدم للتعبير عن البروتين المؤتلف هو خط خلوي خالد متوفر تجاريا ومثبت. وبالتالي، لم تكن هناك حاجة للموافقة الأخلاقية المؤسسية والموافقة المكتوبة المستنيرة.

ملاحظة: منصة سير العمل المتكاملة للتجميد والاختراقية المدمجة منظمة في ثلاث وحدات أساسية: وحدة اكتساب البيانات الآلي، وحدة إعادة بناء ثلاثية الأبعاد هجينة مدعومة بالشبكة العصبية، ووحدة نمذجة ذرية قائمة على التعلم العميق، حيث تعمل البيانات كواجهة اتصال بين هذه المكونات البرمجية، كما هو موضح في الشكل 2. يعتمد نظام منصة سير العمل المدمج للتجميد والكهرومغناطيسية بنية متصفح-خادم (B/S)، مما يمكن المستخدمين من تنفيذ جميع العمليات عبر واجهة ويب، مما يضمن سهولة الاستخدام وسهولة الوصول التشغيلي.

1. الحصول الآلي على البيانات

ملاحظة: تتكون منصة سير العمل المتكاملة للتجميد والEM من ثلاث وحدات أساسية: وحدة اكتساب بيانات مؤتمتة، وحدة إعادة بناء ثلاثية الأبعاد هجينة مدعومة بالشبكة العصبية، ووحدة نمذجة ذرية قائمة على التعلم العميق. تعمل البيانات كواجهة اتصال بين هذه المكونات البرمجية (الشكل 2). يستخدم النظام بنية خادم متصفحات (B/S) تتيح جميع العمليات عبر واجهة ويب.

تهيئة المشروع
1. أنشئ مشروعا جديدا في منصة برمجية لوحدات اكتساب البيانات الآلي.
2. اختر خيار وراثة إعدادات التكوين من مشروع حديث إذا رغبت بذلك. أعد استخدام المعلمات الموروثة لإعداد المجهر الإلكتروني بدلا من إنشاء تكوين جديد.
فحص تحويل العارضة
ملاحظة: قم بضبط إزاحة الحزمة ضمن برنامج التحكم في المجهر الإلكتروني الناقل (TEM).
1. فحص التكبير المنخفض (أطلس وجريدسكوير)
  1. افتح وحدة الفرز . احصل على صور من تكبير أطلس وجريدسكوير.
  2. تحقق من أن الصور مضاءة بشكل صحيح وخالية من تغير الشعاع. تأكد من أن مركز الصورة ليس موضوعا فوق أشرطة الشبكة.
2. فحص تكبير بيانات الحصول على البيانات
  1. احصل على صور عند تكبير بيانات جمع البيانات (مثلا، 60K أو 100K). قيم محاذاة الشعاع.
  2. صحح إزاحة الشعاع قبل المضي قدما إذا فشل التقاط الصورة أو لوحظ انزياح كبير للشعاع.
3. فحص التكبير غير المركزي للثقب
  1. التقاط صور عند التكبير في الثقب/التكبير غير المركزي (عادة 8K). اضبط إزاحة الشعاع حتى يصبح نقطة الإضاءة في المنتصف إذا لم يكن الشعاع في المنتصف.
  2. لا تعدل موضع الفتحة. تحقق من أن حجم الفتحة يتطابق مع الفتحة المستخدمة أثناء جمع البيانات.
تعديل ارتفاع Z
1. أوتو-إيوسنتريك التعديل
  1. انتقل إلى صفحة الفحص . انقل المسرح إلى منطقة طبقة كربونية نظيفة عند التكبير بارتفاع الثقب/المركز الزائد. افتح وحدة Auto-Eucentric في صفحة الوظائف التلقائية .
  2. اضغط على ابدأ. راقب لوحة السجل للحصول على ملاحظات. انتقل إلى منطقة أخرى وكرر العملية إذا فشلت العملية.
2. ضبط التركيز التلقائي
  1. افتح وحدة التركيز التلقائي في صفحة الوظائف التلقائية . اضغط على ابدأ.
  2. راجع رسائل السجل. قم بضبط المعلمات كما هو موضح أو كرر القسم 1.3.1 إذا فشل التركيز التلقائي.
فحص محاذاة التكبير
1. فحص المحاذاة
  1. حدد ميزة مميزة عند تكبير البيانات واحصل على صورة. احصل على صورة عند تكبير الثقب/EucentricHeight.
  2. قارن المناطق المركزية في كلتا الصورتين. انتقل إلى المعايرة إذا لوحظ عدم محاذاة بين تكبير البيانات وتكبيرات الثقب.
  3. افحص المحاذاة بين تكبيرات Hole و GridSquare إذا كانت تكبيرات Data و Hole متزامنة. تابع بدون معايرة إذا كانت جميع مستويات التكبير متطابقة.
2. معايرة تحويل التكبير
  1. انتقل إلى صفحة المعايرة . افتح وحدة تغيير التكبير . ابدأ بتكبير البيانات أو أقل تكبير غير محاذ.
  2. احصل على صورة عالية التكبير تحتوي على ميزة مميزة. احصل على صورة منخفضة التكبير المقابلة. قيم الإزاحة بين الصورتين.
  3. انقر بزر الفأرة الأيمن على الموقع المقابل لمركز الميزة في الصورة منخفضة التكبير. اختر الانتقال هنا. أعد التقاط الصورة ذات التكبير العالي وتحقق من المحاذاة.
  4. كرر التعديل إذا لزم الأمر. انقر التالي للانتقال إلى زوج التكبير التالي بعد تحقيق المحاذاة. كرر إجراء المعايرة لجميع أزواج التكبير غير المتناسقة المتبقية.
التحضير لجمع البيانات
1. قم بالحصول على الأطلس، واختيار المربعات، والتصوير المربع، واختيار الثقب
  1. افتح وحدة أطلس . اترك حقل البلاطات فارغا للحصول على جميع القطع ال 81، أو أدخل العدد المطلوب من البلاطات للحصول عليها.
  2. انتقل إلى واجهة اختيار المربع . انقر بزر الفأرة الأيمن لاختيار المربعات المناسبة.
  3. انتقل إلى صفحة اختيار الحفرة . انقر على "جهز الجميع". راقب نافذة السجل حتى يكتمل التقاط الصورة.
  4. اختر صورة مربعة ملتقطة من قائمة الصور. استخدم وظيفة البحث عن الثقوب لإجراء اختيار الثقوب تلقائيا عندما تكون الثقوب واضحة للعيان.
    تحذير: قد يفشل الكشف التلقائي عن الثقب على الشبكات التي تحتوي على جليد سميك أو تلوث سطحي. تحقق بصريا من الثقوب المكتشفة قبل الحصول عليها واستخدم طريقة اختيار الثقوب شبه الآلية عندما يكون الكشف التلقائي غير موثوق.
  5. استخدم وظيفة الانتقاء القائم على البذور عندما يمنع الثلج السميك أو التلوث الاختيار التلقائي الموثوق (الشكل 3).
    1. اختر فتحة مركزية. اختر ثقبين متجاورين يشكلان زاوية قائمة.
    2. اختر ثقبين بعيدين على طول الاتجاهين المحددين في الفتحتين الثانية والثالثة.
    3. اضغط على إرسال. فعل تحريك الجميع عند معالجة مربع آخر. اسحب واحدة من حفر البذور الخمسة إلى حفرة واضحة. اضغط على إرسال.
2. تعريف القالب
  1. انتقل إلى صفحة تعريف القالب . انقر على اقتناع للحصول على صورة. تحقق من أن الصورة تحتوي على ثقب كامل.
  2. انقر بزر الفأرة الأيمن على المنطقة المستهدفة واختر MoveStageTo إذا لم يكن هناك ثقب كامل مرئي. أعد الحصول على صورة القالب. حدد موقع التصوير وموقع التركيز التلقائي عن طريق سحب العلامات المقابلة.
  3. أدخل عدد الإطارات في كل حفرة. أدخل قيمة إزالة التركيز المطلوبة (مثلا، −1.5 ميكرومتر). تحقق من جميع معلمات الاستحواذ (الشكل 4).
إعادة فحص تحويل الشعاع
1. كرر القسم 1.2 بعد إكمال جميع إجراءات التحضير.
الاستجماتيزم وتصحيح الغيبوبة
1. تصحيح الاستجماتيزم
  1. انقل المسرح إلى منطقة طبقة كربونية نظيفة. قم بضبط الارتفاع باستخدام التركيز التلقائي إلى قيمة إزالة التركيز المطلوبة (مثلا، −1.5 ميكرومتر). افتح وحدة Autostigmate في صفحة الوظيفة التلقائية .
  2. اضغط على ابدأ. راقب مخرج Ctffind في لوحة السجل. راجع الاستجماتيزم وقيم التوافق مع الدقة. كرر العملية في منطقة مختلفة إذا ظل الاستجماتيزم مرتفعا.
2. تصحيح الغيبوبة
  1. افتح وحدة Autocoma إذا بقيت نتائج Autostigmate غير مثالية بعد عدة محاولات. اضغط على ابدأ.
جمع البيانات الآلي
1. انتقل إلى صفحة الجمع التلقائي . اضغط على ابدأ. السماح للنظام بإجراء معايرة الانبعاث التلقائي وAutoZLP تلقائيا.
2. جمع البيانات باستخدام المعايير المحددة في إعدادات الفرز، جمع البيانات، والتحضير. راقب عملية الجمع الآلي (الشكل 5).
  نقطة التوقف: بعد اكتمال جمع البيانات، يمكن تخزين أكوام الأفلام المكتسبة واستئناف البروتوكول في مرحلة معالجة الصور في وقت لاحق دون التأثير على النتائج اللاحقة.
المراقبة الفورية عن بعد
1. راقب تقدم الجمع باستخدام وحدة المراقبة عن بعد. راجع نتائج تصحيح الحركة في الوقت الحقيقي التي تم إنشاؤها باستخدام MotionCor2²³. راجع الاستجماتيزم في الوقت الحقيقي وقياسات فقدان التركيز.
2. شارك رابط المراقبة مع المستخدمين المصرح لهم. الوصول إلى معلومات حالة الجمع وجودة البيانات من خلال الحاسوب أو الجهاز المحمول. راجع مثالا على وظيفة المراقبة عن بعد في الشكل 6.

2. إعادة بناء ثلاثية الأبعاد

ملاحظة: استخدم وحدة إعادة البناء ثلاثية الأبعاد لإجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد من مجموعات بيانات الصور التي تم الحصول عليها سابقا. يشمل سير العمل إنشاء المشروع، استيراد المجهر، تقدير دالة نقل التباين (CTF)، اختيار الجسيمات، استخراج الجسيمات، التصنيف ثنائي الأبعاد، توليد النماذج الأولية، والتحسين ثلاثي الأبعاد (الشكل 7).

إنشاء المشروع
1. انتقل إلى الصفحة الرئيسية لوحدة إعادة البناء ثلاثية الأبعاد. انقر على المشاريع لفتح صفحة إدارة المشاريع. انقر على مشروع جديد.
2. أدخل اسم المشروع وحدد موقع التخزين. انقر على إنشاء مشروع. انقر على الفتح بجانب المشروع الذي تم إنشاؤه حديثا. انقر على تجربة جديدة لإنشاء تجربة جديدة.
  ملاحظة: يمثل المشروع جلسة معالجة بيانات شاملة، بينما يمثل التجربة سير عمل معالجة فردي داخل المشروع. يمكن إنشاء تجارب متعددة ضمن مشروع واحد.
استيراد الملفات
1. اضغط على وظيفة جديدة. اختر الاستيراد واضغط على الإنشاء. اختر نوع الملف المناسب. استيراد ملفات .mrc التي تم إنشاؤها أثناء جمع البيانات. ادخل حجم البكسل، جهد التسارع، وعدد وحدات المعالجة المركزية. انقر على قائمة الانتظار.
  ملاحظة: لإنهاء مهمة جارية، اضغط على إيقاف، ثم انقر على المسح لإعادة المهمة إلى حالة البناء. للأعمال المكتملة أو المنتظرة، انقر على المسح لإعادة تعيين حالة الوظيفة.
تقدير CTF
1. اضغط على وظيفة جديدة. اختر تقدير CTF واضغط على الإنشاء.
  ملاحظة: وحدة إعادة البناء ثلاثية الأبعاد تدعم عدة خوارزميات تقدير CTF. يستخدم هذا البروتوكول CTFFIND4.
2. انقر على زر الاتصال للتعريض. اختر الصور المجهرية المستوردة. اضبط تباين السعة إلى 0.1، والحد الأدنى للدقة التوافقية إلى 30 أوغوستر. الحد الأقصى للدقة الملاءمة إلى 4 أوغوتار، الحد الأدنى لقيمة البحث في إزالة التركيز إلى 5000 أوكتور، الحد الأقصى لقيمة البحث في إزالة التركيز إلى 5000 أنغوتار، وحجم خطوة البحث في إزالة التركيز إلى 500 أنغو.
3. انقر على قائمة الانتظار.
اختيار الجسيمات يدويا
1. اضغط على وظيفة جديدة. اختر اختيار الجسيمات ثم اختر جمع الكتل. انقر على الإنشاء. انقر على زر Connect للصور المجهرية (التعريضات).
2. اختر الصور المجهرية المستوردة. أدخل المعايير المطلوبة. انقر على قائمة الانتظار. افحص 3–4 صور مجهرية تمثيلية. اختر الجسيمات باستخدام زر الفأرة الأيسر.
3. قم بإلغاء تحديد الجسيمات باستخدام زر الفأرة الأيمن. حدد نطاق قطر الجسيمات من الجسيمات المختارة. انقر على الانتهاء من الاختيار! استخرج الجسيمات.
  ملاحظة: قس الجسيمات من ثلاثة صور مجهرية على الأقل.
باحث الكتلة
1. اضغط على وظيفة جديدة. اختر اختيار الجسيمات ثم اختر جمع الكتل. انقر على الإنشاء. قم بتوصيل مدخلات الميكروجراف (التعريضات).
2. اختر الصور المجهرية المستوردة. أدخل المعايير المطلوبة. انقر على قائمة الانتظار.
فحص اختيارات الجسيمات
1. اضغط على وظيفة جديدة. اختر اختيار اختيار الجسيمات. انقر على الإنشاء. قم بتوصيل مدخلات الميكروجراف (التعريضات). ربط مدخلات الجسيمات.
2. اختر الملفات المقابلة. أدخل المعايير المطلوبة. انقر على قائمة الانتظار. افحص 3–4 صور تمثيلية بعد إتمام المهمة.
3. تحقق من اختيار الجسيمات الصحيح. انقر على الانتهاء من الاختيار! مواقع الإخراج.
استخراج الجسيمات من الصور المجهرية
1. اضغط على وظيفة جديدة. اختر المستخرج من الصور المجهرية. انقر على الإنشاء. قم بتوصيل مدخلات الميكروجراف (التعريضات). ربط مدخلات الجسيمات. اختر الملفات المقابلة.
2. اضبط حجم صندوق الاستخراج إلى 2–3 أضعاف قطر الجسيمات. استخدم حجم صندوق استخراج 400 بكسل ل TRPML1. اضبط حجم محصول فورييه إلى ربع إلى نصف حجم صندوق الاستخلاص.
3. استخدم حجم قص فورييه 100 بكسل ل TRPML1. انقر على قائمة الانتظار.
  ملاحظة: تقليل حجم محصول فورييه يقلل من الطلب الحسابي على وحدة معالجة الرسوميات.
التصنيف ثنائي الأبعاد
1. اضغط على وظيفة جديدة. اختر تصنيف ثنائي الأبعاد. انقر على الإنشاء. ربط مدخلات الجسيمات.
2. استورد مكدس الجسيمات. أدخل المعايير المطلوبة. انقر على قائمة الانتظار.
  ملاحظة: اختر من 50 إلى 200 صف. استخدم فئات أقل لمجموعات بيانات أصغر وعدد أكبر من الفئات لمجموعات بيانات أكبر.
فئات ثنائية الأبعاد مختارة
1. اضغط على وظيفة جديدة. اختر فئات ثنائية الأبعاد. انقر على الإنشاء. ربط مدخلات الجسيمات. ربط مدخلات القوالب.
2. استورد الملفات المطلوبة. انقر على قائمة الانتظار. انتظر حتى تدخل الوظيفة حالة الانتظار. انقر على الانتظار.
3. اختر فئات ثنائية الأبعاد واضحة ومحددة جيدا. انقر على تم.
الجيل الأولي للنماذج
1. اضغط على وظيفة جديدة. اختر إعادة بناء أبينيت. ربط مدخلات الجسيمات. استيراد الجسيمات المختارة.
2. هنا يأتي عدد المواد الأولية. هنا يأتي دور معامل التماثل. انقر على قائمة الانتظار.
التنقية غير المتجانسة
ملاحظة: استخدم التنقية غير المتجانسة للعينات غير المتجانسة والتنقية المتجانسة للعينات المتجانسة.
1. اضغط على وظيفة جديدة. أنشئ وظيفة تحسين متجانسة . ربط مدخلات الجسيمات. وصل مدخل الصوت.
2. اختر الملفات المقابلة. هنا يأتي دور معايير التحسين. حدد التماثل المناسب (مثل C1). انقر على قائمة الانتظار.
التقارير المتجانسة
1. اضغط على وظيفة جديدة. إنشاء وظيفة تحسين متجانسة . ربط مدخلات الجسيمات. وصل مدخل الصوت.
2. اختياريا، يمكنك توصيل مدخل Mask. استورد مكدس الجسيمات وأفضل فئة حجم أداء من خطوة التحسين السابقة. أدخل المعايير المطلوبة.
3. حدد التناظر المناسب (مثل O أو C1). انقر على قائمة الانتظار. انقر على الإخراج بعد إتمام المهمة. افحص خريطة الكثافة المعاد بناؤها في واجهة المتصفح (الشكل 8).
تحسين الخريطة
ملاحظة: Map Enhancer يستخدم DeepEMhancer²⁴. استخدم أنصاف الخرائط كلما أمكن. لم تدرج التعديلات بعد الترجمة وجزيئات الليغاند في مجموعة تدريب DeepEMhancer وقد لا يتم تحسينها بدقة. يقوم محسن الخرائط بعملية الشحذ المحلي، والتمويه الآلي، والإزالة من التخفي.
1. اضغط على وظيفة جديدة. أنشئ وظيفة معزز للخريطة . استيراد الحجم الناتج أثناء التنقية المتجانسة.
2. استورد القناع المقابل. استيراد ملفات الخرائط من خلال خيار مسار بيانات الخريطة إذا لزم الأمر. نفذ المهمة.

3. نمذجة ذرية قائمة على التعلم العميق

ملاحظة: وحدة نمذجة ذرية قائمة على التعلم العميق تعتمد على إطار SMARTFold²⁵ المطور سابقا وتدعم بناء النماذج الذرية للبروتينات والأحماض النووية (RNA/DNA) من خرائط كثافة التجميد والكهرومغناطيسية.

إطلاق وحدة نمذجة ذرية قائمة على التعلم العميق
1. سجل الدخول إلى نظام وحدات النمذجة الذرية القائم على التعلم العميق. افتح واجهة تقديم المهام. قم بتحميل خريطة كثافة التجميد والكهرومغناطيسية في اللوحة اليسرى.
2. أدخل معايير الإدخال المطلوبة. قدم مهمة النمذجة.
رفع خريطة كثافة التجميد الكهرومغناطيسي
1. قم بتحميل خريطة الكثافة بصيغة .mrc أو .ccp4 أو .map. تحقق من أن حجم الملف أقل من 100 ميجابايت.
  ملاحظة: إذا تجاوزت خريطة الكثافة 100 ميجابايت، قلل من حجم الملف قبل الرفع.
  1. قم بقص خريطة الكثافة إلى منطقة الاهتمام باستخدام UCSF ChimeraX²⁶ مع الأمر: منطقة الحجم. أعد تجريبات الخريطة إلى حجم بكسل أكبر.
  2. ضع قناعا ناعما لإزالة مناطق المذيبات.
    ملاحظة: افحص خريطة الكثافة قبل الرفع لضمان الأداء الأمثل للنموذج وتقليل خطر أخطاء المعالجة.
فحص وتحضير خريطة الكثافة
1. قم بإجراء قطع خريطة الكثافة. لهذا القص، يتم إزالة خريطة الكثافة لإزالة المناطق غير الضرورية. تحقق من أن الخريطة المقطوعة تحتوي فقط على المنطقة المطلوبة لبناء النماذج.
  ملاحظة: القص يقلل من حجم الملف ويساعد في منع تجاوز الذاكرة أثناء توليد النماذج.
2. ثم تحقق من انعكاس المرآة. افحص خريطة الكثافة بحثا عن احتمال انعكاس المرآة. افحص المناطق الحلزونية α داخل الخريطة. تحقق من أن الحلزونات α تظهر تكوينة يمينية وتدور لأعلى باتجاه عكس عقارب الساعة. قم بقلب خريطة الكثافة إذا تم اكتشاف بنية معكوسة.
رفع ملف التسلسل
1. ارفع ملف التسلسل المقابل. بدلا من ذلك، أدخل التسلسل يدويا. قدم جميع تسلسلات البروتين أو الأحماض النووية المشمولة في إعادة البناء.
2. حدد معلومات التسلسل غير المتجانس أو المتجانس عند الاقتضاء. أدخل اسم البروتين إذا رغبت (خطوة اختيارية).
حدد دقة الخريطة. هنا تأتي الدقة المبلغ عنها لخريطة كثافة التجميد والكهرومغناطيسية. اختر قسم الحوسبة. اختر عقدة الحوسبة في وحدة معالجة الرسومات لاستخدامها في توليد النماذج.
لتحديد موارد المعالج، أدخل عدد وحدات المعالجة المركزية التي سيتم تخصيصها. لا تتجاوز ثمانية معالجات. راجع جميع الملفات والمعلمات المرفوعة. انقر على إرسال لبدء إنشاء النماذج.
فحص النموذج الذري المتوقع
1. افتح نافذة التصور التفاعلي بعد إكمال المهمة. تدوير النموذج لفحص الميزات الهيكلية. قم بالتكبير والتصغير لفحص التفاصيل الهيكلية المحلية والعالمية.
2. افحص النموذج من عدة اتجاهات متعددة. تقييم جودة النموذج، والتكوين المكاني، والميزات على المستوى الذري. استخدم النموذج المولد للتحليل والتحقق من التدقق.
3. راجع الشكل 9 كمثال على واجهة التصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TRPML1، المعروف أيضا باسم المخاطيبين-1 (MCOLN1)، هو قناة كاتيونية ليسوسومية ضرورية للحفاظ على التوازن الأيوني، وتنظيم حركة الحويصل، ودعم التهام الذاتي في خلايا الثدييات²⁷^،²⁸. تم ربط خلل TRPML1 بسبب الطفرات الجينية مباشرة بالتهاب الدهون المخاطية النوع الرابع، وهو اضطراب تخزين ليسوسوم تنكسي عصبي شديد يتميز بتطور عصبي غير طبيعي، وتنكس الشبكية، وفقر الدم الناتج عن نقص الحديد 29,30,31,32.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب تحديد الجزيئات الكبيرة البيولوجية الهيكلية عبر المجهر الإلكتروني البارد (cryo-EM) بطبيعته سير عمل طويل ومتعدد المراحل يتطلب تكاملا دقيقا في أدوات الحوسبة والاعتماد على تدخل خبراء. تعالج المنصة المتكاملة هذا التحدي من خلال توحيد جمع البيانات، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، والنمذجة الذرية في إطار عمل واحد متكامل عموديا—خطوة نحو سير عمل التجميد المغناطيسي أكثر سلاسة. من خلال تضمين خوارزميات مدعومة بالذكاء الاصطناعي عبر خط الأنابيب (مثل التعلم العميق الهندسي لبناء نماذج موجهة بالكثافة)،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث ودعمه من قبل شركة شويمو للعلوم البيولوجية، التي ساهمت أيضا في تصميم الدراسة وتنفيذها وتفسير البيانات، بالإضافة إلى مراجعة المخطوطة والموافقة النهائية عليها. جميع المؤلفين موظفون في شركة شويمو للعلوم الحيوية ولا يعلنون عن وجود أي تضارب مصالح إضافي.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور جينغ لي من مركز التجميد الكهربائي في شويمو للعلوم الحيوية على نصائحه حول مجموعة البيانات الممثلة. نشكر الدكتور يوجي ليو من قسم البروتين والبلورات في شركة شويمو للعلوم الحيوية على توفير عينة بروتين hTRPML1. نشكر الفضل والتقدير للأستاذ المشارك تشيانغفنغ تشانغ، والدكتور كوي شو، والأستاذ المشارك شيومينغ لي، والمهندس بو شين من كلية علوم الحياة بجامعة تسينغهوا، بالإضافة إلى الأستاذ شينتشنغ تشانغ والدكتور تشونلينغ وو من معهد الفيزياء الحيوية بالأكاديمية الصينية للعلوم، على دعمهم القيم وإرشادهم خلال تطوير منصة سير العمل المتكاملة للتجميد والEM.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	وحدة إعادة البناء ثلاثية الأبعاد لمنصة SMART؛ مدعوم بشبكة عصبية هجينة
Cryo-electron microscope	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	يستخدم للحصول على البيانات؛ مجهزة بفلتر الطاقة
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	وحدة الحصول الآلي على البيانات لمنصة SMART
DeepEMhancer	Open source	V0.17	معالجة حجم cryo-EM بعد التوليد بناءً على التعلم العميق؛ مدمجة في CryoSmart Map Enhancer
Direct electron detector	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	الكاميرا المستخدمة لتسجيل الأفلام
Grid	Quantifoil	Au R1.2,1.3	شبكة عينة Cryo-EM
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	وحدة النمذجة الذرية القائمة على التعلم العميق لمنصة SMART؛ يمتد إطار SMARTFold
SMART Platform	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	منصة cryo-EM متكاملة؛ بنية Browser-Server (B/S)؛ تتضمن وحدات DataSmart، وCryoSmart، وModelSmart
TEM control software	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	برنامج التحكم في المجهر الإلكتروني لضبط تحول الحزمة
Topaz	Open source	V 2.5	أداة اختيار الجسيمات القائمة على التعلم العميق؛ مدمجة كمكون إضافي داخل CryoSmart
TRPML1 protein sample	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	TRPML1 البشرية (الموليكوبين-1)؛ تم تحضيرها داخليًا بواسطة قسم البروتين والبلورات
Vitrification device	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	لتحضير عينة cryo-EM
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	برنامج متعدد الأغراض للعرض والتحليل والمزيد

SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	منصة سير عمل cryo-EM المتكاملة
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	إطار التعلم العميق الكامن وراء ModelSmart
Leginon	National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM)	RRID:SCR_016731	برنامج الحصول الآلي على بيانات cryo-EM
SerialEM	University of Colorado	RRID:SCR_017293	برنامج الحصول الآلي على TEM/cryo-EM
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	برنامج جمع بيانات cryo-EM الآلي
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	اكتساب cryo-EM الآلي متعدد الشبكات
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	برنامج الحصول على الميكروسكوب الإلكتروني
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	نظام الحصول على cryo-EM الآلي
Auto-EMation	Tsinghua University	N/A	برنامج الحصول الآلي على cryo-EM
RELION	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016274	برنامج إعادة البناء bayesian cryo-EM
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	معالجة وإعادة بناء صور cryo-EM
EMAN2	Baylor College of Medicine	RRID:SCR_017270	مجموعة معالجة صور cryo-EM
CTFFIND4	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016732	برنامج تقدير CTF
Gctf	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016500	تقدير CTF مسرع بـ GPU
MotionCor2	Howard Hughes Medical Institute / UCSF	RRID:SCR_016499	برنامج تصحيح الحركة
DeepEMhancer	Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	تحسين خرائط cryo-EM بناءً على التعلم العميق
Topaz	University of California Berkeley	RRID:SCR_018037	اختيار الجسيمات بالتعلم العميق
UCSF ChimeraX	University of California San Francisco	RRID:SCR_015872	برنامج التصور الجزيئي
CTFFIND4	Grigorieff Lab	RRID:SCR_016732	ملاءمة CTF المستخدمة في سير عمل CryoSmart
EMDB-8840	Electron Microscopy Data Bank	Accession: EMD-8840	الخريطة المرجعية لـ TRPML1 البشرية
EMPIAR-10204	Electron Microscopy Public Image Archive	Accession: EMPIAR-10204	مجموعة بيانات مرجعية لبيتا-جالاكتوزيداز
Transmission Electron Microscope (TEM)	Not specified	N/A	يستخدم للحصول على بيانات cryo-EM
FEI Tecnai Electron Microscope	FEI (now Thermo Fisher Scientific)	Not specified	المذكور في سير العمل المقتبس
Energy Filter	Not specified	N/A	يستخدم أثناء التجميع الآلي
GPU Computing Node	Not specified	N/A	يستخدم لحسابات ModelSmart

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SMART (تقنية إعادة البناء الآلي من شويمو): منصة حسابية متكاملة لتبسيط سير عمل المجهر الإلكتروني البارد

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة