مقالة منهجية

طريقة ChIRP معتمدة على الأشعة فوق البنفسجية للتعرف القابل للتحقق على البروتينات التي تتفاعل مباشرة مع LncRNA: من الخلايا المزروعة إلى خصيتي الفأر

DOI:

10.3791/71732

⸱

يوليو 10, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Reproductive Medicine and Offspring Health, Nanjing Medical University, 2Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Institute of Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, 3School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, 4School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طريقة ChIRP معتمدة على الأشعة فوق البنفسجية لتحديد التفاعلات المباشرة بين lncRNA والبروتينات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ظهرت الحمض النووي الريبي غير المشفر طويل الأمد (lncRNAs) كمنظمات مهمة للعمليات البيولوجية المتنوعة. ومع ذلك، لا تزال الآليات الجزيئية التي تقوم عليها وظائف معظم ال lncRNA غير مفهومة بشكل جيد. تحديد البروتينات المتفاعلة، وخاصة البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBPs)، هو استراتيجية رئيسية لتوضيح وظيفة lncRNA. من بين الأساليب المتاحة، يستخدم التعرف الشامل على بروتينات ارتباط الحمض النووي الريبي (ChIRP) مع مطيافية الكتلة على نطاق واسع بسبب تصميم المجسات البسيط وسير العمل البسيط. يعتمد التفاعل التقليدي على الربط المتقاطع للبارافورمالديهايد (PFA)، الذي يلتقط كل من الاتصالات المباشرة مع البروتينات الريبية والتفاعلات غير المباشرة التي تتوسط عوامل جسر. في المقابل، يحافظ الربط العرضي بالأشعة فوق البنفسجية مع ظروف الغسيل الصارمة بشكل مفضل على التفاعلات المباشرة بين الحمض النووي الريبي والبروتينات. باستخدام نموذج lncRNA Tug1 ، تمت مقارنة الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية وربط PFA ضمن إطار ChIRP في الخلايا المزروعة، مما أثبت أن ChIRP المعتمد على الأشعة فوق البنفسجية يثري للتفاعلات المباشرة بين lncRNA والبروتينات. تم توسيع هذا السير المعتمد على الأشعة فوق البنفسجية لاحقا ليشمل خصيتي الفئران، حيث تم تفكيك الأنسجة إلى تعليقات خلية واحدة قبل الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية، مما مكن من تحديد بروتينات ارتباط Tug1 في سياق نسيج طبيعي. كشفت المقارنة مع التفاعلات المشتقة من خط الخلايا عن تفاعلات مشتركة وخاصة بالأنسجة. تم التحقق من صحة تفاعلين مباشرين مشتركين بشكل مستقل من خلال تعزيز الربط المناعي المعززة (eCLIP). يشار إلى هذا النهج القائم على الأشعة فوق البنفسجية ChIRP باسم cPDiRT (التقاط البروتينات التي تتفاعل مباشرة مع هدف RNA). معا، تمكن cPDiRT من تحديد البروتينات المرتبطة ب lncRNA في كل من الخلايا المزروعة والأنسجة الأصلية. يوفر الجمع بين تفكك الأنسجة والربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية استراتيجية قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة التفاعلات المباشرة بين ال lncRNA والبروتين عبر أنظمة الأعضاء المتنوعة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كشفت دراسات حديثة عالية الإنتاجية عن النسخات الجاهزة آلاف الحمض النووي الريبي غير المشفر الطويل (lncRNAs) التي تشارك في عمليات بيولوجية متنوعة، تتراوح من تنظيم الكروماتين إلى الإشارات الخلوية 1,2. على الرغم من تعبيرها الواسع وأهميتها الوظيفية، إلا أن الآليات الجزيئية لمعظم lncRNA لا تزال غير محددة جيدا. أحد العقبات الرئيسية هو تحديد شركائهم الفيزيائيين في البروتين، وخاصة البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBPs)3,4,5.

تعتمد الطرق الحالية التي تركز على RNA بشكل أساسي على الربط الكيميائي المتبادل، الذي يلتقط التفاعلات المباشرة وغير المباشرة بين الحمض النووي الريبي والبروتينات. وبالتالي، فإن هذه الأساليب أكثر ملاءمة لرسم خرائط التفاعل العالمي منها لتحديد جهات اتصال مباشرة حقيقية6. التعرف الشامل على بروتينات الارتباط بالرنا متبوعا بمطيافية الكتلة (ChIRP-MS) هو تقنية شائعة الاستخدام لرسم خرائط تفاعلات lncRNA-RBP بسبب تصميمها المباشر للمجسات وسير العمل الفعال 7,8. يستخدم التفاعل التقليدي في ChIRP-MS الربط المتقاطع للبارافورمالديهايد (PFA)، الذي يلتقط كل من الاتصالات المباشرة مع بروتين الحمض النووي الريبي والارتباطات غير المباشرة التي تتوسط عوامل جسر9،10.

على النقيض من ذلك، يوفر الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية عند 254 نانومتر ميزة حرجة. يربط الحمض النووي الريبي والبروتينات تساهميا فقط عندما تكون على مسافة قريبة من الصفر (عادة <1 Å)11. تحول هذه العملية الروابط الهيدروجينية إلى روابط تساهمية مستقرة وتتيح ظروف غسيل شديدة الملح تزيل المتفاعلات غير المباشرة غير المرتبطة تساهميا. وبالتالي، توفر الأساليب المعتمدة على الأشعة فوق البنفسجية خصوصية أكبر للتفاعلات المباشرة بين الحمض النووي الريبي والبروتين مقارنة بطرق الربط الكيميائيالمتقاطع 12,13. ومع ذلك، لا تزال الأساليب المعتمدة على الأشعة فوق البنفسجية غير مستغلة بشكل كاف في دراسات تفاعل الحمض النووي الريبي المشتق من الأنسجة، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى مخاوف بشأن كفاءة الربط المتقاطع وقلة اختراق الأشعة فوق البنفسجية.

لدراسة التفاعلات المباشرة بين lncRNA والبروتين في سياق فسيولوجي ذي صلة، تم اختيار lncRNA Tug1 كنظام نموذجي. يمثل Tug1 معيارا مثاليا للتحقق من سير عمل تفاعل مباشر متوافق مع الأنسجة بسبب نمطاته الشديدة التي تسبب الإثراء الشديد وتثريبه العالي في الخصية. يؤدي الاستئصال الجيني لتوغ1 إلى عقم كامل للذكور، وضعف تكوين الحيوانات المنوية، وشكل غير طبيعي للحيوانات المنوية14. بالإضافة إلى ذلك، يدعم Tug1 وظيفة خلايا سيرتولي وسلامة حاجز الدم والخصية في فئران الحمية عالية الدهون15. على الرغم من هذه الأنماط الظاهرية المعروفة، لا تزال الشركاء البروتينية المباشرة الذين يرسلون وظيفة Tug1 في الخصية—وهي عضو يعبر عن أعداد كبيرة من RBPs والتي تم تصنيفها تجريبيامؤخرا 16—مجهولة. تعكس هذه الفجوة المعرفية إلى حد كبير حقيقة أن معظم طرق رسم خرائط تفاعل البروتين بين lncRNA تم تطويرها لأنظمة الخلايا المزروعة.

ولمعالجة هذا القيد، تم تعديل إطار عمل ChIRP باستبدال الربط المتقاطع PFA بالربط المتقاطع UV لالتقاط البروتينات التي تتفاعل مباشرة مع Tug1. تم التحقق من صحة التفاعلات المرشحة بشكل مستقل من خلال تعزيز الربط المناعي المتقاطع، تليها التسلسل العميق (eCLIP-seq)17. تم توسيع سير العمل ليشمل تطبيقات الأنسجة من خلال تفكيك نسيج الخصية الطازج للفأر إلى خلايا فردية قبل الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية. تم تسمية هذا النهج المحسن باسم cPDiRT (التقاط البروتينات التي تتفاعل مباشرة مع هدف RNA).

تطبيق cPDiRT على Tug1 في الخصية المأمن مكن من رسم خرائط التفاعل المباشر في سياق نسيج أصلي. قدمت التجارب المتوازية في الخلايا المزروعة مقارنة جنبا إلى جنب بين ملفات التفاعل القائمة على PFA والأشعة فوق البنفسجية. وبالاقتران مع التحقق المستقل من eCLIP، أنتج هذا النهج مجموعة عالية الثقة من الشركاء الجزيئيين الذين قد يساهم في وظيفة Tug1 أثناء تكوين الحيوانات المنوية. البروتوكول المعروض هنا يتيح التقاط البروتينات التي تتفاعل مباشرة مع lncRNA المستهدف في كل من الخلايا المزروعة والأنسجة الأصلية. من خلال تعريف التفاعل المباشر ل Tug1 في الخصية، تتقدم هذه الطريقة في الدراسات الميكانيكية لحمض النووي الريبي اللامركزي الضروري للخصوبة وتوفر منصة قابلة للتعميم للتحقيق في تفاعلات البروتين بين ال ncRNA في الأنسجة التناسلية وغيرها من الأنسجة المعقدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تجهيز جميع المحاليل باستخدام ماء فائق النقاء خال من النوكلياز والبروتيز ومواد كيميائية. جميع المواد والمواد مدرجة في جدول المواد.

تمت الموافقة على جميع التجارب على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات الحيوان في جامعة نانجينغ الطبية (رقم الموافقة: IACUC-1812003-4) وأجريت وفقا لدليل العناية واستخدام الحيوانات المخبرية (المجلس الوطني للبحوث، الطبعة الثامنة). حافظ على ذكر C57BL/6 فئران (عمرها 4 أسابيع) تحت دورة 12 ساعة ضوء و12 ساعة مظلمة مع إمكانية الوصول إلى الطعام والماء بحرية مفادمة. تقليل معاناة الحيوانات باستخدام أقل عدد ممكن من الحيوانات لتحقيق الدلالة الإحصائية. قتل الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون ثم خلع عنق الرحم وفقا لبروتوكولات مؤسسية معتمدة.

1. تحضير المخازن

  1. تحضير مخزن تحلل الخلية
    1. تحضير مخزن تحلل الخلية يحتوي على 50 مللي مولار من تريس-HCl (رقم الهيدروجين 7.0)، 10 ملليمولار EDTA، و1٪ SDS.
    2. قبل الاستخدام مباشرة، أضف 1 ملليمولار من PMSF، وكوكتيل مثبط للبروتياز، ومثبط RNase متخصص.
      تحذير: متلازمة الظلام العاطفي هي تهيج للجلد والعين. تجنب استنشاق الغبار أو الهباء الجوي. PMSF شديد السمية، ويعمل كمثبط للكولينستيراز، وغير مستقر في المحلول المائي. حضر PMSF مباشرة قبل الاستخدام. ارتد القفازات ونظارات السلامة عند التعامل مع هذه المواد الكيميائية. أتعامل مع PMSF في غطاء بخار كيميائي.
  2. تحضير مخزن التهجين
    1. جهز مخزن التهجين الذي يحتوي على 750 ملليمولار NaCl، 1٪ SDS، 50 ملليمولار Tris-HCl (pH 7.0)، 1 ملليمول EDTA، و15٪ فوراميد.
    2. قبل الاستخدام مباشرة، أضف 1 ملليمولار من PMSF، وكوكتيل مثبط للبروتياز، ومثبط RNase متخصص.
      ملاحظة: تخزين الفوراميد عند 4 درجات مئوية، محميا من الضوء.
      تحذير: الفوراميد هو خطر للتراتوجين والتكاثر. تعامل مع الفوراميد في غطاء بخار كيميائي أثناء ارتداء قفازات ومعطف مختبر ونظارات أمان. تجنب الاستنشاق وملامسة الجلد.
  3. تحضير مخزن الغسيل
    1. جهز محلول غسيل يحتوي على 50 ملليمولار تريس-HCl (درجة الحموضة 7.0)، 1 ميلار NaCl، 1 ملليمول EDTA، 1٪ NP-40، 0.1٪ SDS، و0.5٪ ديكوسيكولات الصوديوم.
    2. احم حاجز الغسيل من الضوء أثناء التخزين.
  4. تحضير مخزن البروتيناز K (PK)
    1. جهز مخزن PK يحتوي على 100 مللي مولار NaCl، و10 مللي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.0)، و1 ملليمولار EDTA، و0.5٪ SDS.
    2. أضف البروتيناز K إلى تركيز نهائي 5٪ مباشرة قبل الاستخدام.

2. تصميم وتحضير المجسات

  1. تصميم مجسات مضادة للحس
    1. صمم مجسات أوليغونيوكليوتيدات مضادة باستخدام مصمم المجس الإلكتروني المتوفر في singlemoleculefish.com18.
  2. احصل على مجسات بيوتينيلية
    1. اطلب مجسات DNA مضادة للحساسية تحتوي على تعديل 3'-BiotinTEG.
  3. جهز حوض المجسات
    1. قم بتخفيف كل مجبار بشكل فردي إلى 100 ميكرومول.
    2. اخلط أحجام متساوية لجميع المجسات لتوليد تجمع مجسات. الحفاظ على تركيز نهائي مشترك للأوليجونوكليوتيدات يبلغ 100 ميكرومولار.
    3. خزن حوض المسبار عند -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: معلمات تصميم المجس الموصى بها هي كما يلي: (1) مسبار واحد لكل 100 وحدة قوة من الحمض النووي الريبي المستهدف، (2) محتوى GC المستهدف 45٪، (3) طول المجس 20 نتيتار، و(4) تباعد بين المجسات 60–80 نتيتا.
      ملاحظة: إذا تجاوز الحمض النووي الريبي الحد الأقصى للحجم الذي يقبله مصمم المجس، قم بتقسيم التسلسل إلى أجزاء أصغر قبل التصميم. استبعد المناطق المتكررة والمناطق التي تحتوي على تشابه تسلسلي واسع.

3. إجراء جمع الخلايا، وتفكك الأنسجة، والربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية

  1. جهز ضوابط خالية من الأشعة فوق البنفسجية
    1. تحضير عينات ضابطة بالتوازي مع العينات التجريبية.
    2. استبعد خطوة الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية من عينات التحكم.
    3. قم بجميع الإجراءات التالية، بما في ذلك التصويب، سحب البروتين الريبي نا، استخراج الحمض النووي الريبي، واستخلاص البروتين، بنفس الطريقة لكلا المجموعتين.
      ملاحظة: استخدم التحكم بدون الأشعة فوق البنفسجية لتمييز تفاعلات الحمض النووي الريبي والبروتين المعتمدة على الأشعة فوق البنفسجية عن الارتباط الخلفي غير المحدد.
  2. حصاد الخلايا وإجراء الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية
    1. الخلايا المزروعة بالغسل
      1. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لإزالة وسط الزراعة المتبقي.
    2. خلايا الربط المتقاطع
      1. وزع 3 مل من PBS بشكل متساو على طبق زراعة بحجم 15 سم.
      2. تشع الخلايا في رابط متقاطع للأشعة فوق البنفسجية بطول 254 نانومتر بجرعة 4000 ميلي جول/سممربع.
    3. جمع الخلايا المتشابكة
      1. اجمع الخلايا في PBS بعد الربط المتقاطع.
      2. قم بطرد مركزي في نظام التعليق وتخلص من السوبرناتانت.
      3. زن الحبيبة وتأكد من أن الحد الأدنى للكتلة الحبيبية هو 500 ملغ لكل عينة.
  3. انفصال أنسجة الخصية وإجراء الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية
    1. جهز الخصيتين
      1. فك الخصيتين.
      2. اغسل المنديل مرتين باستخدام DMEM.
    2. قم بإجراء هضم الكولاجيناز
      1. حضانة الأنسجة في DMEM تحتوي على 1 ملغ/لتر كولاجناز وريدي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 5–15 دقيقة.
      2. استمر في عملية الهضم حتى يتم تحرير الأنابيب المنطوية.
        ملاحظة: لا تتجاوز 15 دقيقة من الهضم.
    3. اغسل الأنابيب المنتصلة
      1. قم بطرد المركزي بنظام التعليق عند 1000 × جرام لمدة دقيقة واحدة عند 4 درجات مئوية.
      2. أزل السوبرناتانت.
      3. اغسل الحبيبة ب 5–10 مل DMEM.
      4. الطرد المركزي مرة أخرى تحت نفس الظروف.
    4. إجراء هضم التربسين
      1. أعد تعليق الحبيبة في 0.25٪ تريبسين يحتوي على 1 ملغ/مل DNase I.
      2. حضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 5–15 دقيقة.
        ملاحظة: لا تتجاوز 15 دقيقة من الهضم.
    5. إيقاف الهضم الإنزيمي
      1. أضف نفس كمية DMEM مع 10٪ FBS.
    6. توليد تعليق خلية واحدة
      1. قم بترشيح نظام التعليق عبر مصفاة خلية بحجم 70 ميكرومتر.
    7. خلايا الغسيل
      1. خلايا الطرد المركزي عند 2000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
      2. تخلص من السوبرناتانت.
      3. اغسل الحبيبة ب 5–10 مل PBS.
      4. الطرد المركزي مرة أخرى تحت نفس الظروف.
    8. خلايا الخصية المتشابكة
      1. أعد تعليق نظام التعليق أحادي الخلية في PBS.
      2. وزع التعليق بشكل متساو على طبق زراعة بحجم 15 سم.
      3. تشع الخلايا في رابط متقاطع للأشعة فوق البنفسجية بطول 254 نانومتر بجرعة 4000 ميلي جول/سممربع.
    9. جمع الخلايا المتشابكة
      1. بالنسبة للتحكم بدون أشعة فوق بنفسجية، تجنب الإشعاع.
      2. اجمع الخلايا في PBS.
      3. قم بطرد مركزي في نظام التعليق وتخلص من السوبرناتانت.
      4. زن الحبيبة وتأكد من أن الحد الأدنى للكتلة الحبيبية هو 500 ملغ لكل عينة.
        ملاحظة: عدد الفئران المطلوبة للحصول على حوالي 500 ملغ من حبيبات الخلية يعتمد على العمر وإنتاج الأنسجة. تم استخدام حوالي 10–12 فأرا عمرها أربعة أسابيع في هذه الدراسة.

4. أداء التصويب الصوتي

  1. تحضير الليزاتات
    1. أعد تعليق حبيبات الخلايا في مخزن تحلل الخلايا بنسبة 100 ملغ لكل 1 مل من الحافظة.
    2. اخلط جيدا للحصول على تعليق متجانس.
  2. عينات سونيكيت
    1. تحلل سونيكات باستخدام جهاز صوت حمام مائي أو جهاز فوق صوت مركز.
    2. استمر في التصويب حتى يصبح التحذير واضحا بصريا.
      ملاحظة: تحقق من تجزئة الحمض النووي بواسطة الرحلان الكهربائي بجل الأجاروز. استمر في التصويب حتى تصبح معظم شظايا الحمض النووي بين 1 كيلوبايت و2 كيلوبرات.

5. تنفيذ سحب بروتين RNA للأسفل

  1. جمع عينات الإدخال
    1. قم بإزالة أليكوات من الليزيت لأدوات التحكم في الإدخال.
    2. احتفظ بحوالي 10 ميكرولتر لتحليل الحمض النووي الريبي و10 ميكرولتر لتحليل البروتين.
    3. حافظ على عينات الإدخال عند 37 درجة مئوية أثناء عمليات التهجين والغسيل.
  2. تحللات بريكلير
    1. أضف 30 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية المغسولة مسبقا إلى كل عينة.
    2. حضن العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع خلط لطيف في فرن تهجين.
      ملاحظة: اغسل الخرز المغناطيسي قبل الاستخدام. ضع أليكوات الخرز على حامل مغناطيسي لمدة دقيقة واحدة أو حتى يصبح المحلول واضحا. أزل محلول التخزين تماما. اغسل الخرزات مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من محلول تحلل الخلية.
  3. إزالة خرز التنظيف المسبق
    1. ضع العينات على حامل مغناطيسي.
    2. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد.
    3. كرر النقل مرة واحدة لضمان إزالة الخرزات المتبقية بالكامل.
  4. المجسات الهجينة
    1. أضف مجلدين من مخزن التهجين إلى كل عينة.
    2. أضف مجسات بنسبة 1 ميكرولتر من مخزون مجسات 100 ميكرومولار لكل 1 مل من اللايزات (الجدول التكميلي 1).
  5. تفاعلات التهجين الحضنية
    1. حضن العينات عند 37 درجة مئوية مع دوران من طرف إلى طرف لمدة 12–16 ساعة في فرن التهجين.
  6. جهز خرز القبض
    1. غسل 100 ميكرولتر من الخرزات المغناطيسية ثلاث مرات باستخدام مخزن تحلل الخلية مباشرة قبل نهاية التهجين.
    2. أزل كل العزل المتبقي بعد الغسل النهائي.
  7. المجمعات المرتبطة بالمجسات القابضة
    1. تفاعلات هجينة الطرد المركزي لفترة وجيزة.
    2. أعد تعليق الخرزات المغسولة في 1 مل من عينة هجينة.
  8. ربط المركبات بالخرز
    1. أعد نظام التعليق الخرز إلى الأنبوب الأصلي.
    2. حضن عند 37 درجة مئوية مع الخلط لمدة 30–40 دقيقة.
  9. خرز الاسترداد
    1. عينات من الطرد المركزي لفترة وجيزة.
    2. ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي لمدة دقيقة إلى دقيقتين أو حتى يصبح المحلول شفافا.
    3. تخلص من السوبرناتانت.
    4. قم بإزالة السائل المتبقي باستخدام رأس ماصة.
      ملاحظة: تجنب إزعاج حبيبات الخرزة المغناطيسية أثناء إزالة السائل.
  10. المجمعات التي تم الاستيلاء عليها من قبل واش
    1. أضف 1 مل من حاجز الغسيل.
    2. اغسل الخرز عند حرارة 37 درجة مئوية مع خلط مستمر لمدة 5 دقائق.
    3. كرر عملية الغسل خمس مرات.
      ملاحظة: يحتوي مخزن الغسيل على 1 M NaCl، الذي يعطل التفاعلات غير التساهمية بين البروتين والبروتين والحمض النووي الريبي مع الحفاظ على الروابط التساهمية الناتجة عن الأشعة فوق البنفسجية. تزيل هذه الظروف الصارمة المتفاعلات غير المباشرة والخلفية غير المحددة، مما يثري شركاء البروتينالمباشرين 19.
  11. مواد احتياطية لتحليل الحمض النووي الريبي
    1. انقل 1٪–10٪ من الخرزات المغسولة إلى أنبوب جديد لتحليل الحمض النووي الريبي.
    2. استخدم الخرزات المتبقية فورا لاستخراج البروتين أو خزنها عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: أوقف البروتوكول هنا إذا لزم الأمر. تخزين عينات الخرزات عند -80 درجة مئوية حتى يتم استخراج البروتين.
  12. بروتينات الإلوت
    1. أضف مخزن عينات SDS إلى الخرز.
    2. اغلي العينات عند درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لإزالة البروتينات وعكس الروابط المتقاطعة.
    3. انتقل إلى تحليل مطيافية الكتلة.

6. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. هضم البروتينات
    1. أعد تعليق عينات RNA المرتبطة بالخرزات في 100 ميكرولتر من مخزن PK.
    2. ضبط عينات إدخال RNA إلى حجم نهائي 100 ميكرولتر باستخدام مخزن PK.
  2. حضن باستخدام بروتيناز K
    1. حضن العينات عند 50 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع خلط مستمر.
  3. إنزيم البروتيناز K غير منشط
    1. أخذ عينات حرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  4. إضافة كاشف ترايزول
    1. أضف 500 ميكرولتر من مادة ترايزول إلى كل عينة.
    2. فورتكس تماما.
    3. حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      تحذير: يحتوي كاشف التريزول على الفينول والجوانيدين ثيوسيانات. تعامل مع المادة الكيميائية باستخدام غطاء بخار كيميائي أثناء ارتداء القفازات ومعطف المختبر ونظارات السلامة. تجنب الاستنشاق وملامسة الجلد. إذا حدث تلامس للجلد، اغسله فورا بالصابون والماء.
  5. إجراء فصل الطور
    1. أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل عينة.
    2. فورتكس تماما.
    3. حضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. استعادة الطور المائي
    1. عينات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
    2. انقل الطور المائي العلوي إلى أنبوب جديد.
  7. ربط الحمض النووي الريبي بأعمدة التنقية
    1. أضف حجما مساويا بنسبة 100٪ إيثانول إلى الطور المائي.
    2. اخلط جيدا.
    3. تحميل العينات على أعمدة تنقية الحمض النووي الريبي.
  8. تنقية RNA
    1. قم بتنظيف الحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. حمض RNA مائل في 30 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز.
  9. تحقق من إثراء الحمض النووي الريبي بواسطة qRT-PCR
    1. استخدم 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المائل لكل تفاعل لإجراء PCR للنسخ العكسي الكمي (qRT-PCR).
    2. تقييم إثراء الحمض النووي الريبي المستهدف مقارنة بالضوابط.

7. إجراء تحليل LC-MS/MS

  1. فصل البروتينات بواسطة SDS-PAGE
    1. اخلط البروتينات التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.12 مع 4× عينة LDS.
    2. افصل البروتينات على جل بيس-تريس بنسبة 4٪–12٪.
    3. صبغ الجل باستخدام مجموعة صبغ فضية.
    4. قم بإزالة مسار البروتين بالكامل كحلقة واحدة.
  2. قطع جل الضرائب
    1. قم بإزالة شريط البروتين باستخدام مشرط نظيف.
    2. قلل من كمية الجل الزائد.
    3. اقطع الجل إلى حوالي 1 مموثلاث قطع.
    4. انقل قطع الجل إلى أنبوب بسعة 0.5 مل.
  3. قطع جل إزالة الصبغ
    1. أضف 100 ميكرولتر من محلول إزالة الصبغة.
    2. دوامة لمدة 10 دقائق.
    3. الطرد المركزي عند 14,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة.
    4. أزل السوبرناتانت.
    5. كرر عملية إزالة اللون حتى تصبح قطع الجل شفافة.
  4. تقليل البروتينات
    1. أضف 100 ميكرولتر من محلول الاختزال.
    2. حضن عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. عينات باردة إلى درجة حرارة الغرفة.
    4. قم بجهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة وإزالة السوبرناتان.
  5. بروتينات الألكيلات
    1. أضف 100 ميكرولتر من محلول التكلية.
    2. حضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة في الظلام.
    3. أزل السوبرناتانت.
    4. اغسل قطع الجل بمحلول هضم 100 ميكرولتر لمدة 5 دقائق.
  6. هضم البروتينات
    1. أضف كمية كافية من محلول التربسين لتغطية قطع الجل بالكامل.
    2. الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 16–18 ساعة.
  7. الببتيدات المستخلصة
    1. أضف 30 ميكرولتر من محلول الاستخلاص.
    2. سونيكيت لمدة 15 دقيقة أو فورتكس لمدة 30 دقيقة.
    3. الطرد المركزي عند 14,000 × جرام لمدة دقيقة واحدة.
    4. انقل المادة الفائقة إلى أنبوب جديد.
    5. كرر عملية الاستخراج مرتين.
    6. اجمع جميع المستخلصات.
    7. تجمع المستخلصات الجافة في مركز فراغ لمدة ساعة تقريبا.
  8. تنظيف الببتيدات باستخدام StageTip
    1. أعد تعليق الببتيدات المجففة في 20 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪.
    2. حمل عينات على C18 StageTip.
    3. الطرد المركزي عند 1000 × جرام لمدة دقيقتين.
    4. اغسل StageTip ب 20 ميكرولتر من 0.1٪ FA.
    5. ببتيدات إلوت تحتوي على 20 ميكرولتر من 60٪ أسيتونيتريل / 0.1٪ FA في قارورة LC-MS.
    6. جفف اللوات.
    7. إعادة تعليق الببتيدات في 10 ميكرولتر بنسبة 0.1٪ FA.
      ملاحظة: أوقف البروتوكول هنا إذا لزم الأمر. تخزين الببتيدات المنقاة عند -80 درجة مئوية قبل تحليل LC-MS/MS.
  9. الحصول على بيانات LC-MS/MS
    1. إعادة تكوين الببتيدات في حمض الفورميك بنسبة 0.1٪.
    2. ببتيدات منفصلة على عمود تحليلي بحجم 75 ميكرومتر × 250 مم C18 بمعدل تدفق 300 نانولتر/دقيقة.
    3. تطبيق تدرج المذيب B التالي (0.1٪ حمض الفورميك في الأسيتونيتريل):
      2٪–25٪ B خلال 0–40 دقيقة
      25٪–40٪ B خلال 40–48 دقيقة
      40٪–99٪ B خلال 50–57 دقيقة
      حافظ على 99٪ B لمدة 3 دقائق
    4. تشغيل مطياف الكتلة في وضع الاكتساب المعتمد على البيانات.
    5. الحصول على أطياف MS كاملة المسح عبر نطاق m/z من 350–1200 بدقة 70,000.
    6. احصل على خمسة عشر مسحا متتاليا لتفكك التصادم عالي الطاقة (HCD) MS/MS بدقة 17,500.
    7. سجل ميكروسحا واحدا لكل مسح.
    8. اضبط الاستبعاد الديناميكي إلى 30 ثانية.
  10. بيانات مطيافية الكتلة العملية
    1. معالجة البيانات الخام باستخدام MaxQuant (الإصدار 2.1.0.0).
    2. ابحث في طيف الفأر مع تسلسلات بروتينات الفأر التي تم تنزيلها من UniProt.
    3. حدد التريبسين كإنزيم الهضم.
    4. اسمح بحد أقصى لوجود صدمين ضائعين.
    5. حدد أكسدة الميثيونين كتعديل متغير.
    6. حدد كرباميدوميثيليشن السيستين كتعديل ثابت.
    7. اضبط تسامح كتلة المادة الأولية والجزئية إلى 15 جزء في المليون و20 جزء في المليون على التوالي.
    8. التحكم في معدل الاكتشاف الكاذب عند 1٪ عند مستويات الببتيد والبروتين.
    9. تقدير وفرة البروتين باستخدام القياس الخالي من الملصقات المعتمد على iBAQ.

8. إجراء تحليل إثراء الأنطولوجيا الجينية

  1. تحليل الإثراء الوظيفي
    1. قم بإجراء تحليل إثراء الجينات (GO) باستخدام حزمة clusterProfiler R (الإصدار 4.6.0).
    2. استخدم قاعدة بيانات GO (v2024-09-20) كمصدر للتعليقات المرجعية.
    3. طبق تصحيح بنجاميني-هوشبرغ للاختبارات المتعددة.
    4. عرف الدلالة الإحصائية كقيمة P معدلة (FDR) < 0.05.

9. إجراء التحقق من eCLIP-seq

  1. جهز عينات eCLIP
    1. أداء تعزيز الربط المناعي المتقاطع (eCLIP) كما هو موضحسابقا 17.
    2. تحضير عينات خلايا متشابكة بالأشعة فوق البنفسجية لإجراء التقسيط المناعي ل PABPC1 وCCT3.
    3. عينات ليز باستخدام مخزن تحليل eCLIP.
  2. مركبات البروتين الريبي النووي المناعي
    1. أضف 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة لكل عينة.
    2. التقاط مركبات البروتين الريبي على الخرز المغناطيسي.
    3. اجمع عينات الإدخال قبل التفاعل المناعي.
  3. تحضير مكتبات RNA
    1. الحمض النووي الريبي المرتبط بالبروتين ديفوسفوريلات.
    2. قم بربط محول RNA بمقدار 3 أقدام ليتم استعادتها.
    3. غسل عينات مناعية ومدخلة تحت ظروف صارمة.
    4. يتم تدخيم مركبات السحب عن طريق غلي الخرز.
    5. حل العينات على جل تدرج Bis-Tris بنسبة 4٪–12٪.
    6. نقل المركبات المنفصلة إلى غشاء نيتروسلولوز.
  4. استعادة الحمض النووي الريبي
    1. قم بإزالة منطقة غشاء مطابقة للحجم.
    2. هضم البروتينات باستخدام اليوريا وبروتيناز K.
    3. استرجاع الحمض النووي الريبي من الغشاء.
  5. توليد مكتبات التسلسل
    1. تم استرجاع الحمض النووي الريبي العكسي إلى cDNA.
    2. قم بتنقية cDNA باستخدام مزيج من إكسونوكلياز I وخليط فوسفاتاز قلوي من الروبيان.
    3. قم بربط محول DNA إلى الطرف 3' من cDNA باستخدام ليغاز RNA من T4.
    4. تضخيم المكتبات باستخدام بوليميراز DNA عالي الدقة.
    5. مكتبات مضخمة منفصلة على جل أغاروز منخفض نقطة الانصهار بنسبة 3٪.
    6. قم بتنقية المكتبات حسب الحجم باستخدام مجموعة استخراج الجل.
    7. مكتبات التسلسل على منصة Illumina.
  6. تحليل بيانات eCLIP-seq
    1. تحليل بيانات التسلسل باستخدام خط أنابيب ENCODE eCLIP20.
    2. محولات التريم ودايمرات محولات 3 أقدام باستخدام cutadapt (الإصدار 1.14).
    3. محاذاة القراءات مع عناصر UCSC المتكررة باستخدام STAR (الإصدار 2.7.6a).
    4. أزل تعيين القراءات إلى العناصر المتكررة.
    5. محاذاة القراءات المتبقية مع الجينوم المرجعي ل mm10 (رمز التوليد vM23).
    6. قم بإزالة نسخ PCR.
    7. حدد مواقع الربط المثرية باستخدام CLIPPER.
    8. عرف القمم الدلالة بأنها تلك التي تحتوي على تثريبات الطي ≥ 8 ومعدل P ≤ 0.001.
    9. تحديد القمم القابلة للتكرار باستخدام عتبة معدل الاكتشاف غير القابل للتكرار (IDR) وهي 0.01.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتحديد بروتينات ارتباط Tug1، تم دمج الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية في سير عمل ChIRP، مما أدى إلى إنشاء طريقة تسمى cPDiRT (الشكل 1). تم إجراء ChIRP التقليدي لأول مرة في خلايا GC2 لإثراء البروتينات المتفاعلة مع Tug1 (الشكل 2A, B). حدد تحليل مطيافية الكتلة أكثر من 190 بروتينا غنيا بالنسبة للضابط السلبي (الشكل 2C؛ الجدول التكميلي 2). على النقيض م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير cPDiRT كبروتوكول معدل قائم على ChIRP يستبدل الربط المتقاطع للبارافورمالديهايد (PFA) بالربط الفوري UV لالتقاط التفاعلات المباشرة بين lncRNA والبروتينات بشكل انتقائي. من خلال دمج التفكك الإنزيمي للأنسجة الخصية الطازجة إلى خلايا مفردة مع الربط المتقاطع بالأشعة فوق البنفسجية، تم توسيع رسم خرائط التفاعل المباشر من خطوط الخلايا المزروعة إلى الأنسجة الأصلية. مكنت التجارب المتوازية في الخلايا المزروعة من مقارنة جنبا إلى جنب بين الأساليب المعتمدة على PFA والأشعة فوق البنفسجية، وتم التحقق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

جميع المؤلفين يعلنون عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يشكر المؤلفون تشيانغفنغ تشانغ (جامعة تسينغهوا) وتسي تشو (مختبر هوارد تشانغ) على المناقشات المفيدة حول بروتوكول ChIRP الأصلي. حظي ك.ز. بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32170858) والقائد الأكاديمي المتميز لبرنامج المواهب الشرقية في شنغهاي (BJKJ2025057). حظيت L.Y. بدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82571836، 32070843، و 82371617).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
محلول تريبسين-إي دي تي إيه 0.25%Gibco25200056لتفكك الأنسجة وتحضير تعليق الخلايا المفردة
كحول إيثانول 100%Sigma-Aldrich459844لتنظيف الحمض النووي الريبي
عكس النسخ العكسي AffinityScriptAgilent600107لتخليق الحمض النووي الريبي المكمّل لـ eCLIP
جسم مضاد لـ CCT3AbcamAb225878جسم مضاد لـ eCLIP
جسم مضاد لـ PABPC1AbcamAb312314جسم مضاد لـ eCLIP
الكلوروفورمSigma-AldrichC2432لخلع الحمض النووي الريبي
كولاجيناز من النوع الرابعSigma-AldrichC5138للتفكك الأنزيمي للأنسجة الخصيوية
عوامل نزع الفوسفات (T4 PNK)New England BiolabsM0201Sلنزع الفوسفات من الحمض النووي الريبي لـ eCLIP
محلول DMEM عالي الجلوكوزGibco11965092لزراعة الخلايا ومحلول تفكك الأنسجة
مغناطيس Dynabeads MyOne Streptavidin C1Thermo Fisher Scientific65001لفصل معقدات الحمض النووي الريبي المقترن بالبيوتين
مغناطيس DynaMag-15Thermo Fisher Scientific12301Dلفرز الخرزات المغناطيسية
مغناطيس DynaMag-2Thermo Fisher Scientific12321Dلفرز الخرزات المغناطيسية
إي دي تي إيهSigma-AldrichE9884لإشبال الكاتيونات ثنائية التكافؤ في محلول التحلل والغسل
الإكسونوكلياز الأولNew England BiolabsM0293Sلتنقية الحمض النووي الريبي المكمّل لـ eCLIP
مصل بقري جنيني (FBS)Gibco10099141Cلوقف عملية الهضم بالتريبسين
الفورماميدThermo Fisher ScientificAM9342لتحضير محلول الهجينة
فرن الهجينةTUOHELF-Iلهجينة المجس وغسل الخرز
أجار ذو درجة انصهار منخفضةSigma-AldrichA9414لاختيار حجم مكتبة eCLIP
مجموعة استخراج هلام MinEluteQiagen28604لاختيار حجم مكتبة eCLIP
مجموعة miRNeasy MiniQiagen217004لتنقية الحمض النووي الريبي
كلوريد الصوديومSigma-AldrichS7653لتحضير محلول الغسل عالي الملوحة
غشاء نيتروسليلوزGE Healthcare / Amersham10600002لنقل الغربلة الغربية لـ eCLIP
NP-40Thermo Fisher Scientific85125لمنظف محلول الغسل
ماء خالٍ من النيوكليازات والبروتيازThermo Fisher Scientific10977035لتحضير المحاليل الخالية من النيوكلياز
جل NuPAGE 4-12% Bis-TrisThermo Fisher ScientificNP0322BOXلاختيار حجم eCLIP
جل NuPAGE Bis-Tris المصبوغThermo Fisher ScientificNP0321BOXلفصل البروتين بالـ SDS-PAGE
محلول PBS (بـ pH 7.4)Thermo Fisher Scientific10010023لغسل الخلايا وإعادة تعليقها
فلورايد فينيل ميثيل السلفونيل (PMSF)Sigma-AldrichP7626مثبط للبروتيناز سيرين لمحلول تفتيت الخلايا؛ يضاف طازجًا قبل الاستخدام
محلول مثبط البروتيازRoche4693132001مثبط واسع الطيف للبروتياز لمحلول تفتيت الخلايا؛ يضاف طازجًا قبل الاستخدام
بروتياز KSigma-AldrichP4850لهضم البروتين في استخراج الحمض النووي الريبي
خليط qRT-PCR الرئيسيThermo Fisher Scientific11704044للتفاعل البوليميري المتسلسل الكمي للتحقق من إثراء الحمض النووي الريبي
محلول RNase/DNase I الخالي من البروتيازThermo Fisher ScientificEN0521لتفكك الأنسجة
مجموعة RNeasy MiniQiagen74104لتنقية الحمض النووي الريبي
محلول SDS-PAGE لتحميل العيناتBeyotimeP0286لتحضير عينة البروتين
فوسفاتاز القرشي القلويNew England BiolabsM0371Sلتنقية الحمض النووي الريبي المكمّل لـ eCLIP
مجموعة صبغة الفضةBeyotimeP00175لتصور البروتينات في جل SDS-PAGE
ديوكسيكوليت الصوديومSigma-AldrichD6750لمنظف محلول الغسل
دوسيلات الصوديوم (SDS)Sigma-AldrichL3771لتفتيت الخلايا وتفكيك البروتين
Superase-in RNase InhibitorThermo Fisher ScientificAM2694مثبط متخصص للحمض النووي الريبي؛ يضاف طازجًا قبل الاستخدام
التاليغايز RNA T4New England BiolabsM0204لربط محول eCLIP
ثلاثي هيدروكسي ميثيل أميلينو ميثان-هيدروكلوريد (ثلاثي الهيدروكسي ميثيل أميلينو ميثان- هيدروكلوريد) (pH 7.0)Sigma-AldrichT5941لتحضير محلول التحلل، الهجينة، والغسل
محلول TRIzolThermo Fisher Scientific15596026CNلخلع الحمض النووي الريبي
مطحونة الخلايا بالموجات فوق الصوتيةATPIOATPIO-650Dلتفتيت الخلايا وتجزئة الحمض النووي
رابط المتبادل بالأشعة فوق البنفسجيةAnalytik JenaUVP CL-1000لربط الحمض النووي الريبي-البروتين بالأشعة فوق البنفسجية
اليورياSigma-AldrichU5128لإتلاف البروتين في غشاء eCLIP

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

233 233 Tug1 RNA RBP eCLIP
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة